Name: Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę nadekspresji retrowirusowej i transferu adoptywnego mysich komórek B-1a w celu badania ich migracji do szpiku kostnego oraz produkcji IgM w modelu in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Projekt 3 P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) i R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye był wspierany przez American Heart Association Pre-doctoral fellowship 16PRE30300002 i 5T32AI007496-20. Dziękujemy Joanne Lannigan, Mike'owi Soldze i Claude'owi Chew z University of Virginia Flow Cytometry Core za ich doskonałą pomoc techniczną.

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Wirginii.
1. Magnetyczna separacja i wzbogacanie komórek B-1 otrzewnej
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji 12-14-tygodniowego samca myszy CD45.1+ApoE-/- za pomocą CO2 .</li>
	<li>Wykonaj powierzchowne nacięcie w jamie brzusznej za pomocą prostych nożyczek chirurgicznych i złuszcz skórę za pomocą zakrzywionych nożyczek, aby odsłonić ścianę otrzewnej. Przepłukać jamę otrzewnową 10 ml pożywki RPMI-1640 o temperaturze 37 °C za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 25 G. Potrząśnij myszą, aby odłączyć komórki, chwytając ogon i dokładnie przesuwając mysz z boku na bok przez 15−20 s. 
	UWAGA: Masowanie płukanej otrzewnej może również zmaksymalizować regenerację komórek.</li>
	<li>Zebrać płyn otrzewnowy za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 25 G, pobierając płyn w prawym dolnym rogu otrzewnej, tuż nad poziomem biodra, w pobliżu jelit. Unikaj zakłócania nabłonkowych magazynów tłuszczu i leżących pod nimi narządów. Należy unikać pobierania płynu z lewej strony myszy, ponieważ tłuszcz omentalny może być łatwo wciągnięty do strzykawki.</li>
	<li>Po zebraniu ~6-7 ml płynu dozuj do stożkowej probówki o pojemności 50 ml umieszczonej na lodzie. Następnie podnieś mysz pionowo, przytrzymując ścianę otrzewnej nad przeponą za pomocą kleszczy, tak aby pozostały płyn pozostał na dnie jamy otrzewnej. Wykonaj małe nacięcie w ścianie otrzewnej za pomocą nożyczek chirurgicznych nad wątrobą (uważaj, aby nie przeciąć wątroby) i zbierz pozostały płyn otrzewnowy za pomocą szklanej pipety i bańki.</li>
	<li>Zbierz komórki wypłukujące otrzewną ze wszystkich myszy CD45.1 + ApoE-/- (n = 15−20) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i przechowuj na lodzie. 
	UWAGA: Do obliczenia liczby potrzebnych myszy: Komórki B-1a stanowią 5-10% całkowitej populacji otrzewnej i dają około 2,5−5 x 105 komórek B-1a na mysz w rękach autorów. Wydajność transdukcji wynosi ~30−40%, jak pokazano poniżej.</li>
	<li>Policz żywe komórki za pomocą barwnika żywotności, takiego jak błękit trypanowy i hemocytometru (rozcieńczyć próbki w stosunku 1:5 w błękitu trypanowym i załadować 10 μl do komory hemocytometru). Pula komórek do 1 x 108 komórek na probówkę. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić do 1 x 108 komórek w 1 ml przeciwciała anty-CD16 / CD32 (tabela materiałów) rozcieńczonego 1:50 w buforze testowym (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS], 0,5% albumina surowicy bydlęcej [BSA], 2 mM EDTA) w celu zablokowania receptorów Fc. Skaluj w razie potrzeby na podstawie liczby komórek. Inkubować na lodzie przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 2x główną mieszaninę biotynylowanych przeciwciał (Tabela 1) w buforze testowym w celu wyczerpania. 2x mieszanka główna odpowiada za objętość cieczy, w której komórki znajdują się już podczas inkubacji z anty-CD16/CD32. Na przykład, jeśli komórki inkubują się w 500 μl rozcieńczonego przeciwciała anty-CD16/CD32, dodaj 500 μl 2x głównej mieszanki zawierającej 10 μl biotynylowanych przeciwciał Ter119, Gr-1, CD23 i NK1.1 oraz 25 μl biotynylowanego przeciwciała F4/80, aby osiągnąć końcowe stężenia podane w tabeli 1. Dodać 2x master mix do komórek i bejcować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki 5 ml buforu do oznaczania i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić i inkubować komórki za pomocą mikrogranulek antybiotyny (tabela materiałów) rozcieńczonych w buforze testowym zgodnie ze stężeniem i protokołem zalecanym przez producenta.</li>
	<li>Przemyć 5 ml buforu do oznaczania i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić maksymalnie 1 x 108 komórek w 500 μl buforu do oznaczania.</li>
	<li>Magnetyczne kolumny selekcyjne (tabela materiałów) należy zalać 3 ml buforu testowego. Przenieść komórki do zagruntowanych magnetycznych kolumn selekcyjnych i zebrać eluent zawierający wzbogacone komórki B-1 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie. Przemyć magnetyczną kolumnę selekcyjną dodatkowym buforem do oznaczania, aż całkowita zebrana objętość wyniesie 10 ml. 
	UWAGA: Podwielokrotność wstępnie oczyszczonych i po oczyszczonych frakcji komórkowych powinna być oddzielnie analizowana za pomocą cytometrii przepływowej w celu uzyskania skuteczności oczyszczania przez barwienie komórek B CD19 +, makrofagów F480 + i limfocytów T CD5 +, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2.</li>
	<li>Policzyć frakcję komórkową po oczyszczeniu (eluent zawierający wzbogacone komórki B-1), licząc żywe komórki, jak w kroku 1.6, i ponownie zawiesić w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w pożywce do hodowli komórek B (RPMI-1640, 10% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca [FBS], 10 mM HEPES, 1x aminokwasy endogenne, 1 mM pirogronian sodu, 50 μg/ml gentamycyny, 55 μM β-merkaptoetanolu).</li>
</ol>
2. Stymulacja komórek B-1 w otrzewnej
<ol>
	<li>Podziel komórki zbiorcze dla dwóch transdukowanych warunków (Ctl-GFP i CXCR4-GFP), jednocześnie odkładając na bok i posiewając co najmniej 10 x 106 komórek do kontroli bez transdukcji.</li>
	<li>Płytka do 150 μl (150 000 komórek) na dołek do 96-dołkowych płytek okrągłodennych.</li>
	<li>Dodaj 100 nM agonistycznego ODN1668 TLR9 do wszystkich studzienek, aby stymulować proliferację komórek.</li>
	<li>Inkubować przez 16−18 h w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Transdukcja retrowirusowa komórek B otrzewnowej
<ol>
	<li>Generuj cząstki retrowirusowe Ctl-GFP (MigR1) i CXCR4-GFP za pomocą transfekcji fosforanu wapnia, jak opisano w wcześniej opublikowanych protokołach14. 
	UWAGA: Zajmie to kilka dni, dlatego przed rozpoczęciem tego protokołu należy przygotować i określić miano zapasów retrowirusowych oraz przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Rozmrozić zapasy retrowirusów na lodzie. Zużyć natychmiast i nie zamrażać ponownie, ponieważ miano wirusa znacznie się zmniejsza podczas cykli zamrażania i rozmrażania. Dodać supernatanty retrowirusowe Ctl-GFP lub CXCR4-GFP przy wielokrotności infekcji (MOI) 20:1 do komórek, w obecności 8 μg/ml polibrenu i świeżego β-merkaptoetanolu w końcowym stężeniu 55 μM. Nie należy dodawać szczepów wirusowych do komórek odłożonych do kontroli bez transdukcji.</li>
	<li>Przeprowadzić dezynfekcję, odwirowując płytki o sile 800 x g przez 90 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować płytki z retrowirusem w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez dodatkowe 3 godziny.</li>
	<li>Zebrać i ponownie pokryć komórki na świeżym podłożu z komórek B i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.</li>
</ol>
4. Sortowanie komórek transdukowanych komórek otrzewnowej B-1a
<ol>
	<li>Zbierz hodowane komórki i połącz je w trzech oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 50 ml dla każdego stanu: nietransdukowanego, transdukowanego Ctl-GFP i transdukowanego CXCR4-GFP.</li>
	<li>Policzyć żywe komórki jak w kroku 1.6, następnie odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zassać supernatant.</li>
	<li>Zawieś komórki w ilości 100 000 komórek/μl w buforze sortującym (PBS + 1% BSA) zawierającym przeciwciało anty-CD16/CD32 w proporcji 1:50 (tabela materiałów) w celu zablokowania receptorów Fc. Inkubować na lodzie przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podwielokrotne komórki do kontroli kompensacji (~ 30 000 komórek na kontrolę kompensacyjną): dla kontroli niebarwionych i pojedynczych barwień podwielokrotność z próbki nietransdukowanej oraz dla kontroli pojedynczego barwienia GFP podwielokrotna z transdukowanych próbek. 
	UWAGA: Dostępne na rynku koraliki kompensacyjne mogą być alternatywnie używane do kontroli pojedynczego barwienia, jeśli liczba komórek bez transdukcji jest niska.</li>
	<li>Przygotować 2x główną mieszaninę przeciwciał zawierającą przeciwciała sprzężone z fluoroforem w buforze sortującym (Tabela 1). Dodaj 2x master mix do próbek nietransdukowanych, transdukowanych CTL-GFP i CXCR4-GFP. Dodaj pojedyncze przeciwciała do kontroli pojedynczego barwienia. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. 
	UWAGA: 2x mieszanka główna uwzględnia objętość cieczy, w której komórki znajdują się już podczas inkubacji z anty-CD16/CD32, jak w kroku 1.8. Podwielokrotność komórek z każdego warunku może być oddzielnie barwiona dla CXCR4, aby potwierdzić nadekspresję CXCR4.</li>
	<li>Przemyć próbki 1 ml buforu sortującego i przecedzić przez filtry 70 μm do probówek polipropylenowych.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zasysać supernatant. Zawiesić próbki w ilości 50 000 komórek/μl w buforze sortującym.</li>
	<li>Przed sortowaniem komórek należy przygotować znakowane probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) zawierające 1 ml pożywki zbiorczej (RPMI-1640, 20% inaktywowany termicznie FBS, 10 mM HEPES, 1x aminokwasy endogenne, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μg/ml gentamycyny, 55 μM β-merkaptoetanolu) dla każdej populacji, która ma być sortowana.</li>
	<li>Przed uruchomieniem próbek w sortowniku komórek dodać 2x DAPI (przygotowany jako rozcieńczenie 1:5000 w buforze sortującym) w celu rozróżnienia martwych komórek.</li>
	<li>Sortuj komórki GFP + B-1a do probówek FACS zawierających pożywkę zbiorczą jako komórki DAPI-CD19 + GFP + B220mid-lo CD23- IgM + CD5 + z próbek CTL-GFP i CXCR4-GFP. Użyj próbki nietransdukowanej, aby ustawić bramkę GFP+ i posortować nietransdukowane komórki B-1a DAPI- CD19+ GFP- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+. 
	UWAGA: Alternatywnie, komórki nietransdukowane można również sortować z próbek CTL-GFP i CXCR4-GFP poprzez oddzielne bramkowanie komórek B-1a we frakcji GFP. Transdukowane lub nietransdukowane komórki B-1b można również sortować przy użyciu tej strategii sortowania jako komórki DAPI-CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5-.</li>
</ol>
5. Przeniesienie adopcyjne
<ol>
	<li>Po posortowaniu komórek odwirować komórki o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie odessać supernatant.</li>
	<li>Zawieś komórki w zimnym sterylnym 1x PBS przy 1,000 komórek/μL.</li>
	<li>Znieczulić samce myszy Rag1-/- ApoE-/- za pomocą izofluranu i wstrzyknąć 100 μl (100 000 komórek) na mysz poprzez dożylne wstrzyknięcie do żyły zaoczodołowej lub ogonowej za pomocą ultracienkiej strzykawki insulinowej. Wstrzyknij kilku myszom 1x PBS jako kontrolę.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja komórek dawcy i IgM osocza
<ol>
	<li>W pożądanym czasie po transferze adopcyjnym przeanalizuj przeniesione komórki u myszy biorców za pomocą zbioru szpiku kostnego i tkanki śledziony4 i cytometrii przepływowej. Określ ilościowo lokalizację komórek dawcy i nadekspresję CXCR4 poprzez barwienie CD45.1, CD45.2 i CXCR4 oraz przeanalizuj wyniki cytometrii przepływowej za pomocą oprogramowania takiego jak Flowjo. 
	UWAGA: Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z przeciwciałami stosowanymi na tym etapie. Upewnij się, że nie używasz koniugatu przeciwciała, który fluoryzuje w kanale FITC, ponieważ GFP będzie obecny na transdukowanych komórkach dawcy.</li>
	<li>Wyizolować osocze, dodając 10 μl 0,5 M EDTA do krwi pełnej pobranej przez nakłucie serca w momencie uśmiercania zwierząt. Odwirować krew pełną o stężeniu 7 000 x g i podwielokrotność osocza do oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analizy wydzielanych czynników, takich jak IgM, metodą ELISA4.</li>
</ol>

<ol><li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+Cell+Heterogeneity+and+the+Regulation+of+Natural+and+Antigen-Induced+IgM+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production.</a> Frontiers in Immunology. 7, 324(2016).</li>
<li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1a+cell+diversity%3A+nontemplated+addition+in+B-1a+cell+Ig+is+determined+by+progenitor+population+and+developmental+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location.</a> Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).</li>
<li>Prohaska, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Sequencing+of+Peritoneal+and+Splenic+B+Cell+Repertoires+Highlights+Unique+Properties+of+B-1+Cell+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies.</a> Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).</li>
<li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+define+murine+B+cell+lineage+immunoglobulin+heavy+chain+%28IgH%29+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires.</a> Elife. 4, 09083(2015).</li>
<li>Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+cells+in+the+bone+marrow+are+a+significant+source+of+natural+IgM%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM.</a> European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).</li>
<li>Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+secretion+by+B1+cells%3A+Differential+intensity+and+IRF4-dependence+of+spontaneous+IgM+secretion+by+peritoneal+and+splenic+B1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells.</a> European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).</li>
<li>Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS-induced+migration+of+peritoneal+B-1+cells+is+associated+with+upregulation+of+CXCR4+and+increased+migratory+sensitivity+to+CXCL12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12.</a> Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+plasma+cell+alloantigen+1+defines+layered+development+of+B-1a+B-cell+subsets+with+distinct+innate-like+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).</li>
<li>Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+and+differentiation+of+natural+antibody-producing+cells+in+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).</li>
<li>Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+cell+immunoglobulin+directed+against+oxidation-specific+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 415(2012).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+Valuable+tools+or+useless+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+of+murine+B+lymphocyte+blasts+as+a+method+for+examining+gene+regulation+in+primary+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells.</a> Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).</li>
<li>Lin, K. I., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+genes+into+primary+murine+splenic+B+cells+using+retrovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).</li>
<li>Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+Ex+Vivo+Gene+Transfer+to+Primary+Murine+B+Cells+Using+Plasmid+or+Viral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Syndromes+and+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103(2011).</li>
<li>DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PU.1+regulates+expression+of+the+interleukin-7+receptor+in+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors.</a> Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).</li>
<li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Decline+in+Natural+IgM+Function%3A+Diversification+and+Selection+of+the+B-1a+Cell+Pool+with+Age%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age.</a> The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).</li>
<li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+and+efficient+expression+in+mouse+and+human+B+cells+by+a+novel+hybrid+immunoglobulin+promoter+in+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).</li>
<li>Warncke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vitro+transduction+of+naive+murine+B+cells+with+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).</li>
<li>Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IL-5+for+mature+B-1+cells+in+homeostatic+proliferation%2C+cell+survival%2C+and+Ig+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production.</a> Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).</li>
<li>Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+5+in+the+link+between+the+innate+and+acquired+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response.</a> Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).</li>
<li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double+life+of+a+B-1+cell%3A+self-reactivity+selects+for+protective+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metoda umożliwia stabilne i stosunkowo skuteczne dostarczanie pierwotnego genu komórkowego B-1a, transfer adoptywny in vivo oraz identyfikację i lokalizację wstrzykniętych komórek. Komórki były w stanie zostać wykryte 17 tygodni po transferze komórek i zachowały zwiększoną ekspresję CXCR4. Dostarczanie za pośrednictwem retrowirusa zapewniło 30-40% wydajność transdukcji pierwotnych mysich komórek B-1a przy minimalnym wpływie na żywotność komórek w naszych rękach (Figura 4e...

Ostatnie badania wykazały znaczną niejednorodność fenotypową i funkcjonalną komórek odpornościowych, a w szczególności komórek B, w zależności od lokalizacji komórki1,2,3,4,5. Komórki B-1a są jedną z takich populacji o niejednorodnej zdolności do wytwarzania ochronnych przeciwciał IgM; Komórki B-1a szpiku kostnego wydzielają IgM konstytutywnie i znacząco przyczyniają się do miana IgM w osoczu6, podczas gdy komórki B-1a otrzewnej mają niski poziom wydzielania IgM w homeostazie i zamiast tego mogą być aktywowane przez wrodzony receptor toll-podobny (TLR) lub sygnalizację za pośrednictwem cytokin, aby szybko się namnażać, migrować i wydzielać IgM7,8,9,10. Przeciwciała IgM komórek B-1a rozpoznają epitopy specyficzne dla utleniania (OSE), które są obecne na patogenach, komórkach apoptotycznych i utlenionym LDL, a wiązanie IgM z OSE może zapobiegać sygnalizacji zapalnej w chorobach takich jak miażdżyca11. Dlatego strategie mające na celu zwiększenie produkcji IgM poprzez zwiększenie migracji komórek B-1a otrzewnej do miejsc takich jak szpik kostny mogą być przydatne terapeutycznie. Jednak ważne jest, aby takie strategie były ukierunkowane i specyficzne dla typu komórki, ponieważ efekty niezamierzone mogą negatywnie wpływać na funkcje odpornościowe lub zdrowie.
Tutaj opisujemy metodę celowej i długotrwałej nadekspresji CXCR4 w pierwotnych mysich komórkach B-1a, a następnie transferu adoptywnego w celu wizualizacji migracji komórek i funkcjonalnej produkcji przeciwciał IgM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Manipulacja genetyczna pierwotnych limfocytów B jest ograniczona przez niską skuteczność transfekcji w porównaniu z transfekcją przekształconych linii komórkowych. Ponieważ jednak transformowane linie komórkowe mogą znacznie odbiegać od komórek pierwotnych12,13, użycie komórek pierwotnych prawdopodobnie zapewni wyniki, które będą bardziej zgodne z normalną fizjologią. Opisano kilka technik transferu genów w pierwotnych mysich komórkach B, w tym transdukcję retrowirusową, transdukcję adenowirusową, lipofekcję lub transfekcję opartą na elektroporacji, które mają różne poziomy wydajności, przemijalności i wpływu na zdrowie komórek13,14,15. Poniższa metoda wykorzystywała transdukcję retrowirusową, ponieważ zapewniała odpowiednią wydajność transferu genów na poziomie >30%, przy minimalnym wpływie na żywotność komórek. Retrowirus wykazujący ekspresję CXCR4 został wygenerowany przy użyciu wcześniej opisanego retrowirusowego konstruktu wirusa mysich komórek macierzystych - wewnętrznego rybosomalnego miejsca wejścia - zielonego białka fluorescencyjnego (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, do którego podklonowano mysi gen CXCR44. Cząstki retrowirusowe MigR1 (kontrola(Ctl)-GFP) i CXCR4-GFP zostały wygenerowane przy użyciu transfekcji fosforanu wapnia, jak opisano we wcześniej opublikowanych protokołach4,14.
Pomyślnie transdukowane komórki B-1a zostały następnie dożylnie przeniesione do myszy Rag1-/- z niedoborem limfocytów. Zarówno myszy-dawca, jak i biorca zawierały dodatkowo nokaut genu apolipoproteiny E (ApoE), co powoduje zwiększoną akumulację OSE i miażdżycę, zapewniając w ten sposób model aktywacji komórek B-1 in vivo i produkcji IgM. Co więcej, myszy dawcy i biorcy różniły się allotypem CD45; Komórki dawcy B-1 pochodziły od myszy ApoE-/- CD45.1 + i zostały przeniesione do biorców Rag1 - /- CD45.2 + ApoE-/-. Pozwoliło to na różnicowanie limfocytów B CD45.2 dawcy od biorcy CD45.2 po transferze bez konieczności dodatkowego barwienia w poszukiwaniu markerów limfocytów B podczas analizy cytometrii przepływowej. Przedstawione tutaj wyniki pokazują, że ukierunkowana nadekspresja CXCR4 na komórkach B-1a wiąże się ze zwiększoną zdolnością komórek B-1a do migracji do szpiku kostnego, co wiąże się ze zwiększonym poziomem IgM anty-OSE w osoczu. Dodatkowo przedstawiamy metodę wzbogacania komórek B-1 otrzewnej poprzez selekcję negatywną i wykazujemy wymóg aktywacji komórek B-1 w celu efektywnej transdukcji. Metoda ta może być zaadaptowana do innych konstruktów retrowirusowych w celu zbadania wpływu nadekspresji białka na migrację, fenotyp lub funkcję komórek B-1a. Co więcej, zastosowanie rozróżnienia allotypów CD45.1 i CD45.2 może teoretycznie umożliwić transfer do innych immunologicznych modeli mysich zawierających endogenne limfocyty B.

<table><tbody><tr><td>Nasadki filtrujące 70 mikronów</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>mikrokulki antybiotynowe</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD16/CD32 lub blok Fc</td><td>Life Technologies</td><td>MFCR00</td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0452-83</td><td>Klon: RA3-6B2</td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APCef780</td><td>eBioscience</td><td>47-0193-82</td><td>Klon: eBio1D3</td></tr><tr><td>CD23 biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-0232-81</td><td>Klon: B3B4</td></tr><tr><td>CD23 PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0232-82</td><td>Klon: B3B4</td></tr><tr><td>CD3e biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-0033-85</td><td>Klon: eBio500A2</td></tr><tr><td>CD45.1 ApoE-/- myszy</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wyhodowane w domu</td></tr><tr><td>CD45.1 PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560580</td><td>Klon: A20</td></tr><tr><td>CD45.2 BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562895</td><td>Klon: 104</td></tr><tr><td>CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- myszy</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>Wyhodowane w domu</td></tr><tr><td>CD5 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0051-83</td><td>Klon: 53-7.3</td></tr><tr><td>Retrowirus Ctl-GFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wygenerowany w domu przy użyciu plazmidu retrowirusowego MigR1 z ekspresją GFP dostarczonego przez dr T.P. Bender</td></tr><tr><td>CXCR4 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td>Klon: 2B11</td></tr><tr><td>CXCR4-GFP</td><td>retrowirus NIE</td><td>DOTYCZY NIE DOTYCZY Wygenerowany</td><td>w domu przez klonowanie myszy CXCR4 do retrowirusowego plazmidu MigR1</td></tr><tr><td>F4/80 biotyny</td><td>Life Technologies</td><td>MF48015</td><td>Klon: BM8</td></tr><tr><td>Flowjo Software v. 9.9.6</td><td>Treestar Inc.</td><td>Wymagana</td><td></td>licencja</tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td>Klon: RB6-8C5</td></tr><tr><td>inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IgM PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562565</td><td>Klon: R6-60.2</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>Żywe/Martwe Yellow</td><td>Life Technologies</td><td>L34968</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1 biotyna</td><td>BD Biosciences</td><td>553163</td><td>Klon: PK136</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>ODN 1668</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-1668</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-82</td><td>Klon: Ter119</td></tr></tbody></table>

retrowirusowa nadekspresja cxcr4 na mysich komórkach b-1a i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek b-1a do szpiku kostnego i produkcji igm

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

Ponieważ na funkcję komórki wpływają specyficzne dla niszy czynniki w mikrośrodowisku komórkowym, metody analizy lokalizacji i migracji komórek mogą dostarczyć dalszych informacji na temat funkcji komórek. Komórki B-1a są unikalnym podzbiorem limfocytów B u myszy, które wytwarzają ochronne naturalne przeciwciała IgM przeciwko epitopom specyficznym dla utleniania, które powstają podczas zdrowia i choroby. Produkcja IgM komórek B-1a różni się w zależności od lokalizacji komórek B-1a, dlatego z terapeutycznego punktu widzenia przydatne staje się ukierunkowanie na lokalizację B-1a w niszach wspierających wysoką produkcję przeciwciał. W tym miejscu opisujemy metodę celowania w migrację komórek B-1a do szpiku kostnego poprzez nadekspresję receptora chemokiny 4 z motywem C-X-C za pośrednictwem retrowirusa (CXCR4). Indukcja genów w pierwotnych mysich komórkach B może być trudna i zazwyczaj daje niską skuteczność transfekcji wynoszącą 10-20%, w zależności od techniki. Tutaj pokazujemy, że transdukcja retrowirusowa pierwotnych mysich komórek B-1a powoduje 30-40% skuteczność transdukcji. Metoda ta wykorzystuje adoptywny transfer komórek transdukowanych komórek B-1a do myszy biorców z niedoborem komórek B, dzięki czemu można zobrazować migrację i lokalizację komórek B-1a dawcy. Protokół ten może być modyfikowany dla innych konstruktów retrowirusowych i może być stosowany w różnych testach funkcjonalnych transferu poadopcyjnego, w tym w analizie fenotypu i funkcji komórki dawcy lub komórki gospodarza lub analizie rozpuszczalnych czynników wydzielanych po transferze komórek B-1a. Zastosowanie odrębnych myszy dawców i biorców zróżnicowanych na podstawie allotypu CD45.1 i CD45.2 oraz obecności reportera GFP w plazmidzie retrowirusowym może również umożliwić wykrycie komórek dawcy w innych, immunologicznych modelach mysich zawierających endogenne populacje komórek B.

Przegląd protokołu przedstawiono w Rysunek 1. Rysunek 2 wykazuje wzbogacenie komórek B-1a otrzewnej po magnetycznym usuwaniu innych typów komórek otrzewnych. Żywe pojedyncze komórki we frakcji po usunięciu zawierają większą proporcję komórek B CD19+ w porównaniu do F4/80+ makrofagi, brak CD5Witaj CD19- limfocyty T oraz zawierają zwiększoną częstotliwość CD19+ CD5środek Komórki B-1a w porównaniu do frakcji pr...

Tutaj opisujemy metodę retrowirusowej nadekspresji i adoptywnego transferu mysich komórek B-1a w celu zbadania in vivo migracji i lokalizacji komórek B-1a. Protokół ten można rozszerzyć o różne dalsze testy funkcjonalne, w tym kwantyfikację lokalizacji komórek B-1a dawcy lub analizę czynników wydzielanych przez komórki dawcy po transferze adopcyjnym.

Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Protokół ten może ocenić, w jaki sposób celowane dostarczanie genów wpływa na lokalizację i funkcję komórek B-1a i może być użytecznym podejściem potwierdzającym słuszność koncepcji do badania potencjału terapeutycznego genów in vivo. Metoda ta zapewnia stabilne i stosunkowo skuteczne dostarczanie genów do pierwotnych komórek B-1a i umożliwia identyfikację fenotypu i funkcji komórki dawcy po transferze adopcyjnym. Metoda ta może być stosowana do badania różnych procesów zachodzących w komórkach dawcy i gospodarza in vivo, w tym przeżycia komórek, proliferacji i funkcji, i może być stosowana do innych adoptywnych systemów transferowych.Pobieranie płynu otrzewnowego może być trudne. Pamiętaj, aby dokładnie odłączyć komórki, aby zmaksymalizować regenerację i uniknąć przebicia jelit, co może zanieczyścić populację komórek otrzewnej. Do pobrania komórek B-1 otrzewnej użyj prostych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać powierzchowne nacięcie w jamie brzusznej 12-14-tygodniowej myszy z nokautem CD45.1 + apolipoproteiny E i użyj zakrzywionych nożyczek, aby odkleić skórę, aby odsłonić ścianę otrzewnej.Za pomocą 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25 przepłucz jamę otrze

retroviral-overexpression-cxcr4-on-murine-b-1a-cells-adoptive

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie prezentujemy procedurę aktywacji CD40 i ekspansji mysich limfocytów B z splenocytów myszy C57BL/6, które mogą służyć jako model komórki prezentującej antygen (APC) do badania indukcji odporności.

Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

Opisano wydajny system analizy struktury i funkcji genu w kulturze ex vivo limfocytów B śledziony. Metoda ta wykorzystuje produkcję rekombinowanych retrowirusów w wolnej od komórek pomocniczych (helper-free), ekotropowej linii komórkowej pakującej. Osiągnięto stabilną, dziedziczną ekspresję badanego genu w pierwotnych limfocytach, co prowadzi do generowania przeciwciał powierzchniowych na komórkach B przechodzących rekombinację zmiany klasy.

Produkcja rekombinowanych retrowirusów i infekcja limfocytów B

Opisujemy protokół monitorowania ruchliwości radialnej nieprzylegających komórek odpornościowych in vitro za pomocą kolektora sedymentacyjnego/suwaka komórkowego. Migracja komórek jest śledzona na monowarstwach komórek nowotworowych lub na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej. Badanie za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej pozwala na obserwację ruchliwości komórek i funkcjonalności cytotoksycznej.

Ruchliwość promieniowa i funkcja cytotoksyczna retrowirusowych limfocytów T transdukowanych wektorem replikującym, nieadherentnych alloreagujących limfocytów T

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Przedstawiamy szybki i elastyczny protokół dla systemu ekspresji in vivo opartego na pojedynczym receptorze limfocytów T (TCR).  Wektory retrowirusowe są wykorzystywane do transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu zbadania rozwoju i funkcji pojedynczych komórek T in vivo jako alternatywy dla myszy transgenicznych TCR.

Transdukcja retrowirusowa komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu wytworzenia myszy retrogenicznych receptora komórek T

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Opisane tutaj są trzy eksperymentalne podejścia do badania dynamiki infekcji HIV u humanizowanych myszy. Pierwsza z nich pozwala na badanie przewlekłych zdarzeń infekcyjnych, podczas gdy dwie ostatnie pozwalają na badanie ostrych zdarzeń po pierwotnym zakażeniu lub reaktywacji wirusa.

Przewlekłe, ostre i reaktywowane zakażenie wirusem HIV w humanizowanych modelach myszy z niedoborem odporności

Obecne badanie prezentuje protokoły oceny wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH i manipulowania ekspresją genów w tych komórkach.

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV

Przedstawiamy ulepszone protokoły transdukcji retrowirusowej receptorów transportowych i konkurencyjnego naprowadzania w celu zbadania lokalizacji limfocytów specyficznych dla narządów i mikrośrodowisk za pośrednictwem receptorów. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów transportu komórek odpornościowych i ma potencjalne zastosowania w przyszłych badaniach podstawowych i terapeutycznych.

Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych

Poznaj metodę nadekspresji retrowirusowej i transferu adoptywnego mysich komórek B-1a w celu badania ich migracji do szpiku kostnego oraz produkcji IgM w modelu in vivo.

Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM (Wideo) | JoVE Journal

Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM

Przeglądaj więcej filmów