Name: Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życiowego bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek cyklu życiowego drapieżnej bakterii Bdellovibrio bacteriovorus przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół umożliwia śledzenie etapów cyklu w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant Narodowego Centrum Nauki Opus 2018/29/B/NZ6/00539 dla J.Z.C.

1. Przygotowanie lizatu B. bacteriovorus do analizy mikroskopowej
<ol>
	<li>W kolbie o pojemności 250 mL przygotować kokulturę, łącząc 1 mL świeżej 24-godzinnej kultury B. bacteriovorus (np. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) i 3 mL nocnej kultury ofiary (np. E. coli S17-1 pZMR100) z 50 mL buforu Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7,6]) uzupełnionego w razie potrzeby o antybiotyki (tutaj: 50 µg/mL kanamycyny).</li>
	<li>Inkubować kokulturę przez 24 h w temperaturze 30 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm.</li>
	<li>Sprawdzić, czy komórki ofiary zostały całkowicie zlizowane, korzystając z mikroskopii fazowo-kontrastowej w preparacie mokrym. Na tym etapie powinny być obecne liczne ruchliwe komórki B. bacteriovorus w fazie ataku, a żadna komórka E. coli ani bdelloplast nie powinny być widoczne.</li>
	<li>Przefiltrować kulturę B. bacteriovorus przez filtr o rozmiarze porów 0,45 µm, aby usunąć wszelkie pozostałe komórki gospodarza. Komórki drapieżne (0,3–0,5 µm x 0,5–1,4 µm) swobodnie przenikają przez pory 0,45 µm, podczas gdy komórki gospodarza są zatrzymywane na powierzchni filtra.</li>
	<li>Odwirować filtrat przez 20 min przy 2469 x g i 30 °C w stożkowej probówce 50 mL, aby zebrać komórki drapieżne. Resuspendować osad B. bacteriovorus w 3 mL buforu Ca-HEPES (do końcowej wartości OD600 wynoszącej około 0,2) i inkubować w temperaturze 30 °C przy 200 rpm przez 30 min.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek gospodarza do inwazji B. bacteriovorus
<ol>
	<li>Pojedynczą kolonię szczepu gospodarza (E. coli S17-1 pZMR100 jest zalecany ze względu na różnorodność rozmiarów komórek, co prowadzi do powstania bdelloplastów o nierównych rozmiarach) wykorzystać do inokulacji 10 mL pożywki YT (0,8% Bacto tryptone, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,5% NaCl [pH = 7,5]), uzupełnionej w razie potrzeby o antybiotyki (w tym przypadku 50 µg/mL kanamycyny). Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C przy 180 rpm.</li>
	<li>Przenieść 2 mL nocnej hodowli E. coli (OD600 ok. 3,0) do probówki o pojemności 2 mL i odwirować w temperaturze pokojowej (RT) przy 2469 x g przez 5 min. Osad zawiesić w 200 µL buforu Ca-HEPES.</li>
</ol>
3. Konfiguracja mikroskopu (patrz Tabela materiałów)
<ol>
	<li>Przed użyciem podgrzej komorę mikroskopową z obiektywem imersyjnym 100x do 30 °C przez co najmniej 1 h. Krok ten jest niezbędny, aby uniknąć błędów w utrzymaniu ostrości podczas eksperymentu.</li>
	<li>Włącz mikroskop oraz system automatyzacji mikroskopowej. Uruchom oprogramowanie sterujące i wybierz odpowiednie filtry do pozyskiwania obrazów w świetle przechodzącym/DIC/fazowym oraz obrazów fluorescencyjnych, zgodnie z potrzebami (tutaj: obrazy BF, filtr polichromatyczny GFP/mCherry oraz emisja/pobudzenie dla mCherry i GFP).</li>
</ol>
4. Przygotowanie układów do mikroksopii fluorescencyjnej z rejestracją czasową (time-lapse)
<ol>
	<li>Wymieszać 200 mg agarozy klasy molekularnej o niskiej fluorescencji z 20 mL buforu Ca-HEPES (końcowe stężenie agarozy 1%) i rozpuścić agarozę w kuchence mikrofalowej. Partia ta może być wykorzystana wielokrotnie po zastygnięciu, wystarczy zatem powtórzyć etap podgrzewania.</li>
	<li>Wlać 3 mL roztopionej agarozy do szalki z szklanym dnem o średnicy 35 mm (Tabela materiałów). Pozostawić agarozę do zastygnięcia.</li>
	<li>Za pomocą laboratoryjnej mikrołopatki ostrożnie wyjąć wkład agarozowy z szalki 35 mm, nie naruszając środkowego słupa wkładu. Odwrócić wkład spodem do góry i umieścić go w pokrywie szalki Petriego (Rysunek 2).</li>
	<li>Nanieść 5 µL zagęszczonej zawiesiny E. coli na wierzch odwróconego wkładu i rozprzestrzenić komórki w środkowym słupie za pomocą pętli do szczepienia. Dodać 5 µL zagęszczonej zawiesiny B. bacteriovorus (OD600 ok. 0,2) na powierzchnię pokrytą E. coli. Nie rozprzestrzeniać komórek.</li>
	<li>Szybko przenieść żel agarozowy z powrotem do szalki z szklanym dnem 35 mm (stroną wierzchnią do dołu), a następnie przykryć pokrywką. W razie potrzeby usunąć pęcherzyki powietrza, delikatnie dociskając agar do płytki.</li>
</ol>
<img alt="Ustawienie interakcji mikrobiologicznej z B. bacteriovorus i E. coli na agarze, obserwowane za pomocą mikroskopu odwróconego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczny opis przebiegu eksperymentu. Podkładkę agarozową wyjmuje się z szalki 35 mm i odwraca tak, aby strona dolna była skierowana do góry. Świeże zawiesiny komórek drapieżnych oraz nocna kultura komórek ofiar są nakładane na odwróconą podkładkę w celu pokrycia jej strony „dolnej”. Następnie podkładkę agarozową odwraca się do pierwotnej orientacji i umieszcza z powrotem w szalce 35 mm, którą montuje się na stoliku mikroskopu odwróconego w komorze mikroskopowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
5. Przeprowadzenie mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse
<ol>
	<li>Umieść szalkę 35 mm w uchwycie do szalek Petri w taki sposób, aby nie przemieszczała się ona w trakcie eksperymentu. Nanieś jedną kroplę olejku imersyjnego (współczynnik załamania światła 1,518) na obiektyw oraz na dno szalki 35 mm.</li>
	<li>Zamontuj uchwyt na stoliku mikroskopu odwróconego w komorze mikroskopu.</li>
	<li>Skonfiguruj opcje w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, aby zbierać wiele obrazów w wielu pozycjach stolika w czasie.
	<ol>
		<li>Ustaw powiększenie (100x) i soczewkę polichromatyczną (GFP/mCherry). Korzystając z okularu i światła przechodzącego (BF), znajdź płaszczyznę ogniskowania i otwórz menedżera listy punktów.</li>
		<li>Wybierz co najmniej 10 interesujących pozycji, przesuwając stolik i zapisując współrzędne dla każdej pozycji w oprogramowaniu mikroskopu poprzez kliknięcie przycisku Mark point. Unikaj pozycji znajdujących się blisko siebie, aby zapobiec fotoblaknięciu i fototoksyczności. Przełącz zawór kamery z okularu na monitor i skalibruj każdy punkt, ustawiając płaszczyznę ogniskowania i klikając przycisk Replace point w menedżerze listy punktów.</li>
		<li>Otwórz projektant eksperymentu i ustaw wszystkie parametry eksperymentalne w każdej zakładce w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Odznacz pole Z-stacking.</li>
			<li>Wybierz kanały fluorescencyjne i ustaw optymalne parametry oświetlenia. W tym przypadku zastosowano następujące ustawienia: dla kanału mCherry zestaw filtrów mCherry (EX575/25; EM625/45), intensywność 50% i czas ekspozycji 200 ms; dla kanału GFP zestaw filtrów GFP (EX475/28; EM525/48), intensywność 50% i 80 ms; a dla obrazów BF kanał POL, intensywność 5% i 50 ms.</li>
			<li>Wybierz odstępy między akwizycjami obrazów oraz całkowity czas trwania eksperymentu. Tutaj zastosowano odstępy 5 min w ciągu 10 h trwania eksperymentu.</li>
			<li>Włącz utrzymywanie ostrości dla wybranych pozycji (w przypadku używanego tutaj systemu poprzez zaznaczenie pola Maintain focus with UltimateFocus).</li>
			<li>Wybierz folder danych, w którym pliki obrazów mają być automatycznie zapisywane.</li>
			<li>Ponownie sprawdź wszystkie ustawienia w sterowaniu oprogramowaniem mikroskopu, a następnie rozpocznij eksperyment time-lapse.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po pierwszej godzinie eksperymentu sprawdź, czy wszystkie pozycje stolika są nadal w ostrości. W razie potrzeby dostosuj ostrość w odstępach czasu między akwizycjami obrazów.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu time-lapse wyjmij szalkę Petri i zutylizuj szalkę 35 mm z podkładką agarową zgodnie z protokołem bezpieczeństwa biologicznego. 
	UWAGA: Wszystkie podkroki po punkcie 5.2 są specyficzne dla użytkowników systemu DeltaVision Elite. Badacze korzystający z innych systemów muszą dostosować ustawienia do konkretnych urządzeń.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazów time-lapse i generowanie filmów przy użyciu oprogramowania Fiji
<ol>
	<li>Przenieś dane eksperymentalne na komputer z zainstalowanym oprogramowaniem Fiji. Uruchom program Fiji i otwórz obraz za pomocą File | Open lub po prostu przeciągając i upuszczając plik obrazu do programu Fiji.</li>
	<li>W oknie Bio-Formats Import Options wybierz opcję View stack with Hyperstack w ustawieniach wyświetlania stosu, zaznacz Composite color mode w opcjach kolorów oraz zaznacz Autoscale.</li>
	<li>Przewijając stosy obrazów, oceń, czy komórki i bdelloplasty pozostały w ostrości w trakcie trwania eksperymentu. Sprawdź, czy zielone fluorescencyjne punkty DnaN-mNeonGreen są obecne w komórkach B. bacteriovorus wewnątrz bdelloplastów przez całą fazę wzrostu i upewnij się, że wszystkie etapy drapieżnego cyklu życiowego są widoczne.</li>
	<li>Aby przeanalizować konkretną komórkę B. bacteriovorus/bdelloplast, zaznacz ją za pomocą narzędzi zaznaczania w menu Fiji (Rectangle, Oval, Polygon lub Freehand). Powiel wybrany obszar, korzystając z Image | Duplicate lub skrótu Ctrl + Shift + D.</li>
	<li>Dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału fluorescencji w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Aby wybrać pojedynczy kanał, otwórz Channel tools, klikając Image | Color | Channels tools lub Ctrl + Shift + Z, a następnie wybierz interesujący kanał (Channel 1: mCherry, Channel 2: mNeonGreen, Channel 3: jasne pole).</li>
		<li>Dostosuj jasność i kontrast obrazów w kanale fluorescencji, otwierając menu B&amp;C w Image | Adjust | Brightness/Contrast lub klikając Ctrl + Shift + C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj pasek skali za pomocą Analyze | Tools | Scale bar. Dodaj znacznik czasu do obrazów, klikając Images | Stacks | Time Stamper.</li>
	<li>Aby zapisać zmodyfikowane obrazy, przejdź do File | Save As i wybierz TIFF, aby zapisać je jako sekwencję obrazów, AVI, aby stworzyć film, lub PNG, aby zapisać pojedynczy obraz bieżącej klatki.</li>
</ol>

<ol><li>Shatzkes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predatory+Bacteria+Attenuate+Klebsiella+pneumoniae+Burden+in+Rat+Lungs%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs.</a> mBio. 7 (6), (2016).</li>
<li>Iebba, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bdellovibrio+bacteriovorus+directly+attacks+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+Cystic+fibrosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 5, (2014).</li>
<li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injections+of+Predatory+Bacteria+Work+Alongside+Host+Immune+Cells+to+Treat+Shigella+Infection+in+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae.</a> Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+flagellar+filament+and+the+role+of+motility+in+bacterial+prey-penetration+by+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Predatory+Patchwork%3A+Membrane+and+Surface+Structures+of+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Microbial+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Chromosomal+Replication+in+Predatory+Bacterium+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1898(2016).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Chromosome+Replication+and+Its+Relationship+to+Predatory+Attack+Lifestyles+in+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).</li>
<li>Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadowing+the+actions+of+a+predator%3A+backlit+fluorescent+microscopy+reveals+synchronous+nonbinary+septation+of+predatory+Bdellovibrio+inside+prey+and+exit+through+discrete+bdelloplast+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores.</a> Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).</li>
<li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+D-amino-acids+reveal+bi-cellular+cell+wall+modifications+important+for+Bdellovibrio+bacteriovorus+predation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation.</a> Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).</li>
<li>Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predation+of+human+pathogens+by+the+predatory+bacteria+Micavibrio+aeruginosavorus+and+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na rosnące zainteresowanie wykorzystaniem B. bacteriovorus jako żywego antybiotyku, potrzebne są nowe narzędzia do obserwacji cyklu życiowego drapieżników, w szczególności interakcji drapieżnik-patogen. Prezentowany protokół służy do śledzenia całego cyklu życiowego B. bacteriovorus , zwłaszcza podczas jego wzrostu wewnątrz gospodarza, w czasie rzeczywistym. Co więcej, zastosowanie szczepu wytwarzającego znakowany fluorescencyjnie klamrę beta holoenzymu polimerazy III DNA umożliwiło monitorow...

Bdellovibrio bacteriovorus to mała (0,3–0,5 µm na 0,5–1,4 µm) bakteria gram-ujemna, która poluje na inne bakterie gram-ujemne, w tym na szkodliwe patogeny, takie jak Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa oraz Shigella flexneri1,2,3. Ponieważ B. bacteriovorus zabija patogeny, jest uważana za potencjalny żywy antybiotyk, który może być stosowany w walce z infekcjami bakteryjnymi, zwłaszcza tymi wywołanymi przez szczepy wielolekooporne.
B. bacteriovorus wykazuje specyficzny cykl życiowy składający się z dwóch faz: wolnożyjącej, niereplikacyjnej fazy ataku oraz wewnątrzkomórkowej fazy reprodukcyjnej (Rycina 1). W fazie wolnożyjącej ta wysoce ruchliwa bakteria, poruszająca się z prędkością do 160 µm/s, poszukuje swojej ofiary. Po przytwierdzeniu się do błony zewnętrznej ofiary, wnika ona do periplazmy4,5. Podczas reprodukcyjnej fazy w periplazmie B. bacteriovorus wykorzystuje liczne enzymy hydrolityczne do degradacji makrocząsteczek gospodarza i ponownego wykorzystania ich we własnym wzroście. Wkrótce po wniknięciu do periplazmy komórka gospodarza obumiera i pęcznieje, tworząc sferyczną strukturę zwaną bdelloplastem, wewnątrz którego komórka drapieżnika wydłuża się i replikuje swoje chromosomy. Proces replikacji rozpoczyna się w miejscu inicjacji replikacji (oriC)6 i trwa do momentu całkowitej syntezy kilku kopii chromosomu7. Co ciekawe, replikacji każdego chromosomu nie towarzyszy podział komórki. Zamiast tego drapieżnik wydłuża się, tworząc długą, wielonukleoidową komórkę nitkowatą. Po wyczerpaniu składników odżywczych filament przechodzi synchroniczne septowanie, a komórki potomne zostają uwolnione z bdelloplastu8.
Zanim B. bacteriovorus będzie mógł zostać wykorzystany jako żywy antybiotyk w walce z infekcjami bakteryjnymi, kluczowe jest zrozumienie głównych etapów jego cyklu życiowego, w szczególności tych związanych z proliferacją wewnątrz ofiary. Obrazowanie żywych komórek B. bacteriovorus było wyzwaniem ze względu na różnorodne formy morfologiczne drapieżnika i jego ofiary podczas złożonego cyklu życiowego. Do tej pory interakcje między B. bacteriovorus a komórką gospodarza były badane głównie za pomocą mikroskopii elektronowej i analizy statycznej2,9,10, z których obie mają ograniczenia, szczególnie gdy są wykorzystywane do monitorowania kolejnych etapów drapieżnego cyklu życiowego. Metody te zapewniają obrazy komórek B. bacteriovorus o wysokiej rozdzielczości i umożliwiają obserwację małego drapieżnika podczas fazy ataku lub wzrostu. Nie pozwalają one jednak na śledzenie pojedynczych komórek B. bacteriovorus przez obie fazy cyklu życiowego.
Przedstawiono tutaj kompleksowy protokół wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse (TLFM) do monitorowania pełnego cyklu życiowego B. bacteriovorus. Zastosowano system składający się z podkładki agarozowej w połączeniu ze szalką do obrazowania komórek, w której komórki drapieżne mogą swobodnie poruszać się pod podkładką agarozową, podczas gdy unieruchomione komórki ofiar mogą tworzyć bdeloplasty (Rysunek 2). Układ ten został przygotowany w oparciu o konkretne szczepy E. coli oraz B. bacteriovorus, jednak protokół można łatwo zmodyfikować, aby dostosować go do indywidualnych szczepów użytkownika (np. posiadających różne markery selekcyjne, białka połączone z różnymi fluoroforami itp.).
W tym przypadku, aby zwizualizować B. bacteriovorus podczas fazy ataku, skonstruowano specyficzny szczep (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry), który wykazuje ekspresję wersji białka cytoplazmatycznego PilZ z etykietą fluorescencyjną (dostępne w naszym laboratorium na zapytanie)7. Szczep ten dodatkowo produkuje DnaN (β-zacisk ślizgowy), podjednostkę holoenzymu polimerazy DNA III, połączoną z białkiem fluorescencyjnym. Pozwala to na monitorowanie trwającej replikacji DNA wewnątrz komórek drapieżnych podczas ich wzrostu w bdelloplastach.
Chociaż opisany protokół oraz oprogramowanie wykorzystywane do akwizycji obrazów odnoszą się do mikroskopu odwróconego konkretnego producenta (patrz Tabela materiałów), technikę tę można dostosować do każdego mikroskopu odwróconego wyposażonego w komorę inkubacyjną lub inny zewnętrzny uchwyt grzewczy i umożliwiającego obrazowanie w trybie time-lapse. Do analizy danych użytkownicy mogą wybrać dowolne dostępne oprogramowanie kompatybilne z poszczególnymi formatami wyjściowymi.
<img alt="Schemat cyklu życiowego Bdellovibrio; atak na E. coli, reprodukcja, uwalnianie potomstwa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Cykl życiowy B. bacteriovorus w komórce gospodarza E. coli. W fazie ataku wolnopływająca komórka B. bacteriovorus poszukuje komórki gospodarza E. coli i przyczepia się do niej. Po inwazji komórka drapieżnika lokalizuje się w periplazmie ofiary, zmieniając kształt komórki gospodarza i tworząc bdelloplast. Faza reprodukcyjna rozpoczyna się wraz z formowaniem bdelloplastu. Komórka drapieżnika trawi komórkę ofiary i wykorzystuje proste związki do budowy własnych struktur. B. bacteriovorus rośnie w formie długiego, pojedynczego filamentu wewnątrz periplazmy gospodarza. Po wyczerpaniu zasobów komórki ofiary, filament B. bacteriovorus przechodzi synchroniczną septację i tworzy komórki potomne. Po wykształceniu wici przez komórki potomne, następuje liza bdelloplastu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Wirówka</td><td>MPW MED. INSTRUMENTS</td><td>MPW-260R</td><td>Rotor ref. 12183</td></tr><tr><td>Certyfikowana biologia molekularna Agaroza</td><td>BIO-RAD</td><td>161-3100</td><td>agaroza o niskiej fluorescencji do podkładki agarozowej</td></tr><tr><td>Fidżi</td><td>ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>Pakiet do przetwarzania obrazu Open Source</td></tr><tr><td>Naczynie szklane 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81218-200</td><td>szkło</td></tr> <tr><td>niepowlekaneMikroskop</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Microtiter Stage, moduł laserowy o najwyższej ostrości, kamera DV Elite CoolSnap HQ2, montaż SSSI FP DV, zestaw obj. Oly 100x olej 1.4 NA, pryzmat Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V</td></tr><tr><td>Minisart Filter 0,45 &micro; m</td><td>Sartorius</td><td>16555----------K</td><td>Octan celulozy, sterylny, Luer Lock Outlet</td></tr><tr><td>Start SoftWoRx</td><td>GE</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania dostarczone przez producenta</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywymi komórkami cyklu życiowego bakteryjnego drapieżnika bdellovibrio bacteriovorus przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus to mała bakteria Gram-ujemna, która zabija inne bakterie Gram-ujemne, w tym szkodliwe patogeny. Dlatego jest uważany za żywy antybiotyk. Aby zastosować B. bacteriovorus jako żywy antybiotyk, konieczne jest najpierw zrozumienie głównych etapów jego złożonego cyklu życiowego, w szczególności jego namnażania się wewnątrz ofiary. Do tej pory wyzwaniem było monitorowanie kolejnych etapów cyklu życiowego drapieżnika w czasie rzeczywistym. Przedstawiono kompleksowy protokół obrazowania w czasie rzeczywistym pełnego cyklu życia B. bacteriovorus, zwłaszcza podczas jego wzrostu wewnątrz gospodarza. W tym celu stosuje się system składający się z podkładki agarozowej w połączeniu z szalkami do obrazowania komórek, w których komórki drapieżne mogą swobodnie poruszać się pod poduszką agarozową, podczas gdy unieruchomione komórki ofiary są w stanie tworzyć bdelloplasty. Zastosowanie szczepu wytwarzającego znakowaną fluorescencyjnie podjednostkę β polimerazy DNA III pozwala dodatkowo na monitorowanie replikacji chromosomów podczas fazy reprodukcji cyklu życiowego B. bacteriovorus.

Opisany system oparty na TLFM pozwala na śledzenie w czasie pojedynczych komórek . bacteriovorus (Rycina 3, Film 1) i dostarcza cennych informacji na temat każdego etapu złożonego, drapieżnego cyklu życiowego. Fuzja PilZ-mCherry umożliwia oznakowanie całej komórki drapieżnej w fazie ataku, a także we wczesnej fazie wzrostu (Rycina 3). Przejście z fazy ataku do fazy replikacyjnej zwizualizowano nie tylko poprzez tworzenie się bdelloplast...

Prezentowany tutaj jest protokół, który opisuje monitorowanie pełnego cyklu życia drapieżnej bakterii Bdellovibrio bacteriovorus za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w połączeniu z podkładką agarozową i naczyniami do obrazowania komórek.

Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życiowego bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

Obrazowanie bakteriovorus Bdellovibrio z wykorzystaniem żywych komórek było wyzwaniem ze względu na złożony cykl życiowy tych drapieżnych bakterii. Nasz protokół pozwala na monitorowanie etapów całego cyklu życia w czasie rzeczywistym. Chociaż nasz protokół opiera się na specyficznych szczepach wyrównawczych, można go łatwo dostosować do różnych szczepów bakteryjnych, w tym szczepów chorobotwórczych.Aby założyć hodowlę B.bacteriovorus, połącz jeden mililitr świeżych 24-godzinnych bakterii z trzema mililitrami nocnej kultury zdobyczy w 250-mililitrowej kolbie zawierającej 50 mililitrów buforu calcium hipis, uzupełnionego antybiotykami w razie potrzeby. Po 24-godzinnej inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obrotach na minutę sprawdź, czy komórki ofiary zostały w pełni zrandomizowane za pomocą mikroskopii kontrastowej twarzy montowanej na płynie. Powinny być obecne liczne wielofazowe komórki B.bacteriovorus i nie powinny być widoczne żadne komórki E. coli ani bdelloplast.Przecedź kulturę B.bacteriovorus przez filtr o wielkości porów 0,45 mikrometra do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i zawieś filtrat w wirówce. Następnie ponownie zawiesić osad B.bacteriovorus w trzech mililitrach buforu hipisów wapnia do końcowej gęstości optycznej przy 600 nanometrach około 0,2 i inkubować bakterie w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę przez 30 minut. Aby przygotować komórki gospodarza, wybierz pojedynczą kolonię z interesującego nas szczepu gospodarza i umieść bakterie w 10 mililitrach pożywki YT uzupełnionej antybiotykami, jeśli to konieczne do nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 180 obrotów na minutę.Następnego ranka przenieś dwa mililitry nocnej hodowli do dwumililitrowej probówki i zagnieźdź komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach buforu wapniowego hipisów. Bardzo ważne jest, aby po odwirowaniu całkowicie zawiesić całe osady komórkowe, aby upewnić się, że komórka ofiary jest oddzielona na poziomie pojedynczej komórki.Aby przygotować komórki do poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej, najpierw wymieszaj 200 miligramów niskofluorescencyjnej agarozy molekularnej z 20 mililitrami buforu hipisów wapnia i rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej. Wlej trzy mililitry stopionej agarozy do naczynia ze szklanym dnem o grubości 35 milimetrów i pozwól agarozie zestalić się. Za pomocą laboratoryjnej mikroszpatułki ostrożnie wyjmij wacik agarozowy z naczynia, nie naruszając środkowego bieguna podkładki i umieść podkładkę dolną stroną do góry na pokrywie szalki Petriego.Umieść pięć mikrolitrów skoncentrowanej zawiesiny komórek gospodarza na odwróconej podkładce i użyj pętli inokulacyjnej, aby rozprowadzić komórki w środkowym biegunie. Następnie dodaj pięć mikrolitrów skoncentrowanej zawiesiny B.bacteriovorus na powierzchnię pokrytą komórką gospodarza bez rozprowadzania i szybko włóż żel do 35-mililitrowego szklanego dolnego naczynia górną stroną do dołu. Następnie przykryj naczynie pokrywką.W przypadku poklatkowej mikroskopii florescencyjnej kokultury, umieść szalkę w uchwycie na szalkę Petriego tak, aby szalka nie poruszała się w trakcie eksperymentu i umieść jedną kroplę olejku immersyjnego na odwróconym obiektywie mikroskopu i jedną kroplę na dnie naczynia. Zamontuj uchwyt na stoliku mikroskopu w odwróconej komorze mikroskopu i w oprogramowaniu mikroskopu ustaw powiększenie na 100X, a soczewkę polichromowaną na GFP i Mcherry. Korzystając z iPS w Brightfield, zlokalizuj płaszczyznę ogniskową i otwórz bezsensowny menedżer.Przesuń stół montażowy i użyj przycisku oznaczania punktów, aby zapisać współrzędne co najmniej 10 interesujących pozycji. Przełącz wartość kamery z iPS na monitor. Ustaw płaszczyznę ogniskowej i kliknij przycisk zamiany punktu w bezsensownym menedżerze, aby skalibrować każdy punkt.Otwórz projektanta eksperymentów i odznacz pole układania chorób. Wybierz odpowiednie kanały fluorescencyjne i optymalne ustawienia eliminacji oraz ustaw odstępy czasu między akwizycją obrazu a całkowitym czasem eksperymentu. Włącz utrzymanie ostrości dla wybranych pozycji i wybierz folder danych, w którym pliki obrazów mają być automatycznie zapisywane.Ponownie sprawdź wszystkie ustawienia w oprogramowaniu sterującym mikroskopu i rozpocznij eksperyment poklatkowy. Po pierwszej godzinie eksperymentu sprawdź, czy wszystkie pozycje stolika są nadal ostre. Po zakończeniu eksperymentu poklatkowego należy usunąć szalkę Petriego i wyrzucić 35-milimetrową szalkę z podkładką agarozową zgodnie z odpowiednimi protokołami bezpieczeństwa biologicznego.W celu przetworzenia danych obrazu poklatkowego przenieś dane eksperymentalne do komputera z załadowanym oprogramowaniem Fidżi i otwórz obraz w Fidżi. W opcjach importu formatów biologicznych wybierz pozycję Wyświetl stos z hiperstosem. W trybie kolorów kompozytowych wybierz opcję Skalowanie automatyczne.Przewijając stosy obrazów, oceń, czy komórki i bdelloplasty pozostały skupione w trakcie eksperymentu. Czy zielone fluorescencyjne plamki z DNA i zieleń mNeon są obecne w komórkach B.bacteriovorus wewnątrz bdelloplastów przez całą fazę wzrostu i czy można zwizualizować wszystkie etapy cyklu życia drapieżnika. Aby przeanalizować konkretną komórkę B.bacteriovorus bdelloplast, użyj narzędzia do zaznaczania, aby oznaczyć interesującą Cię komórkę.Następnie zduplikuj wybrany region. Na zduplikowanym obrazie kliknij opcję rozkrój i wygładzenie, a dla każdego kanału fluorescencyjnego kliknij narzędzia obraz, kolor, kanały i wybierz interesujący Cię kanał. Następnie kliknij obraz, dostosuj i kontrast jasności, aby dostosować jasność i kontrast obrazu w każdym kanale.Aby dodać podziałkę liniową, wybierz opcje Analizuj, Narzędzia i Podziałka liniowa. Aby dodać sygnaturę czasową do obrazów, kliknij pozycję Obrazy, stosy i Znacznik czasu. Aby zapisać zmodyfikowane obrazy, wybierz opcję TIF.Aby zapisać dane jako sekwencję obrazów, AVI w celu utworzenia filmu lub PNG w celu zapisania pojedynczego obrazu bieżącej klatki. Ten system oparty na poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia śledzenie w czasie rzeczywistym pojedynczych komórek B.bacteriovorus i dostarcza cennych informacji na temat każdego etapu złożonego cyklu życiowego drapieżnika. Pillsy mCherry fusion umożliwia znakowanie całej drapieżnej komórki w fazie ataku, a także we wczesnej fazie wzrostu.Przejście od fazy ataku do fazy replikacji można uwidocznić nie tylko przez tworzenie się bdelloplastu gospodarza, ale także przez pojawienie się repliksomemu. Repensom jest montowany na atakującym biegunie komórki, a w miarę postępu fazy rozmnażania można zaobserwować więcej niż jeden replikom w rosnącym włóknie B.bacteriovorus. Po zsyntetyzowaniu kilku kopii chromosomu replikacja zostaje zakończona.Na koniec wielojądrowe włókno ulega przegrodzie, a komórki potomne są uwalniane z bdelloplastu. Komórki B.bacteriovorus powinny być wystarczająco materialne, aby aktywnie szukać swojej zdobyczy, a cała gęstość komórek powinna być wystarczająco wysoka, aby umożliwić przyczepienie się komórek drapieżnych. Platforma ta może być przydatna w eksperymentach z udziałem patogenów wielolekoopornych oraz w celu ułatwienia ulepszeń w inżynierii genetycznej B.bacteriovorus jako żywego antybiotyku w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej.

live-cell-imaging-life-cycle-bacterial-predator-bdellovibrio

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.

Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Źródło: Heering, J. i wsp., indukcja różnicowania komórkowego i obrazowanie pojedynczych komórek Vibrio parahaemolyticus Swimmer i Swarmer cells. J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje przygotowanie komórek roju z kolonii Vibrio parahaemolyticus do obrazowania fluorescencyjnego. Bakterie są genetycznie modyfikowane w celu ekspresji białka znakowanego fluoroforem, które lokalizuje się jednobiegunowo w komórkach pływaka i dwubiegunowo w wydłużonych komórkach roju, umożliwiając ich wizualne...

Przygotowanie komórek roju Vibrio parahaemolyticus do obrazowania

Źródło: Schumacher, D., i Sogaard-Andersen, L. Obrazowanie żywymi komórkowymi fluorescencji pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje wykorzystanie obrazowania żywych komórek do śledzenia pochodzenia chromosomów oznaczonych fluorescencją podczas podziału komórek bakteryjnych. Rejestruje dynamikę segregacji chromosomów za pomocą mikroskopii poklatkowej fazowo-kontrastowej oraz fluorescencji.

Obrazowanie poklatkowe segregacji chromosomów u bakterii znakowanych fluorescencją

Źródło: Makowski, Ł., i in. Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życia bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej poklatkowej. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne Bdellovibrio bacteriovorus polującego na unieruchomionej E. coli pod agarozową poduszką, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym replikacji wewnątrzkomórkowej i uwalniania potomstwa do badania drapieżnictwa bakteryjnego i interakcji...

Obrazowanie czasowe z żywymi komórkami drapieżnictwa bakterioworu Bdellovibrio na E. coli

Źródło: Brzozowski, R. S. i in. Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu badania lokalizacji białek podkomórkowych oraz zmian morfologii komórek u bakterii. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje mikroskopię fluorescencyjną żywych komórek, aby wizualizować zmiany morfologiczne bakterii w czasie rzeczywistym. Opisuje etapy związane z obrazowaniem, akwizycją poklatkową oraz dekonwolucją w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie zmian morfologicznych u bakterii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek

Streptomyces charakteryzują się złożonym cyklem życiowym, który był eksperymentalnie trudny do zbadania za pomocą biologicznych metod komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykonywania fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej całego cyklu życia poprzez hodowlę Streptomyces venezuelae w urządzeniu mikroprzepływowym.

Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życiowego S. venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Komórki bakteryjne są przestrzennie wysoce zorganizowane. Aby śledzić tę organizację w czasie w wolno rosnących komórkach Myxococcus xanthus, opracowano zestaw do fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przez kilka pokoleń. Za pomocą tej metody można było określić czasoprzestrzenną dynamikę białek ważnych dla segregacji chromosomów i podziału komórek.

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek cyklu życiowego drapieżnej bakterii Bdellovibrio bacteriovorus przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół umożliwia śledzenie etapów cyklu w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życiowego bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życiowego bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów