Name: Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj metodę indukcji akumulacji α-synukleiny w pierwotnych neuronach dopaminowych myszy przy użyciu preformowanych fibryl. Protokół umożliwia automatyczną analizę obrazu i przesiewanie inhibitorów akumulacji białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Prof. Kelvinowi Lukowi za hojny dar α-synukleinowych PFF, Conjung Zhengowi za stworzenie i hodowlę komórek neuronalnych, oraz Zakładowi Mikroskopii Świetlnej w Instytucie Biotechnologii Uniwersytetu w Helsinkach za obrazowanie komórek wybarwionych immunologicznie. Prace te były wspierane przez granty z 3i-Regeneration przez Business Finland (Fińska Agencja Finansowania Innowacji), Akademia Fińska #309489, #293392, #319195; Fundacji im. Sigrid Juselius oraz środków statutowych Instytutu Farmakologii im. M. Maja PAN.

<ol><li>Fearnley, J. M., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+and+Parkinson%27s+disease%3A+substantia+nigra+regional+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity.</a> Brain. 114, Pt 5 2283-2301 (1991).</li>
<li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li>
<li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+pathology+in+Parkinson%27s+disease+consists+of+crowded+organelles+and+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lewy pathology in Parkinson's disease consists of crowded organelles and lipid membranes.</a> Nature Neuroscience. 22 (7), 1099-1109 (2019).</li>
<li>Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Lewy+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">100 years of Lewy pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+neuronal+vulnerability+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neurosciences. 18 (2), 101-113 (2017).</li>
<li>Leverenz, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+novel+proteins+in+cortical+lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of novel proteins in cortical lewy bodies.</a> Brain Pathology. 17 (2), 139-145 (2007).</li>
<li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+in+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li>
<li>Anderson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Ser-129+is+the+dominant+pathological+modification+of+alpha-synuclein+in+familial+and+sporadic+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338 (6109), 949-953 (2012).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2135-2146 (2014).</li>
<li>Osterberg, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+aggregation+of+alpha-synuclein+and+selective+degeneration+of+lewy+inclusion-bearing+neurons+in+a+mouse+model+of+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Progressive aggregation of alpha-synuclein and selective degeneration of lewy inclusion-bearing neurons in a mouse model of parkinsonism.</a> Cell Reports. 10 (8), 1252-1260 (2015).</li>
<li>Mahul-Mellier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+Lewy+body+formation%2C+rather+than+simply+alpha-synuclein+fibrillization%2C+is+the+major+driver+of+neurodegeneration+in+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22J+bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The process of Lewy body formation, rather than simply alpha-synuclein fibrillization, is the major driver of neurodegeneration in synucleinopathies.</a> J bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Elkouzi, A., Vedam-Mai, V., Eisinger, R. S., Okun, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+therapies+in+Parkinson+disease+-+repurposed+drugs+and+new+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Emerging therapies in Parkinson disease - repurposed drugs and new approaches.</a> Nature Reviews Neurology. 15 (4), 204-223 (2019).</li>
<li>Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+for+brain+repair-from+rescue+to+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming.</a> Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).</li>
<li>Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Olanow, C. W., Freeman, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+dopaminergic+neurons+develop+PD+pathologic+changes%3A+a+second+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Transplanted dopaminergic neurons develop PD pathologic changes: a second case report.</a> Movement Disorders. 23 (16), 2303-2306 (2008).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+bodies+in+grafted+neurons+in+subjects+with+Parkinson%27s+disease+suggest+host-to-graft+disease+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation.</a> Nature Medicine. 14 (5), 501-503 (2008).</li>
<li>Planken, A., Porokuokka, L. L., Hanninen, A. L., Tuominen, R. K., Andressoo, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-throughput+computer+aided+micro-island+method+to+assay+embryonic+dopaminergic+neuron+cultures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Medium-throughput computer aided micro-island method to assay embryonic dopaminergic neuron cultures in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (1), 122-131 (2010).</li>
<li>Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF%3A+a+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+for+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.</a> Science. 260 (5111), 1130-1132 (1993).</li>
<li>Hoffer, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+reverses+toxin-induced+injury+to+midbrain+dopaminergic+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo.</a> Neuroscience Letters. 182 (1), 107-111 (1994).</li>
<li>Kearns, C. M., Gash, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF+protects+nigral+dopamine+neurons+against+6-hydroxydopamine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo.</a> Brain Research. 672 (1-2), 104-111 (1995).</li>
<li>Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+rAAV-mediated+gene+transfer+of+GDNF+in+the+rat+Parkinson%27s+model%3A+intrastriatal+but+not+intranigral+transduction+promotes+functional+regeneration+in+the+lesioned+nigrostriatal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system.</a> Journal of Neuroscience. 20 (12), 4686-4700 (2000).</li>
<li>Chmielarz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF%2FRET+signaling+pathway+activation+eliminates+Lewy+Body+pathology+in+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+bioRxiv%22%5BJournal%5D)">GDNF/RET signaling pathway activation eliminates Lewy Body pathology in midbrain dopamine neurons.</a> J bioRxiv. , 752899(2019).</li>
<li>Ganjam, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+damage+by+%CE%B1-synuclein+causes+cell+death+in+human+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons.</a> Cell Death & Disease. 10 (11), 865(2019).</li>
<li>Bieri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+modifies+%CE%B1-syn+pathology+and+spread+in+mouse+models+and+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">LRRK2 modifies α-syn pathology and spread in mouse models and human neurons.</a> Acta Neuropathologica. 137 (6), 961-980 (2019).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li>
<li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+3.0%3A+Next-generation+image+processing+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970(2018).</li>
<li>Kumar, S. T., Donzelli, S., Chiki, A., Syed, M. M. K., Lashuel, H. A. A simple, versatile and robust centrifugation-based filtration protocol for the isolation and quantification of alpha-synuclein monomers, oligomers and fibrils: Towards improving experimental reproducibility in alpha-synuclein research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+ST+%22Journal+of+Neurochemistry%22">Journal of Neurochemistry</a>. , (2020).</li>
<li>Polinski, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Generating+and+Using+Alpha-Synuclein+Pre-Formed+Fibrils+to+Model+Parkinson%27s+Disease+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinsons+Disease%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents.</a> Journal of Parkinsons Disease. 8 (2), 303-322 (2018).</li>
<li>Patterson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibrils+from+Monomers+and+Use+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59758(2019).</li>
<li>Bousset, L., Brundin, P., Bockmann, A., Meier, B., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Procedure+for+Removal+and+Inactivation+of+Alpha-Synuclein+Assemblies+from+Laboratory+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinsons+Disease%22%5BJournal%5D)">An Efficient Procedure for Removal and Inactivation of Alpha-Synuclein Assemblies from Laboratory Materials.</a> Journal of Parkinsons Disease. 6 (1), 143-151 (2016).</li>
<li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+diverse+cellular+morphologies+in+image-based+screens+with+iterative+feedback+and+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).</li>
<li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).</li>
<li>Liss, B., Roeper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+dopamine+midbrain+neurons%3A+functional+diversity+and+flexibility+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Individual dopamine midbrain neurons: functional diversity and flexibility in health and disease.</a> Brain Research Reviews. 58 (2), 314-321 (2008).</li>
<li>Sulzer, D., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+vulnerability%2C+pathogenesis%2C+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson's disease.</a> Movement Disorders. 28 (1), 41-50 (2013).</li>
<li>Peelaerts, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+strains+cause+distinct+synucleinopathies+after+local+and+systemic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration.</a> Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).</li>
<li>Lew, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+statistical+practice+in+pharmacology.+Problem+1%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Good statistical practice in pharmacology. Problem 1.</a> British Journal of Pharmacology. 152 (3), 295-298 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rozprzestrzenianie się patologii Lewy'ego, której głównym składnikiem jest pS129-αsyn, jest histopopatologicznym znakiem rozpoznawczym PD. Zatrzymanie lub spowolnienie akumulacji zagregowanego pS129-αsyn może spowolnić degenerację neuronów dopaminowych i postęp alfa-synukleinopatii. Jednak mechanistyczne zrozumienie, w jaki sposób agregacja pS129-αsyn przyczynia się do śmierci neuronów dopaminowych, nadal musi zostać ustalone. Dowody z ludzkich badań pośmiertnych na próbkach mózgu od pacjentów w różnych stadiach choroby, a także obserwacja dodatniej inkluzji pS129-αsyn w przeszczepionych neuronach płodowych silnie sugerują rozprzestrzenianie się patologii Lewy'ego między komórkami 16,17,33. W związku z tym podobne do prionów rozprzestrzenianie się pS129-αsyn zostało niedawno podsumowane za pomocą α-synukleiny PFF 9,10. Ustanowienie solidnego, opłacalnego i stosunkowo wysoko- lub średnioprzepustowego modelu rozprzestrzeniania i akumulacji pS129-αsyn, szczególnie w neuronach dopaminowych, może znacznie przyspieszyć poszukiwania nowych metod leczenia i związków modyfikujących ten proces.
Ponieważ utrata neuronów dopaminowych jest główną przyczyną objawów motorycznych w PD, a komórki te posiadają wiele unikalnych właściwości 2,34,35, modelowanie prionowego rozprzestrzeniania się pS129-αsyn w neuronach dopaminowych jest najbardziej odpowiednim typem modelu z perspektywy translacyjnej. Protokoły wykorzystujące mikrowyspy kultur embrionalnych neuronów śródmózgowia na 4-dołkowych płytkach i półautomatyczne oznaczanie ilościowe zostały opisane wcześniej18. Opisany tutaj protokół został dostosowany do płytek 96-dołkowych i zapewnia mniej pracochłonne przygotowanie mikrowysp, pozwalając na przygotowanie do czterech płytek zawierających po 60 dołków każda przez doświadczonego badacza w ciągu jednego dnia roboczego. Hodowla neuronów dopaminowych w 96-dołkowych płytkach pozwala na testowanie leków w mniejszych ilościach i umożliwia wysokie szybkości transdukcji z wektorami lentiwirusa. Możliwe jest również łączenie różnych zabiegów w celu przeprowadzenia bardziej złożonych eksperymentów.
Przed zastosowaniem jakichkolwiek zabiegów (w tym PFF) należy sprawdzić jakość hodowli za pomocą mikroskopii w jasnym polu. Jeśli system mikroskopowy nie wykorzystuje komory CO2 z ogrzewaniem, komórki nie powinny być trzymane poza inkubatorem dłużej niż kilka minut, ponieważ pierwotne neurony dopaminowe myszy są delikatne i łatwo się stresują. Z tego samego powodu zaleca się, aby pierwsze obrazowanie wykonać po 24 godzinach inkubacji (między DIV1-DIV3). Komórki powinny wydawać się żywe z obecnymi ciałami komórkowymi i jednorodnie rozmieszczone wewnątrz mikrowyspy. Neurony pierwotne osiadłyby na ziemi pokrytej PO i zaczęłyby tworzyć projekcje neuronalne. Możliwe jest zaobserwowanie małych skupisk komórek (tj. o średnicy mniejszej niż 150–200 μm), które mogą powstać, jeśli proces rozcierania nie zostanie przeprowadzony prawidłowo lub gęstość posiewu jest wyższa niż zalecana. Te małe grudki nie wpłynęłyby na eksperyment, chyba że jest ich więcej niż kilka na studzienkę i/lub więcej. Zbite komórki bardzo utrudniają identyfikację markerów immunohistochemicznych i poszczególnych komórek podczas analizy obrazu. Istotne jest, aby unikać takich grudek poprzez staranne powlekanie, trytuowanie i kontrolowanie gęstości poszycia. Jeśli nie można zaobserwować jednolitości tych warunków w niektórych studniach, nie należy uwzględniać tych wadliwych studni w eksperymencie. Takiego wykluczenia należy dokonać przed wykonaniem jakichkolwiek zabiegów.
Co więcej, zastosowanie 96-dołkowych płytek pozwala na wygodne korzystanie z wielokanałowych pipet podczas procedur barwienia i bezpośrednią wizualizację za pomocą automatycznych mikroskopów płytkowych, co dodatkowo zwiększa przepustowość. Wykorzystanie zautomatyzowanej kwantyfikacji obrazu jest niezbędne do analizy danych z platform obrazowania o wysokiej zawartości. Oprócz możliwości przetwarzania tysięcy obrazów uzyskanych z każdego eksperymentu, zapewnia bezstronną, identyczną kwantyfikację wszystkich grup leczenia. Przepływ pracy zaproponowany do analizy obrazu opiera się na prostych zasadach segmentacji neuronów dopaminowych, filtrowania prawidłowo segmentowanych komórek przez nadzorowane uczenie maszynowe, a następnie kwantyfikacji fenotypów (pS129-αsyn dodatni i pS129-αsyn ujemny), ponownie przez nadzorowane uczenie maszynowe. Chociaż można sobie wyobrazić kilka różnych podejść do tego zadania, stwierdziliśmy, że połączenie segmentacji z uczeniem maszynowym jest najbardziej niezawodne w przypadku kultur dopaminy ze względu na wysoką gęstość posiewu, zróżnicowane kształty neuronów dopaminowych i obecność silnie zabarwionych neurytów. Zaproponowany algorytm analizy obrazu został zaimplementowany w CellProfiler i CellProfiler Analyst, ogólnodostępnym, ogólnodostępnym oprogramowaniu do analizy obrazów o wysokiej zawartości26,27. Algorytm może być również zaimplementowany za pomocą innego oprogramowania do analizy obrazu, zarówno open source (np. ImageJ/FIJI, KNIME), jak i zastrzeżonego. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że często poświęcają one możliwości dostosowywania na rzecz łatwości użytkowania, a zatem mogą nie działać dobrze w skomplikowanych analizach. Odkryliśmy, że pakiety oprogramowania CellProfiler i CellProfiler Analyst dają szczególnie wiarygodne wyniki dzięki połączeniu znacznej liczby zaimplementowanych algorytmów, ekstremalnej elastyczności w projektowaniu przepływu pracy oraz jednoczesnej obsłudze i wydajnemu przetwarzaniu danych obrazowych o wysokiej zawartości.
Opisany protokół można również zaadaptować do oznaczania ilościowego innych fenotypów komórkowych charakteryzujących się barwieniem immunologicznym różnymi przeciwciałami, takimi jak markery innych populacji neuronów (np. DAT, GAD67, 5-HT itp.) oraz agregatów białkowych (np. fospo-Tau, ubikwityna). Można również połączyć wiele markerów fluorescencyjnych w celu rozróżnienia wielu fenotypów (np. komórek z inkluzjami na różnych etapach dojrzewania). Automatyczna klasyfikacja wielu fenotypów powinna być również łatwa do wdrożenia w opisanych potokach analizy obrazu, poprzez zwykłe dodanie kanału zawierającego obrazy immunofluorescencyjne dodatkowych markerów do etapów pomiaru i sortowanie komórek do wielu pojemników. Wykorzystanie wielu markerów w tym samym czasie wymagałoby jednak optymalizacji warunków barwienia immunologicznego i obrazowania. Dodatkowo, w celu uzyskania lepszej jakości obrazowania immunofluorescencyjnego, zaleca się stosowanie specjalnych czarnościennych 96-dołkowych płytek zaprojektowanych specjalnie dla mikroskopu fluorescencyjnego. Mogą one być jednak znacznie droższe niż standardowe płytki do hodowli komórkowych, które są wystarczające do analizy opisanej w naszym protokole.
Rodzaj i jakość zastosowanych PFF mają kluczowe znaczenie dla wyniku eksperymentów. PFF mogą mieć wpływ zarówno na rzetelność testu, jak i na interpretację wyników. Warunki przygotowania mogą mieć wpływ na efektywność wysiewu PFF i rzeczywiście odnotowano "szczepy" PFF o różnych właściwościach fizjologicznych36. Niemniej jednak przygotowanie i walidacja PFF wykraczają poza zakres niniejszego artykułu i zostały opisane w kilku publikacjach 11,28,29,30. Oprócz protokołu przygotowania należy wziąć pod uwagę gatunki pochodzenia α-synukleiny w PFF (np. mysz, człowiek) oraz zastosowanie białka typu dzikiego lub zmutowanego (np. ludzkiej A53T α-synukleiny), w zależności od szczególnych warunków doświadczalnych. Wykazano, że indukcja akumulacji pS129-αsyn przez PFF jest zależna od wieku hodowli (tj. dni in vitro), przy czym bardziej dojrzałe kultury wykazują wyraźniejszą indukcję11. Jest to prawdopodobnie spowodowane zwiększoną liczbą połączeń neuronalnych w bardziej dojrzałych kulturach i zwiększonym poziomem białka α-synukleiny. W naszych rękach leczenie PFF w DIV8 dało najbardziej wiarygodne wyniki, z wyraźną akumulacją pS129-αsyn w somie neuronów dopaminowych, nie zagrażając przy tym przeżyciu neuronów. Opisany protokół dobrze nadaje się do badania terapii modyfikujących wczesne zdarzenia prowadzące do agregacji endogennej α-synukleiny, ponieważ określamy ilościowo inkorpozycje pS129-αsyn dodatni w stosunkowo wczesnym punkcie czasowym, 7 dni po inokulacji PFF. W tym momencie inkluzje wewnątrzsomalne są obecne w znacznej części komórek i można je łatwo odróżnić za pomocą barwienia immunologicznego, podczas gdy nie obserwuje się śmierci komórek wywołanej przez PFF, co upraszcza interpretację wyników. Co ważne, ponieważ morfologia i skład inkluzji indukowanych przez PFF może zmieniać się w czasie12,13, opisany protokół można w zasadzie zmodyfikować w celu zbadania bardziej dojrzałych inkluzji poprzez utrwalenie i barwienie immunologiczne w późniejszych punktach czasowych. Jednak utrzymywanie neuronów dopaminowych w hodowli przez okres dłuższy niż 15 dni wymaga szczególnej ostrożności i może wywołać dodatkowe zmiany z powodu niezdolności komórek do przeżycia niezależnie od inokulacji PFF. Dodatkowo, bardziej rozszerzone posiewy komplikują harmonogramy leczenia farmakologicznego. Wiele związków ma ograniczoną lub źle scharakteryzowaną stabilność w pożywce do hodowli komórkowych, a uzupełnienie leku nie jest trywialne, ponieważ całkowita wymiana pożywki zagraża przetrwaniu kultur dopaminy.
Fosforylacja α-synukleiny w Ser129 jest konsekwentnie zgłaszana w modelach agregacji α-synukleiny opartych na PFF i kolokalizuje się z markerami nieprawidłowego fałdowania i agregacji, takimi jak tioflawina S, ubikwityna lub przeciwciała specyficzne dla konformacji11,12. W naszych rękach barwienie immunologiczne dla pS129-αsyn daje również najsilniejszy sygnał przy najniższym tle i jest najprostsze do analizy, dając solidne wyniki, gdy przeprowadza się wiele terapii. Co ważne, barwienie immunologiczne przeciwciałem pS129-αsyn nie wykrywa PFF, które pozostają poza komórkami, znacznie zmniejszając tło. Należy jednak pamiętać, że fosforylacja Ser129 jest prawdopodobnie jednym z najwcześniejszych procesów związanych z nieprawidłowym fałdowaniem α-synukleiny i może być różnie regulowana w określonych warunkach. Dlatego wszelkie wyniki, które wykazują pozytywny wpływ na pS129-αsyn, powinny być potwierdzone przez inne markery.
Analiza statystyczna powinna być dostosowana odpowiednio do projektu eksperymentalnego. Konieczne jest przeprowadzenie eksperymentów na co najmniej trzech niezależnych replikach biologicznych (tj. oddzielnych pierwotnych kulturach neuronalnych). Kontrpróby te powinny być posiane na różnych płytkach i poddawane niezależnej obróbce. Analizujemy dane uzyskane z powtórzeń na różnych płytkach z losową konstrukcją blokową ANOVA37 , aby uwzględnić parowanie danych dla różnych płytek eksperymentalnych.

Choroba Parkinsona (PD) jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym charakteryzującym się śmiercią neuronów dopaminowych śródmózgowia w istocie czarnej (SN), późniejszą utratą tonu dopaminy w zwojach podstawy i wynikającym z tego upośledzeniem motorycznym1,2. Główną cechą histopatologiczną w mózgach pacjentów z chorobą Parkinsona są wewnątrzkomórkowe agregaty białkowo-lipidowe znajdujące się w somie neuronalnej, zwane ciałami Lewy'ego (LB) lub w neurytach, neuryty Lewy'ego (LN), zbiorczo znane jako patologia Lewy'ego3. Patologia Lewy'ego w mózgu wydaje się postępować wraz z postępującą chorobą Parkinsona, przypominającą rozprzestrzenianie się czynników chorobotwórczych poprzez połączenia neuronalne. Obfita patologia Lewy'ego występuje w neuronach dopaminowych w SN i komórkach w innych obszarach dotkniętych neurodegeneracją4. Jednak podczas progresji choroby, rozprzestrzenianie się i początek agregacji białek nie zawsze korelują ze śmiercią neuronów, a dokładny udział patologii Lewy'ego w śmierci neuronów jest nadal niejasny5.
Wykazano, że LB i LN składają się ze składników błoniastych i białkowych3. Te pierwsze to fragmenty błony, struktury pęcherzykowe (ewentualnie lizosomy i autofagosomy) oraz mitochondria3. Ten ostatni składa się z co najmniej 300 różnych białek6. Charakterystyczne badanie przeprowadzone przez Spillantini et al.7 wykazało, że głównym składnikiem białkowym patologii Lewy'ego jest α-synukleina. Silnie eksprymowana w neuronach i związana z fuzją błony i uwalnianiem neuroprzekaźników, α-synukleina w patologii Lewy'ego występuje głównie w nieprawidłowo sfałdowanej formie fibryli amyloidowej, z której większość jest fosforylowana w Ser129 (pS129-αsyn)4,8.
Co ważne, wykazano również, że ze względu na swoje właściwości podobne do prionów, nieprawidłowo sfałdowana α-synukleina może odgrywać przyczynową rolę w powstawaniu patologii Lewy'ego4. Właściwości podobne do prionów nieprawidłowo sfałdowanej α-synukleiny wykazano zarówno w przypadku ekstraktów śródmózgowia od pacjentów, jak i egzogennie przygotowanych włókienek preformowanych α-synukleiną (PFF) w celu indukowania agregatów α-synukleiny w neuronach w hodowli i in vivo9,10. PFF stanowią wiarygodny i solidny model do badania progresji patologii α-synukleiny w neuronach dopaminowych. Kiedy PFF są stosowane do hodowanych neuronów pierwotnych lub wstrzykiwane do mózgu zwierzęcia, prowadzą do powstania inkluzji zawierających α-synukleinę w neurytach i soma11, które podsumowują wiele cech obserwowanych w patologii Lewy'ego. Obserwowane inkluzje są nierozpuszczalne w detergentach w Triton X, ubikwitynowane, barwione barwnikiem specyficznym dla amyloidu tioflawiną S i zawierają α-synukleinę hiperfosforylowaną w Ser12911,12. Co ważne, inkluzje te nie tworzą się u zwierząt z nokautem α-synukleiny11, co wskazuje na zależność ich powstawania od endogennej α-synukleiny.
Niemniej jednak, trudno jest bezpośrednio porównać inkluzje wywołane przez PFF i patologię Lewy'ego występujące u pacjentów z PD, ponieważ ludzkie LB i LN są bardzo niejednorodne3. Obserwowana niejednorodność patologii Lewy'ego może być spowodowana różnymi etapami powstawania, odmiennym położeniem anatomicznym lub różnicami w budowie nieprawidłowo sfałdowanej α-synukleiny inicjującej proces agregacji. Te same czynniki mogą wpływać na indukowane przez PFF inkluzje dodatnie pS129-αsyn. Rzeczywiście, niedawno wykazano, że indukowane przez PFF inkluzje dodatnie pS129-αsyn w pierwotnych kulturach neuronalnych reprezentują bardzo wczesne stadia patologii, które mogą dojrzeć do struktur bardzo przypominających LB po długotrwałym okresie inkubacji12,13.
Modelowanie wczesnego rozprzestrzeniania się i akumulacji nieprawidłowo sfałdowanej α-synukleiny za pomocą PFF jest cenne dla rozwoju leków, ponieważ rozprzestrzenianie się patologii Lewy'ego jest uważane za jeden z markerów wczesnego stadium choroby. W związku z tym terapie zapobiegające agregacji mogą być obiecujące w zatrzymywaniu lub spowalnianiu postępu choroby Parkinsona na bardzo wczesnych etapach. Obecnie prowadzonych jest kilka badań klinicznych mających na celu spowolnienie lub zatrzymanie akumulacji α-synukleiny14. Dla pacjentów w późniejszym stadium przeszczepienie progenitorów neuronów dopaminowych może być lepszą alternatywą leczenia15. Jednak patologia Lewy'ego została udokumentowana w przeszczepionych neuronach embrionalnych podczas analizy pośmiertnej mózgów pacjentów z chorobą Parkinsona 16,17, co również wskazuje na potrzebę ochrony przed akumulacją α-synukleiny.
In vitro, α-synukleinowe PFF są znane z indukowania agregacji w unieśmiertelnionych liniach komórkowych, lub częściej w pierwotnych neuronach hipokampa lub kory mózgowej gryzoni. Żaden z nich nie jest bliski rekapitulacji neuronów dopaminowych10. Hodowla tych neuronów wymaga gęstego posiewu pewnej liczby neuronów in vitro18. Aby osiągnąć wysoką gęstość posiewu przy użyciu ograniczonego materiału (np. pierwotnych neuronów dopaminowych), powszechnie stosuje się metodę hodowli mikrowyspowej. W hodowli mikrowyspowej komórki są początkowo umieszczane w małej kropli podłoża (zwykle kilka mikrolitrów) utrzymywanej razem przez napięcie powierzchniowe w środku dużej studni18. Po przyczepieniu się neuronów cała studzienka jest wypełniana pożywką, podczas gdy komórki pozostają zamknięte w dużej gęstości w małym obszarze poszycia. Oprócz osiągnięcia wysokiej gęstości posiewu, mikrowyspy zapobiegają również powlekaniu w pobliżu krawędzi studzienek, gdzie częste są różnice w gęstości komórek i przeżywalności. Mikrowyspy są często wykorzystywane w stosunkowo dużych studniach lub naczyniach; jednak ustanowienie kultur neuronów śródmózgowia na mikrowyspach w formacie płytki 96-dołkowej umożliwia badanie patologii Lewy'ego w neuronach dopaminowych działających w dobrej wierze o mocy od średniej do wysokiej przepustowości. Eksperymenty in vitro z tymi neuronami pozwoliły nam odkryć czynnik neurotroficzny pochodzenia z linii komórek glejowych (GDNF), który sprzyja przetrwaniu dojrzałych neuronów dopaminowych in vitro i in vivo19,20,21,22, a także zapobiega tworzeniu się agregatów α-synukleiny w neuronach dopaminowych23. Ludzkie, indukowane przez pacjenta pluripotencjalne neurony dopaminowe pochodzące z komórek macierzystych stanowią dokładniejszy model ze względu na ich ludzkie pochodzenie i dłuższy czas przeżycia in vitro. Jednak indukcja patologii α-synukleiny w ludzkich neuronach obserwuje się po wielu miesiącach, w porównaniu z tygodniem w mysich neuronach embrionalnych i/lub z wieloma stresorami (np. kombinacją nadekspresji α-synukleiny i PFF)24,25. Ponadto utrzymanie ludzkich neuronów dopaminowych jest bardziej kosztowne i pracochłonne w porównaniu z pierwotnymi neuronami embrionalnymi, co zasadniczo ogranicza ich wykorzystanie w zastosowaniach o wysokiej przepustowości.
Ponadto, pierwotne kultury neuronów dopaminowych mogą być genetycznie modyfikowane (np. za pomocą CRISPR/Cas9) i/lub leczone środkami farmakologicznymi23. Stanowią one szybką i powtarzalną platformę do zastosowań takich jak sekcja szlaków molekularnych i badania przesiewowe bibliotek leków. Mimo że z tych kultur można uzyskać ograniczony materiał, nadal możliwe jest przeprowadzanie analiz genomicznych/proteomicznych na małą skalę. Hodowla neuronów pierwotnych w formacie 96 dołków jest lepsza w przypadku technik immunocytochemicznych i mikroskopii fluorescencyjnej, a następnie analizy fenotypu o wysokiej zawartości. Wielospektralne obrazy fluorescencyjne pochodzące z automatycznego obrazowania 96 płytek dołkowych można przekształcić w wyniki ilościowe (np. liczbę neuronów zawierających LB w basenie). Takie analizy można wykonać za pomocą darmowego oprogramowania, takiego jak CellProfiler26,27. Ogólnie rzecz biorąc, pierwotne embrionalne kultury śródmózgowia posiane na 96-dołkowych płytkach stanowią solidną i wydajną platformę do badania neuronów dopaminowych i agregacji α-synukleiny z możliwością wysokoprzepustowych badań przesiewowych fenotypu.

<table><tbody><tr><td>0,4% barwienie błękitu trypanowego</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>15 ml CELLSTAR Probówka polipropylenowa</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>5 M HCl</td><td>N/A</td> N<td>/A N/A</td><td>Kuchnia medialna, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Helsiński</td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Kuchnia medialna, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Helsiński</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka widokowa ()</td><td>PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>6005182</td><td></td></tr><tr><td>99,5% etanolu (EtOH)</td><td>Altia Oyj, Rajam&auml; ki, Finlandia</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>AquaSil Siliconizing</td><td>Fluid Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>TS-42799</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawizowana probówka mikrowirówkowa 1,5 ml</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Media kitchen, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Helsiński</td></tr><tr><td>Urządzenie do sonikacji Bioruptor</td><td>Diagenode, Liège, Belgia</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+, Mg2+ wolny Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>Pakiety oprogramowania CellProfiler i CellAnalyst</td><td>Nie</td> dotyczy Nie <td>dotyczy</td><td>bezpłatnego oprogramowania typu open source</td></tr><tr><td>Wirówka 5702</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy</td><td>5702000019</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca</td><td>BioRad Inc., Hercules, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop DeltaVision o ultrawysokiej rozdzielczości ze stołem powietrznym i szafką</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA</td><td>29254706</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease-I (Dnase I)</td><td>Roche, Bazylea, Szwajcaria</td><td>22098700</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>21331&ndash; 020</td><td></td></tr><tr><td>osł anty-mysz AlexaFluor 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>osioł anty-królik AlexaFluor 647</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>osł anty-owca AlexaFluor 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>A11015</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Dulbecco</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Nie dotyczy</td><td>Media kitchen, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet w Helsinkach</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar</td><td>fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>11507582</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Nano Automated Imaging System</td><td>Urządzenia molekularne, San Jose, Kalifornia, USA</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>25030&ndash; 032</td><td></td></tr><tr><td>mysia monoklonalna hydroksylaza antytyrozynowa</td><td>Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, niemiecki</td><td>suplement MAB318</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>17502&ndash; 048</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Serum</td><td>Vector Laboratories Inc., Burlingame, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>proszek paraformaldehydu, 95%</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>pH-Fix, paski wskaźnikowe z utrwalonym kolorem</td><td>Macherey-Nagel, D&uuml; ren, Niemcy</td><td>92110</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosfatowy sól fizjologiczna (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Media kuchnia, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Helsiński</td></tr><tr><td>poli-L-ornityna</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, San Diego, Kalifornia, USA</td><td>ant-pm-1, ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>królik monoklonalny filament anty-alfa-synukleinowy</td><td>Abcam, Cambridge, Wielka Brytania</td><td>ab209538</td><td></td></tr><tr><td>monoklonalny anty-fosfo-seryno129-alfa-synukleina królika</td><td>Abcam, Cambridge, Wielka Brytania</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>RCT Basic, IKA Mieszadło magnetyczne</td><td>IKA&reg;-Werke GmbH, Staufen, Niemcy</td><td>3810000</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany ludzki czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (hGDNF)</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA lub Prospec, Ness-Ziona, Izrael</td><td>450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)</td><td></td></tr> <tr><td>rekombinowana mysia alfa synukleina wstępnie uformowane fibryle (PFF)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prezent od współpracownika, prof. Kelvina C Luk</td></tr><tr><td>Research Stereomicroscope System</td><td>Olympus Corporation, Tokio, Japonia</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>owcza poliklonalna hydroksylaza antytyrozynowa</td><td>Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>ab1542</td><td></td></tr><tr><td>TC 20 Zautomatyzowany Licznik komórek</td><td>BioRad Inc., Hercules, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna</td><td>MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, Chiny</td><td>2199700</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

Celem tego protokołu jest stworzenie solidnego i powtarzalnego modelu akumulacji α-synukleiny w pierwotnych neuronach dopaminowych. W połączeniu z barwieniem immunologicznym i bezstronną automatyczną analizą obrazu, model ten pozwala na analizę wpływu leków i manipulacji genetycznych na agregację α-synukleiny w hodowlach neuronalnych. Pierwotne hodowle śródmózgowia stanowią wiarygodne źródło embrionalnych neuronów dopaminowych w dobrej wierze. W tym protokole charakterystyczna histopatologia choroby Parkinsona, ciała Lewy'ego (LB), jest naśladowana przez dodanie wstępnie uformowanych włókienek α-synukleiny (PFF) bezpośrednio do pożywek hodowlanych neuronów. Nagromadzenie endogennej fosforylowanej α-synukleiny w somie neuronów dopaminowych wykrywa się za pomocą barwienia immunologicznego już po 7 dniach od dodania PFF. Warunki hodowli komórkowej in vitro są również odpowiednie do stosowania i oceny metod leczenia zapobiegającego akumulacji α-synukleiny, takich jak leki małocząsteczkowe i czynniki neurotroficzne, a także wektory lentiwirusowe do manipulacji genetycznych (np. za pomocą CRISPR/Cas9). Hodowla neuronów na 96-dołkowych płytkach zwiększa solidność i moc konfiguracji eksperymentalnych. Pod koniec eksperymentu komórki są utrwalane paraformaldehydem do immunocytochemii i obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wielospektralne obrazy fluorescencyjne uzyskuje się za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii 96-dołkowych płytek. Dane te są określane ilościowo (np. zliczając liczbę neuronów dopaminowych zawierających fosfo-α-synukleinę w dołku) za pomocą bezpłatnego oprogramowania, które zapewnia platformę do bezstronnej analizy fenotypu o wysokiej zawartości. Indukowane przez PFF modelowanie akumulacji fosforylowanej α-synukleiny w pierwotnych neuronach dopaminowych stanowi wiarygodne narzędzie do badania mechanizmów leżących u podstaw powstawania i eliminacji inkluzji α-synukleiny, z możliwością wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i analizy fenotypu komórkowego.

Kilka dni po wysiewaniu (DIV1–DIV3) wykonano mikroskopię w polu jasnym, aby ocenić stan zdrowia i jednorodność rozkładu hodowanych komórek oraz jednolitość tych warunków w poszczególnych studniach (Rysunek 3). Hodowane komórki śródmózgowia były rozmieszczone jednorodnie w obrębie mikro-wyspy utworzonej przed wysiewaniem (Rysunek 3A,B). Pierwotne neurony osiadły jednorodnie na powlekanym podłożu i wytworzyły wypustki neuronalne (Rysunek 3B). W studni zaobserwowano niewielki skupisk komórek (o średnicy mniejszej niż 150 μm), który przedstawiono jako przykład (Rysunek 3C).
<img alt="Wypustki neuronalne i skupiska komórek na obrazie mikroskopowym; schemat przedstawia skalę pomiarową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61118/61118fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Kilka dni po wysiewaniu (np. DIV3) stan pierwotnych hodowli z mózgu środkowego obserwowano za pomocą mikroskopii w polu jasnym. (A) Hodowane komórki rozprzestrzeniły się w środkowej części studzienki w obrębie mikro wyspy pokrytej PO o przybliżonym promieniu 4,4 mm (wskazane białymi strzałkami), utworzonej poprzez zdrapanie PO z około 1 mm obwodu studzienki (wskazane czarnymi strzałkami). (B) Pierwotne neurony uległy jednorodnemu rozprzestrzenieniu w obrębie obszaru, zaobserwowano wypustki neuronalne (oznaczone czerwonymi grotami strzałek). (C) Skupisko komórek o średnicy mniejszej niż 150 μm jest oznaczone niebieskimi grotami strzałek. Paski skali = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61118/61118fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Pierwotne hodowle średniego mózgu myszy poddano immunobarwieniu z użyciem przeciwciał anty-TH i anty-pS129-αsyn, a następnie obrazowano za pomocą mikroskopu automatycznego po 15 dniach in vitro. Powlekane mikro wyspy zapewniały ograniczony obszar przylegania komórek w centrum studni (Rysunek 4A,B). Neurony dopaminergiczne immunoznakowane markerem TH były rozmieszczone wokół mikro wyspy w warstwie jednowarstwowej, oddzielone od siebie, bez żadnych skupisk (Rysunek 4A’ i 4B’).
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna ekspresji neuronów TH/pS129-αsyn/DAPI; wykres słupkowy liczby komórek dodatnich pod kątem TH." class="xfigimg bigfig" src="/files/ftp_upload/61118/61118fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: W 15. dniu in vitro (DIV15) z każdej mikro wyspy ilościowo oznaczono od 800 do 1 000 komórek dopaminergicznych, z zastosowaniem leczenia PFF lub bez. Reprezentatywne obrazy kultur embrionalnego śródmózgowia poddanych immunobarwieniu przeciwciałami anty-TH oraz anty-pS129-αsyn. (A, A’, A’’) Komórki kontrolne bez leczenia PFF. (B, B’, B’’) Komórki traktowane PFF z inkluzjami pS129-αsyn. (C) Ilościowe oznaczenie liczby komórek dodatnich pod kątem TH w dołkach traktowanych nośnikiem (kontrola), PFF lub PFF z dodatkiem 50 ng/mL GDNF. (D) Ilościowe oznaczenie agregatów pS129-αsyn w komórkach dodatnich pod kątem TH traktowanych nośnikiem (kontrola), PFF lub PFF z dodatkiem 50 ng/mL GDNF. Istotność statystyczną obliczono za pomocą analizy ANOVA z randomizacją blokową. **p &lt; 0.01, n = 4 oddzielne płytki (powtórzenia biologiczne), każda z 3–6 dołkami na grupę traktowania (powtórzenia techniczne). Paski skali = 300 μm dla A, B; 50 μm dla A’, B’; 25 μm dla A’’, B’’. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61118/61118fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Podczas gdy w kulturach bez podania PFF nie stwierdzono sygnału pS129- αsyn (Ryc. 4A’ oraz 4A’’), w kulturach traktowanych PFF α-synukleiny rozwinęły się inkluzje pS129-αsyn dodatnie (Ryc. 4B’ oraz 4B’’). Siedmiodniowe traktowanie PFF in vitro nie spowodowało istotnego spadku liczby neuronów TH-dodatnich w porównaniu z pozostałymi grupami eksperymentalnymi (Ryc. 4C). W kulturach traktowanych PFF populacja neuronów dopaminergicznych TH-dodatnich z pS129-αsyn dodatnią wynosiła ok. 40%. Podanie kontroli pozytywnej, GDNF, zmniejszyło odsetek neuronów dopaminergicznych TH-dodatnich z inkluzjami pS129-αsyn dodatnimi (Ryc. 4D, patrz również surowe dane i przykładowe obrazy w Plikach uzupełniających).
Pliki uzupełniające: Przykładowe potoki analizy obrazów wysokotreściowych (high-content image analysis) z wykorzystaniem pakietów oprogramowania CellProfiler i CellAnalyst, przykładowe obrazy oraz surowe dane do Rysunku 4E, F. (1-9) Example_Images. Otwórz te obrazy w programach ImageJ lub CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Kroki 6.2–6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (Kroki 6.11–6.18) <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61118/Supplementary_Files.zip" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Protokół ten zapewnia solidny, powtarzalny model akumulacji alfa synukleiny w pierwotnych neuronach dopaminowych w celu zbadania mechanizmów i metod leczenia, które mogą regulować tę akumulację. Wstępnie uformowane fibryle alfa-synukleiny indukują postępującą, wysoce powtarzalną akumulację białek w połączeniu z automatycznym obrazowaniem i bezstronną analizą obrazu, protokół ten ułatwia stosunkowo szybkie, średnio lub wysokoprzepustowe badania przesiewowe ciężarówek hamujących akumulację alfa-synukleiny. Postępująca akumulacja alfa-synukleiny może być jednym z czynników upośledzających funkcję neuronów w chorobie Parkinsona i niektórych ciałach jądrowych.Nowe cząsteczki blokujące taką akumulację mogą stać się nowymi terapiami neurodegeneracji. Uważamy, że protokół ten jest ważnym krokiem w kierunku ustanowienia standardowego i niezawodnego narzędzia do badania mechanizmów molekularnych regulujących akumulację alfa-synukleiny w neuronach dopaminowych. Procedurę zademonstruje Julia Konovalova, doktorantka z mojego laboratorium.Przed założeniem podstawowej hodowli embrionalnych komórek śródmózgowia dodaj 50 mikrolitrów dopaminy, pożywki neuronowej, do każdej studzienki 96-dołkowej płytki pokrytej poli-L-ornityną i użyj końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby zassać pożywkę, jednocześnie drapiąc dno każdej studzienki w kierunku okrężnym, aby usunąć powłokę na obwodzie każdej studzienki. Wyspa pokryta poli-L-ornityną pozostanie w środku każdej studni. Dodaj 10 mikrolitrów pożywki do środka każdej powlekanej wyspy, aby utworzyć mikrowyspy.Założenie pierwotnych embrionalnych kultur śródmózgowia z zarodków myszy w dniu embrionalnym myszy 13,5. Zbierz wszystkie zebrane podłogi śródmózgowia w tej samej 1,5-mililitrowej probówce i umyj próbki trzykrotnie 500 mikrolitrami HBSS bez wapnia i magnezu na pranie. Po ostatnim praniu zastąp HBSS 0,5% trypsyną na 30 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji dodać 500 mikrolitrów świeżo przygotowanej DNazy I w roztworze FBS do częściowo strawionej tkanki i użyć pipety ze szkła silikonowanego z wypolerowaną ogniowo końcówką do roztarcia tkanki. Gdy można zaobserwować tylko małe, ledwo widoczne cząstki, pozwól tym fragmentom tkanek osiąść na dnie probówki mikrowirówki i przenieść ten supernatant do pustej stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 mililitrów. Dodać jeden mililitr HBSS do probówki zawierającej DNazę I w FBS i kilkakrotnie wymieszać pipetując.Przenieś jeden mililitr tego roztworu na pozostałe cząstki tkanki i ponownie rozcieraj próbki. Następnie wyciągnąć strawioną zawiesinę komórkową za pomocą probówki z supernatantem, nie przenosząc żadnych pozostałych fragmentów tkanki po ponownym rozdrobnieniu próbki tkanki z pozostałą DNazą I i FBS w osadzie HBSS, pobrane komórki przez odwirowanie i odessać supernatant bez naruszania osadu. Umyj komórki dwa razy w dwóch mililitrach podgrzanej pożywki dla neuronów dopaminowych na jedno pranie.I ponownie zawiesić komórki w ilości trzy razy 10 do komórek siły na sześć mikrolitrów świeżego, ciepłego, średniego stężenia w mikroprobówce wirówkowej. Następnie usuń pożywkę z każdej wcześniej przygotowanej mikrowyspy i wymieszaj komórki delikatnym pipetowaniem, a następnie użyj pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby dodać sześć mikrolitrów komórek do każdej mikrowyspy. Po dodaniu wszystkich komórek napełnić puste studzienki na krawędziach płytki 150 mikrolitrami wody lub PBS i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na jedną godzinę.Pod koniec inkubacji dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki neuronów dopaminowych do każdej studzienki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora. W ósmym dniu hodowli komórkowej w okapie z przepływem laminarnym dodać 3,75 mikrolitra 100 mikrogramów na mililitr włókienek preformED do każdej studzienki eksperymentalnej i 3,75 mikrolitra PBS do każdej studzienki kontrolnej. Podczas pracy z PFS należy zachować ostrożność w przypadku niepożądanego zanieczyszczenia białkami, a następnie wyczyść maskę i wszystkie instrumenty związane z PF za pomocą 1% SDS i 70% etanolu.W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym po barwieniu markerów będących przedmiotem zainteresowania, załadować 96-dołkową płytkę hodowlaną na skaner płytek o wysokiej zawartości wyposażony w obiektyw 10X. Dostosuj ustawienia zgodnie ze specyfikacjami płytki 96-dołkowej, takimi jak typ odtwarzania, producent, rozmiar, odległość między studzienkami oraz rodzaj i objętość medium. Wybierz obszar obrazowania studzienek, aby pokryć wszystkie komórki w każdej mikrowyspie i użyj jednego dołka, aby dostosować automatyczne ustawianie ostrości na wyrażeniu DAPI.Skalibrować czas akwizycji dla każdego kanału fluorescencyjnego w oparciu o intensywność barwienia w studzienkach kontrolnych i dostosować parametry tak, aby komórki dopaminy w wstępnie uformowanych studzienkach kontrolnych traktowanych fibrylami, zawierające agregaty fosfoseryny 129 alfa synukleiny w somie komórki, były wyraźnie rozróżniane, co pozwala na jednoznaczne określenie ilościowe komórek dodatnich i ujemnych fosfoseryny 129 alfa synukleiny. Następnie zobrazuj wszystkie wybrane studnie jednocześnie we wszystkich kanałach, używając dokładnie tych samych parametrów dla każdej studni. W celu analizy obrazów otwórz narzędzie CellProfiler analyst i wybierz V2_THpos.plik właściwości. Aby posortować komórki podzielone na segmenty na fosfoserynę, 129, alfa synukleinę, komórki dodatnie i ujemne, najpierw ustaw liczbę komórek pobierania na 50 losowych komórek i kliknij pobierz, aby załadować obrazy podzielonych na segmenty komórek. Przeciągnij co najmniej 30 komórek do odpowiedniego kosza u dołu okna.Wybierz opcję Użyj szybkiego, łagodnego zwiększania z regułami maksymalnej liczby 50 lub losowymi klasyfikatorami lasu, a następnie kliknij przycisk Trenuj. Ustaw pobieranie na 50 komórek dodatnich i kliknij pobierz, aby uzyskać przykład dodatnich komórek synukleiny fosfoseryny 129 alfa ocenionych zgodnie z klasyfikatorem pociągu lub ustaw pobieranie na 50 komórek ujemnych i kliknij pobierz, aby uzyskać przykład ujemnych komórek fosfoseryny 129 alfa synukleiny zgodnie z klasyfikatorem pociągu. Gdy wyniki będą zadowalające, kliknij wynik wszystko, aby wygenerować tabelę wyników podsumowującą liczbę dodatnich i ujemnych neuronów dopaminowych fosfoseryny 129 alfa synukleiny w każdym dołku.Kilka dni po posiewie można zaobserwować jednorodnie rozprowadzoną kulturę za pomocą mikroskopii świetlnej w mikrowyspie utworzonej przed posiewem. Neurony pierwotne osiadają jednorodnie na pokrytym dnie płytki i tworzą projekcje neuronalne. Na tym zdjęciu można zaobserwować małe skupisko komórek o średnicy mniejszej niż 150 mikrometrów.Barwienie immunologiczne kontrolnych, nieleczonych pierwotnych hodowli środkowej części mózgowia myszy markerami komórek neuronalnych 15 dni po posiewie ujawnia ograniczone przyleganie komórek w obrębie mikrowysp w środku dołków płytki. Neurony dopaminowe znakowane immunologicznie markerem hydroksylazy tyrozynowej rozprzestrzeniają się po mikrowyspie w monowarstwie oddzielonej od siebie bez zbrylania. W kulturach traktowanych fibrylami pS129 można również zaobserwować dodatnie inkluzje pS129 alfa synukleiny.Leczenie fibrylami uformowanymi in vitro przez siedem dni nie powoduje znaczącego spadku liczby neuronów dodatnich pod względem hydroksylazy tyrozynowej w porównaniu z innymi grupami eksperymentalnymi. Leczenie czynnikiem neurotroficznym pochodzącym z linii komórek glejowych zmniejsza jednak odsetek dodatniej inkluzji pS129 alfa-synukleiny, zawierającej neurony dopaminowe dodatnie pod względem hydroksylazy tyrozyny. Przed utworzeniem mikrowysp upewnij się, że studzienki pokryte ornityną Poly-L są solidnie umyte.Pamiętaj również, aby używać świeżych pożywek podczas powlekania nowych kultur mózgu. Metodę tę można połączyć z edycją genów i inhibitorami farmakologicznymi w celu zbadania wpływu określonych genów i fal myślowych na agregację nukleonów. Rutynowo używamy tej metody do badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych cząsteczek, które hamują akumulację alfa synukleiny.Wykazali działanie TDN chroniące przed akumulacją i obecnie analizują kilka małych cząsteczek kandydujących.

studying-pre-formed-fibril-induced-synuclein-accumulation-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zacznij od pierwotnej hodowli śródmózgowia z zarodków szczurów, zawierających neurony dopaminergiczne, które nadmiernie eksprymują zmutowaną alfa-synukleinę.Zastąp pożywki w studzienkach uzdatniających świeże pożywki zawierające badany związek, a pożywki w studzienkach kontrolnych zwykłą pożywką. Następnie inkubować.W grupie kontrolnej alfa-synukleina tworzy toksyczne agregaty w neuronach dopaminergicznych, powodując retrakcję neurytów i prowadząc do śmierci neuronów.W leczeniu badany związek...

Ocena neuroprotekcyjnego działania badanego związku przeciwko toksyczności alfa-synukleiny w neuronach embrionalnych szczurów

Wideo pokazuje proces izolacji i hodowli neuronów dopaminowych ze śródmózgowia embrionów myszy. Izolowane brzuszne dno śródmózgowia jest dysocjowane za pomocą enzymów. Powstałe neurony dopaminowe są zbierane i przenoszone do mikrowysp wewnątrz płytek wielodołkowych. Komórki są inkubowane z pożywką neuronów dopaminowych, aby utrzymać komórki w dużej gęstości wewnątrz mikrowysp.

Izolacja i hodowla pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminowych śródmózgowia myszy

Ten film pokazuje proces ilościowego określania akumulacji alfa-synukleiny w embrionalnych mysich neuronach dopaminowych wstępnie potraktowanych wstępnie uformowanymi włókienkami alfa-synukleiny. Przedstawia etapy utrwalania, barwienia i ilościowego oznaczania neuronów dopaminowych zawierających agregaty alfa-synukleiny za pomocą immunofluorescencji.

Badanie akumulacji alfa-synukleiny w pierwotnych embrionalnych mysich neuronach dopaminowych

Neurony dopaminergiczne odgrywają istotną rolę regulacyjną w mózgu. Ich utrata jest związana z chorobą Parkinsona. W tym filmie pokazujemy, jak wygenerować pierwotne kultury centralnych neuronów dopaminergicznych z embrionalnego śródmózgowia myszy. Takie kultury są przydatne do badania ekstremalnej podatności tych neuronów na różne stresy.

Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

Przyczyny degeneracji neuronów dopaminergicznych śródmózgowia podczas choroby Parkinsona nie są w pełni zrozumiałe. Systemy hodowli komórkowych stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neurofizjologicznych tych neuronów. Poniżej przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który może być wykorzystany do modelowania neurodegeneracji in vitro.

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Celem tego artykułu jest nakreślenie kroków wymaganych do wytworzenia włókienek z monomerycznej alfa-synukleiny, późniejszej kontroli jakości i użycia wstępnie uformowanych włókienek in vivo.

Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru in vitro strumieni Ca2+ w neuronach śródmózgowia i ich dalszego wpływu na kaspazę-3 za pomocą pierwotnych hodowli śródmózgowia myszy. Model ten można wykorzystać do badania zmian patofizjologicznych związanych z nieprawidłową aktywnością Ca2 + w neuronach śródmózgowia oraz do badań przesiewowych nowych terapii pod kątem właściwości antyapoptotycznych.

Kwantyfikacja spontanicznych strumieni Ca2+ i ich dalszych skutków w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy

Ta praca analizuje dawkę wektora i czas ekspozycji wymagane do wywołania zapalenia nerwów, neurodegeneracji i upośledzenia motorycznego w tym przedklinicznym modelu choroby Parkinsona. Te wektory kodujące ludzką α-synukleinę są dostarczane do istoty czarnej w celu podsumowania patologii synukleiny związanej z chorobą Parkinsona.

Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Poznaj metodę indukcji akumulacji α-synukleiny w pierwotnych neuronach dopaminowych myszy przy użyciu preformowanych fibryl. Protokół umożliwia automatyczną analizę obrazu i przesiewanie inhibitorów akumulacji białka.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy (Wideo) | JoVE Journal

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

Przeglądaj więcej filmów