Name: Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę produkcji pseudotypowanych cząstek wirusa grypy o wysokim mianie z glikoproteinami H5N1 i H7N9. Protokół umożliwia ocenę zakaźności metodą qRT-PCR w warunkach BSL-2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Planu Medycyny i Technologii Prowincji Zhejiang (numery grantów, 2017KY538), Miejskiego Planu Medycyny i Technologii Zdrowotnej w Hangzhou (numery grantów, OO20190070), kluczowego projektu Nauki i Technologii Medycznej w Hangzhou (numery grantów, 2014Z11) oraz projektu autonomicznego zastosowania samorządu miejskiego w Hangzhou w zakresie rozwoju społecznego i badań naukowych (numery grantów, 20191203B134).

1. Dzień 1: Hodowla komórkowa i wysiew
<ol>
	<li>Hodować ludzkie komórki embrionalne nerki (HEK) 293T/17 w 60-milimetrowych szalkach ze zmodyfikowaną pożywką egzogenną (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (DMEM Complete Medium, DCM) w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% dwutlenku węgla (CO2) do około 80% konfluencji. 
	UWAGA: Zalecane są ogniwa niskoprzelotowe HEK 293T/17.</li>
	<li>Ostrożnie umyć komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x, 
	UWAGA: Ręczne obchodzenie się z ogniwami HEK 293T/17 musi być bardzo delikatne, ponieważ łatwo się odłączają.</li>
	<li>Usuń PBS i zdysocjuj komórki za pomocą 1 ml 0,25% roztworu kwasu trypsynowo-etylenodiaminowego (EDTA). Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na nie dłużej niż 5 minut, aż komórki zostaną rozdzielone.</li>
	<li>Dezaktywuj trypsynę, dodając 5 ml DCM. Rozproszyć komórki w zawiesinie jednokomórkowej, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Przenieść zawiesiny komórek do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować jak najwięcej supernatantu. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 6 ml pożywki DCM i policzyć komórki. Rozcieńczyć komórki do 1 x 106 komórek/ml pożywką DCM.</li>
	<li>Zasiej komórki na 6-dołkowej płytce z 1 ml zawiesiny komórek na studzienkę. Delikatnie wklep płytkę, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Inkubować płytkę przez noc (14–16 godzin) w inkubatorze o temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Dzień 2: Kotransfekcja czteroplazmidowa za pośrednictwem lipofekcji
<ol>
	<li>Sprawdź morfologię i gęstość komórek pod mikroskopem światła odwróconego. Idealnie, komórki powinny być w około 85% zlewające się podczas transfekcji. Zastąp pożywkę 1 ml pożywki DMEM bez surowicy na dołek, a następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora. 
	UWAGA: Ręczne obchodzenie się z ogniwami HEK 293T/17 musi być bardzo delikatne, ponieważ łatwo się odłączają.</li>
	<li>Dla każdej studzienki z hodowanymi komórkami, które mają być transfekowane, rozcieńczyć 8 μl odczynnika do transfekcji do objętości 150 μl zredukowanym podłożem surowicy (probówka 1). Delikatnie wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT, około 20 °C). 
	UWAGA: Dla każdej próbki do transfekcji należy przygotować dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml ponumerowane 1 i 2.</li>
	<li>W probówce 2 rozcieńczyć 2,5 μg plazmidowego DNA w 150 μl zredukowanego podłoża surowicy. 
	UWAGA: W probówce 2 rozcieńczyć każdy plazmidowy DNA, jak pokazano w Tabeli 1. Jako kontrolę pozytywną zastosowano glikoproteinę G wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej kodującego plazmid (VSV) (plazmid pLP-VSVG), ponieważ VSV jest w stanie zainfekować szeroki zakres komórek. Cząstki kontroli ujemnej, które nie mają glikoprotein otoczki grypy (Δenv pps), zostały wygenerowane przy użyciu plazmidów pcDNA-Gag-Pol i pcDNA-GFP.</li>
	<li>Po 5 minutowej inkubacji połączyć rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać kompleks DNA-lipid do odpowiedniej studzienki zawierającej komórki i pożywkę wolną od surowicy. Delikatnie wymieszaj, kołysząc talerzem w przód iw tył.</li>
	<li>Po inkubacji przez 4–6 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 należy usunąć pożywkę i zastąpić 2 ml DMEM. Inkubować przez kolejne 36–48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . 
	UWAGA: Zastąp DMEM bez surowicy i przeciwciał. W tym protokole dwa HA i dwa NAs mogą być użyte do wygenerowania ośmiu typów PPS (pokazanych w tabeli 1).</li>
</ol>
3. Dzień 3: Siew komórek podatnych
<ol>
	<li>W przypadku testu zakaźności należy wysiać każdy rodzaj podatnych komórek w ilości 1 x 104 komórki na studzienkę na płytce 96-dołkowej. 
	UWAGA: Do przeprowadzenia testu zakaźności w tym artykule należy użyć dwóch typów komórek docelowych: linii komórek ludzkich pochodzących z pęcherzyków płucnych (komórki A549) i komórek nerki psa Madin-Darby (MDCK). Komórki MDCK są szeroko stosowane w badaniach nad grypą i mogą być dobrą kontrolą. Ten krok jest elastyczny. Wszelkie inne docelowe linie komórkowe mogą być wykorzystane zgodnie z wymaganiami badawczymi.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez noc (14–16 godzin) w inkubatorze o temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Dzień 4: Pseudotypowane zbieranie cząstek wirusa, kwantyfikacja i test zakaźności
<ol>
	<li>Pseudotypowany zbiór cząstek wirusa
	<ol>
		<li>Sprawdź kolor podłoża. Najlepiej, aby był jasnoróżowy lub lekko pomarańczowy. Zbadaj komórki za pomocą odwróconego fluorescencyjnego mikroskopu biologicznego pod 440–460 nm.</li>
		<li>Po 36–48 godzinach od transfekcji zbierz pps, przechodząc przez filtr membranowy z polifluorku winylidenu (PVDF) o grubości 0,45 μm w celu wyeliminowania resztek komórkowych.</li>
		<li>Podziel pps na podwielokrotności o małej objętości.</li>
		<li>Przechowywać pps w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Nie jest to jednak zalecane, ponieważ zakaźność pps gwałtownie spadnie po zamrożeniu i rozmrożeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja pseudotypowanych cząstek wirusa
	<ol>
		<li>Przenieść 20 μl oczyszczonych pps do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od rybonukleazy (RNazy).</li>
		<li>Dodać 1 μl nukleazy benzonazy o stężeniu 0,24 j./mL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu wyeliminowania wszelkich zanieczyszczeń DNA i RNA. 
		UWAGA: Docelowy RNA, zwykle obniżony poziom wirusa cytomegalii (CMV)-GFP RNA, jest upakowany w pps i może uniknąć degradacji przez nukleazę benzonazy.</li>
		<li>Zamrażać próbkę w temperaturze -70 °C w celu inaktywacji nukleazy benzonazy.</li>
		<li>Dodać 2 μl proteinazy K. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut, aby wytrawić białka otoczki i uwolnić CMV-GFP RNA. Dezaktywować proteinazę K w temperaturze 100 °C przez 3 min.</li>
		<li>Określ ilościowo pps za pomocą ilościowej odwrotnej transkrypcji (qRT)-PCR w czasie rzeczywistym za pomocą uniwersalnego zestawu jednoetapowego RT-qPCR z sondą, przy użyciu startera do przodu 5'-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3', startera odwrotnego 5'-GGGTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3' i sondy 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3', na termocyklerze Real-Time PCR. Znormalizuj pps dla liczby kopii RNA przed infekcją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test zakaźności
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć każdy rodzaj pps pod względem danych qRT-PCR do 4 x 105 kopii/ml (normalizacja pp).</li>
		<li>Dodaj trypsynę chlorometylo-ketonu tozylo-fenyloalaniny (TPCK) do końcowego stężenia 40 μg / ml do pps, które zawierają H7N9 HA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu utworzenia podjednostek funkcjonalnych HA1 i HA2. 
		UWAGA: Nie ma potrzeby traktowania pps, które zawierają H5, trypsyną TPCK, ponieważ mają one wiele reszt argininy i lizyny w miejscu rozszczepienia HA1-HA2. To wieloelementowe miejsce rozszczepienia może zostać rozszczepione przez wszechobecne proteazy komórkowe.</li>
		<li>Wymieszaj znormalizowane pps z podłożem DMEM (bez surowicy) w stosunku 1:1 (objętość/objętość).</li>
		<li>Przynieś płytkę zawierającą wrażliwe komórki do komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Odessać supernatant i przemyć komórki raz 0,1 ml podgrzanego PBS.</li>
		<li>Dodaj 0,1 ml mieszaniny pps-DMEM do jednego dołka. Trzykrotnie przeprowadź testy zakaźności każdego typu pps na jednej podatnej linii komórkowej (omówione w <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Inkubować 96-dołkową płytkę przez 4–6 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Odessać supernatant i zastąpić go 0,1 ml DCM.</li>
		<li>Inkubować 96-dołkową płytkę przez kolejne 24–36 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Dzień 5 lub 6: Wykrywanie zakaźności
<ol>
	<li>Przynieś 96-dołkową płytkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Odessać supernatant i umyć komórki 1x 0,2 ml podgrzanego PBS.</li>
	<li>Usuń PBS i zdysocjuj komórki za pomocą 0,1 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 3 minuty, aż komórki zostaną rozdzielone. 
	UWAGA: Unikaj inkubacji dłużej niż 5 minut, ponieważ doprowadzi to do zlepiania się komórek.</li>
	<li>Dezaktywuj trypsynę, dodając 0,4 ml DCM.</li>
	<li>Rozproszyć komórki w zawiesinie jednokomórkowej, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Przenieść zawiesiny komórek do schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Określ komórki reporter-dodatnie GFP za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). 
	UWAGA: Aby określić stosunek komórek docelowych reporter-dodatnich GFP, ustaw bramki cytometru przepływowego przy użyciu próbek kontrolnych (komórki A549 nietraktowane pps lub komórki MDCK), a następnie policz komórki reporter-dodatnie GFP po 10 000 komórek na próbkę.</li>
</ol>

<ol><li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+Virology+%286th%29%22">Fields Virology (6th)</a>. , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).</li>
<li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins%3A+multiple+variations+on+a+common+theme%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li>
<li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501(2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629(2014).</li>
<li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+envelope+glycoproteins%3A+fusogens%2C+antigens%2C+and+immunogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li>
<li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li>
<li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li>
<li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li>
<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li>
<li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li>
<li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li>
<li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+%28H7N9%29+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioterrorism+%26+Biodefense%22%5BJournal%5D)">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104(2011).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825(2010).</li>
<li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles%3A+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li>
<li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li>
<li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li>
<li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70(2006).</li>
<li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+%28H5%29+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li>
<li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li>
<li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li>
<li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li>
<li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+%28SARS-CoV%29+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+%28VLPs%29+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li>
<li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254(2016).</li>
<li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010(2019).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses%3A+a+system+for+analysis+of+cell+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li>
<li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses%3A+identification+of+receptor-deficient+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li>
<li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li>
<li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies%3A+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li>
<li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819(2019).</li>
<li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+production%3A+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt%28R%29-T17%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole opisujemy metodę wytwarzania pseudotypowanych cząstek wirusa grypy (pp) w warunkach BSL-2. Plazmid reporterowy pcDNA-GFP jest włączony do pps i może być wykorzystany do ilościowego oznaczania pps za pomocą FACS w teście zakaźności. Wybraliśmy dwa rodzaje podatnych linii komórkowych, ponieważ są one szeroko stosowane w badaniach nad grypą. Komórki MDCK zapewniłyby dobrą kontrolę nad zmiennymi, unieśmiertelnionymi komórkami ludzkimi używanymi w tych badaniach.
Protokół ten opiera...

Misją cząsteczki wirusa jest transport jej genomu z zainfekowanej komórki gospodarza do niezainfekowanej komórki gospodarza i dostarczenie go do cytoplazmy lub jądra w formie zdolnej do replikacji1. Proces ten jest początkowo wywoływany przez wiązanie się z receptorami komórek gospodarza, a następnie fuzję wirionu i błon komórkowych. W przypadku wirusów otoczkowych, takich jak wirusy grypy, glikoproteiny kolców są odpowiedzialne za wiązanie receptorów i fuzję1,2. Glikoproteiny otoczki wirusa (np. pirogeny, antygeny) biorą udział w wielu ważnych właściwościach i zdarzeniach, takich jak inicjacja cyklu życiowego wirusa (wiązanie i fuzja), patogeneza wirusa, immunogenność, apoptoza komórek gospodarza i tropizm komórkowy, komórkowy szlak endocytarny, a także transmisja międzygatunkowa i reasortacja1,3,4,5,6,7. Badania nad glikoproteinami otoczki wirusowej pomogą nam zrozumieć wiele aspektów procesu infekcji wirusowej. Pseudotypowane cząstki wirusowe (pp), zwane również pseudowirionami lub pseudocząstkami, mogą być generowane za pomocą techniki pseudotypowania8,9,10. Technologia ta została wykorzystana do opracowania pseudotypowanych cząsteczek wielu wirusów, w tym wirusowego zapalenia wątroby typu C11,12, wirusowe zapalenie wątroby typu B13, wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV)14,15 i wirus grypy16,17,18,19. Technologia ta opiera się na białku Gag-Pol lentiwirusów lub innych retrowirusów.
Pseudotypowane cząsteczki wirusa można uzyskać za pomocą systemu trójplazmidowego poprzez kotransfekcję plazmidu ekspresji glikoproteiny otoczki wirusa, plazmidu retrowirusowego bez genu env otoczki i oddzielnego plazmidu reporterowego do komórek producenta pp. Retrowirus jest składany przez białko Gag i pączkuje z zainfekowanej błony komórkowej, która wyraża białko otoczki wirusa1. W związku z tym możliwe jest uzyskanie pps o wysokim mianie grypy przy użyciu białka Gag retrowirusa do produkcji pąków na błonie komórkowej wykazującej ekspresję HA i NA. W naszych poprzednich badaniach HAs/NA we wszystkich kombinacjach były funkcjonalne i zdolne do pełnienia odpowiadających im funkcji w cyklu życiowym wirusa16,17,18,20,21. Te pps są używane do badania cech biologicznych grypy, w tym hemaglutynacji, aktywności neuraminidazy, tropizmu wiążącego receptor HA i zakaźności. Ponieważ kwas hialuronowy i na-czynnik są ważnymi białkami funkcyjnymi powierzchniowo w cyklu życiowym wirusa, niedopasowane HA i NA pochodzące z różnych szczepów grypy mogą częściowo wykazywać reasortację między nimi. W tym przypadku generujemy osiem typów pps grypy, łącząc dwa HA i dwa NA (pochodzące ze szczepu HPAI H5N1 i barwienia H7N9), używając trójplazmidowego systemu pseudotypowania. Te osiem typów pps obejmuje dwa natywne pps, H5N1pp, H7N9pp; dwie niedopasowane pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; i cztery pp zawierające tylko jedną glikoproteinę (HA lub NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Badania nad wirusem grypy, takim jak H5N1 i H7N9, są ograniczone wymogami bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie badania szczepów wirusa dzikiej grypy powinny być przeprowadzane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3). Technologia pseudotypowanych cząstek wirusa może być wykorzystana do pakowania sztucznego wirionu w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Dlatego pps stanowi bezpieczniejsze i użyteczne narzędzie do badania procesów zachodzących w wirusie grypy w zależności od jego dwóch głównych glikoprotein: hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA).
Ten protokół opisuje generowanie tych pps za pomocą strategii kotransfekcji trójplazmidowej (omówionej w Rysunek 1), jak określić ilościowo pps i wykrywanie zakaźności. Produkcja pp obejmuje trzy rodzaje plazmidów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Gen gag-pol, który koduje białko Gag-Pol retrowirusa, został sklonowany z zestawu do pakowania retrowirusa i umieszczony w plazmidzie pcDNA 3.1 i nazwany pcDNA-Gag-Pol. Gen wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP), który koduje białko zielonej fluorescencji, został sklonowany z wektora pTRE-EGFP, wstawiony do plazmidu pcDNA 3.1 i nazwany pcDNA-GFP. Podczas klonowania sekwencja sygnału pakowania (ψ) została dodana za pomocą startera. Geny HA i NA sklonowano do plazmidu pVRC, nazwanego odpowiednio pVRC-HA i pVRC-NA. Ostatni plazmid koduje białko fuzyjne i może być zastąpiony dowolnym innym białkiem fuzyjnym. Nasza platforma do pseudotypowania obejmuje dwa plazmidy ekspresji glikoprotein: pVRC-HA i pVRC-NA. Może to uprościć badania nad reasortacją między różnymi szczepami wirusa w warunkach BSL-2.

<table><tbody><tr><td>Nukleaza benzonazowa</td><td>Millipore</td><td>70664</td><td>Skuteczna redukcja lepkości i usuwanie kwasów nukleinowych z roztworów białkowych</td></tr><tr><td>Przezroczyste polistyren z płaskim dnem Mikropłytki poddane TC (96-dołkowe)</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Impregnowane w celu optymalnego przylegania komórek Sterylizowane promieniowaniem gamma i certyfikowane jako niepirogenne Indywidualne kody alfanumeryczne do identyfikacji</td></tr> <tr><td>odwiertówPrzezroczyste płytki wielodołkowe (6-dołkowe) z powłoką TC</td> <td>Costar</td><td>3516</td><td>Indywidualne kody alfanumeryczne do identyfikacji studni Poddawane obróbce w celu optymalnego przylegania komórek Sterylizowane przez promieniowanie gamma</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka egzogenna Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Szeroko stosowana pożywka podstawowa wspomagająca wzrost wielu różnych komórek ssaków</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Excell</td><td>FND500</td><td>płodowe surowice bydlęce, które mogą zaoferować doskonałą wartość dla podstawowej hodowli komórek, specjalistycznych badań i specyficznych testów</td></tr><tr><td>Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)</td><td>Beckman coulter</td><td>cytoflex</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki gruczolakorak pęcherzyków płucnych Komórki A549</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka nerka embrionalna (HEK) HEK-293T/17 komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>Wszechstronny odczynnik do transfekcji, który, jak wykazano, skutecznie transfekuje najszerszą gamę linii komórkowych przylegających i zawiesinowych</td></tr><tr><td>Odwrócony fluorescencyjny mikroskop biologiczny</td><td>Olympus</td><td>BX51-32P01-FLB3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop światła odwróconego</td><td>Olympus</td><td>CKX31-12PHP</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Szybka, czuła i precyzyjna detekcja qPCR za pomocą sondy i ilościowe oznaczanie docelowych celów RNA.</td></tr><tr><td>Uniwersalna sonda Luna Jednoetapowy zestaw RT-qPCR</td><td>NEB</td><td>E3006L</td><td>Wytrzyma do 14 000 RCF Wolne od RNaz/DNaz Niepirogenne</td></tr><tr><td>komórki nerki psów Madin-Darby (MDCK)</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MaxyClear Snaplock Probówka mikrowirówkowa (1,5 ml)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>33 mm, sterylizowana promieniami gamma</td></tr> jednostka <tr><td>filtrująca strzykawkę Millex-HV, 0,45 i mikro; m, PVDF</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>ulepszone Minimal Essential Medium (MEM), które pozwala na zmniejszenie suplementacji płodowej surowicy bydlęcej o co najmniej 50% bez zmiany tempa wzrostu lub morfologii komórek. Pożywka Opti-MEM I jest również zalecana do stosowania z kationowymi odczynnikami do transfekcji lipidów, takimi jak odczynnik Lipofectamina.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Obniżona surowica</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>Antybiotyki penicylina i streptomycyna są stosowane w celu zapobiegania zanieczyszczeniu bakteryjnemu kultur komórkowych ze względu na ich skuteczne połączone działanie przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym.</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Maksymalny RCF wynosi 12 500 xg Zakres temperatur od -80 &deg; C do 120 &deg; C Wolne od RNaz/DNaz Sterylne</td></tr><tr><td>probówki wirówkowe PP (15 ml)</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>stabilną i wysoce reaktywną proteazę serynową</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Beyotime</td><td>ST532</td><td>Poddana obróbce w celu optymalnego przylegania komórek Sterylizowane promieniowaniem gamma i certyfikowane niepirogenne</td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane z powłoką TC (60 mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>Trypsyna z trzustki bydlęcej TPCK Traktowana, zasadniczo bez soli, liofilizowany proszek, &ge; 10 000 jednostek BAEE / mg białka</td></tr><tr><td>TPCK-trypsyna</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>Ta płynna formuła trypsyny zawiera EDTA i czerwień fenolową. Gibco Trypsin-EDTA jest wytwarzany z trypsyny w proszku, napromieniowanej mieszaniny proteaz pochodzących z trzustki świni. Ze względu na swoją siłę trawienną trypsyna jest szeroko stosowana do dysocjacji komórek, rutynowego pasażowania hodowli komórkowych i pierwotnej dysocjacji tkanek. Stężenie trypsyny wymagane do dysocjacji różni się w zależności od typu komórki i wymagań eksperymentalnych.</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów h5n1 i ptasich h7n9

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Sporadyczne bezpośrednie przenoszenie wirusa wysoce zjadliwej grypy ptaków A H5N1 (HPAI H5N1) i H7N9 na ludzi oraz ich śmiertelność są poważnymi problemami zdrowia publicznego i sugerują możliwość wystąpienia epidemii. Jednak nasza wiedza molekularna na temat wirusa jest szczątkowa i konieczne jest zbadanie właściwości biologicznych jego białek otoczki jako celów terapeutycznych oraz opracowanie strategii kontrolowania infekcji. Opracowaliśmy platformę do badania wirusa ptasiej grypy (pp) w postaci stałych cząstek pseudotypowanych wirusów, w tym analizy funkcjonalnej jego glikoprotein otoczki hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA), charakterystyki reasortacji HA i NA, receptorów, tropizmów, przeciwciał neutralizujących, diagnozy, zakaźności, w celu opracowania leków i projektowania szczepionek. W tym miejscu opisujemy procedurę eksperymentalną mającą na celu ustalenie pps z glikoproteinami otoczki (HA, NA) z dwóch szczepów grypy A (HAPI H5N1 i 2013 ptasi H7N9). Ich wytwarzanie opiera się na zdolności niektórych wirusów, takich jak wirus białaczki myszy (MLV), do włączania glikoprotein otoczki do pp. Ponadto szczegółowo opisujemy, w jaki sposób te pps są oznaczane ilościowo za pomocą RT-qPCR oraz wykrywanie zakaźności natywnych i niedopasowanych wirusów pps w zależności od pochodzenia HA i NA. System ten jest bardzo elastyczny i adaptowalny i może być używany do tworzenia wirusowych pps z glikoproteinami otoczkowymi, które mogą być włączone do dowolnego innego typu wirusa otoczkowego. W ten sposób ta platforma cząstek wirusowych może być wykorzystywana do badania dzikich wirusów w wielu badaniach naukowych.

W zależności od opisanego powyżej ogólnego sposobu postępowania, wygenerowaliśmy 10 typów pps łączących dwie HA/NA z grupy H lub glikoproteinę VSV-G lub glikoproteiny bezotoczkowe (przedstawione w Tabela 1). Siedem z nich jest zakaźnych. Pseudotypowane cząstki (pps), które nie posiadały glikoproteiny otoczki lub posiadały wyłącznie NA, nie wykazały w tym przypadku zdolności do zakażania. Procedura produkcji pps grypy została przedstawiona w Rysunek 1Mikrografie z transmisyjn...

Ten protokół opisuje eksperymentalny proces wytwarzania zakaźnych cząsteczek pseudotypowych wirusa o wysokim mianie (pp) z glikoproteinami otoczkowymi z dwóch szczepów grypy A i jak określić ich zakaźność. Protokół ten jest wysoce elastyczny do tworzenia pps dowolnego innego typu wirusów otoczkowych z różnymi glikoproteinami otoczki.

Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Ta technika wytwarzania wirusa grypy PP i określania jego zakaźności może uprościć badania nad wirusem grypy w mieście BSL-2. Znormalizowaliśmy PPS dla infekcji na podstawie danych qRT-PCR PPS. Zakodowane są dwa plazmidy do ekspresji glikoproteiny, co może uprościć badania nad reasortacją wirusów.Jednego dnia po wysiewie komórek sprawdź morfologię i gęstość komórek pod mikroskopem odwróconego światła. Idealnie, komórka powinna być w około 85% zlewająca się podczas transfekcji. Zastąp pożywkę jednym mililitrem DMEM bez surowicy na dołek i włóż płytkę z powrotem do inkubatora.Dla każdej studzienki komórek, która ma być transfekowana, rozcieńczyć osiem mikrolitrów odczynnika do transfekcji do objętości 150 mikrolitrów zredukowaną pożywką surowicy. Delikatnie wymieszaj roztwór i pozostaw w temperaturze pokojowej na pięć minut. W międzyczasie rozcieńczyć 2,5 mikrograma plazmidowego DNA w 158 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy.Po pięciominutowej inkubacji połączyć rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji, delikatnie wymieszać roztwór i pozostawić w temperaturze pokojowej na 15 minut. Dodaj kompleks lipidowy DNA do odpowiednich studzienek z komórkami w pożywce bez surowicy. Następnie delikatnie wymieszaj talerz, kołysząc się w przód iw tył.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez cztery do sześciu godzin. Po inkubacji usuń pożywkę i zastąp ją dwoma mililitrami DMEM na studzienkę. Następnie inkubuj go przez kolejne 36 do 48 godzin.Wysiewaj każdy rodzaj podatnej komórki w 10 000 komórek na dołek i 96-dołkowej płytce. Następnie pozostaw płytkę na noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowej dwutlenku węgla. Trzeciego dnia po transfekcji sprawdź kolor pożywki, która powinna być jasnoróżowa lub lekko pomarańczowa i zbadaj komórki za pomocą odwróconego fluorescencyjnego mikroskopu biologicznego o długości fali od 440 do 460 nanometrów.Po 38 do 48 godzinach po transfekcji należy zebrać pseuotypowane cząstki lub PPS, przepuszczając je przez filtr membranowy z polifluorku winylidenu o średnicy 0,45 mikrometra w celu wyeliminowania resztek komórkowych, a następnie podzielić je na porcje o małej objętości i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby określić ilościowo PPS, przenieś 30 mikrolitrów oczyszczonych cząstek wirusa do 1,5 mikrolitrowej probówki wolnej od RNaz i dodaj jeden mikrolitr nukleazy benzonazy. Inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczenia DNA i RNA.Po inkubacji zamroź próbkę do minus 70 stopni Celsjusza, aby aktywować nukleazę i dodaj dwa mikrolitry proteinazy K. Inkubuj mieszaninę przez 30 minut, aby strawić białka otoczki i uwolnić CMV-GFP RNA. Następnie dezaktywuj proteinazę K w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Określ ilościowo PPS za pomocą ilościowej odwrotnej transkrypcji RTPCR przy użyciu zestawu Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit w starterach i sondach określonych w manuskrypcie tekstowym.Normalizuj PPS do czterech razy od 10 do piątych kopii RNA na mililitr. Następnie dodaj trypsynę TPCK do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr do PPS, który zawiera hemaglutyninę H7N9. Inkubować PPS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę, aby utworzyć podjednostki funkcjonalne HA1 i HA2.Wymieszać znormalizowany PPS z pożywką DMEM w stosunku jeden do jednego, a następnie przynieść płytkę zawierającą wrażliwe komórki do komory bezpieczeństwa biologicznego. Odessać supernatant i przemyć komórki raz 100 mikrolitrami wstępnie podgrzanego PBS. Dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny PPS-DMEM do każdej studzienki, trzykrotnie przeprowadzając testy zakaźności każdego typu PPS do jednej podatnej linii komórkowej.Inkubuj płytkę przez cztery do sześciu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie odessać supernatant i zastąpić go 100 mikrolitrami DCM Inkubować płytkę przez kolejne 24 do 36 godzin przed wykryciem zakaźności. Nasze wyniki są takie, że PPS są obecnie uważane za zakaźne dla ludzi.Dlatego zaleca się podjęcie niezbędnych procedur ochronnych, takich jak noszenie maski i wykonywanie testów zakaźności w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Protokół ten został wygenerowany w celu wygenerowania 10 typów pseudotypowanych cząstek lub PPS z dwiema grupowanymi hemaglutyninami i pęcherzykowym wirusem zapalenia jamy ustnej neuraminidazy glikoproteinami G lub glikoproteinami bez otoczki. PPS zobrazowano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, a ich zakaźność oceniono w dwóch liniach komórkowych, A549 i MDCK.W grupie PPS nosicieli H5 zakaźność H5N1, H5 plus N9 i H5 wynosiła odpowiednio około 90%18%i 10%dla linii komórkowej A549 oraz 40%5%i 5%dla MDCK. W grupie PPS nosicieli H7 zakaźność H7N9, H7 plus N1 i H7 wynosiła odpowiednio około 10%7%i 1%dla linii komórkowej A549 oraz 8%4%i 1%dla MDCK. Zakaźność wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej G glikoproteiny PP wynosiła około 21% dla A549 i 16% dla komórek MDCK.Podczas gdy glikoproteiny otoczki delta PP nie wykazywały zakaźności. Należy pamiętać, że podstawą tej procedury są ogniwa HEK-293T/17 producenta PP. Tak więc najważniejszy jest optymalny wzrost, którego uczą nas komórki HEK-293T/17.Postępując zgodnie z tą procedurą lub innym testem, takim jak receptura L2, można przeprowadzić test ograniczający. Ten test może prawie pozbyć się biologicznych osobliwości preferencji receptora, a wzór ujawni tropizm PPS. Ponieważ pobrali glikoproteiny z wirusa grypy są klonowane na dwa plus max.Białka HA i NA mogą być badane oddzielnie, dzięki czemu dokonujemy reasortacji między nimi. Można badać mutanty i dojrzałe efekty.

production-high-titer-infectious-influenza-pseudotyped-particles-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje generowanie cząsteczek wirusopodobnych do grypy (VLP) w organizmie ssaków. Po ekspresji trzech eukariotycznych wektorów ekspresyjnych - kodujących różne białka strukturalne wirusa - w odpowiednich komórkach gospodarza ssaków, wyrażone białka wirusowe samoorganizują się w VLP na błonie plazmatycznej gospodarza i uwalniają się poprzez pączkowanie z powierzchni komórki.

Technika wytwarzania cząstek podobnych do wirusa grypy przez system ssaków

Film prezentuje metodę tworzenia rekombinowanych wirusów grypy dostosowanych do zimna. Polega na transfekcji komórek ludzkich dwukierunkowymi plazmidami, a następnie inkubacji w niższej temperaturze w celu uzyskania wirusów odpowiednich do produkcji szczepionek, charakteryzujących się zmniejszoną replikacją w cieplejszych warunkach.

Wytwarzanie rekombinowanych, żywych, atenuowanych wirusów grypy do szczepionek

Tutaj opisujemy sposób na wyrażenie prawidłowo złożonych i funkcjonalnych antygenów powierzchniowych wirusa grypy pochodzących z nowego chińskiego wirusa H7N9 w komórkach owadów. Technikę tę można dostosować do ekspresji ektodomen dowolnych wirusowych lub komórkowych białek powierzchniowych.

Ekspresja funkcjonalnych rekombinowanych białek hemaglutyniny i neuraminidazy nowego wirusa grypy H7N9 przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

Opisujemy metodę, za pomocą której identyfikujemy krytyczne pozostałości wymagane do wiązania ludzkich lub mysich przeciwciał monoklonalnych, które celują w wirusową hemaglutyninę wirusów grypy A. Protokół można dostosować do innych glikoprotein powierzchniowych wirusa i odpowiadających im przeciwciał neutralizujących.

Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

Tutaj prezentujemy protokół generowania pseudotypowanych cząstek w ustawieniu BSL-2 zawierających białko kolca wysoce patogennych wirusów bliskowschodniego zespołu oddechowego i koronawirusów zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej. Te pseudotypowane cząstki zawierają gen reporterowy lucyferazy, który umożliwia ilościowe określenie wnikania wirusa do docelowych komórek gospodarza.

Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

Tutaj opisujemy protokół pakowania pseudowirusów i pomiaru aktywności neutralizującej przeciwciała.

Otrzymywanie pseudotypowych wirusów ptasiej grypy H5 metodą transfekcji fosforanu wapnia i pomiar aktywności neutralizującej przeciwciała

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do wyznaczania struktur białek błonowych z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej oraz trójwymiarowego przetwarzania obrazów. Obejmuje on szczegóły przygotowania preparatów, gromadzenia danych, ich przetwarzania i interpretacji, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla tej metody, jakim jest glikoproteina otoczki HIV-1. Procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający badaczom i studentom pracę zdalną oraz wkład w...

Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Zwalidowano i rozszerzono metodę konserwacji, detekcji i sekwencjonowania RNA wirusów grypy ptasiej, wykorzystując naturalne próbki odchodów ptaków. Technika ta eliminuje konieczność zachowania łańcucha chłodniczego oraz obchodzenia się z zakaźnymi wirusami i może być zastosowana w wysokoprzepustowym układzie 96-dołkowym.

Nadzór nad grypą ptaków z wykorzystaniem kart FTA: rozwiązanie problemów związanych z metodami terenowymi, bezpieczeństwem biologicznym i transportem

Poznaj metodę produkcji pseudotypowanych cząstek wirusa grypy o wysokim mianie z glikoproteinami H5N1 i H7N9. Protokół umożliwia ocenę zakaźności metodą qRT-PCR w warunkach BSL-2.

Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9 (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9

Przeglądaj więcej filmów