Name: Badania przesiewowe w kierunku inhibitorów pirofosfatazy związanych z błoną Thermotoga maritima (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę przesiewową identyfikacji inhibitorów pirofosfatazy związanych z błoną Thermotoga maritima przy użyciu reakcji molibdenowej w formacie 96-well. Protokół ten jest prosty, ekonomiczny i stabilny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Fundacji Jane i Aatos Erkko oraz BBSRC (BB/M021610) dla Adriana Goldmana, Akademii Fińskiej (nr 308105) dla Keni Vidilaseris, (nr 310297) dla Henri Xhaarda i (nr 265481) dla Jari Yli-Kauhaluoma, oraz Funduszy Badawczych Uniwersytetu Helsińskiego dla Gustava Boije af Gennäsa. Autorzy dziękują Bernadette Gehl za jej pomoc techniczną podczas realizacji projektu.

1. Przygotowanie białka
UWAGA: Ekspresja i oczyszczanie TmPPase zostały opisane w innej publikacji13.
<ol>
	<li>Przygotować 10 mL roztworu buforu do reaktywacji zawierającego 20 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) pH 6.5, 3,5% (v/v) glicerolu, 2 mM ditiotreitolu (DTT) oraz 0,05% dodecylomaltosydy (DDM).</li>
	<li>Przygotować 10 mL mieszaniny reakcyjnej zawierającej 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8,0 mM MgCl2, 333 mM KCl i 67 mM NaCl. 
	UWAGA: Mg2+ jest niezbędny do chelatowania pirofosforanu jako substratu mPPase, K+ jest wymagany do zwiększenia aktywności enzymatycznej, ponieważ TmPPase jest mPPase zależną od potasu, a Na+ jest potrzebny do aktywności enzymu podczas translokacji jonów sodu przez TmPPase.</li>
	<li>Przygotować liposomy o stężeniu 30 mg/mL do reaktywacji enzymu.
	<ol>
		<li>Dodać 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8.0 z 1 mM DTT do 0,3 g L-α-fosfatydylocholiny z soi w 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8.0 z 1 mM DTT.</li>
		<li>Umieścić liposomy w lodzie i poddać sonikacji z 1-sekundowymi impulsami przez 1 minutę, zrobić 1-minutową przerwę i powtarzać czynność, aż roztwór stanie się przezroczysty i żółty.</li>
		<li>Rozdzielić liposomy na alikwoty, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zreaktywować enzym.
	<ol>
		<li>Wymieszać 40 µL roztworu liposomów z 22,5 µL 20% DDM.</li>
		<li>Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 55 °C przez 15 min, a następnie pozwolić jej ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Dodać 36,5 µL roztworu buforu do reaktywacji, wymieszać i dodać 1 µL stężonego białka (13 mg/mL), aby uzyskać całkowite stężenie 0,13 mg/mL. 
		UWAGA: Białko jest zazwyczaj mrożone w alikwotach po 10 µL po oczyszczeniu i rozmrażane na lodzie przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odlać 20 µL zreaktywowanego enzymu i dodać do 1 480 µL mieszaniny reakcyjnej, a następnie delikatnie wymieszać. 
	UWAGA: Dodanie zreaktywowanego enzymu do mieszaniny reakcyjnej powinno zostać wykonane bezpośrednio przed użyciem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie związku
<ol>
	<li>Rozpuścić związki w dimetylosulfoksydzie (DMSO), aby przygotować roztwory zapasowe o stężeniu 25−100 mM w objętości 50−200 µL, zależnie od dostępności związków. 
	UWAGA: Wszystkie użyte tutaj związki (Rysunek 2A) zostały opisane w poprzednich publikacjach9. Jeśli rozpuszczalność związku jest niska, stężenie zapasowe można odpowiednio dostosować.</li>
	<li>Przygotować trzy różne stężenia każdego związku w wodzie. 
	UWAGA: Końcowe stężenia w mieszaninie reakcyjnej wyniosą odpowiednio 1, 5 i 50 mikromol na litr dla związków dobrze rozpuszczalnych oraz 1, 5 i 20 mikromol na litr dla związków słabo rozpuszczalnych.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć roztwór zapasowy wodą do 1 mL w mikroprowetkach, aby uzyskać stężenia 2 µM, 10 µM i 100 µM dla związków rozpuszczalnych lub alternatywnie 2 µM, 10 µM i 40 µM dla związków słabo rozpuszczalnych.</li>
		<li>Niezwłocznie po rozcieńczeniu roztworu zapasowego wymieszać roztwór związku za pomocą wortexa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdzić obecność agregatów związków za pomocą nefelometru. 
	UWAGA: Badanie przeprowadzono w trzech powtórzeniach dla trzech stężeń (1 µM, 5 µM i 20 µM) i znormalizowano względem próbki ślepej na płytce 96-dołkowej.
	<ol>
		<li>Napełnić każdy dołek 75 µL mieszaniny reakcyjnej przy użyciu pipety wielokanałowej.</li>
		<li>Dodać 75 µL każdego związku (w przypadku próbki ślepej użyć 75 µL wody) i wymieszać, pipetując w górę i w dół 5×.</li>
		<li>Zmierzyć każdy dołek przy napięciu 300 V za pomocą mikropłytkowego nefelometru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Odczynniki do przygotowania testu
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu arsenitu-cytrynianu.
	<ol>
		<li>Odważyć 5 g arsenitu sodu i 5 g cytrynianu trisodu dwuwodnika. 
		OSTRZEŻENIE: Arsenit sodu jest toksyczny, dlatego należy stosować odpowiedni sprzęt ochronny i obchodzić się z nim ze szczególną ostrożnością. W ramach środków ostrożności nie należy go używać, dopóki wszystkie niezbędne zasady bezpieczeństwa nie zostaną przeczytane i zrozumiane. Pracować wyłącznie w dygestorium, aby uniknąć wdychania pyłów/oparów związku lub jego roztworów. W przypadku wdychania przenieść poszkodowanego na świeże powietrze i wezwać pomoc medyczną. Nosić odpowiednie gogle ochronne, rękawice i odzież ochronną, aby uniknąć połknięcia oraz kontaktu z oczami/skórą. W przypadku połknięcia natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. W przypadku kontaktu ze skórą lub oczami przemyć obficie wodą i wezwać pomoc medyczną.</li>
		<li>Rozpuścić w 100 mL wody.</li>
		<li>Dodać 5 mL lodowatego kwasu octowego, wymieszać i uzupełnić wodą do objętości 250 mL.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. 
		UWAGA: Roztwór jest stabilny przez ponad rok.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu A i roztworu B.
	<ol>
		<li>W celu przygotowania roztworu A dodać 10 mL lodowatego 0.5 M HCl do 0.3 g kwasu askorbinowego. Rozpuścić kwas askorbinowy za pomocą vortexu.</li>
		<li>W celu przygotowania roztworu B dodać 1 mL lodowatej wody do 70 mg heptamolibdanu amonu tetrahydratu i wymieszać na vortexie do rozpuszczenia. 
		UWAGA: Oba roztwory należy przechowywać w lodzie do momentu użycia. Dla zachowania spójności wyników analizy oba roztwory można przechowywać w lodzie maksymalnie przez jeden tydzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie standardów fosforanowych (Pi) o stężeniach 0 µM, 62.5 µM, 250 µM i 500 µM do kalibracji.
	<ol>
		<li>Dodać odpowiednio 0 µL, 25 µL, 50 µL i 100 µL 5 mM Na2HPO4 dwuwodnika do czterech mikroprobówek zawierających 370 µL mieszaniny reakcyjnej.</li>
		<li>Uzupełnić wodą do objętości 1 mL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza aktywności dla jednej płytki 96-dołkowej
UWAGA: Schematyczny przebieg analizy przedstawiono na Rysunku 1.
<ol>
	<li>Do 10 mL roztworu A dodać 1 mL roztworu B, wymieszać za pomocą wortexa i przechowywać roztwór w lodzie. 
	UWAGA: Roztwór ten powinien być przejrzysty i żółty. Roztwór A + B należy przechowywać w lodzie przez co najmniej 30 min przed użyciem. Należy jednak zużyć roztwór w ciągu 3 h, ponieważ ulegnie on degradacji po długotrwałym przechowywaniu.</li>
	<li>Do pasków z probówkami nanieść w trzech powtórzeniach po 40 µL standardów Pi o stężeniach 0 µM, 62,5 µM, 250 µM i 500 µM, używając pipety wielokanałowej. 
	UWAGA: Mieszanina reakcyjna bez dodatku Pi będzie służyć jako ślepa próba.</li>
	<li>Do pasków z probówkami nanieść 25 µL roztworu związku za pomocą pipety wielokanałowej. 
	UWAGA: Dla każdego związku zastosowano trzy różne stężenia w trzech powtórzeniach, co jest wystarczające do wstępnej oceny połowy stężenia hamującego maksymalnie (IC50). Do dokładniejszego wyznaczenia IC50 można użyć ośmiu różnych stężenia związku. W przypadku enzymu niehamowanego roztwór związku zastępuje się równą ilością wody. Jako kontrole pozytywne zastosowano sól sodową imidodifosforanu (IDP) w stężeniach 2,5 µM, 25 µM i 250 µM.</li>
	<li>Do pasków z probówkami (z wyjątkiem tych zawierających standard Pi) nanieść 15 µL mieszaniny roztworu mPPase za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Uszczelnić paski z probówkami za pomocą folii uszczelniającej. Odciąć folię, aby oddzielić poszczególne paski.</li>
	<li>Próbki inkubować wstępnie przez 5 min w temperaturze 71 °C. Próbki umieszczać na bloku grzewczym w odstępach 20 s między poszczególnymi paskami, aby zminimalizować czas trwania kolejnych etapów.</li>
	<li>Dla każdego paska usunąć folię uszczelniającą. Dodać 10 µL 2 mM pirofosforanu sodu dwuzasadowego za pomocą pipety wielokanałowej i wymieszać, pipetując w górę i w dół 5 razy. Ponownie uszczelnić pasek z probówkami tą samą folią. 
	UWAGA: Ten etap może być początkowo trudny do wykonania w ciągu 20 s; stanie się on jednak łatwiejszy po przeprowadzeniu kilku analiz.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 71 °C przez 5 min.</li>
	<li>Próbki umieszczać na urządzeniu chłodzącym w odstępach 20 s między poszczególnymi paskami. Chłodzić przez 10 min, przy czym każdy pasek należy krótko odwirować po 5 min chłodzenia, aby odprowadzić krople wody pod folię uszczelniającą, następnie ponownie umieścić w urządzeniu chłodzącym i usunąć folię. 
	UWAGA: Urządzenie chłodzące można wykonać po prostu umieszczając płytkę PCR 96-dołkową na polistyrenowej szalce Petriego (wymiary 150 mm × 15 mm) wypełnionej wodą i zamrożonej przez co najmniej 1 h. Urządzenie należy wyjąć z zamrażarki około 5 min przed rozpoczęciem analizy. Nie należy wyjmować urządzenia chłodzącego bezpośrednio przed chłodzeniem próbek, ponieważ zamrozi ono mieszaninę reakcyjną i utrudni rozwój barwy.</li>
	<li>Po 10 min chłodzenia dodać 60 µL roztworu A + B, wymieszać, pipetując w górę i w dół 5 razy, i pozostawić paski z probówkami w urządzeniu chłodzącym na 10 min.</li>
	<li>Dodać 90 µL roztworu arsenianu-cytrynianu i pozostawić w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 min, aby uzyskać trwały niebieski kolor. 
	OSTROŻNIE: Ze względu na toksyczność wszystkie roztwory zawierające arsenian sodu należy przez cały czas obchodzić się z wyjątkową ostrożnością. W związku z tym dodawanie roztworu arsenianu-cytrynianu powinno odbywać się w dygestorium.</li>
	<li>Przenieść 180 µL każdej mieszaniny reakcyjnej do przezroczystej polistyrenowej mikropłytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję każdego dołka przy 860 nm za pomocą spektrofotometru do mikropłytek.</li>
</ol>
5. Analiza wyników
<ol>
	<li>Oblicz średnią z trzech powtórzeń dla każdej próbki oraz wartość Pi standardy. Następnie odjąć wartość próbki ślepej, aby wyeliminować sygnał tła.</li>
	<li>Stwórz krzywą kalibracyjną, nanosząc absorbancję (A860) wartości w funkcji ilości Pi standardu (nmol) i przeprowadź regresję liniową, aby uzyskać funkcję linii trendu, korzystając z następującego wzoru: 
	<img alt="Równanie absorbancji A&lt;sub&gt;860&lt;/sub&gt;=mP&lt;sub&gt;i&lt;/sub&gt;+b, wzór analizy spektroskopii optycznej." src="/files/ftp_upload/60619/60619equ01a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"></li>
	<li>Oblicz ilość fosforanu (nmol) uwolnionego w reakcji enzymatycznej na podstawie powyższego wzoru regresji liniowej.</li>
	<li>Oblicz aktywność właściwą, korzystając z następującego wzoru: 
	<img alt="Równanie aktywności właściwej; kinetyka enzymatyczna; wzór na pomiar aktywności enzymu." src="/files/ftp_upload/60619/60619equ02a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> 
	gdzie nPi jest ilością fosforanu uwolnionego w reakcji (nmol), t jest czasem reakcji (min), a mTmPPaza jest ilością czystej TmPPazy użytej w teście (mg).</li>
	<li>Oblicz procentową aktywność dla każdego stężenia inhibitora, korzystając z następującego wzoru: 
	<img alt="Wzór na procentową aktywność; % aktywności = (SAi/SAun) × 100%; równanie analizy biochemicznej." src="/files/ftp_upload/60619/60619equ03a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"> 
	gdzie SAi ijest aktywność właściwa próbki z inhibitorem i SAProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. jest aktywnością właściwą próbki niehamowanej.</li>
	<li>Oblicz logIC5050 (szacunek) i IC50 (oszacować) za pomocą dopasowania regresji nieliniowej z czteroparametrowej krzywej dawka-odpowiedź, korzystając z następującego wzoru: 
	<img alt="Wzór regresji logistycznej, Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)*HillSlope))." src="/files/ftp_upload/60619/60619equ04a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 4"> 
	gdzie X to logarytm stężenia ( µM), Y to aktywność (%), Top i Bottom to plateau w tej samej jednostce co Y (odpowiednio 100% i 0%), logIC50 ma te same jednostki logarytmiczne co X, a HillSlope = współczynnik nachylenia lub nachylenie funkcji Hilla, które jest bezwymiarowe. 
	UWAGA: Oprogramowanie (Tabela materiałów) jest wykorzystywany do dopasowania. Należy użyć stężenia 0.01 µM (zamiast 0.00 µM) dla próbki bez inhibitora, ponieważ logarytm z zera nie jest określony.</li>
</ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+research+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li>
<li>Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+pyrophosphatases%3A+a+novel+drug+target+for+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens.</a> AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).</li>
<li>Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrophosphate-Fueled+Na%2B+and+H%2B+Transport+in+Prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).</li>
<li>Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-PPases%3A+yesterday%2C+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">H+-PPases: yesterday, today and tomorrow.</a> IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuolar-H%2B-pyrophosphatase+%28TgVP1%29+is+required+for+microneme+secretion%2C+host+cell+invasion%2C+and+extracellular+survival+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).</li>
<li>Lemercier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyrophosphatase+regulating+polyphosphate+metabolism+in+acidocalcisomes+is+essential+for+Trypanosoma+brucei+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).</li>
<li>Belogurov, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+pyrophosphatase+of+Thermotoga+maritima+requires+sodium+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity.</a> Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).</li>
<li>Vidilaseris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+in+catalysis+by+Thermotoga+maritima+membrane-bound+pyrophosphatase+demonstrated+by+a+nonphosphorus+allosteric+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor.</a> Science Advances. 5 (5), (2019).</li>
<li>Lin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+membrane-embedded+H%2B-translocating+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase.</a> Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).</li>
<li>Fiske, C. H., Subbarow, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+colorimetric+determination+of+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The colorimetric determination of phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).</li>
<li>Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molybdenum+blue+reaction+for+the+determination+of+orthophosphate+revisited%3A+Opening+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box.</a> Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).</li>
<li>Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+and+purification+of+membrane-bound+pyrophosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases.</a> Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).</li>
<li>Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+orthophosphate+determination+of+thermostable+membrane-bound+pyrophosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity.</a> Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).</li>
<li>He, Z. Q., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+in+Soil+Science+and+Plant+Analysis%22%5BJournal%5D)">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).</li>
<li>Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorinated+tyrosine+phosphates+to+probe+the+substrate+specificity+of+the+low+molecular+weight+phosphatase+activity+of+calcineurin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).</li>
<li>Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+strategy+to+determine+the+dependence+of+membrane-bound+pyrophosphatases+on+K%2B+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor.</a> Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół prostego badania przesiewowego inhibitorów pirofosfatazy związanej z błoną T. maritima w formacie płytki 96-dołkowej na podstawie Vidilaseris i wsp.14. Protokół ten jest niedrogi i oparty na kwasie 12-fosfomolibdenowym, który jest tworzony z ortofosforanu i molibdenianu w kwaśnych warunkach i redukowany do form fosfomolibdenu o wyraźnym niebieskim kolorze12. Ta metoda jest preferowana w stosunku do innych protokołów,...

Około 25% wszystkich białek komórkowych to białka błonowe, a około 60% z nich to cele leków1,2. Jednym z potencjalnych celów leków3, pirofosfatazy związane z błoną (mPPazy), to dimeryczne enzymy, które pompują proton i/lub jon sodu przez błonę poprzez hydrolizę pirofosforanu do dwóch ortofosforanów4. MPPazy można znaleźć w różnych organizmach5, takich jak bakterie, archeony, rośliny i pasożyty protistów, z wyjątkiem ludzi i zwierząt4. U pasożytów protistów, na przykład Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii i Trypanosoma brucei, mPPazy są niezbędne dla zjadliwości pasożytów6, a nokaut tego wyrażenia u pasożytów prowadzi do niepowodzenia w utrzymaniu wewnątrzkomórkowego pH po ekspozycji na zewnętrzne podstawowe pH 7. Ze względu na ich znaczenie i brak homologicznego białka obecnego u kręgowców, mPPazy mogą być uważane za potencjalne cele leków na choroby protistalne3.
Badania in vitro inhibitorów mPPazy w tej pracy opierają się na systemie modelowym TmPPazy. TmPPaza jest pompującą jonami sodu i zależną od jonów potasu mPPazą z T. maritima i ma optymalną aktywność w temperaturze 71 °C8. Zaletami tego enzymu są na przykład łatwość produkcji i oczyszczania, dobra stabilność termiczna i wysoka aktywność właściwa. TmPPaza wykazuje zarówno wysokie podobieństwo, jak i pełne zachowanie pozycji, jak i identyczność wszystkich reszt katalitycznych do protistycznych mPPaz3,9 oraz do rozwiązanej struktury Vigna radiata10 mPPase. Dostępne struktury TmPPazy w różnych konformacjach są również przydatne w eksperymentach z projektowaniem leków w oparciu o strukturę (jako wirtualne badania przesiewowe i projektowanie de novo).
Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół badań przesiewowych inhibitorów TmPPazy w formacie płytki 96-dołkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Protokół opiera się na metodzie kolorymetrycznej reakcji błękitu molibdenowego, która została po raz pierwszy opracowana przez Fiske i Subbarow11. Metoda ta polega na wytworzeniu kwasu 12-fosfomolibdenowego z ortofosforanu i molibdenianu w warunkach kwaśnych, który następnie jest redukowany do uzyskania charakterystycznych gatunków fosfomolibdenu o niebieskim zabarwieniu12.

<table><tbody><tr><td>Samoprzylepny arkusz uszczelniający</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat heptamolibdenianu amonu</td><td>Merck</td><td>F1412481 636</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95212-250G</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96Well Multidish</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Merck</td><td>1167431000</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowe paski probówki do PCR 0,2 ml bez nakrętek (120)</td><td>Nippon genetics</td><td>FG-028</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl maltozyd (DDM)</td><td>Melford</td><td>B2010-100G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1009901001</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Merck</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidodifosforan sodu sól</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0631-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydylocholina z lecytyny sojowej</td><td>Sigma</td><td>429415-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8147330500</td><td></td></tr><tr><td>Multiplate 96-dołkowe płytki PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9651</td><td></td></tr><tr><td>MultiSkan</td><td>Go Thermo Scientific</td><td>10680879</td><td></td></tr><tr><td>Nepheloskan Ascent (Typ 750)</td><td>Labsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowa szalka Petriego (rozmiar 150 mm x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5981-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td> Oprogramowanie <td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>Blok grzewczy GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QBT2</td><td>Grant Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meta-arsenin sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td></td><td></td>12897692</tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Pi)</td><td>Sigma</td><td>S0876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Fluka</td><td>71501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy dwuwodny</td><td>Fluka</td><td>71404-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe w kierunku inhibitorów pirofosfatazy związanych z błoną thermotoga maritima

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Pirofosfatazy związane z błoną (mPPazy) to dimeryczne enzymy, które występują w bakteriach, archeonach, roślinach i pasożytach protistów. Białka te rozszczepiają pirofosforan na dwie cząsteczki ortofosforanu, które są sprzężone z protonem i/lub jonami sodu pompowanymi przez błonę. Ponieważ u zwierząt i ludzi nie występują białka homologiczne, mPPazy są dobrymi kandydatami do projektowania potencjalnych celów leków. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół badań przesiewowych w kierunku inhibitorów mPPazy wykorzystujących reakcję błękitu molibdenowego w systemie 96-dołkowym. Jako enzym modelowy używamy mPPazy z ciepłolubnej bakterii Thermotoga maritima (TmPPaza). Ten protokół jest prosty i niedrogi, zapewniając spójny i solidny wynik. Wypełnienie protokołu oznaczania aktywności zajmuje tylko około jednej godziny od rozpoczęcia testu do pomiaru absorbancji. Ponieważ niebieski kolor uzyskany w tym teście jest stabilny przez długi czas, kolejne testy można przeprowadzić natychmiast po poprzedniej partii, a absorbancję można zmierzyć później dla wszystkich partii jednocześnie. Wadą tego protokołu jest to, że jest on wykonywany ręcznie, a zatem może być wyczerpujący, a także wymagać dobrych umiejętności pipetowania i pomiaru czasu. Ponadto roztwór cytrynianu arsenitu stosowany w tym teście zawiera arsenin sodu, który jest toksyczny i należy obchodzić się z nim z zachowaniem niezbędnych środków ostrożności.

W niniejszym protokole przetestowano osiem związków (1−8) (Rycyna 2A) wraz z IDP, powszechnie stosowanym inhibitorem pirofosfataz, jako kontrolą dodatnią. Każdy związek badano w trzech różnych stężeniach (1 µM, 5 µM i 20 µM) w trzech powtórzeniach. Schemat przebiegu przesiewania przedstawiono na Rycynie 1, obejmując etapy od przygotowania próbek i odczynników aż po pomiar absorbancji przy 860 nm.
Pod koniec tego protokołu, po dodaniu ...

Tutaj prezentujemy metodę przesiewową dla inhibitorów pirofosfatazy związanej z błoną (z Thermotoga maritima) opartą na reakcji błękitu molibdenowego w formacie płytki 96-dołkowej.

Badania przesiewowe w kierunku inhibitorów pirofosfatazy związanych z błoną Thermotoga maritima

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Nasz protokół działa jako narzędzie do znajdowania związków, które hamują deaktywność pirofosfatazy związanej z błoną. A te inhibitory mogą być stosowane w leczeniu wielu chorób pasożytniczych. Protokół ten jest tani i prosty, zapewniając stabilny kolor przez długi czas, nie wykazując żadnych zakłóceń w obecności wysokiego stężenia fosfolipidów wymaganego do reaktywacji enzymów.Przygotować 10 mililitrów roztworu buforowego reaktywacji, zawierającego 20 milimolowych MES o pH 6,5, 3,5% objętości glicerolu, dwa milimolowe DTT i 0,05% D-D-M. Przygotować 10 mililitrów mieszalnika reakcyjnego, zawierającego 200 milimolowy chlorowodorek tris o pH ośmiu. Ośmiomilimolowy chlorek magnezu, 333 milimolowy chlorek potasu i 67-milimolowy chlorek sodu.Aby przygotować 30 miligramów na mililitr liposomów do reaktywacji enzymów. Najpierw dodaj 10 mililitrów 20 milimolowych chlorowodorku tris o pH ośmiu, z jednym milimolowym DTT do 0,3 grama L alfa fosfatydylocholiny z soi. Umieść liposom na lodzie i sonikuj w jednosekundowych odstępach przez jedną minutę.Zatrzymaj się na minutę i powtarzaj, aż roztwór stanie się przezroczysty żółty. Podwielokrotnie liposomów w 100 mikrolitrach, ciekły azot zamrozić i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu użycia. Aby reaktywować enzym, rozmrozić roztwór liposomu w temperaturze pokojowej.Wymieszaj 40 mikrolitrów roztworu liposomu z 22,5 mikrolitrami 20% D-D-M. Trzymaj mieszaninę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 15 minut. I pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.Następnie dodać 36,5 mikrolitra roztworu buforu reaktywacyjnego. I dodaj jeden mikrolitr skoncentrowanego białka, aby uzyskać całkowite stężenie 0,13 miligrama na mililitr. Następnie przenieś 20 mikrolitrów reaktywowanego enzymu do 1480 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej.Delikatnie wymieszaj i natychmiast zużyj. Najpierw rozpuść związki w D-M-S-O, aby uzyskać roztwory podstawowe 50 milimolów w 200 mikrolitrach. W przypadku związków rozpuszczalnych rozcieńczyć roztwór podstawowy wodą do jednego mililitra w mikroprobówkach, aby uzyskać dwa, 10 i 100 mikromolów.Dla każdego rozcieńczenia należy zmieszać roztwór związku w celu prawidłowego wymieszania. Następnie sprawdź, czy nie ma dywergacji związków i za pomocą pipety wielokanałowej dozuj 75 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce. Dodać 75 mikrolitrów każdego związku i wodę jako kontrolę w trzech egzemplarzach i wymieszać, pipetując w górę i w dół pięć razy.Zmierz każdą studzienkę przy napięciu 300 woltów za pomocą nefelometru z mikropłytką. Aby przygotować roztwór cytrynianu arsenitu, odważ pięć gramów arsenianu sodu i pięć gramów dwuwodnego cytrynianu trisodowego, rozpuść oba związki w 100 mililitrach wody. Następnie dodaj pięć mililitrów lodowatego kwasu octowego.Wymieszaj i dodaj wodę do 250 mililitrów, przechowuj w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Następnie przygotuj roztwór A, dodając 10 mililitrów lodowatego 0,5 molowego kwasu solnego do 0,3 grama kwasu askorbinowego Rozpuść kwas askorbinowy przez wirowanie. Przygotuj roztwór B, dodając jeden mililitr lodowatej wody do 70 miligramów tetratiomolibdenianu amonu tetrahydratu i wiruj do rozpuszczenia.Roztwór A i B należy przechowywać na lodzie. Aby przygotować wzorzec fosforanowy o stężeniu zero, 62,5, 250 i 500 mikromolowych do kalibracji. Dodaj zero mikrolitrów, 12,5 mikrolitrów, 50 mikrolitrów i 100 mikrolitrów 5 milimolowego dihydratu fosforanu disodowego do czterech mikroprobówek zawierających 370 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej.Uzupełnij wodą do jednego mililitra. Teraz dodaj jeden mililitr roztworu B do 10 mililitrów roztworu A, wymieszaj ręcznie i przechowuj roztwór na lodzie. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 40 mikrolitrów wzorca fosforanu zero, 62,5, 250 i 500 mikromolowego do skryptów probówek w trzech powtórzeniach.Następnie dodaj 25 mikrolitrów roztworu złożonego i 15 mikrolitrów mieszaniny roztworu M-P-P-A z każdej probówki. Z wyjątkiem probówek zawierających wzorzec fosforanowy. Uszczelnij paski rur za pomocą samoprzylepnego arkusza uszczelniającego.Wytnij arkusz uszczelniający, aby oddzielić każdy pasek rury. Następnie należy wstępnie inkubować próbkę przez pięć minut w temperaturze 71 stopni Celsjusza. Umieścić próbkę na bloku grzewczym w 20-sekundowych odstępach między każdym paskiem.Dla każdego paska otwórz uszczelkę samoprzylepną. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 mikrolitrów dwuzasadowego molowego pirofosforanu sodu. I mieszać, pipetując w górę i w dół przez pięć razy.Ponownie uszczelnij taśmę rurową za pomocą tego samego uszczelnienia. Ponownie inkubować w temperaturze 71 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie umieścić próbki w aparacie chłodzącym w 20-sekundowym odstępie między każdym paskiem.Pozwól im ostygnąć przez pięć minut, a następnie krótko odwiruj każdy pasek, aby zdekantować krople wody pod arkuszem uszczelniającym. Włóż pasek z powrotem do aparatu chłodzącego, usuń uszczelkę i pozwól im ostygnąć przez kolejne pięć minut. Następnie dodać 60 mikrolitrów roztworu A i B, mieszać pipetując w górę i w dół przez pięć razy i trzymać paski probówek na aparacie chłodzącym jeszcze przez 10 minut.W dygestorium dodaj 90 mikrolitrów roztworu cytrynianu arsenu i trzymaj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Aby uzyskać stabilny niebieski kolor. Dozować 180 mikrolitrów każdej mieszaniny reakcyjnej do przezroczystej 96-dołkowej mikropłytki polistyrenowej.Użyj spektrofotometru z mikropłytkami, aby zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy 860 nanometrach. W tym protokole przetestowano osiem związków razem z I-D-P, powszechnym inhibitorem pirofosfatazy jako kontrolą pozytywną. Po dodaniu roztworu A i B oraz cytrynianu arsenitu kolor niebieski w ciągu 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej.Wszystkie trzy stężenia związków niehamujących wykazywały tę samą intensywność koloru niebieskiego. Jak również E-1 do E-3 bez żadnego inhibitora. Wykres aktywności enzymatycznej w stosunku do stężenia każdego badanego związku, pokazuje, że związek o aktywności inhibicyjnej utworzył nieliniowe dopasowanie krzywej.Wykres I-D-P jako kontroli pozytywnej wyraźnie pokazuje spadek aktywności przy wyższych stężeniach. Krzywa inhibicji dla związków jeden, pięć, sześć, siedem i osiem. Wykazuje połowę maksymalnych stężeń hamujących odpowiednio przy 1,7 mikromola, 21,4 mikromola, 58,8 mikromola, 239,0 mikromola i powyżej 500 mikromola.Pamiętaj o przygotowaniu roztworu M-P-P-A. Tuż przed rozpoczęciem testu.

screening-for-thermotoga-maritima-membrane-bound-pyrophosphatase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opracowano nową metodę ewolucji kierowanej, specyficzną dla dziedziny inżynierii termostabilności, a następnie zwalidowano ją dla enzymów bakteriolitycznych. Po zaledwie jednej rundzie mutagenezy losowej ewoluowany enzym bakteriolityczny, PlyC 29C3, wykazał ponad dwukrotnie wyższą aktywność resztkową w porównaniu z białkiem typu dzikiego po inkubacji w podwyższonej temperaturze.

Nowa metoda przesiewowa dla ewolucji sterowanej termostabilnych enzymów bakterio();tycznych

Źródło: Vidilaseris, K., et al. Badania przesiewowe w kierunku inhibitorów pirofosfatazy związanych z błoną Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia test kolorymetryczny do badania przesiewowego inhibitorów pirofosfatazy związanej z błoną bakteryjną (mPPazy) poprzez ilościowe określenie uwalniania ortofosforanu. Metoda umożliwia identyfikację związków hamujących mPPazę z Thermotoga maritima, potencjalnego celu dla leków przeciwdrobnoustrojowych.

Przesiewowe inhibitory pirofosfatazy związanej z błoną bakteryjną za pomocą testu kolorymetrycznego 

Niniejszy raport opisuje test enzymatyczny in vitro do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy przy użyciu ekstraktów z komórek Leishmania. Test ten opiera się na przeniesieniu radioaktywnej grupy metylowej z S-[metylo-3] H]adenozylo-L-metioniny do endogennej fosfatydyloetanoloaminy.

In vitro Test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Sygnalizacja receptora Toll-podobnego (TLR) odgrywa ważną rolę w patofizjologii wielu chorób zapalnych u ludzi, a regulacja odpowiedzi TLR przez bioaktywne nanocząstki jest korzystna w wielu stanach zapalnych. Komórki reporterowe oparte na komórkach THP-1 stanowią wszechstronną i solidną platformę przesiewową do identyfikacji nowych inhibitorów sygnalizacji TLR.

Badania przesiewowe bioaktywnych nanocząstek w fagocytarnych komórkach odpornościowych pod kątem inhibitorów sygnalizacji receptora toll-podobnego

Ten protokół został opracowany do badania przejścia dimery-dodekameru TmPep1050, aminopeptydazy M42, na poziomie strukturalnym. Jest to prosty proces obejmujący proces od oczyszczania białek po przetwarzanie danych rentgenowskich. Krystalogeneza, indeksacja zbioru danych i wymiana molekularna zostały podkreślone na przykładzie wariantu TmPep1050H60A H307A.

Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

Możliwość oceny zaangażowania inhibitorów kandydatów w komórkach nienaruszonych jest kluczowa dla odkrywania leków. Protokół ten opisuje 384-dołkowy test termiczny przesunięcia komórkowego, który niezawodnie wykrywa zaangażowanie inhibitorów celujących w dziki typ SHP2 lub jego warianty onkogenne.

Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11)

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Protokół ten wprowadza fluorometryczną metodologię przesiewania zoptymalizowaną do identyfikacji produktów naturalnych/inhibitorów małych cząsteczek syntezy białek. Jego praktyczność sprawia, że nadaje się zarówno do nauczania technik odkrywania leków na poziomie licencjackim, jak i do wdrażania w kampaniach chemii medycznej.

Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

Poznaj metodę przesiewową identyfikacji inhibitorów pirofosfatazy związanych z błoną Thermotoga maritima przy użyciu reakcji molibdenowej w formacie 96-well. Protokół ten jest prosty, ekonomiczny i stabilny.

Badania przesiewowe w kierunku inhibitorów pirofosfatazy związanych z błoną Thermotoga maritima

Przeglądaj więcej filmów