Name: Wywoływanie owłosionych korzeni przez przemianę za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes w gryce winnej (Fagopyrum tataricum) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę indukcji owłosionych korzeni w gryce winnej Fagopyrum tataricum poprzez przemianę z użyciem Agrobacterium rhizogenes. Prosta technika umożliwia badania genomowe i mikrobiomowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundusze Badań Podstawowych dla Centralnych Instytutów Badawczych Opieki Społecznej ZXKT17002.

Gruźlica użyta w tym badaniu została nazwana jako BT18, która pochodzi od rasy "JinQiao No.2" uprawianej przez Centrum Badawcze Małych Różnych Ziaren Akademii Nauk Rolniczych w Shanxi. Podstawowe kroki tego protokołu są zilustrowane w Rysunek 1.
UWAGA: Szybko manipuluj eksplantatami, a jeśli to możliwe, trzymaj szalki Petriego zamknięte, aby uniknąć więdnącego i zanieczyszczonego. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie inkubacje eksplantatów przeprowadzono w warunkach 14-godzinnego światła i 10-godzinnego ciemnego fotoperiodu w temperaturze 25 °C. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie operacje związane z eksplantatami lub bakteriami przeprowadzono w warunkach aseptycznych w okapie z przepływem laminarnym. Wszystkie składniki pożywek dla A. rhizogenes i kultur roślinnych uzyskanych metodą in vitro przedstawiono w tabeli 1. Po dostosowaniu pH wszystkie media sterylizowano w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 20 minut. Zestalone podłoża przygotowywano poprzez wlanie 25 ml pożywki do szalki Petriego o średnicy 9 cm i pozostawienie jej do zestalenia.
UWAGA: Umieść wszystkie genetycznie zmodyfikowane bakterie i rośliny w odpowiednim pojemniku na odpady. Wszystkie niebezpieczne chemikalia należy przechowywać w dygestoriach i umieszczać w pojemniku na odpady niebezpieczne.
1. Przygotowanie eksplantatów gruźlicy
<ol>
	<li>Przygotowanie nasion gruźlicy
	<ol>
		<li>Wybierz pulchne i nieuszkodzone nasiona gruźlicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A1), które były przechowywane w temperaturze poniżej −20 °C nie dłużej niż 2 lata.</li>
		<li>Namocz nasiona w wodzie o temperaturze 28 °C przez około 20 minut, aby można było łatwo zdjąć okrywę nasienną (Rysunek 1A2). W razie potrzeby użyj nożyczek, aby wyciąć szczelinę na nasionach, aby ułatwić obieranie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterylizacja nasion gruźlicy
	<ol>
		<li>Umieść 100–200 obranych nasion w wysterylizowanej kolbie stożkowej o pojemności 100 ml.</li>
		<li>Zdezynfekuj nasiona za pomocą 75% etanolu przez 30 s.</li>
		<li>Zastąp etanol 5% podchlorynem sodu i dezynfekuj przez 15 min. 
		UWAGA: Dezynfekcja przy użyciu wodorochlorku rtęci w stężeniu 1 g/L przez 8 min może być stosowana jako alternatywny sterylizator zastępujący podchloryn sodu w każdym przypadku nieodpowiedniej sterylizacji. 
		UWAGA: Wodorochlorek rtęci jest materiałem niebezpiecznym i nieprzyjaznym dla środowiska. Umieść go w dymiącej szafce i wrzuć do pojemnika na odpady niebezpieczne, jeśli w każdym przypadku używany jest wodorochlorek rtęci.</li>
		<li>Wylej podchloryn sodu.</li>
		<li>Umyj nasiona sterylną wodą dejonizowaną 5 razy.</li>
		<li>Osusz nasiona sterylnym bibulous paperem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie sadzonek gruźlicy
	<ol>
		<li>Przygotować 50 ml pożywki podstawowej Murashige and Skoog (MS) (1962) uzupełnionej 30 g/l sacharozy i 7 g/l proszku agarowego (MSSA) (Tabela 1) w 300 ml butelki do hodowli tkanek roślinnych.</li>
		<li>Dostosuj pH do 5,8 przed autoklawowaniem.</li>
		<li>Rozprowadź 10 nasion równomiernie na butelkę podłoża MSSA.</li>
		<li>Nasiona kiełkować w pomieszczeniu hodowlanym w temperaturze 25 °C ± 1 °C w warunkach świetlnych przez 7–10 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie sterylnych eksplantatów
	<ol>
		<li>Wybierz wytrzymałe siewki gruźlicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), gdy 2 kawałki liścieni są rozłożone.</li>
		<li>Odetnij sadzonki od korzeni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C groty strzałek z czerwoną kreską), unikając kontaktu z podłożem.</li>
		<li>Umieść je na sterylnej szalce Petriego.</li>
		<li>Pokrój hipokotyle na segmenty o długości 0,8–1 cm, a liścienie zetnij na około 0,5 cm kawałki.</li>
		<li>Hodowla wstępna tych eksplantatów na pożywce MSSA w warunkach świetlnych przez 24 godziny.</li>
		<li>Przenieś je do wysterylizowanej kolby stożkowej o pojemności 100 ml, która jest teraz gotowa do infekcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie A. rhizogenes do przemiany
UWAGA: Szczep A. rhizogenes ACCC10060 został udostępniony przez Instytut Rozwoju Roślin Leczniczych i zachowany w temperaturze -80 °C. A. rhizogenes został przekształcony za pomocą wektora binarnego pK7GWIWG2D (II), który zawiera T-DNA zawierające gen b4 towarzyszący GFP jako gen wskaźnikowy i gen oporności Kan jako marker selektywny. Gen b4 należy do rodziny czynników transkrypcyjnych bHLH, która nie została jeszcze opublikowana. Aby ocenić potencjał owłosionych korzeni gruźlicy, A. rhizogenes poddano transformacji za pomocą wektora binarnego pK7WG2D zawierającego gen MYB116 w celu zbadania jego wpływu na produkcję metabolitów wtórnych, takich jak flawonoidy, na poziomie ekspresji genów i za pomocą analiz metabolicznych. Aktywowane A. rhizogenes powinny być dobrze przygotowane w tym samym czasie co eksplantaty.
<ol>
	<li>Aktywacja A. rhizogenes
	<ol>
		<li>Rozmrozić A. rhizogenes na lodzie</li>
		<li>Zanurz bakterie i ułóż je równomiernie na pożywce z mannitolem drożdżowym (YEB) uzupełnionej 15 g/l proszku agarowego, 50 mg/l ryfampicyny i 50 mg/l spektynomycyny (YEBARS, pH 7,0).</li>
		<li>Inkubować bakterie w temperaturze 28 °C przez 12–16 godzin.</li>
		<li>Wybierz kolonię monoklonalną i hoduj ją na innej szalce Petriego w ten sam opisany powyżej sposób.</li>
		<li>Wybrać kolonie monoklonalne i hodować je w 100 ml wysterylizowanej kolbie stożkowej zawierającej 20 ml pożywki YEB uzupełnionej 50 mg/l ryfampicyny i 50 mg/l spektynomycyny (YEBRS, pH 7,0) w temperaturze 28 °C i 200 obr./min przez 16–18 godzin, aż wartość OD600 osiągnie 2,0.</li>
		<li>Inkubować 2%-4% wyżej wymienionej kultury w innej stożkowej kolbie o pojemności 100 ml zawierającej 20 ml pożywki YEBRS w temperaturze 28 °C i 200 obr./min przez 4-5 godzin, aż wartość OD600 osiągnie około 0,5 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zakażenie i badania przesiewowe eksplantatów gruźlicy
UWAGA: Celem tego protokołu jest uzyskanie genetycznie przekształconych owłosionych korzeni. Korzenie typu dzikiego wykorzystano jako kontrolę negatywną do oceny ekspresji transgenicznej. W tym protokole A. rhizogenes został przekształcony z wektorem binarnym albo pK7WG2D niosącym gen FtMYB116, albo pK7GWIWG2D (II) przenoszącym gen b4 z wyprzedzeniem.
<ol>
	<li>Ponowne zawieszenie A. rhizogenes
	<ol>
		<li>Przenieść kulturę otrzymaną w kroku 2.1.6 do wysterylizowanej probówki odśrodkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wirować z prędkością 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny za pomocą pożywki MS uzupełnionej 30 g/l sacharozy i 300 μM acetosyringonu (AS) (MSSAS, pH 5,8) do OD600 ≈ 0,2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie eksplantatów
	<ol>
		<li>Zawiesinę bakteryjną otrzymaną w kroku 3.1.3 należy wprowadzić do stożkowej kolby zawierającej eksplantaty przygotowane w kroku 1.4.6 przez 10 minut (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
		<li>Wyjmij eksplantaty i osusz je sterylnym bibulous paperem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kokultura eksplantatów z A. rhizogenes
<ol>
	<li>Umieścić sterylną bibułę filtracyjną o średnicy 9 cm na pożywce MS, która jest zestalana przy użyciu 7 g/l proszku agarowego uzupełnionego 30 g/l sacharozy i 100 μM AS (pożywka MSSAAS, pH 5,2).</li>
	<li>Nakładaj eksplantaty na bibułę filtracyjną w temperaturze 25 °C przez 3 dni w ciemności (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F).</li>
</ol>
5. Indukcja i selektywna hodowla
<ol>
	<li>Umieść około 20 zakażonych eksplantatów na pożywce MSSA uzupełnionej cefotaksymem 500 mg/l i 50 mg/l kanamycyny (Kan) (MSSACK, pH 5,8) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1G).</li>
	<li>Inkubować je pionowo w warunkach oświetleniowych w temperaturze 25 °C ± 1 °C. Owłosione korzenie pojawiają się około 1 tygodnia po inkubacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H czarne groty strzałek wskazują na występowanie owłosionych korzeni). 
	UWAGA: W razie potrzeby należy wymieniać podłoże MSSACK co 15 dni.</li>
</ol>
6. Hodowla owłosionych korzeni gruźlicy
UWAGA: Ta procedura ma na celu zebranie energicznych, owłosionych korzeni. Regularnie obserwuj wzrost owłosionych korzeni podczas rozmnażania i usuwaj zanieczyszczone i inaktywowane w odpowiednim czasie. W razie potrzeby powtórz następujące kroki, aby rozmnożyć bardziej owłosione korzenie. Od uprawy do zbiorów mija około 10–14 dni.
<ol>
	<li>Wybierz owłosione korzenie o białym wyglądzie i szybkim wzroście.</li>
	<li>Pokrój je na kawałki o długości 2-3 cm.</li>
	<li>Wyraźnie ponumeruj ich na czystej ławce.</li>
	<li>Posadź je w 100 ml wysterylizowanej kolbie stożkowej zawierającej 5 ml pożywki MS uzupełnionej 30 g/l sacharozy i 50 mg/l Kan (MSSK, pH 5,8) z prędkością obrotową 80 obr./min w temperaturze 25 °C w ciemności, aż rozprzestrzenią się na dno kolby (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1I).</li>
</ol>
7. Identyfikacja przekształconych owłosionych korzeni i konserwacja
UWAGA: Przekształcone owłosione korzenie można zidentyfikować na podstawie aspektów morfologii i poziomu genów. Identyfikację można również przeprowadzić na podstawie genomu korzenia owłosionego i odporności, które nie są objęte tym protokołem. Procedura ta koncentruje się przede wszystkim na identyfikacji genu reporterowego i genu docelowego.
<ol>
	<li>Usuń płowe i zanieczyszczone owłosione korzenie i wybierz te o białym wyglądzie.</li>
	<li>Oceń, czy występuje zielona fluorescencja pod niebieskim/jasnym podwójnym transiluminatorem ultrafioletowym.</li>
	<li>Owłosione korzenie należy wybrać w ponumerowanych probówkach lub owinąć oznaczoną folią aluminiową po wysuszeniu ich chłonnym papierem.</li>
	<li>Liofilizować je w ciekłym azocie, a następnie przechowywać wszystkie zbiory w temperaturze -80 °C do dalszych badań.</li>
	<li>Identyfikacja genów
	<ol>
		<li>Rozetrzeć 0,1 g owłosionych korzeni na drobny proszek w ciekłym azocie.</li>
		<li>Przygotować genomowe DNA niezależnych transgenicznych linii gruźlicy przy użyciu zmodyfikowanej metody bromku cetyltrimetyloamoniowego (CTAB)25 zgodnie z instrukcją producenta zestawu roślinnego genomowego DNA.</li>
		<li>Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu 100 ng matrycy genomowego DNA i starterów wymienionych w tabeli 2.</li>
		<li>Cykl amplifikacji należy przeprowadzić w następujący sposób: denaturacja wstępna w temperaturze 94 °C przez 5 minut, denaturacja w temperaturze 94 °C przez 30 s, wyżarzanie podkładu w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużanie podkładu w temperaturze 72 °C przez 30 s. Po 36 cyklach i końcowym etapie przedłużania w temperaturze 72 °C przez 10 minut, przeanalizować produkty amplifikacji na 1% żelach agarozowych.</li>
		<li>Zabarwić żele barwieniem kwasów nukleinowych i uwidocznić je w świetle UV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fabjan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartary+Buckwheat+%28+Fagopyrum+tataricum+Gaertn+.%29+as+a+Source+of+Dietary+Rutin+and+Quercitrin%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin.</a> Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).</li>
<li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Phenolic+Compounds+in+Hairy+Root+Culture+of+Tartary+Buckwheat+%28Fagopyrum+tataricum+Gaertn%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crop+Science+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn).</a> Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-chiro-inositol-enriched+tartary+buckwheat+bran+extract+lowers+the+blood+glucose+level+in+KK-Ay+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).</li>
<li>Giri, A., Narasu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+hairy+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Transgenic hairy roots.</a> Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-induced+transcription+factor+FtMYB116+promotes+accumulation+of+rutin+in+Fagopyrum+tataricum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum.</a> Plant, Cell & Environment. 42, (2018).</li>
<li>Chilton, M. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+thizogenes+inserts+T-DNA+into+the+genomes+of+the+host+plant+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells.</a> Nature. 295 (4), 129(1982).</li>
<li>Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+Roots%3A+a+Powerful+Tool+for+Plant+Biotechnological+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Molecules+and+Medicinal+Plants%22%5BJournal%5D)">Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances.</a> Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).</li>
<li>Srivastava, S., Srivastava, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+culture+for+mass-production+of+high-value+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).</li>
<li>Veena, V., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes%3A+Recent+developments+and+promising+applications%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+and+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).</li>
<li>Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+cultures%3A+Chemical+factories+of+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites.</a> Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).</li>
<li>Palazón, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+Ginsenoside+Production+in+Hairy+Root+Cultures+of+Panax+ginseng+using+a+Novel+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor.</a> Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).</li>
<li>Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elicitation+of+secondary+metabolites+in+in+vitro+cultures+of+Ammi+majus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+and+Microbial+Technology%22%5BJournal%5D)">Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L.</a> Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).</li>
<li>Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbicidal+activity+of+phenolic+compounds+from+hairy+root+cultures+of+Fagopyrum+tataricum%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum.</a> Weed Research. 52, 25-33 (2011).</li>
<li>Christey, M. C., Braun, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hairy+root+cultures+and+transgenic+plants+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 286, Clifton, N.J. 47-60 (2005).</li>
<li>Olhoft, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+method+of+soybean+%5BGlycine+max+%28L.%29+Merrill%5D+using+primary-node+explants+from+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+and+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).</li>
<li>Kereszt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+soybean+to+study+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology.</a> Nature Protocols. 2 (4), (2007).</li>
<li>Pistelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPistelli%2C+L+%22Bio-Farms+for+Nutraceuticals%3A+Functional+Food+and+Safety+Control+by+Biosensors%22">Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors</a>. , Chapter 13 (2010).</li>
<li>Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+culture+of+Plumbago+indica+as+a+potential+source+for+plumbagin%5BTitle%5D)+AND+%22Biologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin.</a> Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).</li>
<li>Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+Hairy+Root+Transformation+in+lotus+Japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus.</a> Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).</li>
<li>Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+genetic+transformation+in+Cichorium+intybus+L.+via+removing+macronutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+Crops+and+Products%22%5BJournal%5D)">High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients.</a> Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).</li>
<li>Fernández-piñán, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Potato+and+the+Promoter+Activity+of+a+Suberin+Gene+by+GUS+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining.</a> Journal Of Visualized Experiments. , e1(2019).</li>
<li>Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transgenic+hairy+root+system+in+jute+%28Corchorus+capsularis+L.%29+with+gusA+reporter+gene+through+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+co-transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation.</a> Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).</li>
<li>Sirikantaramas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+controlling+marijuana+psychoactivity.+Molecular+cloning+and+heterologous+expression+of+%CE%941-tetrahydrocannabinolic+acid+synthase+from+Cannabis+sativa+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).</li>
<li>Zhou, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Functional+Genes+in+Buckwheat%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding+and+Nutritional+Aspects+of+Buckwheat%22%5BJournal%5D)">Characterization of Functional Genes in Buckwheat.</a> Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).</li>
<li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Analysis+of+the+Chloroplast+Genomes+of+Four+Salvia+Medicinal+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering%22%5BJournal%5D)">A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants.</a> Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).</li>
<li>Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+the+PaAP1+gene+from+sweet+cherry+%28Prunus+avium+L.%29+causes+early+flowering+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Flavonoid+Metabolites+in+Buckwheat+Leaves+Using+UPLC-ESI-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. , (2019).</li>
<li>Zhu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+and+health+effects+of+Tartary+buckwheat%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat.</a> Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).</li>
<li>Kaur, B., Malik, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+culture+-a+unique+source+for+metabolites+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Hairy root culture -a unique source for metabolites production.</a> Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).</li>
<li>Thwe, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+Analysis+and+Phenylpropanoid+Biosynthesis+in+Hairy+Root+Culture+of+Tartary+Buckwheat+Cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars.</a> Plos One. 8 (6), (2013).</li>
<li>Thwe, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+Phenylpropanoids+and+Correlated+Gene+Expression+in+Hairy+Roots+of+Tartary+Buckwheat+under+Light+and+Dark+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jasmonate-responsive+MYB+factors+spatially+repress+rutin+biosynthesis+in+Fagopyrum+tataricum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum.</a> Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtSAD2+and+FtJAZ1+regulate+activity+of+the+FtMYB11+transcription+repressor+of+the+phenylpropanoid+pathway+in+Fagopyrum+tataricum%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum.</a> New Phytologist. 216, (2017).</li>
<li>Giri, A., Narasu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+hairy+roots%3A+Recent+trends+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Transgenic hairy roots: Recent trends and applications.</a> Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).</li>
<li>Thwe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+Agrobacterium+rhizogenes+strains+on+hairy+root+induction+and+phenylpropanoid+biosynthesis+in+tartary+buckwheat+%28Fagopyrum+tataricum+Gaertn%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn).</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).</li>
<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-mediated+repression+of+SmCPS+%28copalyldiphosphate+synthase%29+expression+in+hairy+roots+of+Salvia+miltiorrhiza+causes+a+decrease+of+tanshinones+and+sheds+light+on+the+functional+role+of+SmCPS%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS.</a> Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Rutin+and+Quercetin+Biosynthesis+through+Flavonoids-Related+Gene+Expression+in+Fagopyrum+tataricum+Gaertn+.+Hairy+Root+Cultures+with+UV-B+Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).</li>
<li>Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+acetosyringone+and+pH+on+Agrobacterium-mediated+transformation+vary+according+to+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species.</a> Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).</li>
<li>Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+signal+molecules+produced+by+wounded+plant+cells+that+activate+T-DNA+transfer+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens.</a> Nature. 318 (19), (1985).</li>
<li>Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Phenolic+Compounds+Induce+Expression+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+loci+needed+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence.</a> Science. 232 (10), 983-985 (1986).</li>
<li>Ferri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+treatment+induces+changes+of+protein+expression+profile+and+stilbene+distribution+in+Vitis+vinifera+cell+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions.</a> Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).</li>
<li>Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+plant+secondary+metabolites%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Production of plant secondary metabolites: a historical perspective.</a> Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).</li>
<li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).</li>
<li>Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+potato+hairy+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots.</a> Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Gruźlica została wykorzystana w kilku badaniach związanych z metabolitami wtórnymi na poziomie genetycznym i metabolicznym 1,2,5,27,28. Kultura owłosionych korzeni, jako unikalne źródło produkcji metabolitów, odgrywa kluczową rolę w inżynierii metabolicznej29 i może być wykorzystywana do zmiany szlaków metabolicznych poprzez wprowadzen...

Gryka tatarialna (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) to typ dwuliścienny należący do rodzaju Fagopyrum i rodziny Polygonaceae1. Gruźlica, jako rodzaj homologicznego pokarmu medycyny chińskiej, cieszy się dużym zainteresowaniem ze względu na swój charakterystyczny skład chemiczny i różnorodną bioaktywność przeciwko chorobom. Gruźlica jest przede wszystkim bogata w węglowodany, białka, witaminy i karotenoidy, a także w polifenole, takie jak kwasy fenolowe i flawonoidy1. Wykazano różne biologiczne i farmakologiczne działania flawonoidów, w tym przeciwutleniające, przeciwnadciśnieniowe2 oraz przeciwzapalne, przeciwnowotworowe i przeciwcukrzycowe3.
Agrobacterium rhizogenes to bakteria glebowa, która przyczynia się do rozwoju choroby owłosionych korzeni u kilku roślin wyższych, zwłaszcza dwuliściennych, poprzez infekowanie miejsc ran4,5. Proces ten jest inicjowany przez transfer T-DNA w plazmidzie indukującym korzenie (Ri) class5,6 i zwykle towarzyszy mu integracja i ekspresja egzogennego genu z plazmidu Ri oraz kolejne etapy generowania fenotypu owłosionego korzenia7. Transgeniczne korzenie włochate, w których pośredniczy A. rhizogenes, jako potężne narzędzie w dziedzinie biotechnologii roślin, są najczęściej stosowane ze względu na ich stabilną i wysoką produktywność oraz łatwość uzyskania w krótkim czasie. Co więcej, owłosione korzenie indukowane przez A. rhizogenes są skutecznie odróżniane przez plagiotropowy rozwój korzeni i wysoce rozgałęziony wzrost w pożywce wolnej od hormonów8. Mogą być wykorzystywane w kilku dziedzinach badań, w tym w produkcji sztucznych nasion, badaniach nad guzkami korzeniowymi oraz w badaniu interakcji z innymi organizmami, takimi jak grzyby mikoryzowe, nicienie i patogeny korzeni7,9. Ponadto kultury transformacji owłosionych korzeni są szeroko stosowane jako system eksperymentalny do badania szlaków biochemicznych i sygnalizacji chemicznej oraz do produkcji metabolitów wtórnych roślin, które są stosowane jako farmaceutyki, kosmetyki i dodatki do żywności8,10. Cenne metabolity wtórne, w tym alkaloidy indolowe, tojady, alkaloidy tropanowe, terpenoidy i flawonoidy, syntetyzowane w korzeniach owłosionych typu dzikiego są badane od kilkudziesięciu lat u wielu gatunków, takich jak ginsenozyd w żeń-szeniu Panax11, kumaryna w Ammi majus12 oraz związki fenolowe w TB2,13.
Owłosione korzenie zostały wyprodukowane przy użyciu A. rhizogenes w 79 gatunkach roślin z 27 rodzin14. Na przykład transformację owłosionych korzeni za pośrednictwem A. rhizogenes opisano w soi15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19 i cykorii (Cichorium intybus L.)20. Zbadano również transformację owłosionych korzeni gruźlicy2. Dostępnych jest niewiele szczegółowych protokołów dotyczących rozwoju owłosionych korzeni, w których pośredniczy A. rhizogenes, zarówno przenoszących wektor binarny, jak i nie. Na przykład, Sandra et al.21 wprowadzili metodę wytwarzania transgenicznych owłosionych korzeni ziemniaków utrzymywanych w pędach typu dzikiego. W pełni rozwinięte owłosione korzenie można było uwidocznić 5-6 tygodni po wstrzyknięciu A. rhizogenes przenoszącego gen reporter gus do międzywęźli łodyg roślin ziemniaka. Inne badanie również donosiło o transgenicznym owłosionym systemie korzeniowym indukowanym przez A. rhizogenes zawierającym gen reporterowy gusA w jucie (Corchorus capsularis L.)22. Ponadto, Supaart et al.23 uzyskali transgeniczne owłosione korzenie tytoniu za pomocą A. rhizogenes przekształconych za pomocą wektora ekspresyjnego pBI121 przenoszącego gen Δ1-tetrahydrokannabinolowy (THCA) syntazy do produkcji THCA.
Jednak proces krok po kroku do skutecznego generowania owłosionej transformacji korzeni, szczególnie w gruźlicy, został stosunkowo mniej zademonstrowany. W tym badaniu opisaliśmy szczegółowy protokół z wykorzystaniem A. rhizogenes przenoszącego gen reporterowy (GFP), marker selektywny (Kan) i gen będący przedmiotem zainteresowania (b4, zidentyfikowany z naszej grupy, ale nieopublikowany gen z rodziny podstawowej helisy-pętli-helisy (bHLH)) w celu wygenerowania transformacji genetycznej owłosionego korzenia w gruźlicy. Eksperyment trwał od 5 do 6 tygodni, od zaszczepienia nasion do wytworzenia owłosionych korzeni, obejmujących przygotowanie eksplantatu, infekcję, hodowlę, subkulturację i późniejsze rozmnażanie. Ponadto A. rhizogenes zawierający binarny plazmid przenoszący transgen gruźlicy czynnika transkrypcyjnego mieloblastozy 116 (FtMYB116) wykorzystano do określenia, czy FtMYB116 może sprzyjać akumulacji flawonoidów, zwłaszcza rutyny, w gruźlicy na poziomie genu i metabolizmu poprzez transformację owłosionego korzenia gruźlicy. FtMYB116, który jest czynnikiem transkrypcyjnym indukowanym światłem, reguluje syntezę rutyny w różnych warunkach oświetleniowych5. Syntaza chalkonu (CHS), flawanon-3-hydroksylaza (F3H), flawonoid-3'-hydroksylaza (F3'H) i syntaza flawonolu (FLS)24 są kluczowymi enzymami zaangażowanymi w szlak metaboliczny biosyntezy rutyny. Dlatego badanie to wykazuje nadekspresję FtMYB116 w owłosionych korzeniach gruźlicy i ekspresję kluczowych genów enzymatycznych, a także zawartość rutyny i innych flawonoidów, takich jak kwercetyna.

<table><tbody><tr><td>2 * Taq PCR MasterMix</td><td>Aidlab, Chiny</td><td>PC0901</td><td></td></tr><tr><td>Proszek agarowy</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Chiny</td><td>A8190</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler Applied Biosystems 2720</td><td>ThermoFisher Scientific, US</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>AS</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Chiny</td><td>A8110</td><td>Rozcieńczony w DMSO, wektory binarne 100 mM</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Naukowy (invitrogen), US/</td><td></td><td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td></tr><tr><td>Cefotaksym, sód</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Chiny</td><td>C8240</td><td>Rozcieńczony w wodzie, 200 mg/ml</td></tr><tr><td>CF15RXII szybkoobrotowy mikro</td><td>Hitachi, Japonia</td><td>Nr 90560201</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa szalka Petriego</td><td>Fabryka instrumentów medycznych Guanghua, Yangzhou, Chiny</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td> <td>do elektroforezy DYY-6CBjliuyi, Pekin Chiny</td><td>ECS002301</td><td></td></tr><tr><td>EASYspin Plus Plant RNA Kit</td><td>Aidlab, Chiny</td><td>RN38</td><td></td></tr><tr><td>ELGA purelab untra bioscience</td><td>ELGA LabWater, Wielka Brytania</td><td>82665JK1819</td><td></td></tr><tr><td>Epokowy spektrofotometr mikropłytkowy</td><td>biotek, US/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP/LR enzym reakcyjny</td><td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), USA</td><td>11789100/11791110</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka wielofunkcyjna HYG-C</td><td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. Chiny</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Kan</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Chiny</td><td>K8020</td><td>Rozcieńczony w wodzie, 100 mg/ml</td></tr><tr><td>MLS-3750 Sterylizator autoklawu</td><td>Sanyo, Japonia</td><td></td><td></td>/</tr><tr><td>Sole MS z witaminami</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Chiny</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio Life Nauka, Pekin, Chiny</td><td>S8210</td><td></td></tr><tr><td>Inne chemikalia niewymienione</td><td>Beijing Chemical Works, Chiny</td><td></td><td>etanol, wodorochlorek rtęci itp.</td></tr><tr><td>pH-metr PHS-3C</td><td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chiny</td><td>a008</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNA genomowego roślin</td><td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td><td>DP305</td><td></td></tr><tr><td>Rifampin</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Chiny</td><td>R8010</td><td>Rozcieńczony w DMSO, 50 mg / ml</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Chiny</td><td>S8040</td><td>Rozcieńczony w wodzie, 100 mg / ml</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Chiny</td><td>S8270</td><td></td></tr><tr><td>Marker DNA</td><td>Trans2K TransGen Biotech, Pekin, Chiny</td><td>BM101-01</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Chiny</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Średnica Whatmana 9 cm Bibuła filtracyjna</td><td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży w proszku</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Chiny</td><td>Zobacz materiał LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

wywoływanie owłosionych korzeni przez przemianę za pośrednictwem agrobacterium rhizogenes w gryce winnej (fagopyrum tataricum)

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Gryka tartarska (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] posiada różne działania biologiczne i farmakologiczne, ponieważ zawiera obfite metabolity wtórne, takie jak flawonoidy, zwłaszcza rutyna. Agrobacterium rhizogenes są stopniowo stosowane na całym świecie do wywoływania owłosionych korzeni u roślin leczniczych w celu zbadania funkcji genów i zwiększenia wydajności metabolitów wtórnych. W tym badaniu opisaliśmy szczegółową metodę generowania owłosionych korzeni za pośrednictwem A. rhizogenes w gruźlicy. Liścienie i oś podkoleniowa po 7–10 dniach zostały wybrane jako eksplantaty i zakażone A. rhizogenes przenoszącym wektor binarny, który indukował przypadkowe owłosione korzenie, które pojawiły się po 1 tygodniu. Wygenerowaną transformację owłosionego korzenia zidentyfikowano na podstawie morfologii, selekcji oporności (kanamycyna) i ekspresji genu reporterowego (białko zielonej fluorescencji). Następnie przekształcone owłosione korzenie zostały samorozmnażane w razie potrzeby. Tymczasem czynnik transkrypcyjny mieloblastozy (MYB), FtMYB116, został przekształcony w genom gruźlicy przy użyciu owłosionych korzeni, w których pośredniczy A. rhizogenes, aby zweryfikować rolę FtMYB116 w syntezie flawonoidów. Wyniki wykazały, że ekspresja genów związanych z flawonoidami i wydajność związków flawonoidowych (rutyny i kwercetyny) były znacząco (p < 0,01) promowane przez FtMYB116, co wskazuje, że korzenie owłosione, w których pośredniczy A. rhizogenes, mogą być wykorzystywane jako skuteczne narzędzie alternatywne do badania funkcji genów i produkcji metabolitów wtórnych. Szczegółowy protokół krok po kroku opisany w tym badaniu dotyczący generowania owłosionych korzeni może być przyjęty do dowolnej transformacji genetycznej lub innych roślin leczniczych po dostosowaniu.

Agrobacterium rhizogenes-mediated transformacja korzeni włochatych TB 
Niniejsze badanie opisuje protokół krok po kroku opracowany w celu uzyskania genetycznie przekształconych korzeni włochatych przy użyciu A. rhizogenes. Od momentu inokulacji nasion TB do zbioru zidentyfikowanych korzeni włochatych upłynęło około 5-6 tygodni, a niektóre kluczowe etapy przedstawiono na Rysunku 1 (A-H). W skrócie, wysterylizowane nasiona łuskowe poddan...

Opisujemy metodę wywoływania owłosionych korzeni przez przemianę za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes w gryce tartarskiej (Fagopyrum tataricum). Może to być wykorzystane do zbadania funkcji genów i produkcji metabolitów wtórnych w gryce tartarskiej, może być wykorzystane do dowolnej transformacji genetycznej lub wykorzystane do innych roślin leczniczych po ulepszeniu.

Wywoływanie owłosionych korzeni przez przemianę za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes w gryce winnej (Fagopyrum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Korzystając z tego protokołu, po raz pierwszy pokażemy krok po kroku proces wywoływania owłosionych korzeni u gryki winnej nazębnej. Ta technika jest łatwa i niedroga do rozpoczęcia genomiki i mikrobiomiki dla gryki winnej i innych roślin. Chociaż ta szczegółowa metoda jest opracowana dla gryki winnej (tatowej), można ją zastosować do innych roślin dwuliściennych z pewnymi modyfikacjami.Chociaż ta metoda jest łatwa do wykonania, składa się z wielu szczegółowych kroków. Demonstracja wizualna może pomóc naukowcom w osiągnięciu bardziej efektywnej indukcji owłosionych korzeni. Procedurę zademonstruje Guangtao Qian, student studiów magisterskich z mojego laboratorium.Zacznij od wybrania pulchnych i nieuszkodzonych nasion gryki winowej i namoczenia nasion w wodzie o temperaturze 28 stopni Celsjusza przez około 20 minut. Gdy okrywę nasienną można łatwo usunąć, umieść od 100 do 200 obranych nasion w wysterylizowanej stożkowej kolbie o pojemności 100 mililitrów zawierającej 75% etanolu na 30 sekund. Pod koniec sterylizacji zastąp etanol 5% podchlorynem sodu.Po 15 minutach zdekantować podchloryn sodu i pięciokrotnie umyć nasiona sterylną wodą dejonizowaną. Następnie osusz nasiona kawałkiem sterylnego bibulous papieru. Aby uzyskać siewki gryki winnej winnym, dodaj 10 nasion na butelkę do pojedynczych 300-mililitrowych butelek do kultur tkankowych roślin zawierających 50 mililitrów pożywki MSSA.Następnie wykiełkuj nasiona w pomieszczeniu hodowlanym w temperaturze 25, plus minus 1 stopni Celsjusza w warunkach oświetleniowych. Po 7 do 10 dniach wybierz mocne sadzonki z dwoma kawałkami rozłożonych liścieni i odetnij sadzonki od korzeni. Umieść sadzonki na sterylnej szalce Petriego i pokrój hipokotyle na segmenty o długości od 0,8 do 1 centymetra.Pokrój liścienie na około 0,5 centymetra i poddaj wstępnej hodowli powstałe eksplantaty w warunkach świetlnych przez 24 godziny. Następnego dnia przenieś eksplantaty do wysterylizowanej stożkowej kolby o pojemności 100 mililitrów. Aby aktywować A.rhizogenes, należy rozmrozić kulturę na lodzie, a następnie równomiernie posiać bakterie na stałym podłożu YEB z antybiotykami przez 12 do 16 godzin inkubacji w temperaturze 28 stopni Celsjusza.Następnego ranka wybierz kolonię monoklonalną do hodowli na nowej szalce Petriego, jak właśnie pokazano. Po kolejnej 12 do 16 godzinnej inkubacji zaszczepić powstałe kolonie monoklonalne w wysterylizowanej stożkowej kolbie o pojemności 100 mililitrów zawierającej 20 mililitrów stałej pożywki YEB antybiotykami w temperaturze 28 stopni Celsjusza i 200 obrotach na minutę przez 16 do 18 godzin, aż gęstość optyczna przy 600 osiągnie 2,0. Następnie przenieś 2-4% kultury komórek bakteryjnych do nowej 100-mililitrowej stożkowej kolby zawierającej 20 mililitrów świeżej pożywki stałej YEB z antybiotykami w temperaturze 28 stopni Celsjusza i 200 obrotach na minutę przez 4 do 5 godzin, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie około 0,5.Aby wywołać przemianę owłosionego korzenia, przenieś kulturę A.rhizogenes do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i zbierz bakterie przez odwirowanie. Zawiesić osad w pożywce MSSAS do gęstości optycznej około 0,2 i wprowadzić zawiesinę do kolby eksplantatów. Po 10 minutach wyjmij eksplantaty z kolby i osusz je kawałkiem sterylnego bibulous papieru.Następnie umieść sterylny kawałek bibuły filtracyjnej o średnicy 9 centymetrów na naczyniu z pożywką MSSAAS i nałóż eksplantaty na bibułę filtracyjną na trzydniową inkubację w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Pod koniec inkubacji przenieś około 20 zainfekowanych eksplantatów na pożywkę MSSACK i inkubuj rośliny pionowo w warunkach oświetleniowych w temperaturze 25, plus minus 1 stopni Celsjusza. Po 10 do 14 dniach uprawy wybierz owłosione korzenie o białym wyglądzie i szybkim wzroście i pokrój korzenie na dwu- lub trzycentymetrowe kawałki.Wyraźnie ponumeruj korzenie na czystej ławce. Subkulturuj kawałki korzeni w wysterylizowanej stożkowej kolbie o pojemności 100 mililitrów zawierającej pożywkę MSSK w temperaturze 25 stopni Celsjusza i 80 obrotach na minutę w ciemności, aż rozprzestrzenią się na dno kolby. Aby zidentyfikować owłosione korzenie, usuń wszelkie płowe i zanieczyszczone owłosione korzenie i wybierz te o białym wyglądzie.Jeśli użyto genu reporterowego, sprawdź korzenie pod kątem fluorescencji pod niebieskim lub jasnym podwójnym ultrafioletowym transilluminatorem i wybierz owłosione korzenie, które wykazują silny sygnał fluorescencyjny. Następnie wysusz korzenie papierem chłonnym i zawiń je w oznaczoną folię aluminiową do natychmiastowej analizy. W celu długotrwałego przechowywania liofilizuj korzenie w ciekłym azocie i umieść korzenie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu ich zbadania.Po transformacji genetycznej i hodowli, jak wykazano, owłosione korzenie będą wykazywać puszysty biały kolor i plagiotropowy sposób w miejscach ran eksplantatów i utworzą silnie rozgałęzioną i zazębioną matrycę. Gen reporterowy może być wykorzystany do ułatwienia różnicowania transgenicznych owłosionych korzeni pod wpływem niebieskiego lub jasnego podwójnego oświetlenia ultrafioletowego lub identyfikacji docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania. W tym miejscu pokazano względną ekspresję indukowanego światłem czynnika transkrypcyjnego w transgenicznych liniach owłosionych korzeni gryki winnej (tatowej).Warto zauważyć, że biosynteza rutyny i kwercetyny jest również promowana na poziomie metabolicznym w odpowiedzi na indukowaną nadekspresję czynnika transkrypcyjnego. Co więcej, względna ekspresja genów szlaku syntezy flawonoidów we wszystkich trzech liniach transgenicznych jest znacznie wyższa niż ta mierzona w grupie kontrolnej, co wskazuje na udaną transformację owłosionych korzeni u eksplantatów gryki włochatej. Oznacza to, że infekcja nasion, selekcja eksplantatów i stężenie bakterii bezpośrednio wpływają na powodzenie indukcji owłosionych korzeni.Możemy ocenić ekspresję genów, reakcje białek DNA lub białek białkowych lub masową produkcję metabolitów wtórnych w celu zbadania regulacji transkrypcji metabolitów wtórnych. Zmodyfikowane bakterie są niebezpieczne dla ludzi i ich środowiska. Zadbaj o prawidłowe obchodzenie się z bakteriami, ich obsługę i utylizację.

inducing-hairy-roots-agrobacterium-rhizogenes-mediated-transformation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Tutaj prezentujemy dwa protokoły przekształcania roślin ziemniaka. Transformacja Agrobacterium tumefaciens prowadzi do kompletnej rośliny transgenicznej, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes wytwarza transgeniczne owłosione korzenie w pędach typu dzikiego, które mogą się samodzielnie rozmnażać. Następnie wykrywamy aktywność promotora poprzez barwienie GUS w przekształconych korzeniach.

Przemiana ziemniaka w ziemniaku za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes oraz aktywność promotorowa genu suberyny przez barwienie GUS

Ze względu na jej wszechstronne zastosowanie jako gatunku modelowego w różnych dziedzinach nauki, istnieje potrzeba stworzenia zestawu narzędzi do transformacji genetycznej u babki lancetowatej (Plantago lanceolata). Tutaj, przy użyciu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, przedstawiono protokół, w wyniku którego powstają stabilne linie transgeniczne o wydajności transformacji wynoszącej 20%.

Transformacja genetyczna babki wąskolistnej za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens

Tutaj prezentujemy protokół do wysokowydajnej produkcji transgenicznych korzeni owłosionych soi.

Transformacja owłosionych korzeni soi w celu analizy funkcji genów

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół jednoetapowej metody transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, w celu produkcji roślin kompozytowych.

Wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes

Protokół opisuje indukcję owłosionych korzeni za pomocą łodyg kwiatostanu Arabidopsis i hipokotyli Brassica napus. Owłosione korzenie mogą być hodowane i wykorzystywane jako eksplantaty do regeneracji roślin transgenicznych.

Transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Oogeneza Drosophila nadal jest wyjątkowo przydatna w badaniach nad proliferacją i dziedziczeniem mitochondriów. Manuskrypt ten opisuje szczegółowy protokół używany do oznaczania replikującego się mitochondrialnego DNA (mtDNA) w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), co ułatwia odkrycie mechanizmów związanych z dziedziczeniem mitochondriów, które wcześniej były dyskusyjne.

In Situ Znakowanie replikacji mitochondrialnego DNA w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą barwienia EdU

Optogenetyczna mutageneza losowa z wykorzystaniem histonów-miniSOG u C. elegans

Mutanty delecji genów generowane przez rekombinację homologiczną są złotym standardem w badaniach funkcji genów. Opisano metodę OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) służącą do szybkiego generowania konstruktów delecyjnych. Następuje przemiana grzybów za pośrednictwem Agrobacterium. Na koniec przedstawiono metodę potwierdzania delecji genów w transformantach grzybowych opartą na PCR.

Szybkie wytwarzanie delecji u grzybów za pośrednictwem Agrobacterium transformacji konstruktów delecji OSCAR

Tutaj prezentujemy protokół do przestrzennej i czasowej oceny obecności żywotnej mikroflory w jelitach kleszczy przy użyciu zmodyfikowanego podejścia do hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

Poznaj metodę indukcji owłosionych korzeni w gryce winnej Fagopyrum tataricum poprzez przemianę z użyciem Agrobacterium rhizogenes. Prosta technika umożliwia badania genomowe i mikrobiomowe.

Wywoływanie owłosionych korzeni przez przemianę za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes w gryce winnej (Fagopyrum tataricum)

Przeglądaj więcej filmów