Name: Obrazowanie poklatkowe rojów bakterii i zbiorowej reakcji na stres (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Poznaj metodę obrazowania poklatkowego rojów Pseudomonas aeruginosa w odpowiedzi na stres bakteriofagowy i antybiotykowy. Technika ta umożliwia wizualizację dynamiki rojów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.-L.B., A.S. i N.M.H-K. napisali i poprawili rękopis. Wszyscy autorzy zaprojektowali eksperymenty. J.-L.B. przeprowadził eksperymenty i analizy. Praca ta była wspierana przez NIH award K22AI112816 i grant R21AI139968 dla AS oraz przez Uniwersytet Kalifornijski. N.M.H-K. był wspierany przez stypendia Lundbeck R220-2016-860 i R251-2017-1070. Fundatorzy nie odegrali żadnej roli w podjęciu decyzji o zgłoszeniu pracy do publikacji. Nie mamy żadnych sprzecznych interesów, które moglibyśmy zadeklarować.

1. Przygotowanie płytek agarowych roju do obrazowania poklatkowego roju P. aeruginosa
<ol>
	<li>Przygotuj 1 l 5 pożywek minimum M8 w szklanej butelce, dodając 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4 i 2,5 g NaCl w 500 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O). Dostosuj końcową objętość do 1 l za pomocą dodatkowego ddH2O. Autoklaw do sterylizacji i przechowywania płynnych mediów w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 100 ml 1 MMgSO4 (siarczan magnezu) w szklanej butelce, dodając 24,6 g MgSO4•7H2O w 50 ml ddH2O. Dostosuj końcową objętość do 100 ml z dodatkowym ddH2O. Autoklaw do sterylizacji. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj 100 ml 20% casamino acidów w szklanej butelce, dodając 20 g casamino acidów w 50 ml ddH2O. Dostosuj końcową objętość do 100 ml z dodatkowym ddH2O. Autoklaw do sterylizacji. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj 100 ml 20% glukozy w szklanej butelce, dodając 20 g glukozy do 50 ml ddH2O. Dostosuj końcową objętość do 100 ml z dodatkowym ddH2O. Sterylizuj przez filtrację z filtrem 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby przygotować 10 rojących się płytek agarowych, dodać 1 g agaru do 100 ml ddH2O i dostosować końcową objętość do 160 ml z dodatkowym ddH2O w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Sterylizuj w autoklawie.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio po sterylizacji w autoklawie umieścić roztwór agaru w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C na 15 minut.</li>
		<li>Usuń roztwór agaru z łaźni wodnej i dodaj 40 ml 5x M8 minimum pożywki, 200 μL 1 M MgSO4, 2 ml 20% glukozy i 5 ml 20% casaminoacids15. Przejdź do kroku 1.6 natychmiast po wymieszaniu. 
		UWAGA: Końcowe stężenia to 0,5% agaru, 1 mMMgSO4, 0,2% glukozy i 0,5% casaminokwasów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając pipety o pojemności 25 ml w celu uzyskania stałej objętości, dodaj 20 ml roztworu agaru rojowego na szalkę Petriego o średnicy 10 cm. 
	UWAGA: Stała objętość roztworu agaru jest ważna, ponieważ objętość wpływa na czas schnięcia i zawartość wilgoci w agarze. Unikaj bąbelków podczas robienia rojowych płytek agarowych.</li>
	<li>Pozwól agarowi zestalić się, umieszczając rojące się płytki agarowe w jednym stosie z założonymi pokrywkami na 1 godzinę na stole w temperaturze pokojowej. Włącz osuszacz, aby zmniejszyć wilgotność względną w pomieszczeniu do 40–50% na 1 godzinę przed kolejnym krokiem.</li>
	<li>Suszyć rojące się płytki agarowe przez dodatkowe 30 minut ze zdjętymi pokrywkami w okapie z przepływem laminarnym na 300 stóp3/min przy wilgotności względnej 40–50% w temperaturze pokojowej. Osusz wnętrze pokrywek, umieszczając je stroną zadrukowaną do góry w okapie z przepływem laminarnym. Przechowywać rojące się płytki agarowe w temperaturze 4 °C do 24 godzin.</li>
	<li>Przygotuj czarne pokrywki na szalki Petriego o średnicy 10 cm do obrazowania, wygładzając wnętrze pokrywki papierem ściernym. Umieść pokrywki w pudełku do pakowania i umieść pudełko pod kapturem chemicznym. Spryskaj wnętrze pokrywek czarną farbą w sprayu. Pozostaw pokrywki do wyschnięcia. 
	UWAGA: Czarne pokrywki mogą być ponownie wykorzystane do dodatkowych eksperymentów. Ważne jest, aby pokrywy były pomalowane tak, aby nie odbijały światła podczas skanowania.</li>
</ol>
2. Wzrost P. aeruginosa i warunki posiewu
<ol>
	<li>Przygotuj 400 ml bulionu lizogenicznego (LB), dodając 10 g mieszanki proszku LB-Miller do 400 ml ddH2O. W przypadku 2% LB-agarowych szalek Petriego dodaj dodatkowe 8 g agaru. Autoklaw do sterylizacji.</li>
	<li>Wlej 20 ml stopionej pożywki LB-agarowej do szalek Petriego o średnicy 10 cm i pozwól im zestalić się w temperaturze pokojowej przez noc. Przechowywać płynne podłoża w temperaturze pokojowej, a płytki agarowe w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Smugi P. aeruginosa na szalce Petriego LB-agar z zamrożonego bulionu przechowywanego w temperaturze -80 °C za pomocą sterylnych pętelek lub drewnianych patyczków. Inkubować szalkę Petriego do góry nogami przez noc w temperaturze 37 °C. Przechowywać płytkę LB-agar w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.</li>
	<li>Wybrać pojedynczą kolonię z szalki Petriego za pomocą sterylnej pętli lub drewnianego patyczka, zaszczepić ją w pożywce o pojemności 2 ml LB i inkubować kulturę do nasycenia przez noc (16–18 godzin) w temperaturze 37 °C w bębnie rolkowym ustawionym na 100 obr./min.</li>
	<li>Odmierzyć pipetę 5 μl kultury przez noc z kroku 2.4 za pomocą pipety P20 i umieścić na środku płytki agarowej roju, zbliżając się do końcówki pipety pod kątem (10–45°) 2,5 cm powyżej obszaru plamienia, pipetując w dół do pierwszego przystanku i dotykając agaru tylko kroplą płynu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).
	<ol>
		<li>Unikaj dotykania agaru końcówką pipety, ponieważ uszkadza to agar. Użyj szablonu, aby ustawić plamkę równomiernie na różnych płytkach agarowych roju (rysunek uzupełniający S1).</li>
		<li>W przypadku tradycyjnych testów roju użyj tylko środkowego punktu i przejdź do kroku 2.8. W przypadku zbiorczych testów odpowiedzi na stres przejdź do kroku 2.6 (w przypadku zakażenia fagami) lub kroku 2.7 (w przypadku stresu antybiotykowego).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku zakażenia fagami zmieszaj 30 μl nocnej hodowli P. aeruginosa z kroku 2.4 z 6 μl 1 x10 12 pfu/mL faga DMS3vir20. Przejdź od razu do następnego kroku.
	<ol>
		<li>Odmierzyć 6 μl mieszaniny P. aeruginosa i faga z kroku 2.6 za pomocą pipety P20 i umieścić w 6 równoodległych miejscach satelitarnych na koncentrycznym okręgu o promieniu 2,8 cm, który jest wyśrodkowany na szalce Petriego, zbliżając się do końcówki pipety pod kątem (10 do 45°) 2,5 cm powyżej obszaru wykrywania, pipetowanie do pierwszego stopnia i dotykanie agaru tylko kroplą płynu (Rysunek 1C).</li>
		<li>Unikaj dotykania agaru końcówką pipety, ponieważ uszkadza to agar. Użyj szablonu do powlekania w celu uzyskania spójności (rysunek uzupełniający S1). Przejdź do kroku 2.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku antybiotykoterapii należy zmieszać 30 μl hodowli P. aeruginosa przez noc z kroku 2.4 z 6 μl 3 mg/ml gentamycyny, 10 μl 100 mg/ml kanamycyny lub 7,5 μl 100 mg/ml fosfomycyny. Przejdź od razu do następnego kroku.
	<ol>
		<li>Odpipetować 6 μl P. aeruginosa poddanego działaniu antybiotyku z kroku 2.7 za pomocą pipety P20 i umieścić w 6 równoodległych miejscach satelitarnych na koncentrycznym okręgu o promieniu 2,8 cm wokół środka naczynia, zbliżając się do końcówki pipety pod kątem (10 do 45°) 2,5 cm powyżej obszaru plamkowania, pipetując do pierwszego przystanku, i dotykając agaru tylko kroplą płynu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
		<li>Unikaj dotykania agaru końcówką pipety, ponieważ uszkadza to agar. Użyj szablonu do powlekania w celu uzyskania spójności (rysunek uzupełniający S1). Przejdź do kroku 2.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastąp przezroczyste pokrywki szalek Petriego czarnymi pokrywkami wykonanymi w kroku 1.9 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Umieść rojące się płytki agarowe na skanerze w inkubatorze ustawionym na 37 °C z 10 l łaźni wodnej, aby utrzymać wilgotność na poziomie 75% (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E, <silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Nie przeszkadzaj plamistym komórkom na rojących się płytkach agarowych. Talerze powinny być zawsze skierowane do góry.</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu za pomocą skanera
<ol>
	<li>Zmniejsz oświetlenie otoczenia szalek Petriego, umieszczając czarną matową tkaninę na stojaku 40–60 cm nad płaskim skanerem dokumentów. Zabezpiecz go za pomocą opasek zaciskowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Skaner będzie sterowany za pomocą oprogramowania do skanowania i oprogramowania do automatycznego tworzenia skryptów.
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu do skanowania wybierz tryb Home Mode (Tryb domowy) (Rysunek 3A). Przechwytuj obrazy w kolorze, wybierając opcję Kolor w obszarze Typ obrazu. Aby ustawić jakość obrazu, wybierz opcję Inne w obszarze Miejsce docelowe i dostosuj rozdzielczość do 300 dpi. Zachowaj standardowy rozmiar obrazów, wybierając opcję Oryginał dla opcji Rozmiar docelowy. Pozostaw wszystkie opcje w obszarze Dopasowania obrazu niezaznaczone, aby uzyskać standardową jakość obrazu. 
		UWAGA: Rozmiar docelowy jest domyślnie ustawiony na Oryginalny. Aby wybrać inne opcje dla rozmiaru docelowego, najpierw kliknij Podgląd.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw ścieżkę zapisywania obrazów, klikając ikonę folderu po prawej stronie opcji Skanuj, aby otworzyć Ustawienia zapisywania plików (Rysunek 3A).
	<ol>
		<li>Wybierz folder docelowy do zapisywania obrazów, wybierając Inne w obszarze Lokalizacja i kliknij Przeglądaj. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać obrazy.</li>
		<li>Nazwij obrazy w polu tekstowym Prefiks. Ustaw numer początkowy 001, aby rozpocząć sekwencję nazw obrazów. Ustaw format pliku na JPEG, wybierając JPEG (*.jpg) dla Typ w obszarze Format obrazu i kliknij Opcje, aby dostosować dla Szczegóły. Ustaw jakość formatu obrazu, dostosowując poziom kompresji na 16, Kodowanie na standardowy, a następnie zaznacz opcję Osadź profil ICC. Kliknij OK, aby zamknąć okno (Rysunek 3B).</li>
		<li>Pozostaw pierwszą opcję niezaznaczoną ("Zastąp wszystkie pliki o tej samej nazwie") i zaznacz 3 kolejne opcje ("Pokaż to okno dialogowe przed następnym skanowaniem", "Otwórz folder obrazów po skanowaniu" i "Pokaż okno dialogowe Dodaj stronę po skanowaniu"). Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno</li>
		<li>Sprawdź jakość obrazu, klikając Podgląd. Pojawi się okno podglądu, a ikona Skanuj zacznie działać (Rysunek 3C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj oprogramowania skryptowego, aby zautomatyzować akwizycję obrazu. Dostarczony skrypt klika Skanuj w oknie Skanowanie i OK w oknie Ustawienia zapisywania plików w odstępach 30 minut.
	<ol>
		<li>Zaimportuj skrypt, klikając Zadanie | Zaimportuj i wybierz zarówno Single_scan.tsk, jak i Idle_scanning.tsk (pliki TSK dostarczane jako pliki uzupełniające 1 i 2). Zobacz Rysunek 3D. 
		UWAGA: Single_scan.tsk klika przycisk Skanuj w oknie Skanowanie i OK w oknie Ustawienia zapisywania plików. Idle_scanning.tsk aktywuje Single_scan.tsk co 30 minut. Częstotliwość skanowania można zmienić, zmieniając aktywację Idle_scanning.tsk.</li>
		<li>Włącz automatyczne skanowanie w odstępach 30 minut, wybierając zarówno skanowanie w stanie bezczynności (importowane), jak i skanowanie pojedyncze (importowane), klikając prawym przyciskiem myszy skanowanie w trybie bezczynności (importowane) i klikając lewym przyciskiem myszy w pozycji Włączone (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3D, Rysunek uzupełniający S2). 
		UWAGA: Skanowanie automatyczne jest uruchamiane do momentu ręcznego zatrzymania skryptu przez użytkownika. Aby zatrzymać skrypt, wybierz opcję Skanowanie bezczynności (zaimportowane), kliknij prawym przyciskiem myszy Skanowanie bezczynności (zaimportowane) i kliknij lewym przyciskiem myszy Włączone. Znacznik wyboru zostanie usunięty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kompilacja zdjęć poklatkowych i pomiar odpychania roju
<ol>
	<li>Edycja filmów i analiza obrazu za pomocą ImageJ.</li>
	<li>Zaimportuj wszystkie zeskanowane obrazy do ImageJ, klikając Plik | Import | Sekwencja obrazów i wybierz obrazy. W oknie Opcje sekwencji zaznacz opcję Konwertuj na RGB, aby zachować kolory obrazów. Liczba obrazów wskazuje liczbę wybranych obrazów.</li>
	<li>Zachowaj opcję Rozpocznij obraz od 1, aby rozpocząć od pierwszego obrazu w folderze i Skaluj obrazy do 100%, aby zachować oryginalny rozmiar obrazów. Pozostaw pole wyboru Użyj stosu wirtualnego niezaznaczone. Kliknij OK i poczekaj, aż obrazy się załadują (Rysunek 4A).</li>
	<li>Ustaw poziom kompresji wideo na 100, klikając Edytuj | Opcje | Wejście/Wyjście... i ustaw jakość JPEG na 100.</li>
	<li>Zapisz plik jako .avi, klikając Plik | Zapisz jako | AVI. Dostosuj kompresję do JPEG i liczbę klatek na sekundę do 5 kl./s (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). Zapisz .avi film poklatkowy w wybranym folderze.</li>
	<li>Aby określić ilościowo odległości odpychania roju, otwórz obraz pod koniec okresu roju w ImageJ. Kliknij Plik | Otwórz i wybierz obraz. Dostosuj skalę, klikając Analizuj | Ustaw Skala i ustaw Odległość w pikselach na 118, Znaną odległość na 1, Współczynnik proporcji pikseli na 1,0 i Jednostkę długości na cm (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C). Pozostaw opcję Globalne niezaznaczoną. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno.</li>
	<li>Kliknij ikonę Prosty i zmierz od środka kolonii w pozycji satelitarnej do krawędzi populacji roju. Wybierz pozycję Analizuj | Zmierz, aby pojawiło się nowe okno z wymiarami (długość) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D). 
	UWAGA: Użyj "+", aby przybliżyć i "-", aby pomniejszyć.</li>
</ol>
<!--Nie usuwaj—>

<ol><li>Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+and+mobility+protect+swarming+bacteria+against+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).</li>
<li>Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility%3A+a+multicellular+behaviour+conferring+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance.</a> Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).</li>
<li>Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+a+complex+adaptation+leading+to+increased+production+of+virulence+factors+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance.</a> Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).</li>
<li>Yeung, A. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators%2C+including+MetR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li>
<li>Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+physiochemical+properties+of+mucus+in+the+protection+of+the+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium.</a> The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).</li>
<li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li>
<li>Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aD%C3%A9ziel%2C+E+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).</li>
<li>Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+implications+on+rhamnolipid+biosurfactant+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Genetic+Engineering+Reviews%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production.</a> Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).</li>
<li>Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+dependent+on+cell-to-cell+signaling+and+requires+flagella+and+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili.</a> Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).</li>
<li>Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+forms+spreading+dendrites+that+have+characteristics+of+active+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility.</a> Scientific Reports. 5, 17698(2015).</li>
<li>Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotaxis+system%2C+but+not+chemotaxis%2C+is+essential+for+swarming+motility+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Tremblay, J., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li>
<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+imaging%2C+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338(2015).</li>
<li>Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plate-based+assay+for+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).</li>
<li>Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li>
<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+dependent+alkyl+quinolone+signaling+responses+to+antibiotics+in+Pseudomonas+aeruginosa+swarms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).</li>
<li>Bru, J. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PQS+produced+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+stress+response+repels+swarms+away+from+bacteriophage+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li>
<li>van Kessel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PQS+signaling+for+more+than+a+quorum%3A+the+collective+stress+response+protects+healthy+Pseudomonas+aeruginosa+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li>
<li>Zegans, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+bacteriophage+DMS3+and+host+CRISPR+region+inhibits+group+behaviors+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).</li>
<li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PloS One. 6 (6), 20888(2011).</li>
<li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Environmental+Factors+Influence+the+Importance+of+the+Phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+Swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).</li>
<li>Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Metabolic+and+Quorum+Sensing+Signals+Governing+the+Decision+to+Cooperate+in+a+Bacterial+Social+Trait%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait.</a> PLoS computational biology. 11 (5), 10004279(2015).</li>
<li>Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+surface-associated+group+behaviors+by+individual+amino+acids+through+c-di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling.</a> Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten koncentruje się na zminimalizowaniu zmienności w roju płytek agarowych oraz zapewnieniu prostej i taniej metody pozyskiwania poklatkowych obrazów P. aeruginosa rojącego się i reagującego na stres. Procedura ta może być rozszerzona o obrazowanie innych systemów bakteryjnych poprzez dostosowanie składu pożywki i warunków wzrostu. W przypadku P. aeruginosa, chociaż do wywołania rojumożna użyć minimalnej pożywki M9 lub FAB, przedstawion...

Rój to zbiorowa forma skoordynowanej ruchliwości bakterii, która zwiększa oporność na antybiotyki i produkcję czynników wirulencji u gospodarza1,2,3. To wielokomórkowe zachowanie zachodzi na półstałych powierzchniach, które przypominają warstwy śluzowe pokrywające błony nabłonkowe w płucach4,5. Biosurfaktanty są powszechnie wytwarzane przez populacje rojowe w celu pokonania napięcia powierzchniowego na powierzchniach, a ich produkcja jest regulowana przez złożone systemy sygnalizacji komórka-komórka, znane również jako quorum sensing6,7,8. Wiele gatunków bakterii jest zdolnych do rozprzestrzeniania się, w tym Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Escherichia coli9,10,11,12. Wzorce rojów tworzone przez bakterie są zróżnicowane i mają na nie wpływ właściwości fizyczne i chemiczne warstwy powierzchniowej, w tym skład składników odżywczych, porowatość i wilgotność13,14. Oprócz właściwości powierzchni, temperatura wzrostu i wilgotność otoczenia wpływają na kilka aspektów dynamiki roju, w tym szybkość i wzorce roju12,13,14,15. Zmienne wzrostu, które wpływają na rój, stwarzają wyzwania, które wpływają na odtwarzalność eksperymentalną i zdolność do interpretacji wyników. W tym miejscu opisujemy prostą, ustandaryzowaną metodę monitorowania dynamiki rojów bakterii za pomocą obrazowania poklatkowego. Metoda opisuje, w jaki sposób kontrolować krytyczne warunki wzrostu, które znacząco wpływają na postęp roju. W porównaniu z tradycyjnymi metodami analizy roju, ta metoda obrazowania poklatkowego umożliwia śledzenie ruchliwości wielu rojów jednocześnie przez dłuższy czas i z wysoką rozdzielczością. Aspekty te poprawiają głębię danych, które można uzyskać z monitorowania rojów i ułatwiają identyfikację czynników wpływających na roje.
Rój u P. aeruginosa jest ułatwiony dzięki produkcji i uwalnianiu ramnolipidów i kwasów 3-(3-hydroksyalkanoyloksy)alkanowych do otoczenia6,16. Wprowadzenie stresu spowodowanego subletalnymi stężeniami antybiotyków lub zakażenie wirusem fagowym wpływa na organizację rojów. W szczególności naprężenia te skłaniają P. aeruginosa do uwalniania cząsteczki wyczuwającej kworum 2-heptylo-3-hydroksy-4-chinolon, znanej również jako sygnał chinolonu Pseudomonas (PQS)17,18. W testach roju, które zawierają dwie populacje rojów, PQS wytwarzany przez populację wywołaną stresem odstrasza nieleczone roje przed wejściem do obszaru, w którym występuje stres (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Ta zbiorowa reakcja na stres stanowi system sygnalizacji niebezpieczeństwa, który ostrzega P. aeruginosa przed pobliskimi zagrożeniami18,19. Wpływ stresu na P. aeruginosa, aktywację zbiorowej reakcji na stres i odpychanie rojów można zobrazować za pomocą opisanej tutaj metody obrazowania poklatkowego. Opisany tutaj protokół wyjaśnia, jak: (1) przygotować płytki agarowe do roju, (2) wyhodować P. aeruginosa do dwóch rodzajów testów (tradycyjne testy rojowe lub zbiorowe testy reakcji na stres) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), (3) uzyskać obrazy poklatkowe i (4) użyć ImageJ do kompilacji i analizy obrazów.
Krótko mówiąc, P. aeruginosa z nocnej hodowli jest dostrzegany w środku rojącej się płytki agarowej, podczas gdy P. aeruginosa, które są zakażone fagami lub leczone antybiotykami, są dostrzegane na pozycjach satelitarnych. Postęp roju P. aeruginosa jest monitorowany za pomocą płaskiego skanera dokumentów konsumenckich, który jest umieszczony w inkubatorze o regulowanej wilgotności 37 °C. Skaner jest sterowany przez oprogramowanie, które automatycznie skanuje płytki w regularnych odstępach czasu w okresie wzrostu roju, zwykle 16–20 godzin. Ta metoda pozwala uzyskać jednoczesne filmy poklatkowe z maksymalnie sześcioma 10-centymetrowymi płytami roju. Obrazy są kompilowane w filmy, a odpychanie rojów przez populacje wywołane stresem jest określane ilościowo za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ. Szczególną uwagę zwraca się na zapewnienie spójności i odtwarzalności między różnymi doświadczeniami roju.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar, odwodniony</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td>Do płytki agarowej LB i płytki agarowej do roju</td></tr><tr><td>Casaminokwasy</td><td>BD Difco</td><td>223050</td><td>Do podłoża rojowego</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dekstroza. Do podłoża rojowego</td></tr><tr><td>Fosfomycyna sól disodowa</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>F0889</td><td>Stężenie zapasów: 200 mg / mL. Rozpuszczony w ddH2O</td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td>Stężenie podstawowe: 3 mg/ml. Rozpuszczony w ddH2O</td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Stężenie podstawowe: 100 mg/mL. Rozpuszczony w ddH2O</td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Do bulionu LB i płytek agarowych LB</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Do podłoża rojowego</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>Do 5x pożywki M8</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Do 5x M8</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td>Do 5x M8 pożywki</td></tr> <tr><td>szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS27E.118</td><td>PA14 szczep</td></tr><tr><td>DMS3vir</td><td>O'Toole lab</td><td>DMS3vir20</td><td>Bacteriophage</td></tr><tr><td>Kieszonkowe materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier ścierny z tlenku glinu</td><td>3M</td><td>150 Fine</td><td>Do czarnych pokrywek</td></tr><tr><td>tkanina</td><td>Joann</td><td>PRD7089</td><td>tkanina</td></tr><tr><td>farba w sprayu</td><td>Krylon</td><td>5592 Matowa czerń</td><td>Do czarnych pokrywek</td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera</td><td>Kimax</td><td>26500</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Szklane butelki do przechowywania</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1,000 mL</td></tr><tr><td>8-calowe opaski zaciskowe</td><td>Gardner Bender</td><td>E173770</td><td>Do mocowania czarnej matowej tkaniny</td></tr><tr><td>Szalki Petriego (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 mm x 15 mm płyty styropianowe</td></tr><tr><td>Drewniane patyczki</td><td>Fisher</td><td>23-400-102</td><td>Do smug i zaszczepiania bakterii</td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rynek autoklawów</td><td>Kuźnia Industries</td><td>STM-E Do</td><td>sterylizacji odczynników</td></tr><tr><td>Pipeta 25 ml</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1072-5410</td><td>Do pipetowania 20 ml do rojowych płytek agarowych</td></tr><tr><td>Osuszacz</td><td>Frigidaire</td><td>FAD704DWD 70-litrowy</td><td>Do utrzymywania wilgotności względnej w pomieszczeniu na poziomie około 45%</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.52a</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>Do wzrostu bakterii w temperaturze 37 &; C</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna Isotemp</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>Do mediów chłodzących do 55 & deg; C</td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>The Baker Company</td><td>SG603A</td><td>Do suszenia płyt</td></tr><tr><td>Pibuła P-20</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>Plamienie na rojowych płytkach agarowych</td></tr><tr><td>Kontroler pipet</td><td>BrandTech</td><td>accu-jet</td><td>Do pipetowania 20 ml do rojowych płytek agarowych</td></tr><tr><td>Bęben rolkowy</td><td>Nowy Brunszwik</td><td>TC-7</td><td>Do rozwoju bakterii przy 100 obr./min</td></tr><tr><td>Skaner</td><td>Epson</td><td>Skaner fotograficzny Epson Perfection V370</td><td>do płyt obrazowych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do automatyzacji skanera</td><td>RoboTask Lite</td><td>v7.0.1.932</td><td>Do 30-minutowego obrazowania wewnętrznego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu skanera</td><td>Epson</td><td>v9.9.2.5US</td><td>Oprogramowanie do płyt obrazowych</td></tr></tbody></table>

obrazowanie poklatkowe rojów bakterii i zbiorowej reakcji na stres

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Rój to forma ruchliwości powierzchni obserwowana u wielu gatunków bakterii, w tym Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli. Tutaj gęste populacje bakterii przemieszczają się na duże odległości w charakterystycznych zbiorowiskach w kształcie wąsów w ciągu kilku godzin. Rój jest wrażliwy na kilka czynników, w tym średnią wilgotność, wilgotność i zawartość składników odżywczych. Ponadto zbiorowa reakcja na stres, którą obserwuje się u P. aeruginosa, które są stresowane antybiotykami lub bakteriofagami (fagami), odstrasza roje przed zbliżaniem się do obszaru, w którym występuje stres. Opisane tutaj metody dotyczą sposobu kontrolowania krytycznych czynników, które wpływają na rój. Przedstawiamy prostą metodę monitorowania dynamiki roju i zbiorowej reakcji na stres z wysoką rozdzielczością czasową za pomocą płaskiego skanera dokumentów oraz opisujemy, jak skompilować i przeprowadzić analizę ilościową rojów. Ta prosta i opłacalna metoda zapewnia precyzyjną i dobrze kontrolowaną ocenę ilościową roju i może być rozszerzona na inne rodzaje testów wzrostu na płytkach i gatunki bakterii.

Kroki prowadzące do hodowli P. aeruginosa, wywołania stresu komórkowego oraz obrazowania płytek agarowych do badania ruchu rojowego (swarming) przedstawiono na Ryc. 1. Pojedynczą kolonię szczepu dzikiego P. aeruginosa UCBPP-PA14 z płytki z agarem LB zaszczepiono w 2 mL bulionu LB i inkubowano przez noc w 37 °C, a następnie 5 µL zawiesiny naniesiono w centrum płytki agarowej do badania swarmingu. Obrazowanie poklatkowe tej płytki wykazuje początkowy wzrost w formie kolonii w centrum, a n...

Szczegółowo opisujemy prostą metodę tworzenia filmów poklatkowych o wysokiej rozdzielczości rojów Pseudomonas aeruginosa, które reagują na bakteriofagi (fagi) i stres antybiotykowy za pomocą płaskiego skanera dokumentów. Procedura ta jest szybką i prostą metodą monitorowania dynamiki roju i może być dostosowana do badania ruchliwości i wzrostu innych gatunków bakterii.

Obrazowanie poklatkowe rojów bakterii i zbiorowej reakcji na stres

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Protokół ten może być wykorzystany do tworzenia filmów poklatkowych przedstawiających rój Pseudomonas aeruginosa oraz do uchwycenia odpychania roju przez bakteriofagi lub antybiotyki. Filmy poklatkowe ukazują szczegółową dynamikę reakcji roju na antybiotyki i bakteriofagi, a technika ta wymaga jedynie osuszacza, komputera, inkubatora i skanera dokumentów. Aby przygotować płytki agarowe do obrazowania poklatkowego roju P.aeruginosa, użyj pipety o pojemności 25 mililitrów, aby dodać 20 mililitrów roztworu agaru rojowego do każdej eksperymentalnej szalki Petriego o średnicy 10 centymetrów.Umieść talerze w jednym stosie z pokrywkami na godzinę w temperaturze pokojowej. Włącz osuszacz, aby zmniejszyć wilgotność względną w pomieszczeniu do 40-50%Gdy agar zastygnie, wysusz rojące się płytki agarowe przez dodatkowe 30 minut w okapie z przepływem laminarnym ze zdjętymi pokrywkami i skierowanymi do góry z prędkością 300 stóp sześciennych na minutę przy wilgotności względnej 40-50% w temperaturze pokojowej. Następnie przechowuj wysuszone płytki agarowe roju w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 24 godzin.W celu powlekania roju agaru, przytrzymaj końcówkę pipety P20 załadowaną pięcioma mikrolitrami z nocnej kultury P.aeruginosa pod kątem 10-45 stopni 2-1/2 centymetra powyżej środka jednej płytki rojowej i wciśnij tłok do pierwszego oporu, dotykając agaru tylko kroplą cieczy. Użyj szablonu, aby ustawić miejsce równomiernie na różnych płytkach agarowych roju. Aby pokryć infekcję fagową, najpierw zmieszaj 30 mikrolitrów nocnego hodowanego P.aeruginosa z sześcioma mikrolitrami jeden razy 10 do 12 jednostek tworzących płytki nazębne na mililitr faga DMS3 vir i natychmiast dodaj sześć mikrolitrów mieszaniny fagów P.aeruginosa w sześciu równoodległych pozycjach satelitarnych na koncentrycznym okręgu o promieniu 2,8 centymetra, jak pokazano.Użyj szablonu, aby ustawić miejsce spójnie na różnych płytkach agarowych roju. Aby poddać się antybiotykoterapii, wymieszaj 30 mikrolitrów wyhodowanego przez noc P.aeruginosa z odpowiednim stężeniem i objętością antybiotyku, który Cię interesuje, i natychmiast dodaj sześć mikrolitrów bakterii potraktowanych antybiotykiem w sześciu równoodległych pozycjach satelitarnych na koncentrycznym okręgu o promieniu 2,8 centymetra wokół środka naczynia. Użyj szablonu, aby ustawić miejsce równomiernie na różnych płytkach agarowych roju.Gdy wszystkie kultury zostaną platerowane, zastąp przezroczyste pokrywki szalek Petriego wykonanymi na zamówienie czarnymi pokrywkami. Ostrożnie umieść rojące się płytki agarowe na skanerze w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 10 litrową łaźnią wodną, aby utrzymać wilgotność na poziomie 75%Po umieszczeniu płytek w skanerze otwórz file i zapisz ustawienia, aby ustawić ścieżkę zapisu dla obrazów i kliknij skanuj i OK w odstępach 30-minutowych. Aby zautomatyzować pobieranie obrazów, użyj oprogramowania do tworzenia skryptów.Wybierz zarówno skanowanie w trybie bezczynności, jak i skanowanie pojedyncze, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy skanowanie w trybie bezczynności, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy włączone. Pod koniec inkubacji zaimportuj wszystkie zeskanowane obrazy do ImageJ. W oknie opcji sekwencji liczba obrazów będzie wskazywać liczbę wybranych obrazów.Rozpocznij obraz od jednego, aby rozpocząć od pierwszego obrazu w folderze i skaluj obrazy do 100%, aby zachować oryginalny rozmiar obrazów. Kliknij ukryty do RGB, aby zachować obrazy w kolorze. Pozostaw opcję Użyj wirtualnego stosu niezaznaczoną i kliknij OK, aby załadować obrazy.Kliknij file, save as i AVI, aby scalić obrazy w plik AVI. Dostosuj kompresję do JPEG, a liczbę klatek na sekundę do pięciu klatek na sekundę. Następnie zapisz film poklatkowy AVI w odpowiednim folderze przechowywania.Obrazowanie poklatkowe pojedynczej kolonii P.aeruginosa typu dzikiego z płytki agarowej LB w bulionie LB przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zauważone w środku rojącej się płytki agarowej ujawnia początkowy wzrost w postaci kolonii w środku płytki, która rozprzestrzenia się w wąsach promieniście od kolonii. Roje przemieszczają się ze środka rojących się płytek agarowych na obrzeża i są odpychane przez sygnał stresu emitowany przez bakterie, które zostały zakażone fagami lub potraktowane Gentamycyną. Fagi lub gentamycyna zauważone pojedynczo na pozycjach satelitarnych nie powodują, że rojowe populacje unikają tych obszarów.Użyj pipety o pojemności 25 mililitrów, aby upewnić się, że płytki agarowe zawierają dokładnie 20 mililitrów. Ważne jest również, aby dostosować czas schnięcia płytki do środowiska laboratoryjnego. Nasza technika pozwala nam zwizualizować ogólne wzorce rojenia się populacji Pseudomonas aeruginosa.Kolejnym celem jest monitorowanie ruchliwości poszczególnych komórek za pomocą mikroskopii Brightfield.

time-lapse-imaging-bacterial-swarms-collective-stress

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aby zbadać zachowanie roju Myxococcus xanthus, opracowaliśmy protokół mikrokinematografii poklatkowej, który można modyfikować dla różnych analiz. Wykorzystuje on standardowe warunki hodowli dostosowane do mikroskopii i zapewnia powtarzalne wyniki dzięki zastosowaniu niedrogich, wielorazowych uszczelek silikonowych. Metodę tę wykorzystaliśmy do ilościowego określenia wielokomórkowego chemotaksy.

Nagrywanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach Myxococcus xanthus przy użyciu mikrocynematografii poklatkowej

Źródło: Bru, J., et al., Obrazowanie poklatkowe rojów bakteryjnych i zbiorowa reakcja na stres. J. Vis. Exp. (2020)Ten film przedstawia procedurę analizy zachowania roju Pseudomonas aeruginosa poprzez obserwację wzrostu bakterii z centralnej hodowli w kierunku plam satelitarnych zawierających tę samą kulturę zmieszaną z antybiotykiem, przy użyciu zestawu płytki agarowej i obrazowania poklatkowego.

Zachowanie rojowe Pseudomonas aeruginosa pod wpływem stresu antybiotykowego

Źródło: Bru, J., et.al. Obrazowanie poklatkowe rojów bakterii i zbiorowej reakcji na stres. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje, jak wizualizować i mierzyć zachowanie unikania roju u Pseudomonas aeruginosa za pomocą testu roju na płytkach agarowych. Pokazuje konfigurację obrazowania poklatkowego w kontrolowanych warunkach i wyjaśnia, w jaki sposób sygnały stresu wywołanego antybiotykiem przekierowują ruch bakterii, który jest określany ilościowo za pomocą analizy obrazu.

Obrazowanie i ilościowe określanie reakcji unikania roju na stres antybiotykowy u Pseudomonas aeruginosa

Źródło: Morales-Soto, N. i wsp., Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia test roju z wykorzystaniem bakterii, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne, w celu obserwacji ruchliwości powierzchni na miękkim agarze. Obrazowanie poklatkowe rejestruje skoordynowaną ekspansję i tworzenie wąsów, podkreślając ruchliwość powierzchni bakterii.

Test roju do wizualizacji ruchliwości powierzchni bakterii

Źródło: Cayron, J., et al. Wieloskalowa analiza wzrostu bakterii w warunkach leczenia stresem. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje, jak przygotować i wykorzystać płytkę mikroprzepływową do obrazowania komórek bakteryjnych w warunkach stresu. Przedstawia proces wprowadzania kultury bakteryjnej i wywołującej stres pożywki antybiotykowej, a następnie ładowania komórek i ustawiania mikroskopu. Obrazowanie poklatkowe w trybie kontrastu fazowego jest następnie wykorzystywane do obserwacji rozwoju...

Mikroskopowa analiza wzrostu bakterii pod wpływem stresu przy użyciu komór mikroprzepływowych

Źródło: Guo, S., et al. Kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora. J. Vis. Exp. (2022).Ten film demonstruje wykorzystanie dwuwarstwowej gradientowej płyty roju do badania zachowania roju bakterii przy różnych stężeniach inhibitorów. Płytkę z inhibitorem tworzącym gradient w dolnej warstwie zaszczepia się bakteriami i inkubuje. Obrazy są rejestrowane w regularnych odstępach czasu w celu analizy wpływu stężenia inhibitora na rozprzestrzenianie się...

Ocena roju bakterii za pomocą gradientowej płytki inhibitora

ScanLag to wysokoprzepustowa metoda pomiaru opóźnienia wzrostu, a mianowicie czasu opóźnienia, a także tempa wzrostu kolonii dla tysięcy komórek równolegle. Badania przesiewowe za pomocą ScanLag umożliwiają rozróżnienie między długim czasem opóźnienia a powolnym wzrostem na poziomie pojedynczego wariantu.

ScanLag: Wysokoprzepustowa kwantyfikacja wzrostu kolonii i czasu opóźnienia

Ten protokół pozwala na czasowy opis wzrostu bakterii w warunkach stresu na poziomie pojedynczej komórki i populacji komórek.

Wieloskalowa analiza wzrostu bakterii w warunkach leczenia stresem

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

W tym manuskrypcie udostępniamy kompleksowy protokół oceny przeżywalności antybiotyków dla Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, przekształcając plazmidy w P. aeruginosa i S. aureus w celu stworzenia szczepów reporterowych i wizualizacji wariantów fenotypowych, takich jak uporczywe, za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej.

Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej

Poznaj metodę obrazowania poklatkowego rojów Pseudomonas aeruginosa w odpowiedzi na stres bakteriofagowy i antybiotykowy. Technika ta umożliwia wizualizację dynamiki rojów w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie poklatkowe rojów bakterii i zbiorowej reakcji na stres

Przeglądaj więcej filmów