Name: Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Naucz się izolacji ludzkich fibroblastów skórnych i wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych metodą nieintegrującą bez użycia wektorów wirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Próbki z tkanek ludzkich zostały pobrane zgodnie z Deklaracją Helsińską, przestrzegając wytycznych Szpitala Uniwersyteckiego Federico II. Wszyscy pacjenci biorący udział w tym badaniu wyrazili pisemną zgodę.
1. Przygotowanie materiałów i pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Oczyść i autoklaw jedną dużą parę nożyczek chirurgicznych, dwa zestawy cienkich kleszczy, dwie pary nożyczek do mikropreparacji, sterylną butelkę o pojemności 1 l, sterylną butelkę o pojemności 500 ml i sterylną butelkę o pojemności 250 ml.</li>
	<li>Przygotuj płytki 100 mm, płytki 60 mm, płytki 35 mm, jednorazowe skalpele, sterylne probówki 50 ml, sterylne probówki 15 ml i szklaną płytkę 100 mm. Przechowuj narzędzia w sterylnych warunkach, aż będą gotowe do użycia.</li>
	<li>Przed użyciem wyczyść i wysterylizuj szkła nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm. W tym celu umieść okulary nakrywkowe w szklanej płycie, przykryj je 70% etanolem i odczekaj kilka sekund przed zasysaniem etanolu. Pozostaw szklanki nakrywkowe do wyschnięcia w suszarce w temperaturze 37 °C, a następnie przelej je w autoklawe.</li>
	<li>Przygotuj 1 l zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) o pH 7,4, rozpuszczając dostępne w handlu sproszkowane sole w podwójnie destylowanej sterylnej wodzie i dodając 0,35 g wodorowęglanu sodu. Sterylizować przez filtrację pod sterylnym kapturem i przechowywać w temperaturze +4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotować 500 ml sterylnego 1x buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS), rozpuszczając 0,1 g jednozasadowego fosforanu potasu, 0,1 g chlorku potasu, 4,0 g chlorku sodu i 0,575 g dwuzasadowego fosforanu sodu w sterylnej podwójnie destylowanej wodzie. Sprawdzić wartość pH (7.4) i wysterylizować pod sterylnym kapturem przez filtrację. Przechowywać w temperaturze +4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml roztworu zatrzymującego trypsynę (TSS), dodając 5 ml 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 45 ml HBSS pod sterylnym kapturem. Przechowywać w temperaturze +4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Eagle firmy Dulbecco do izolacji fibroblastów (I-DMEM) przy użyciu 250 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% FBS i 0,5% penicyliny i streptomycyny (wstrzykiwacz/paciorkowiec) pod sterylnym kapturem. Przechowywać w temperaturze +4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotuj DMEM do synchronizacji fibroblastów (S-DMEM) przy użyciu 250 ml DMEM uzupełnionego 0,1% FBS i 0,5% pióra / paciorkowca pod sterylnym kapturem. Przechowywać w temperaturze +4 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Izolacja ludzkich fibroblastów skórnych
UWAGA: Kroki od 2.1 do 2.3 opisane poniżej muszą być wykonywane pod sterylnym kapturem. Cylindryczna próbka o średnicy około 0,8 cm daje 2 x 106 fibroblastów w pasażu 1.
<ol>
	<li>Świeżo uzyskaną próbkę ludzkiej skóry z brzucha przemyć w naczyniu o średnicy 100 mm roztworem HBSS. Delikatnie wstrząśnij, aby usunąć krew i inne płyny biologiczne. Powtórz ten krok trzy razy, zmieniając roztwór HBSS i płytkę przy każdym praniu.</li>
	<li>Umieścić próbkę na płytce o średnicy 100 mm, usunąć włosy i tłuszcz za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek, a następnie rozciąć ją skalpelem, aby uzyskać fragmenty o wymiarach 2 mm x 1 mm (w sumie 16 fragmentów), unikając blizn, zabrudzeń (np. powstałych w wyniku rysunków pisakiem dermograficznym) lub poparzonych obszarów tkanki.</li>
	<li>Umieść 4 małe fragmenty w każdym naczyniu o średnicy 35 mm, przykryj sterylnym szkłem nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 22 mm. Wyreguluj za pomocą cienkich kleszczyków. Dodać 1,5 ml I-DMEM.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez około 15 dni lub do momentu, gdy komórki osiągną 85% konfluencji. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 3 dni i codziennie sprawdzaj wzrost komórek za pomocą mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym.</li>
</ol>
3. Ekspansja fibroblastów ludzkiej skóry
UWAGA: Poniższe kroki muszą być wykonywane pod sterylnym kapturem, z wyjątkiem czynności wykonywanych w inkubatorze.
<ol>
	<li>Podnieś okulary nakrywkowe cienkimi kleszkami, umieść je do góry nogami w jednym naczyniu o średnicy 100 mm i umyj 1x sterylnym PBS.</li>
	<li>Usunąć fragmenty próbek i wyrzucić je, umyć płytki 1x sterylnym PBS.</li>
	<li>Usuń 1x PBS i dodaj 3 ml i 1 ml trypsyny-EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) do przykrycia szklanek umieszczonych odpowiednio w szalkach 100 mm i 35 mm. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Zablokuj trypsynizację, dodając 5 ml TSS do szalki o średnicy 100 mm i 2 ml TSS do każdej płytki o średnicy 35 mm. Zebrać zawiesinę do sterylnych probówek o pojemności 15 ml, odwirować przy 400 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 12 ml I-DMEM. Podzielić zawiesinę komórek na 3 ml porcji na każdą płytkę o średnicy 60 mm.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zmieniaj medium codziennie. Utrzymuj komórki w hodowli, aż osiągną zbieg 75%.</li>
	<li>Odessać pożywkę z płytek i szybko umyć w 1x PBS.</li>
	<li>Powtórzyć trypsynizację (kroki 3.3 i 3.4) trzy razy, aby uzyskać komórki w pasażu 4. Użyj 1,5 ml trypsyny-EDTA i 3 ml TSS w każdej naczyniu o średnicy 60 mm. Podziel komórki 1:3.</li>
	<li>Zsynchronizować komórki, zastępując I-DMEM S-DMEM i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Przygotuj następujące elementy (podczas synchronizacji komórek).
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę ekspandującą fibroblastów, dodając 5,0 ml FBS i 0,5 ml L-glutaminy do 44,5 ml zaawansowanego DMEM (A-DMEM), przechowywać w temperaturze +4 °C.</li>
		<li>Przygotuj całkowity koktajl przeprogramowania NM-RNA do przeprogramowania fibroblastów, łącząc następujące elementy w każdej z 9 sterylnych probówek wolnych od RNaz: 32 μL OSKMNL NM-RNA, 24 μL EKB NM-RNA, 5,6 μL NM-microRNA (61,6 μL końcowej objętości na 9 podwielokrotności).</li>
		<li>Podzielić każdą probówkę zawierającą 61,6 μl całkowitego koktajlu przeprogramowującego NM-RNA do przeprogramowania fibroblastów na cztery jednorazowe podwielokrotności 15,4 μl w sterylnych probówkach wolnych od RNaz i przechowywać w temperaturze -80 °C (15,4 μl końcowej objętości na 36 podwielokrotności).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przeprogramowanie fibroblastów skórnych na iPSC
<ol>
	<li>Dzień 0: Wysiew komórek 
	UWAGA: Kroki 4.1.1 do 4.1.3 i 4.1.8 do 4.1.9 muszą być wykonywane pod sterylnym kapturem. Macierz błony podstawnej (BMM) szybko żeluje w temperaturze pokojowej. Dlatego zdecydowanie zaleca się rozmrażanie BMM przez noc na lodzie w lodówce, rozcieńczenie go lodowatym podłożem bez surowicy i użycie wstępnie schłodzonych pipet, końcówek i probówek.
	<ol>
		<li>Przygotować 24-dołkową płytkę, pokrywając każdą studzienkę 100 μl BMM i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C przed wysiewem komórek.</li>
		<li>Odessać pożywkę z płytek z komórkami w kulturze i szybko przemyć w 1x PBS.</li>
		<li>Powtórzyć trypsynizację (kroki 3.3 i 3.4), aby uzyskać komórki w pasażu 5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki ekspandującej fibroblasty (patrz krok 3.10).</li>
		<li>Przygotuj i wyczyść hemocytometr 70% alkoholem.</li>
		<li>Przygotować roztwór, delikatnie mieszając 10 μl błękitu trypanowego i 10 μl zawiesiny komórkowej w probówce o pojemności 1,5 ml i inkubować przez 1–2 minuty w temperaturze pokojowej. Uważaj, aby nie inkubować dłużej niż 5 minut.</li>
		<li>Odpipetować 10 μl roztworu do hemocytometru, umieścić go na stoliku mikroskopu kontrastowego z odwróconymi fazami, aby policzyć. Komórki niezdolne do życia będą niebieskie, podczas gdy komórki żywotne będą niebarwione.</li>
		<li>Policz komórki w co najmniej 2 kwadratach komory hemocytometru. Zastosuj następujące obliczenia, aby uzyskać łączną liczbę komórek: 
		Całkowita liczba komórek = (Całkowita liczba zliczonych komórek/Liczba kwadratowa) x 2 x 10 x Całkowita objętość zawiesiny komórek</li>
		<li>Wykonać rozcieńczenie, aby uzyskać gęstość 2,5 x 104 komórek na 500 μl pożywki ekspandującej fibroblasty, w oparciu o całkowitą liczbę zliczonych komórek. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości podłoża ekspandującego fibroblasty.</li>
		<li>Odpipetować 500 μl zawiesiny komórek do każdego dołka płytki 24-dołkowej. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 1: Transfekcja 
	UWAGA: Wszystkie powierzchnie robocze i materiały eksploatacyjne (np. rękawice, butelki, sterylne powierzchnie kapturów, pipetory) MUSZĄ być oczyszczone odczynnikiem czyszczącym do usuwania RNazy przed rozpoczęciem procedury. Wykonaj kroki 4.2.2, 4.2.4–4.2.8 pod sterylnym kapturem.
	<ol>
		<li>Rozgrzej pożywkę hodowlaną o niskim współczynniku wzrostu i niskim współczynniku wzrostu (pożywka hodowlana XF/FF) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usuń starą pożywkę z każdej studzienki i zastąp ją 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej XF/FF.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w temperaturze poniżej 5% CO2 przez co najmniej 6 godzin.</li>
		<li>Rozmrozić pięć 15,4 μl podwielokrotności całkowitego koktajlu przeprogramowującego NM-RNA w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić go na lodzie.</li>
		<li>Dodać 234,6 μl pożywki o obniżonej surowicy do każdej podwielokrotności, delikatnie odpipetować 3–5 razy i oznaczyć każdą z nich jako probówkę A (RNA + pożywka o obniżonej surowicy).</li>
		<li>Oznaczyć 5 sterylnych, wolnych od RNaz probówek o pojemności 0,5 ml jako probówkę B i zmieszać 6 μl syntetycznego odczynnika do transfekcji siRNA z 244 μl pożywki o obniżonej surowicy (odczynnik do transfekcji RNA + pożywka o obniżonej surowicy).</li>
		<li>Dodawać zawartość każdej probówki B do probówki A kroplami (aby uzyskać 500 μl końcowej objętości roztworu kompleksu transfekcji NM-RNA). Wymieszaj, stukając w spód tuby. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać 125 μl roztworu kompleksu transfekcji NM-RNA z każdej z pięciu podwielokrotności 500 μl do 4 dołków (aby uzyskać łącznie 20 dołków), przechylając płytkę i pipetując kroplami do pożywki. Wymieszaj, delikatnie kołysząc. Użyj pozostałych 4 dołków jako odniesienia.</li>
		<li>Inkubować przez 15 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2–4: Zakończ transfekcję
	<ol>
		<li>Zassać pożywkę. Powtórzyć procedurę transfekcji jak w dniu 1 pod sterylnym kapturem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 5–10: Zmiany w mediach
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę i wymienić na świeżą, wstępnie ogrzaną pożywkę hodowlaną XF/FF pod sterylnym kapturem.</li>
		<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Przechowywać w kulturze do momentu zaobserwowania tworzenia się kolonii iPSC, monitorując je codziennie pod mikroskopem z kontrastem fazowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lo, B., Parham, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethical+Issues+in+Stem+Cell+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Ethical Issues in Stem Cell Research.</a> Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).</li>
<li>Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+How+They+Will+Change+the+Practice+of+Cardiovascular+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Methodist+Debakey+Cardiovasc+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine.</a> Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).</li>
<li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+applications+in+regenerative+medicine%2C+disease+modeling%2C+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2(2015).</li>
<li>Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+and+ethics+of+induced+pluripotency%3A+what+will+become+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Liver+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Cell+Medicine%22%5BJournal%5D)">Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases.</a> Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).</li>
<li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li>
<li>Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+induced+pluripotent+stem+cell+%28ipsc%29+based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).</li>
<li>Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+Cell+Reprogramming%3A+Methods+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%2C+Physiology+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications.</a> Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422(2016).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+using+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li>
<li>Malik, N., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+the+Methods+for+Human+iPSC+Derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Review of the Methods for Human iPSC Derivation.</a> Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Poleganov, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Reprogramming+of+Human+Fibroblasts+and+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells+Using+Nonmodified+RNA+for+Reprogramming+and+Immune+Evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion.</a> Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).</li>
<li>Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choices+for+Induction+of+Pluripotency%3A+Recent+Developments+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Reprogramming+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).</li>
<li>Revilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+the+generation+of+human+iPS+cells%3A+implications+in+cell-based+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).</li>
<li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-Mediated+Ultra-Effective+Direct+Conversion+of+Human+Fibroblasts+into+Neural+Progenitor-like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells.</a> ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li>
<li>Shan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+passages+accelerate+the+reprogramming+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).</li>
<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).</li>
<li>Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytotoxic+and+immunogenic+hurdles+associated+with+non-viral+mRNA-mediated+reprogramming+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts.</a> Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).</li>
<li>Beissert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+In+Vivo+Expression+of+Genes+Delivered+by+Self-Amplifying+RNA+Using+Vaccinia+Virus+Immune+Evasion+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins.</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).</li>
<li>Mathieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+induces+re-entry+of+committed+cells+into+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency.</a> Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+Enhances+Direct+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+to+Cardiomyocyte-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells.</a> Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+buffalo+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+proliferation%2C+stemness%2C+and+reprogramming+into+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).</li>
<li>Karagiannis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Their+Use+in+Human+Models+of+Disease+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).</li>
<li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).</li>
<li>Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+and+challenges+in+the+comprehensive+characterization+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Komórki iPS szybko stają się najbardziej obiecującymi kandydatami na komórki do zastosowań w medycynie regeneracyjnej oraz niezwykle użytecznym narzędziem do modelowania chorób i testowania leków 3,8. Przedstawiony tutaj protokół opisuje generowanie ludzkich iPSC z próbki o wielkości biopsji dziurkowania skóry za pomocą prostej i skutecznej procedury, która nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu ani wcześniejszego doświadczenia z technologią przeprogramowywania.<...

Przeprogramowanie komórek reprezentuje nowatorską technologię przekształcania każdej komórki somatycznej ciała w pluripotencjalną komórkę macierzystą, znaną jako iPSC1. Możliwość przeprogramowania dorosłej komórki somatycznej z powrotem do stanu pluripotencjalnego i niezróżnicowanego przezwyciężyła ograniczenia narzucone przez słabą dostępność i problemy etyczne związane z wykorzystaniem komórek pluripotencjalnych, wcześniej możliwych do uzyskania tylko z ludzkich embrionów (embrionalne komórki macierzyste lub ESC)2,3,4. W 2006 roku Kazutoshi Takahashi i Shinya Yamanaka przeprowadzili pionierskie badanie, w którym dokonali pierwszej konwersji dorosłych komórek somatycznych ze skóry w komórki pluripotencjalne poprzez sztuczne dodanie czterech specyficznych genów (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5. Rok później prace przeprowadzone w laboratorium Thomsona doprowadziły do pomyślnego przeprogramowania komórek somatycznych na iPSC poprzez transdukcję innej kombinacji czterech genów (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.
iPSC oferują szereg możliwości naukowcom i badaczom z różnych dziedzin, takich jak medycyna regeneracyjna i farmakologia, będąc doskonałą platformą do badania i leczenia różnych chorób wraz z genotypowym odzwierciedleniem cech pacjenta, od którego pochodzą. Zastosowanie iPSC zapewnia kilka korzyści, w tym: zmniejszone ryzyko odpowiedzi immunologicznej ze względu na całkowicie autologiczne pochodzenie komórek; możliwość stworzenia biblioteki komórek, ważnego narzędzia do przewidywania odpowiedzi na nowe leki i ich skutków ubocznych, ponieważ są one w stanie stale się odnawiać i generować różne typy komórek; oraz szansa na opracowanie zindywidualizowanego podejścia do podawania leków7,8,9.
Obecnie znane są różne techniki indukowania ekspresji czynników przeprogramowujących i są one zawarte w dwóch głównych kategoriach: metody niewirusowe i oparte na wektorach wirusowych10,11,12,13. Metody niewirusowe obejmują transfekcję mRNA, infekcję/transfekcję miRNA, PiggyBac, wektory minicircle oraz plazmidy episomalne i egzosomy10,11,12,13. Metody oparte na wirusach obejmują wirusy nieintegrujące, takie jak adenowirus, wirus Sendai i białka, oraz wirusy integrujące, takie jak Retrovirus i Lentivirus10,11,12,13.
Według kilku badań, nie zauważono znaczących różnic między tymi metodami pod względem skuteczności przeprogramowania komórek, dlatego wybór odpowiedniej metody ściśle zależy od użytego typu komórki i od kolejnych zastosowań uzyskanych iPSCs14,15. Wszystkie wymienione metody mają wady, na przykład wirus Sendai jest skuteczny na wszystkich typach komórek, ale wymaga wielu pasaży, aby uzyskać iPSC; Przeprogramowanie przez episomy jest doskonałe dla komórek krwi, ale wymaga modyfikacji standardowych warunków hodowli fibroblastów; Metoda PiggyBac może stanowić atrakcyjną alternatywę, ale badania na komórkach ludzkich są nadal ograniczone i słabe10,11,12,13. Egzosomy to nanopęcherzyki fizjologicznie wydzielane przez komórki do wszystkich płynów ustrojowych. Według najnowszych badań są one odpowiedzialne za komunikację międzykomórkową i mogą odgrywać rolę w ważnych procesach biologicznych, takich jak proliferacja, migracja i różnicowanie komórek. Egzosomy mogą transportować i przenosić mRNA i miRNA do komórek biorców z całkowicie naturalnym mechanizmem, ponieważ mają ten sam skład błony komórkowej16. Dlatego egzosomy są obiecującą techniką przeprogramowania nowej generacji, ale ich potencjał do przeprogramowywania komórek somatycznych na podstawie ich zawartości jest nadal badany. Metody oparte na wektorach wirusowych wykorzystują wirusy zmodyfikowane w celu przekazania genów przeprogramowujących do komórek biorcy. Technika ta, pomimo wysokiej skuteczności przeprogramowania, nie jest uważana za bezpieczną, ponieważ integracja wirusa w komórce może być odpowiedzialna za infekcję, potworniaki i niestabilność genomu17.
Następujący protokół do generowania kolonii iPSC łączy w sobie koktajl przeprogramowania Yamanaki i Thompsona i opiera się na użyciu metody wymagającej NM-RNA i czynników unikania odporności z możliwością przeprowadzenia go w warunkach wolnych od kseno. Uzasadnieniem dla zastosowania tej metody jest rozpowszechnienie w środowisku naukowym protokołu umożliwiającego szybkie, proste i wysoce skuteczne przeprogramowanie fibroblastów dorosłego człowieka ze skóry brzucha na iPSCs18.
Mocnymi stronami proponowanej metody są łatwość wykonania i krótki czas potrzebny do uzyskania iPSC. Co więcej, metoda ta pozwala uniknąć komórkowych mechanizmów obronnych i wykorzystania wektorów wirusowych, odpowiedzialnych za istotne problemy.
W odniesieniu do standardowego protokołu, dokonano następujących modyfikacji: (1) Zlewające się fibroblasty zostały zsynchronizowane w pasażu 4 poprzez umieszczenie w 0,1% surowicy na 48 godzin przed trypsynizacją; (2) Gęstość komórkową dla hodowli i objętość odczynników dostosowano do wykorzystania na 24-dołkowej płytce wielodołkowej zamiast na płytce 6-dołkowej; (3) Doświadczenie przeprogramowania przeprowadzono przy użyciu inkubatora o stężeniu 5%CO2 zamiast inkubatora o warunkach atmosferycznych (21%O2) lub niedotlenionych (5%O2).

<table><tbody><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>sterylne, polistyrenowe</td></tr><tr><td>płytki 100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Treated, sterylne naczynie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>15 mL sterylne probówki</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Wirówka sterylne probówki, polipropylenowe</td></tr><tr><td>płytki 24-dołkowe</td><td>Falcon</td><td><mocna>353935</td><td>przezroczysta, płaska płytka do hodowli komórkowych poddanych działaniu substancji wielodołkowej, z pokrywką, sterylna</td></tr><tr><td>pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Falcon</td><td>357525</td><td>Sterylne, polistyrenowe</td></tr><tr><td>płytki 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Treated, sterylne naczynie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>5 ml pipeta serologiczna</td><td>Falcon</td><td>357543</ mocne></td><td>sterylne, polistyrenowe</td></tr><tr><td>probówki sterylne 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>Sterylne probówki wirówkowe, polipropylen</td></tr><tr><td>Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>12491-015</td><td>Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C; unikaj ekspozycji na światło</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>D6429-500ml</td><td>Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C; unikać ekspozycji na światło</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>F9665-500ml</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni C. Surowicę należy podzielić na mniejsze objętości robocze, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1387-1L</td><td>Powder</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Powinien być podzielony na mniejsze objętości robocze, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji lipofekcaminy RNAiMAX</td><td>INVITROGEN</td><<td>strong>13778-030</td><td>Syntetyczny odczynnik do transfekcji siRNA; przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>CORNING</td><<td>strong>354234</td><td>Basement Membrane Matrix, przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.</td></tr><tr><td>Komora Neubauera</td><td>VWR</td><<td>strong>631-1116</td><td>hemocytometr</td></tr><tr><td>NutriStem XF Culture Medium</td><td>Biological Industries</td><td>05-100-1A-500ml</td><td>Xeno-free, bez surowicy, o niskim czynniku wzrostu ludzkiego ESC/iPSC. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu podłoże można przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C przez 14 dni. Pożywki należy dzielić na mniejsze objętości robocze, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-062-100ml</td><td>Reduced Serum Medium; przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C; unikać ekspozycji na światło</td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4333-100ml</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni C. Roztwór należy podzielić na mniejsze objętości robocze, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P9333</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Fosforan potasu Monobasic</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P5665</td><td></td></tr><tr><td>Powder 0,5 ml probówki bez RNaz</td><td>Eppendorf</td><td>H0030124537</td><td>Probówki do mikrofug bez RNaz, polipropylen</td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml bez RNaz</td><td>Eppendorf</td><td>H0030120086</td><td>RNazo-free sterylne, mikrofuge, polipropylenowe</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>INVITROGEN</td><<td>strong>AM9780</td><td>Środek czyszczący do usuwania RNazy</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S5761</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S7653</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>94046</td><td></td></tr><tr><td>Powder StemRNA 3rd Gen</td><td>Reprocell</td><td>00-0076</td><td>Zestaw do przeprogramowania trzeciej generacji oparty na NM-RNA do komórkowego przeprogramowania fibroblastów, krwi i moczu. Przechowywać w temperaturze -70 stopni Celsjusza lub niższej.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T4049-100ml</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni C. Powinien być podzielony na mniejsze objętości robocze, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania</td></tr></tbody></table>

izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą być do tej pory uważane za obiecujące źródło komórek pluripotencjalnych do leczenia obecnie nieuleczalnych chorób, do rekonstytucji i regeneracji uszkodzonych tkanek oraz do opracowywania nowych leków. Pomimo wszystkich zalet związanych ze stosowaniem iPSC, takich jak niskie ryzyko odrzucenia, mniejsze problemy etyczne oraz możliwość uzyskania ich zarówno od młodych, jak i starszych pacjentów bez różnicy w ich potencjale przeprogramowania, problemów do pokonania jest nadal wiele. W rzeczywistości przeprogramowanie komórek przeprowadzone za pomocą wirusów i wirusów integrujących może powodować infekcje, a wprowadzenie wymaganych genów może wywołać niestabilność genomową komórki biorcy, utrudniając ich wykorzystanie w klinice. W szczególności istnieje wiele obaw związanych z wykorzystaniem genu c-Myc, znanego z wielu badań ze swojej aktywności indukującej mutacje. Fibroblasty stały się odpowiednią populacją komórek do przeprogramowania komórkowego, ponieważ są łatwe do wyizolowania i hodowli oraz są zbierane za pomocą minimalnie inwazyjnej biopsji dziurkowania skóry. Opisany tutaj protokół zawiera szczegółowy opis krok po kroku całej procedury, od przetwarzania próbki do uzyskania kultur komórkowych, wyboru odczynników i materiałów eksploatacyjnych, czyszczenia i przygotowania, aż po przeprogramowanie komórek za pomocą komercyjnego zestawu do przeprogramowania opartego na niemodyfikowanych RNA (NM-RNA). Wybrany zestaw do przeprogramowania pozwala na skuteczne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów skórnych na iPSC, a małe kolonie można zobaczyć już po 24 godzinach od pierwszej transfekcji, nawet z modyfikacjami w stosunku do standardowego arkusza danych. Procedura przeprogramowania zastosowana w tym protokole ma tę zaletę, że można ją bezpiecznie przeprogramować, bez ryzyka infekcji spowodowanych metodami opartymi na wektorach wirusowych, zmniejsza mechanizmy obronne komórek i umożliwia generowanie iPSC wolnych od kseno, wszystkich krytycznych cech, które są niezbędne do dalszych zastosowań klinicznych.

Celem protokołu było przeprogramowanie fibroblastów skóry właściwej wyizolowanych ze skóry brzucha przy użyciu nieintegrującej metody przeprogramowania opartej na NM-RNA w celu indukcji ekspresji specyficznych czynników. Aby osiągnąć ten cel, ludzkie fibroblasty skóry właściwej wyizolowano z próbek skóry pacjentów poddawanych zabiegowi plastyki brzucha, a iPSCs wygenerowano poprzez wprowadzenie czynników przeprogramowania Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 oraz czynników unikania odpowiedzi immunologicznej E3, K3, B18 ...

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Poniższy protokół zawiera instrukcje dotyczące generowania autologicznych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez szybkie i skuteczne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów skóry wyizolowanych z biopsji stempla skóry. Procedury mogą być przeprowadzane przez badaczy z niewielkim lub żadnym doświadczeniem w przeprogramowywaniu komórek, a przy odpowiednim dostosowaniu pozwala na uzyskanie produktu z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych wolnych od kseno. Autologiczne komórki IPS mogą być wykorzystywane do zastosowań w medycynie regeneracyjnej oraz do modelowania chorób, takich jak zaburzenia genetyczne lub nowotwory, w celu zbadania podstawowych mechanizmów molekularnych i opracowania bardziej specyficznych terapii.Obciążenie pracą jest duże. Niezwykle pomocne jest zapoznanie się z protokołem przed dokładnym zaplanowaniem eksperymentu, w tym kroków, podczas których należy przygotować odczynniki i materiały. Wizualna demonstracja procedury pomaga naukowcom z niewielkim lub zerowym doświadczeniem w przeprowadzaniu izolacji komórek i przeprogramowywania, unikając typowych błędów związanych z możliwym zanieczyszczeniem mikrobiologicz

isolation-adult-human-dermal-fibroblasts-from-abdominal-skin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano szybką i skuteczną metodę izolacji żywych dorosłych komórek macierzystych nabłonka ze skóry ludzkiej. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne macierzy kolagenowej skóry, a następnie wyrywanie mieszków włosowych i izolację zawiesin pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki do hodowli komórkowej.

Izolacja i hodowla dorosłych epitelialnych komórek macierzystych ze skóry człowieka

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Ten film demonstruje technikę izolowania indukowanych nerwowych komórek progenitorowych (iNPC) pochodzących z dorosłych ludzkich fibroblastów. Przedstawiono w nim etapy związane z izolacją kolonii iNPC i hodowlą ich w wielodołkowych dołkach płytkowych pokrytych lamininą w obecności odpowiednich pożywek hodowlanych, które ułatwiają ciągłą proliferację i ekspansję populacji iNPC.

Izolowanie indukowanych kolonii nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z fibroblastów dorosłego człowieka

Opisujemy metodę izolowania naiwnych multipotencjalnych komórek prekursorowych pochodzenia skórnego (SKP) z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów. Pokazujemy, że te SKP pochodzące z kultur fibroblastów mają podobne właściwości komórek macierzystych do tych pochodzących bezpośrednio z biopsji ludzkiej skóry. Komórki te wyrażają marker grzebienia nerwowego, nestynę, oprócz markerów multipotencjalnych, takich jak OCT4 i Nanog.

Izolacja naiwnych dorosłych komórek macierzystych z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Ten manuskrypt opisuje oparty na FACS protokół izolacji brodawkowatych i siateczkowatych fibroblastów z ludzkiej skóry. Omija hodowlę in vitro, która była nieunikniona w przypadku powszechnie stosowanego protokołu izolacji za pomocą kultur eksplantatów. Emanujące podzbiory fibroblastów są funkcjonalnie odrębne i wykazują zróżnicowaną ekspresję i lokalizację genów w skórze właściwej.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Naucz się izolacji ludzkich fibroblastów skórnych i wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych metodą nieintegrującą bez użycia wektorów wirusowych.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Przeglądaj więcej filmów