Name: Zakażenie in vivo Leishmania amazonensis w celu oceny zjadliwości pasożyta u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj metodę zakażenia in vivo Leishmania amazonensis w celu oceny zjadliwości pasożyta u myszy. Protokół umożliwia jednoczesną analizę odpowiedzi zapalnej gospodarza i replikacji pasożyta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Prof. Dr. Nielsowi Olsenowi Saraivie Câmara z Centrum Zwierząt Instytutu Nauk Biomedycznych Uniwersytetu w São Paulo za wsparcie oraz Prof. Dr. Silvii Reni Uliana za dostarczenie szlifierki do szklanych chusteczek. Prace te były wspierane przez Fundację Badawczą Sao Paulo (FAPESP - grant MFLS 2017/23933-3).

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Instytucie Nauk Biologicznych Uniwersytetu w São Paulo (CEUA 342/2019) i zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami i zasadami opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych stanu São Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) oraz rządu brazylijskiego (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Wszystkie czynności opisane w rozdziałach 1-5 należy wykonywać aseptycznie w komorach o przepływie laminarnym. Podczas pracy z żywymi pasożytami Leishmania należy stosować środki ochrony osobistej.
1. In Vitro Różnicowanie L. amazonensis Promastigotes na Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38
UWAGA: Pasożyt L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) został użyty w tym teście. W zależności od celu badania, zakaźną formę pasożyta można uzyskać albo przez oczyszczenie postaci metacyklicznej za pomocą gradientu gęstości, jak opisano wcześniej14, albo przez różnicowanie promastigotów w aksendyjskie amastigoty, zgodnie z poniższym protokołem.
<ol>
	<li>Hodować La promastigotes w 25 cm 2-komórkowej kolbie hodowlanej zawierającej 10 ml pożywki dla promastigotów (pro-pożywki) (pH = 7,0).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 dni. 
	UWAGA: Użyj kultur promastynów, które były pasażowane in vitro mniej niż 10 razy, aby uniknąć utraty zjadliwości i zmian aneuploidii pasożytów39,40,41,42,43,44.</li>
	<li>Odpipetować 5 ml logarytmicznej kultury promastigotów w fazie wzrostu do nowej kolby o średnicy 25cm2.</li>
	<li>Dodać 5 ml pożywki dla aksenów amastigotów (ama-pożywka) (pH = 5,2).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 34 °C przez 3-4 dni.</li>
	<li>Podzielić kulturę, rozcieńczając pożywką ama-medium w stosunku 1:3 do nowej kolby o średnicy 25cm2.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 34 °C przez 3-5 dni. 
	UWAGA: Inkubuj aksseniczne amastigoty przez okres do 5 dni, ponieważ oznacza to koniec dojrzewania37.</li>
</ol>
2. C57BL/6 Zakażenie opuszki stopy L. amazonensis
UWAGA: Samice myszy C57BL/6 (w wieku 6-8 tygodni) zostały pozyskane i utrzymywane w Centrum Zwierząt Instytutu Nauk Biomedycznych Uniwersytetu w São Paulo. Zwierzęta otrzymywały pożywienie i wodę ad libitum.
<ol>
	<li>Policz kulturę akskonów amastigotów, przenosząc podwielokrotność zawiesiny pasożyta rozcieńczonej w PBS do komory Neubauera (tj. hemocytometru). Policz niewiciowe pasożyty, które reprezentują formy amastigotes. 
	UWAGA: Alternatywnie, błękit trypanowy (1:1) może być użyty do zliczenia liczby żywotnych amastigotów (tj. tych, które nie są barwione błękitem trypanowym).</li>
	<li>Rozcieńczyć amestigoty akseniczne w PBS zgodnie z pożądaną dawką inokulum i zamierzoną liczbą inokulum (zaleca się 1 x 106 aksenicznych amastigotów w 50 μl PBS).</li>
	<li>Załadować strzykawkę tuberkulinową igłą 27 G z przygotowaną zawiesiną pasożytów.</li>
	<li>Znieczulenie myszy C57BL/6 za pomocą 3-5% izofluranu, zgodnie z zaleceniami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa45. Oceń głębokość znieczulenia, testując reakcję myszy na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Zaszczepić 50 μl homogenizowanej zawiesiny pasożyta (1 x 106 aksenicznych amastigotów lub pożądana dawka inokulum) w tkance podpodeszwowej lewej tylnej poduszki stopy, używając uprzednio załadowanej strzykawki tuberkulinowej (krok 2.3).</li>
</ol>
3. Rozwój uszkodzeń opuszki stopy myszy
<ol>
	<li>Mierz postęp zmiany raz w tygodniu, mierząc grubość lewej (zainfekowanej) i prawej (niezainfekowanej) opuszki stopy za pomocą suwmiarki.</li>
	<li>Oblicz różnicę grubości między lewą i prawą tylną poduszką stopy co tydzień, aby ocenić postęp zmiany.</li>
	<li>Wykreślić obliczone różnice na osi Y i czas infekcji na osi X i obliczyć istotność statystyczną. 
	UWAGA: Zgodnie z zaleceniami Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania, zwierzęta muszą zostać uśmiercone, zanim zakażona zmiana ulegnie owrzodzeniu, ponieważ owrzodzenia skóry mogą prowadzić do wtórnego zakażenia. Jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1, potrzeba około 10 tygodni, aby zmiany wykazywały oznaki owrzodzenia po dawce pasożyta (106 aksenicznych amastigotów) i szczepu gospodarza (C57BL/6) zastosowanej w tym protokole. Myszy należy poświęcić w celu usunięcia zmiany chorobowej, zanim zaobserwuje się oznaki owrzodzenia.</li>
</ol>
4. Usuwanie uszkodzeń opuszki stopy myszy i rozcieńczanie ograniczające pasożyty
<ol>
	<li>Przygotuj 96-dołkową płytkę (płaskie dno) do testu rozcieńczenia granicznego46,47, dodając 180 μl pro-pożywki do wszystkich studzienek. 
	UWAGA: Użyj czterech pasów płytki (połowa płytki) dla każdego zwierzęcia, reprezentujących poczwórne testy (tj. zwierzę 1 = pasy A-D; zwierzę 2 = pasy E-H).</li>
	<li>Dodać 1 ml pro-pożywki do szklanej probówki do rozdrabniania tkanek na zmianę i zważyć probówkę. 
	UWAGA: Probówka musi być sterylna, więc użyj sterylnej pokrywki i zważ probówkę z zamkniętą pokrywką, jeśli waży się poza komorą z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Zwierzę należy złożyć w ofierze w komorze CO2 , postępując zgodnie z zaleceniami Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania. Zdezynfekuj zwierzę, spryskując je 70% etanolem.</li>
	<li>Wytnij stopę zwierzęcia na piętach, aby usunąć zainfekowaną poduszkę stopy i spryskaj ją 70% etanolem w celu dezynfekcji. Zapewnij sterylizację nożyczek i kleszczy, trzymając je namoczone w 70% etanolu.</li>
	<li>Umieść zainfekowaną opuszkę stopy na sterylnej szalce Petriego i przeprowadź sekcję za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela, aby zebrać wszystkie tkanki miękkie. Wyrzuć kości. 
	UWAGA: Zaleca się jednorodność na etapie sekcji, aby uniknąć tendencyjnego odzyskiwania tkanki.</li>
	<li>Przenieś zebrane tkanki do szklanej probówki do mielenia tkanek za pomocą pro-medium, a następnie ponownie zważyć probówkę, aby określić masę zmiany. 
	UWAGA: Unikaj umieszczania kleszczy i skalpela bezpośrednio w podłożu, ponieważ małe objętości mogą zostać usunięte, co spowoduje niedoszacowanie masy tkanki. Masę zmiany oblicza się poprzez odjęcie masy probówki zawierającej pro-pożywkę z pobraną tkanką od masy probówki zawierającej tylko pro-pożywkę.</li>
	<li>Homogenizuj tkankę 10 razy za pomocą młynka, aby całkowicie rozbić tkankę.</li>
	<li>Pozostawić mieszaninę do osadzenia się na 10 minut, a następnie zebrać 20 μl supernatantu.</li>
	<li>Załadować 20 μl supernatantu do pierwszej kolumny 1. pasa 96-dołkowej płytki przygotowanej w kroku 4.1. Powtórz to dla następnych trzech pasów, aby uzyskać poczwórne duplikaty dla każdego zwierzęcia (tj. dla zwierzęcia 1 dodaj 20 μl do każdego dołka i oznacz A1, B1, C1 i D1).</li>
	<li>Homogenizować każdą studzienkę w 1. kolumnie 10x za pomocą pipety wielokanałowej. Następnie przenieść 20 μl rozcieńczonych próbek z 1. kolumny do 2. kolumny. 
	UWAGA: Ważne jest, aby homogenizować każdą studzienkę 10x z jednej kolumny do drugiej.</li>
	<li>Powtórzyć krok 4.10 dla wszystkich pozostałych kolumn aż do ostatniej kolumny (12-tej) i wyrzucić ostatnie 20 μl rozcieńczonej próbki. 
	UWAGA: Wymieniaj końcówki po każdym rozcieńczeniu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
	<li>Uszczelnić płytki folią i inkubować w temperaturze 25 °C przez 7 dni w wilgotnej komorze.</li>
</ol>
5. Określanie obciążenia pasożytami zmian chorobowych
<ol>
	<li>Przeanalizuj płytki po 7 dniach inkubacji za pomocą odwróconego mikroskopu, aby określić ostatnią studzienkę zawierającą pasożyty dla każdego pasa. 
	UWAGA: Możliwe jest również wskazanie wzrostu pasożytów lub gęstości komórek poprzez wizualną analizę zmian koloru i zmętnienia pożywki.</li>
	<li>Obliczyć obciążenie tkanką pasożyta dla każdego pasa, dzieląc współczynnik rozcieńczenia na masę zmiany. 
	UWAGA: Na określonym torze, jeśli pasożyty są obecne tylko w kolumnach 1-5 (tj. studzienki A1-A5 są dodatnie dla wzrostu pasożyta), oznacza to, że kolumna 5 zawierała tylko 1 pasożyta, kolumna 4 zawierała 10 pasożytów i tak dalej, w wielokrotnościach dziesięciu. Kolumna 1 zawierałaby 104 pasożytów, co odpowiada liczbie pasożytów w początkowych 20 μl supernatantu (nierozcieńczona próbka w kroku 4.7). Ponieważ te 20 μl rozcieńczono 180 μl pro-pożywki, początkowa probówka zawierała 5 x 105 pasożytów: (1 x 104) / (0,02 ml) = 5 x 105 pasożytów/1 ml. Następnie obciążenie pasożytem w tej zmianie można obliczyć, dzieląc początkowe stężenie pasożyta przez masę zmiany: (5 x 105) / masę zmiany (patrz krok 4.6).</li>
	<li>Wykreślić średnią z poczwórnego wyniku dla każdego zwierzęcia za pomocą logarytmicznej skali Y.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Należy przedstawić dane jako średnią ± odchyleniem standardowym, wykorzystując co najmniej pięć zwierząt na grupę doświadczalną jako kontrpróby.</li>
	<li>Przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu niesparowanego testu dwustronnego, uznając wartość p < 0,05 za istotną.</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Test zakażenia in vivo opisany w tym protokole pozwala każdemu badaczowi ocenić leiszmaniozę skórną in vivo, biorąc pod uwagę interakcję gospodarz-pasożyt w scenariuszu ogólnoustrojowym. Testy te były używane przez wiele grup 22,24,27,29,31,32,34,49, a tutaj opracowaliśmy protokół krok po kroku, aby ustandaryzować tę metodę, biorąc pod uwagę ograniczenia infrastrukturalne, które mogą mieć niektóre grupy.<sup class="xr...

Leiszmaniozy są powszechnymi na całym świecie pasożytniczymi chorobami zakaźnymi, stanowiącymi poważne wyzwanie w krajach rozwijających się i są uznawane przez Światową Organizację Zdrowia za jedną z najważniejszych zaniedbanych chorób tropikalnych1,2. Leiszmaniozy charakteryzują się objawami skórnymi, śluzówkowymi i/lub trzewnymi. Leiszmanioza skórna jest zwykle wywoływana przez L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica i L. aethiopica3. Ta forma choroby często leczy się samoistnie u ludzi ze względu na indukcję ochronnej komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Jednak komórkowa odpowiedź immunologiczna może się nie powieść, a choroba może rozwinąć się w rozsianą leiszmaniozę skórną4,5. Nie ma dostępnej szczepionki ze względu na różnorodność gatunków Leishmania i tła genetycznego gospodarza6,7. Możliwości leczenia są również ograniczone, ponieważ większość obecnie dostępnych leków jest droga, toksyczna i/lub może wymagać długotrwałego leczenia8,9. Poza tym pojawiły się doniesienia o lekooporności na dostępne metody leczenia10,11.
Czynnikiem wywołującym leiszmaniozy jest pasożyt pierwotniaka Leishmania. Pasożyt w swoim cyklu życiowym prezentuje dwie różne formy morfologiczne: promastigotes, wiciową formę występującą u muszek piaskowych; i amastigoty, forma wewnątrzkomórkowa znajdująca się w parazytoforycznych wakuolach makrofagów gospodarza ssaków12,13. Zdolność amastigotów do inwazji, przetrwania i replikacji pomimo mechanizmów obronnych makrofagów gospodarza kręgowców jest przedmiotem wielu badań14,15,16,17. W związku z tym kilka grup badawczych opisało testy infekcji makrofagami in vitro, aby ocenić wpływ określonych czynników środowiskowych, a także genów pasożytów i gospodarzy na zakaźność pasożytów. Test ten ma kilka zalet, takich jak możliwość dostosowania badań do formatu o wysokiej przepustowości, stosunkowo krótszy czas oczekiwania na wyniki oraz zmniejszona liczba zwierząt laboratoryjnych uśmiercanych18. Jednak wyniki testów in vitro są ograniczone, ponieważ nie zawsze powtarzają one badania in vivo14,19,20,21. Testy in vivo zapewniają ogólnoustrojowy fizjologiczny przegląd interakcji gospodarz-pasożyt, którego nie można w pełni naśladować za pomocą testów in vitro. Na przykład, badania immunologiczne można przeprowadzić za pomocą testów immunohistochemicznych z pobranych skrawków tkanki opuszki stopy lub nawet z węzłów chłonnych podkolanowych w celu analizy odzyskanych komórek odpornościowych22.
Zwierzęta są często używane jako model chorób ludzkich w badaniach biologicznych i biomedycznych, aby lepiej zrozumieć fizjologiczne mechanizmy leżące u podstaw chorób23. W przypadku leiszmaniozy droga, miejsce lub dawka szczepienia wpływają na wynik choroby24,25,26,27. Co więcej, podatność i odporność na infekcję u ludzi i myszy są silnie regulowane przez podłoże genetyczne gospodarza i pasożyta4,5,22,28,29,30,31. Myszy BALB/c są bardzo podatne na zakażenie skóry L. amazonensis, wykazując szybki postęp choroby z rozprzestrzenianiem się pasożytów do węzłów chłonnych, śledziony i wątroby32. Ponieważ choroba może przekształcić się w przerzuty skórne, infekcja może być śmiertelna. W przeciwieństwie do tego, myszy C57BL/6 często rozwijają przewlekłe zmiany z trwałym obciążeniem pasożytami w testach infekcji L. amazonensis33. W związku z tym zakażenie L. amazonensis tym konkretnym gatunkiem myszy zostało uznane za doskonały model do badania przewlekłych postaci leiszmaniozy skórnej u ludzi, ponieważ naśladuje postęp choroby lepiej niż model infekcji myszy BALB/c5,34.
Dlatego proponujemy, że mysia infekcja in vivo jest użyteczną metodą do badań fizjologicznych nad wirulencją Leishmania mającą zastosowanie do chorób ludzkich, pozwalając na systemowe spojrzenie na interakcję gospodarz-pasożyt. Wracając do dobrze ugruntowanych testów22, przedstawiamy tutaj skompilowany protokół krok po kroku zakażenia in vivo myszy C57BL/6 L. amazonensis, który obejmuje różnicowanie pasożytów na aksendyjskie amastigoty, szczepienie skórne opuszki stopy myszy, rozwój zmian i określanie obciążenia pasożytami. Protokół ten można dostosować do innych szczepów myszy i gatunków Leishmania, które powodują leiszmaniozy skórne. Podsumowując, przedstawiona tutaj metoda ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji nowych celów leków i szczepionek przeciwko Leishmanii, a także w badaniach fizjologicznych odpowiedzi immunologicznej i metabolicznej gospodarza na zakażenie Leishmania.

<table><tbody><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Greiner bio-ne</td><td>655180</td><td>Płytka z płaskim dnem do oznaczania granicznego rozcieńczania</td></tr><tr><td>adenina</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td>Suplement dodany do pożywki do hodowli komórkowych M199</td></tr><tr><td>suwmiarka</td><td>Mitutoyo</td><td>700-118-20</td><td>Suwmiarka do pomiaru grubości</td></tr><tr><td>kolby do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>353014</td><td>Kolba do hodowli komórkowych o objętości 25 cm2 do hodowli pasożytów Leishmania</td></tr><tr><td></td><td>Wirówka Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Urządzenie służące do rozdzielania próbek na podstawie ich gęstości</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 34 &deg; C</td><td>Thermo Scientific</td><td>3110</td><td>Inkubator do różnicowania amastigotów</td></tr><tr><td>etanolu</td><td>Merck</td><td>K50237083820</td><td>Środek dezynfekujący do przedmiotów ogólnych</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>Suplement dodany do pożywki do hodowli komórkowych M199</td></tr><tr><td>szklana rurka do mielenia tkanek</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431 E04</td><td>Probówka do zbierania i niszczenia zainfekowanej tkanki</td></tr> <tr><td>opuszki stopyglukoza</td><td>Synth</td><td>G1008.01.AH</td><td>Suplement dodany do pożywki do hodowli komórkowych M199</td></tr><tr><td>Oprogramowanie GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Oprogramowanie służące do wykreślania danych i obliczania istotności statystycznej</td></tr><tr><td>hemin</td><td>Sigma</td><td>H-2250</td><td>Suplement dodany do pożywki do hodowli komórkowych M199</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Promega</td><td>H5303</td> Suplement dodany do inkubatora <td>pożywek do hodowli komórkowych M199</td></tr><tr><td>25 &deg; C</td><td>Fanem</td><td>347CD</td><td>Inkubator do hodowli promastigot,</td></tr><tr><td>mikroskop odwrócony,</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>Sprzęt służący do wizualnej analizy kultur promastigotów i amastigotów</td></tr><tr><td>izofluran</td><td></td><td></td><td>Środek wziewny znieczulający dla myszy (3-5%)</td></tr><tr><td>komora z przepływem laminarnym</td><td>Veco</td><td>VLFS-09</td><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego używana do aseptycznego obszaru roboczego Komórka</td></tr><tr><td>M199 pożywki hodowlane</td><td>Gibco</td><td>31100-035</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych do mikrowirówki do hodowli Leishmania</td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td>Mikroprobówka służąca do pobierania, przetwarzania i przechowywania próbek</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Labsystems</td><td>F61978</td><td>Pipeta wielokanałowa służąca do oznaczania granicznego rozcieńczenia</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>Suplement dodany do pożywki do hodowli komórkowych M199</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td>Sigma S8045</td><td>Suplement dodany do pożywki do hodowli komórkowych M199</td></tr><tr><td>Komora Neubauera</td><td>HBG</td><td>2266</td><td>Hemocytometr do zliczania zawiesiny pasożytów</td></tr><tr><td>mikroskop optyczny</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td>Sprzęt optyczny używany do liczenia</td></tr><tr><td>parafilmu</td> pasożyta <td>Bemis</td><td>349</td><td>Elastyczne i odporne tworzywo sztuczne do uszczelniania </td></tr><tr><td>penicylina płytkowa/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td></td><td>15140122 Suplement dodawany do pożywki do hodowli komórkowych M199</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Sterylne naczynie do preparowania tkanek opuszki stopy</td></tr><tr><td>Zestaw do pipetowania</td> tkanek <td>Gilson</td><td>F167360</td><td>Zestaw do mikropipet zawierający cztery pipety (P2, P20, P200, P1000)</td></tr> <tr><td>Quimis</td><td>BG2000</td><td></td> <td>Sprzęt służący do ważenia pobranej podkładki pod stopy skalpel do zmian chorobowych</td></tr><tr><td></td><td>Solidor</td><td>10237580026</td><td>Skalpel do cięcia i pobierania tkanek opuszki stopy</td></tr><tr><td>pipeta serologiczna 10 ml</td><td>Nest</td><td>327001</td><td>Sterylna pipeta służąca do przenoszenia końcówek o objętościach mililitrowych</td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td></td><td>Końcówka do pipet służąca do przenoszenia objętości mikrolitrów</td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Barwnik używany do liczenia żywotnych pasożytów</td></tr><tr><td>tryptyka pepton</td> Suplement <td>Merck</td><td></td><td>dodany do pożywki tuberkulinowej M199 pożywki</td></tr><tr><td>tuberkulinowej</td><td>BD</td><td>305945</td><td>Strzykawka z igłą 27G do inokulacji zawiesiny pasożyta</td></tr></tbody></table>

zakażenie in vivo leishmania amazonensis w celu oceny zjadliwości pasożyta u myszy

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. to pasożytnicze pierwotniaki, które powodują leiszmaniozy, choroby, które prezentują szerokie spektrum objawów klinicznych, od zmian skórnych do trzewnych. Obecnie szacuje się, że 12 milionów ludzi na świecie jest zarażonych Leishmanią, a ponad 1 miliard ludzi żyje w grupie ryzyka zakażenia. Leishmania amazonensis jest chorobą endemiczną w Ameryce Środkowej i Południowej i zwykle prowadzi do skórnej postaci choroby, którą można bezpośrednio uwidocznić w modelu zwierzęcym. Dlatego szczepy L. amazonensis są dobrymi modelami do badań nad leiszmaniozą skóry, ponieważ są również łatwe w uprawie in vitro. Myszy C57BL/6 naśladują postęp choroby wywołany przez L. amazonensis obserwowany u ludzi i są uważane za jeden z najlepszych modeli szczepów myszy dla leiszmaniozy skórnej. W żywicielu kręgowców pasożyty te zasiedlają makrofagi pomimo mechanizmów obronnych tych komórek. W kilku badaniach wykorzystuje się testy infekcji makrofagami in vitro do oceny zakaźności pasożyta w różnych warunkach. Jednak podejście in vitro ogranicza się do wyizolowanego systemu komórkowego, który ignoruje odpowiedź organizmu. W tym miejscu opracowujemy metodę infekcji mysiej in vivo, która zapewnia ogólnoustrojowy przegląd fizjologiczny interakcji gospodarz-pasożyt. Szczegółowy protokół zakażenia in vivo myszy C57BL/6 L. amazonensis obejmuje różnicowanie pasożytów w zakaźne amastigoty, szczepienie skóry opuszki podeszwowej myszy, rozwój zmian i określenie obciążenia pasożytami. Proponujemy tę sprawdzoną metodę jako najbardziej odpowiednią metodę do badań fizjologicznych odpowiedzi immunologicznych i metabolicznych gospodarza na leiszmaniozę skórną.

Leishmania, pierwotniaki pasożytnicze, występują w dwóch formach rozwojowych podczas swojego cyklu życiowego u gospodarzy bezkręgowców i kręgowców: promastygotach, formach proliferacyjnych znajdujących się w świetle jelita samicy muchówki z rodzaju Phlebotomus; oraz amastygotach, formach proliferacyjnych znajdujących się w wakuolach pasożytniczych komórek gospodarza ssaka. Promastygoty mają wydłużony kształt o szerokości około 1,5 µm i długości 20 µm, z wicią zazwyczaj wychodzącą...

Tutaj prezentujemy skompilowany protokół do oceny infekcji skórnej myszy Leishmania amazonensis. Jest to wiarygodna metoda badania zjadliwości pasożytów, pozwalająca na systemowy wgląd w reakcję kręgowców gospodarza na infekcję.

Zakażenie in vivo Leishmania amazonensis w celu oceny zjadliwości pasożyta u myszy

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

Protokół ten jest odpowiedni do badania zjadliwości Leishmania, ponieważ zapewnia systemowy obraz kręgowców, u których dochodzi do zakażenia skórnego. Główną zaletą przyjęcia tego protokołu jest to, że pozwala on naukowcom na jednoczesną ocenę odpowiedzi zapalnej gospodarza i replikacji pasożyta. Metoda ta może być wykorzystana do scharakteryzowania kilku celów i metod leczenia związanych ze zjadliwością, co może przynieść nowe informacje na temat kontroli leiszmaniozy skórnej.Może być również stosowany do innych szczepów myszy i gatunków Leishmania, które powodują leiszmaniozę skórną. Ten test składa się z kilku krytycznych etapów, takich jak wymaganie przeszkolonego personelu, który czuje się komfortowo w pracy z myszami i ma doświadczenie w wykonywaniu zastrzyków podpodeszwowych, aby uniknąć przypadkowego narażenia na materiał zakaźny. Procedurę zademonstruje dr Ricardo Zampieri, technik z mojego laboratorium.Zacznij od uprawy promastigotów L.amazonensis w kolbie do hodowli komórkowej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych, zawierającej 10 mililitrów pożywki, przez trzy dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po inkubacji odpipetować pięć mililitrów logarytmicznej kultury pro

in-vivo-infection-with-leishmania-amazonensis-to-evaluate-parasite

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System obrazowania in vivo jest wykorzystywany do generowania pomiarów ilościowych zakażenia myszy pierwotniakiem z grupy Trypanosomatidów, Leishmania. Jest to nieinwazyjna i nieletalna metoda wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję lucyferazy w wielu tkankach w przebiegu przewlekłej infekcji Leishmania spp.

Obrazowanie in vivo transgenicznych pasożytów Leishmania u żywego gospodarza

Optymalizacja eksperymentalnego modelu chomika w leiszmaniozie skórnej poprzez wstrzyknięcie promastigot Leishmania do skóry grzbietu. Podejście to jest przydatne podczas inokulacji, obserwacji, charakteryzacji zmian, stosowania leczenia oraz pobierania próbek klinicznych. Zachowane zostają zdolność poruszania się, poszukiwanie pokarmu i wody, zabawa oraz aktywności społeczne.

Leiszmanioza skóry na grzbietowej skórze chomików: użyteczny model do przesiewowych badań leków przeciwleiszmanialnych

Ten film bada zjadliwość Leishmanii poprzez traktowanie makrofagów metacyklicznymi promastigotami, co prowadzi do powstania wewnątrzkomórkowych amastigotów. Potwierdzenie zjadliwości Leishmania uzyskuje się poprzez barwienie barwnikiem fluorescencyjnym kwasem nukleinowym. Ta wiedza może przyczynić się do opracowania nowych metod leczenia leiszmaniozy.

Ocena zjadliwości Leishmania w hodowlanych makrofagach

Ten film demonstruje test do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożytów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Komórki makrofagów są zakażone ruchliwymi i nieruchliwymi stadiami inwazyjnymi Leishmania, odpowiednio promastigotykami metacyklicznymi i amastigotami. Pasożyty atakują makrofagi, uwewnętrzniając się w parazytoforycznej wakuoli i namnażając się w środku. Wewnątrzkomórkowy wzrost pasożyta określa się ilościowo za pomocą mikroskopu po fluorescencyjnym...

Test in vitro w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożyta w makrofagach

Ten artykuł opisuje szczegółową metodę dynamicznego pomiaru i kwantyfikacji prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych układu krwionośnego wątroby myszy przy użyciu obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym w połączeniu ze specyficzną metodologią pozyskiwania i analizy obrazów.

Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Wszystkie chorobotwórcze gatunki Leishmania rezydują i rozmnażają się wewnątrz makrofagów swoich kręgowców gospodarzy. W tym miejscu przedstawiamy protokół infekowania mysich makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w hodowli Leishmania, a następnie precyzyjne określenie ilościowe kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego. Metoda ta jest przydatna do badania poszczególnych czynników wpływających na interakcję gospodarz-patogen i zjadliwość Leishmania.

Kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów Leishmania

Tutaj prezentujemy podłużną ocenę chomików złocistych zakażonych dootrzewnowo (IP) lub dodziąsłowy (IG) L. infantum-Luc za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i PCR. Chomiki oceniano 1 dzień po zakażeniu (1 dpi), 1 tydzień po zakażeniu (8 dpi) i 3 tygodnie po zakażeniu (22 dpi) i usypano w 50. dpi i 8 miesięcy po zakażeniu.

In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy

Strongyloides ratti to pasożytniczy nicień, który powoduje przejściowe infekcje u myszy laboratoryjnych, wykazując migrację tkanek i etapy życia jelitowego. W tym miejscu przedstawiamy protokół utrzymania cyklu pasożytniczego u szczurów i eksperymentalnego zakażenia myszy, w tym kwantyfikację pasożytów w głowie, płucach i jelicie.

Eksperymentalne zakażenie myszy pasożytniczym nicieniem Strongyloides ratti

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Opracowano zoptymalizowany test ratowania i transformacji pasożytów z komórek THP1 zainfekowanych in vitro za pomocą Leishmania donovani w celu przesiewania leków przeciwleiszmaniowych. Test ten obejmuje różnicowanie komórek THP1, infekcję promastigotami, traktowanie badanymi lekami, kontrolowaną lizę zainfekowanych makrofagów, ratowanie amastigot, ich transformację w promastigoty oraz monitorowanie wzrostu i proliferacji promastigot za pomocą testu fluorometrycznego.

Test ratowania i transformacji pasożytów do przesiewania leków przeciwleiszmaniowych przeciwko wewnątrzkomórkowym amastigotom Leishmania donovani w ludzkiej linii komórkowej ostrej białaczki monocytycznej THP1

Poznaj metodę zakażenia in vivo Leishmania amazonensis w celu oceny zjadliwości pasożyta u myszy. Protokół umożliwia jednoczesną analizę odpowiedzi zapalnej gospodarza i replikacji pasożyta.

Zakażenie in vivo Leishmania amazonensis w celu oceny zjadliwości pasożyta u myszy

Przeglądaj więcej filmów