Name: Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metodę optycznego mapowania napięcia i wapnia w ludzkich wycinkach serca do przedklinicznych badań farmakologicznych. Technika ta umożliwia jednoczesny zapis potencjałów czynnościowych i transjentów wapniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie przez NIH (granty R21 EB023106, R44 HL139248 i R01 HL126802), przez fundację Leducq (projekt RHYTHM) oraz stypendium podoktorskie American Heart Association (19POST34370122) są wdzięczne za uznanie.

<ol><li>Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+animal+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Missouri+Medicine%22%5BJournal%5D)">A brief history of animal modeling.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).</li>
<li>Choudhary, A., Ibdah, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+today%27s+translational+medicine+world%5BTitle%5D)+AND+%22Missouri+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal models in today's translational medicine world.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).</li>
<li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+human+disease%3A+An+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%2C+Medicine%2C+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li>
<li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li>
<li>Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+neuroprotective+drugs+that+are+so+promising+in+animals+fail+in+the+clinic%3F+An+industry+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).</li>
<li>Shinnawi, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPCS+cell+modeling+of+inherited+cardiac+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331(2014).</li>
<li>Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+fiber-shaped+cardiac+tissue+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li>
<li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li>
<li>Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immature+electrophysiological+phenotype+of+iPSC-CMs+still+hampers+in+vitro+drug+screening%3A+Special+focus+on+IK1%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1.</a> Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+and+proliferation+of+mammalian+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes.</a> PloS One. 5 (9), 12559(2010).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10, 2168(2019).</li>
<li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10, 117(2019).</li>
<li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li>
<li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology+2%22%5BJournal%5D)">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).</li>
<li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices%3A+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798(2016).</li>
<li>Camelliti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+heart+slices+are+a+multicellular+system+suitable+for+electrophysiological+and+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).</li>
<li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts+-+A+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li>
<li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices+with+prolonged+survival+for+in+vitro+drug+safety+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).</li>
<li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Slices%3A+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).</li>
<li>Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supply+of+nutrients+to+cells+in+engineered+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Genetic+Engineering+Reviews%22%5BJournal%5D)">Supply of nutrients to cells in engineered tissues.</a> Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).</li>
<li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3275(2011).</li>
<li>Brianna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-Source+Multiparametric+Optocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Open-Source Multiparametric Optocardiography.</a> Scientific Reports. 9, 721(2019).</li>
<li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+cardiac+conduction+during+metabolic+ischemia+with+perfusate+sodium+and+calcium+in+guinea+pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).</li>
<li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109(2018).</li>
<li>Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cycle+length+dependence+of+human+action+potential+duration+in+vivo.+Effects+of+single+extrastimuli%2C+sudden+sustained+rate+acceleration+and+deceleration%2C+and+different+steady-state+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li>
<li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy metody krok po kroku uzyskiwania żywotnych wycinków serca z zatrzymanych sercowo serc ludzkich oraz funkcjonalnego charakteryzowania wycinków za pomocą podwójnego mapowania optycznego potencjału transbłonowego i wewnątrzkomórkowego wapnia. Dzięki zachowanemu środowisku zewnątrzkomórkowemu i natywnemu sprzężeniu komórka-komórka, ludzkie wycinki serca mogą być wykorzystywane jako dokładny model ludzkiego serca do fundamentalnych odkryć naukowych oraz do testowania skuteczności i kardiotoksycznoś...

Modele zwierzęce były cennym narzędziem używanym do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw ludzkiej fizjologii i patofizjologii, a także platformą do wstępnego testowania terapii różnych chorób1. Na podstawie tych badań na zwierzętach poczyniono wielkie postępy w dziedzinie badań biomedycznych2. Istnieją jednak znaczące różnice międzygatunkowe między fizjologią ludzi i zwierząt, w tym myszy, szczurów, świnek morskich, królików, owiec, świń i psów3,4. W rezultacie, istnieje wiele terapii lekowych, genowych i komórkowych, które okazały się obiecujące na etapie testów na zwierzętach, ale nie osiągnęły wyników w badaniach klinicznych5. Aby wypełnić tę lukę, opracowano izolowane miocyty serca i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) jako modele do testowania reakcji ludzkiej fizjologii na różne leki i choroby6. Kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych są szeroko stosowane w systemach typu organ-on-a-chip jako substytut serca6,7,8. Jednak przydatność kardiomiocytów pochodzących z iPSC (iPSC-CM) jest utrudniona przez ich stosunkowo niedojrzały fenotyp i brak reprezentacji subpopulacji kardiomiocytów; Dojrzały mięsień sercowy to złożona struktura składająca się z kilku współistniejących typów komórek, takich jak fibroblasty, neurony, makrofagi i komórki śródbłonka. Z drugiej strony, izolowane ludzkie kardiomiocyty są elektrycznie dojrzałe, a różne subpopulacje kardiomiocytów można uzyskać, zmieniając parametry hodowli9. Mimo to miocyty te na ogół wykazują zmienioną morfologię potencjału czynnościowego z powodu braku sprzężenia komórka-komórka, szybkiego odróżnicowania i występowania zachowań proarytmicznych in vitro10,11. Niektóre z tych ograniczeń zostały rozwiązane za pomocą modeli hodowli komórkowych 3D iPSC-CM i miocytów serca. Modele te, które obejmują sferoidy, hodowle 3D w kapsułkach z rusztowaniami hydrożelowymi, zmodyfikowane tkanki serca (EHT) i systemy serca na chipie, wykorzystują wiele populacji komórek serca, takich jak kardiomiocyty, fibroblasty i komórki śródbłonka. Albo same się organizują, albo montują wzdłuż rusztowania, tworząc struktury 3D, a niektóre nawet odtwarzają złożoną anizotropową naturę mięśnia sercowego. Doniesiono, że modele te mają komórki o dojrzałych fenotypach, właściwościach kurczliwych i profilach molekularnych podobnych do tkanki serca. System Heart-on-a-Chip pozwala również na badanie skutków ogólnoustrojowych w testach leków i modelach chorób. Jednak modele komórkowe oparte na in vitro nie mają natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej i dlatego nie mogą dokładnie naśladować elektrofizjologii na poziomie narządów. Z kolei ludzkie plastry serca mają nienaruszoną macierz zewnątrzkomórkową i natywne kontakty międzykomórkowe, co czyni je przydatnymi do dokładniejszego badania arytmogennych właściwości ludzkiego mięśnia sercowego.
Badacze opracowali organiczne wycinki ludzkiego serca jako fizjologiczną platformę przedkliniczną do testowania leków ostrych i przewlekłych oraz do badania elektrofizjologii serca i progresji chorób serca12,13,14,15,16,17,18,19. W porównaniu z kardiomiocytami pochodzącymi z iPSC, wycinki ludzkiego serca wierniej odwzorowują elektrofizjologię serca dorosłego człowieka z dojrzałym fenotypem kardiomiocytów. W porównaniu z izolowanymi ludzkimi kardiomiocytami, wycinki serca wykazują czas trwania fizjologicznego potencjału czynnościowego ze względu na dobrze zachowane sprzężenie komórka-komórka i nieodłączne istnienie ich rodzimych środowisk wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych.
Ten protokół opisuje proces generowania wycinków ludzkiego serca z całych serc dawców, przeprowadzając ostre (tj. wielogodzinne) i przewlekłe (tj. dniowe) badania w celu sprawdzenia parametrów elektrofizjologii serca za pomocą mapowania optycznego. Chociaż protokół ten opisuje tylko użycie tkanki lewej komory (LV), został z powodzeniem zastosowany do innych regionów serca, a także innych gatunków, takich jak myszy, szczury, świnki morskie i świnie14,20,21,22. Nasze laboratorium wykorzystuje całe ludzkie serca dawców, które zostały odrzucone do przeszczepu w ciągu ostatnich 5 lat, ale możliwe jest przeprowadzenie tych samych procedur na dowolnych próbkach serca dawcy pobranych w inny sposób (np. implantacje urządzenia wspomagającego lewą komorę [LVAD], biopsje, miektomia), o ile tkanki te mają możliwość podzielenia na kostki. Mapowanie optyczne jest wykorzystywane do analizy w tym badaniu ze względu na jego zdolność do jednoczesnego mapowania potencjałów czynnościowych i stanów przejściowych wapnia z wysoką rozdzielczością przestrzenną (100 x 100 pikseli) i czasową (>1000 klatek/s). Można również stosować metody alternatywne, takie jak matryce wieloelektrodowe (MEA) lub mikroelektrody, ale techniki te są ograniczone przez ich stosunkowo niską rozdzielczość przestrzenną. Ponadto MEA zostały zaprojektowane do stosowania z hodowlami komórkowymi, a ostre mikroelektrody są łatwiejsze w obsłudze w przypadku całych serc lub dużych klinów tkankowych.
Celem artykułu jest umożliwienie większej liczbie badaczy wykorzystania tkanek ludzkiego serca do badań elektrofizjologii serca. Należy zauważyć, że technologia opisana w tym artykule jest stosunkowo prosta i korzystna dla badań krótkoterminowych (rzędu kilku godzin do dni). Bardziej fizjologiczna kultura biomimetyczna do badań długoterminowych (rzędu tygodni) została omówiona i opisana w wielu innych badaniach12,18,23. Stymulacja elektryczna, obciążenie mechaniczne i rozciąganie tkanek są korzystnymi mechanizmami kondycjonującymi, które mogą pomóc ograniczyć początek przebudowy tkanek in vitro12,18,23.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml BD</td><td>Thomas Scientific</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>2,3-butanodion monoksymus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki hodowlane</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1377</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Cayman</td><td>13186</td><td></td></tr><tr><td>Pułapka bąbelkowa</td><td>Radnoti</td><td></td><td></td>130149</tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Filtry siatkowe Corning Cell</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>Di-4-ANEPPS</td><td>Roztwór podstawowy biotu</td><td></td><td>w stężeniu 1,25 mg/ml w DMSO</td></tr><tr><td>DMSO Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze #3c Dumont</td><td>Narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Emisyjne zwierciadło dichroiczne</td><td>Chroma</td><td>T630LPXR-UF1</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny (RH237)</td><td>Filtr emisyjny Chroma</td><td>ET690/50m</td><td></td></tr><tr><td>(Rhod2AM)</td><td>Chroma</td><td>ET590/33m</td><td></td></tr><tr><td>Wzbudzenie zwierciadło dichroiczne</td><td>Chroma</td><td>T550LPXR-UF1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Chroma</td><td>ET500/40x</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Wymiennik ciepła</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50145502</td><td></td></tr><tr><td>Insulina Transferyna Selen (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła wzbudzenia LED</td><td>Prizmatix</td><td>UHP-Mic-LED-520</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11150059</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CMOS Micam Ultima L typ Scimedia</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Pennicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07522-20</td><td></td></tr><tr><td>Platynowy drut stymulacyjny</td><td>Alfa Aesar</td><td>43275</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P6867</td><td>niejonowy, surfaktantowy poliol</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Dane Powerlab akwizycja i stymulator</td><td>AD Instruments</td><td>Powerlab 4/26</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator, sucha kulka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z378550</td><td></td></tr><tr><td>Kamienny dyfuzor tlenu</td><td>Drewno wodne</td><td>B00O0NUVM0</td><td></td></tr><tr><td>TissueSeal - Histoacryl Miejscowy klej do skóry</td><td>gobiomed</td><td>AESCULAP</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy sonograf</td><td></td><td>Branson 1800</td><td></td></tr><tr><td>Wibratome</td><td>Campden Instrumenty</td><td>7000 smz</td><td></td></tr></tbody></table>

przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Preparaty do badań nad ludzkim sercem zostały ostatnio opracowane jako platforma do badań fizjologii człowieka i testowania terapii, aby wypełnić lukę między badaniami na zwierzętach a badaniami klinicznymi. Do zbadania działania leków wykorzystano liczne modele zwierzęce i komórkowe, jednak reakcje te często różnią się u ludzi. Plastry ludzkiego serca mają przewagę w testach narkotykowych, ponieważ pochodzą bezpośrednio z żywotnych ludzkich serc. Oprócz zachowanych struktur wielokomórkowych, sprzężenia komórka-komórka i środowiska macierzy zewnątrzkomórkowej, wycinki ludzkiej tkanki serca mogą być używane do bezpośredniego testowania wpływu niezliczonych leków na fizjologię serca dorosłego człowieka. To, co odróżnia ten model od innych preparatów na serce, takich jak całe serca czy kliny, to fakt, że plastry można poddawać długotrwałej hodowli. W związku z tym plastry serca pozwalają na badanie zarówno ostrych, jak i przewlekłych skutków leków. Co więcej, możliwość zebrania od kilkuset do tysiąca wycinków z jednego serca sprawia, że jest to model o wysokiej przepustowości do testowania kilku leków w różnych stężeniach i kombinacjach z innymi lekami w tym samym czasie. Plastry można przygotować z dowolnego obszaru serca. W tym protokole opisujemy przygotowanie plastrów lewej komory poprzez wyizolowanie kostek tkankowych z wolnej ściany lewej komory i podzielenie ich na plasterki za pomocą precyzyjnego mikrotomu wibracyjnego. Plastry te można następnie poddać ostrym eksperymentom w celu zmierzenia wyjściowej funkcji elektrofizjologicznej serca lub wyhodować do badań nad lekami przewlekłymi. Protokół ten opisuje również podwójne mapowanie optyczne wycinków serca w celu jednoczesnego rejestrowania potencjałów transbłonowych i wewnątrzkomórkowej dynamiki wapnia w celu określenia skutków badanych leków.

Ludzkie skrawki organotypowe pobrano z lewej komory serca ludzkiego dawcy zgodnie z protokołem opisanym powyżej i zilustrowanym na Rysunku 1. Do jednoczesnego mapowania optycznego napięcia i wapnia, około 1 h po zakończeniu protokołu skrawkowania, wykorzystano dwukamerowy system mapowania optycznego w konfiguracji obrazowania pionowego, przedstawiony na Rysunku 2. Dane analizowano za pomocą oprogramowania RHYTHM1.2 (Rysunek 3), otwa...

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ zapewnia naukowcom umiejętności wykorzystania ludzkich serc dawców do przedklinicznych testów fizjologicznych leków. Tkanka ta wykorzystuje zarówno barwniki napięciowe, jak i wapniowe do jednoczesnej charakterystyki potencjałów czynnościowych serca i wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia w wycinkach tkanki ludzkiej. Aby skonfigurować system mapowania optycznego, przymocuj kąpiel tkankową z dolną warstwą żelu polidimetylosiloksanowego do systemu perfuzyjnego i cyrkuluj jeden litr roztworu regeneracyjnego w temperaturze 37 stopni Celsjusza natlenionego 100% tlenem przez system perfuzyjny z natężeniem przepływu wystarczająco szybkim, aby utrzymać temperaturę i zapobiec gromadzeniu się perfuzatu w kąpieli.Następnie użyj tarczy, aby dostosować ostrość i wyrównanie dwóch kamer CMOS i użyj zielonego źródła światła LED o długości fali 520 plus minus pięć nanometrów, aby jednocześnie wzbudzić barwniki wrażliwe na napięcie i wskaźnik wapnia. Przed uzyskaniem skrawków tkanek wymieszaj zamrożony i płynny roztwór kardioplegii i umieść tkankę serca w lodowatej kąpieli kardioplegii i zidentyfikuj wolną ścianę lewej komory. Przyklej gotowy żel agarozow

preclinical-cardiac-electrophysiology-assessment-dual-voltage-calcium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Niniejszy artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania oraz podwójnej modalności obrazowania (napięciowego i wapniowego).

Multiparametryczne mapowanie optyczne serca królika perfundowanego metodą Langendorffa

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Ten artykuł opisuje technikę używaną do wykonywania dwukanałowego mapowania optycznego w monowarstwach hodowlanych komórek przedsionkowych HL-1. Ten unikalny protokół umożliwia jednoczesną wizualizację zarówno aktywności wapnia (Ca), jak i napięcia (Vm) w tym samym obszarze w celu szczegółowego wykrywania i analizy właściwości elektrofizjologicznych monowarstw kultur.

Dwukanałowe mapowanie optyczne napięcia i wapnia w monowarstwie miocytów przedsionkowych HL-1 z hodowlą

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Ten protokół opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków myszy za pomocą optycznego systemu mapowania o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, w tym podwójne zapisy napięcia membranowego i Ca2+ przejściowego pod zaprogramowaną stymulacją przez specjalistyczny cewnik elektrodowy.

Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości

Tutaj prezentujemy protokół modulacji wewnątrzsercowego autonomicznego układu nerwowego i oceny jego wpływu na podstawową elektrofizjologię, arytmogenezę i dynamikę cAMP przy użyciu układu Langendorffa ex vivo.

Wpływ neuronów wewnątrzsercowych na elektrofizjologię serca i arytmogenezę w układzie Langendorffa ex vivo

Celem tego badania było ustalenie metody badania dynamiki serca za pomocą translacyjnego modelu zwierzęcego. Opisane podejście eksperymentalne obejmuje optokardiografię podwójnej emisji w połączeniu z badaniem elektrofizjologicznym w celu oceny aktywności elektrycznej w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Przedstawiamy protokół oceny elektromechanicznych efektów aktywacji GtACR1 w kardiomiocytach królików. Dostarczamy szczegółowych informacji na temat izolacji komórek, hodowli i transdukcji adenowirusa oraz na temat eksperymentów funkcjonalnych z użyciem technik patch-clamp i włókna węglowego.

Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Ten protokół wprowadza dwubarwne optyczne mapowanie serc myszy uzyskanych od zwierząt typu dzikiego i knock-in dotkniętych katacholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym, w tym elektrofizjologiczne pomiary napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2+ o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej.

Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym

Poznaj metodę optycznego mapowania napięcia i wapnia w ludzkich wycinkach serca do przedklinicznych badań farmakologicznych. Technika ta umożliwia jednoczesny zapis potencjałów czynnościowych i transjentów wapniowych.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca (Wideo) | JoVE Journal

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Przeglądaj więcej filmów