Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy
16 sierpnia 2020
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.
Protokół ten zapewnia solidny, powtarzalny model akumulacji alfa synukleiny w pierwotnych neuronach dopaminowych w celu zbadania mechanizmów i metod leczenia, które mogą regulować tę akumulację. Wstępnie uformowane fibryle alfa-synukleiny indukują postępującą, wysoce powtarzalną akumulację białek w połączeniu z automatycznym obrazowaniem i bezstronną analizą obrazu, protokół ten ułatwia stosunkowo szybkie, średnio lub wysokoprzepustowe badania przesiewowe ciężarówek hamujących akumulację alfa-synukleiny. Postępująca akumulacja alfa-synukleiny może być jednym z czynników upośledzających funkcję neuronów w chorobie Parkinsona i niektórych ciałach jądrowych.
Nowe cząsteczki blokujące taką akumulację mogą stać się nowymi terapiami neurodegeneracji. Uważamy, że protokół ten jest ważnym krokiem w kierunku ustanowienia standardowego i niezawodnego narzędzia do badania mechanizmów molekularnych regulujących akumulację alfa-synukleiny w neuronach dopaminowych. Procedurę zademonstruje Julia Konovalova, doktorantka z mojego laboratorium.
Przed założeniem podstawowej hodowli embrionalnych komórek śródmózgowia dodaj 50 mikrolitrów dopaminy, pożywki neuronowej, do każdej studzienki 96-dołkowej płytki pokrytej poli-L-ornityną i użyj końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów, aby zassać pożywkę, jednocześnie drapiąc dno każdej studzienki w kierunku okrężnym, aby usunąć powłokę na obwodzie każdej studzienki. Wyspa pokryta poli-L-ornityną pozostanie w środku każdej studni. Dodaj 10 mikrolitrów pożywki do środka każdej powlekanej wyspy, aby utworzyć mikrowyspy.
Założenie pierwotnych embrionalnych kultur śródmózgowia z zarodków myszy w dniu embrionalnym myszy 13,5. Zbierz wszystkie zebrane podłogi śródmózgowia w tej samej 1,5-mililitrowej probówce i umyj próbki trzykrotnie 500 mikrolitrami HBSS bez wapnia i magnezu na pranie. Po ostatnim praniu zastąp HBSS 0,5% trypsyną na 30 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji dodać 500 mikrolitrów świeżo przygotowanej DNazy I w roztworze FBS do częściowo strawionej tkanki i użyć pipety ze szkła silikonowanego z wypolerowaną ogniowo końcówką do roztarcia tkanki. Gdy można zaobserwować tylko małe, ledwo widoczne cząstki, pozwól tym fragmentom tkanek osiąść na dnie probówki mikrowirówki i przenieść ten supernatant do pustej stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 mililitrów. Dodać jeden mililitr HBSS do probówki zawierającej DNazę I w FBS i kilkakrotnie wymieszać pipetując.
Przenieś jeden mililitr tego roztworu na pozostałe cząstki tkanki i ponownie rozcieraj próbki. Następnie wyciągnąć strawioną zawiesinę komórkową za pomocą probówki z supernatantem, nie przenosząc żadnych pozostałych fragmentów tkanki po ponownym rozdrobnieniu próbki tkanki z pozostałą DNazą I i FBS w osadzie HBSS, pobrane komórki przez odwirowanie i odessać supernatant bez naruszania osadu. Umyj komórki dwa razy w dwóch mililitrach podgrzanej pożywki dla neuronów dopaminowych na jedno pranie.
I ponownie zawiesić komórki w ilości trzy razy 10 do komórek siły na sześć mikrolitrów świeżego, ciepłego, średniego stężenia w mikroprobówce wirówkowej. Następnie usuń pożywkę z każdej wcześniej przygotowanej mikrowyspy i wymieszaj komórki delikatnym pipetowaniem, a następnie użyj pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby dodać sześć mikrolitrów komórek do każdej mikrowyspy. Po dodaniu wszystkich komórek napełnić puste studzienki na krawędziach płytki 150 mikrolitrami wody lub PBS i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na jedną godzinę.
Pod koniec inkubacji dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki neuronów dopaminowych do każdej studzienki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora. W ósmym dniu hodowli komórkowej w okapie z przepływem laminarnym dodać 3,75 mikrolitra 100 mikrogramów na mililitr włókienek preformED do każdej studzienki eksperymentalnej i 3,75 mikrolitra PBS do każdej studzienki kontrolnej. Podczas pracy z PFS należy zachować ostrożność w przypadku niepożądanego zanieczyszczenia białkami, a następnie wyczyść maskę i wszystkie instrumenty związane z PF za pomocą 1% SDS i 70% etanolu.
W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym po barwieniu markerów będących przedmiotem zainteresowania, załadować 96-dołkową płytkę hodowlaną na skaner płytek o wysokiej zawartości wyposażony w obiektyw 10X. Dostosuj ustawienia zgodnie ze specyfikacjami płytki 96-dołkowej, takimi jak typ odtwarzania, producent, rozmiar, odległość między studzienkami oraz rodzaj i objętość medium. Wybierz obszar obrazowania studzienek, aby pokryć wszystkie komórki w każdej mikrowyspie i użyj jednego dołka, aby dostosować automatyczne ustawianie ostrości na wyrażeniu DAPI.
Skalibrować czas akwizycji dla każdego kanału fluorescencyjnego w oparciu o intensywność barwienia w studzienkach kontrolnych i dostosować parametry tak, aby komórki dopaminy w wstępnie uformowanych studzienkach kontrolnych traktowanych fibrylami, zawierające agregaty fosfoseryny 129 alfa synukleiny w somie komórki, były wyraźnie rozróżniane, co pozwala na jednoznaczne określenie ilościowe komórek dodatnich i ujemnych fosfoseryny 129 alfa synukleiny. Następnie zobrazuj wszystkie wybrane studnie jednocześnie we wszystkich kanałach, używając dokładnie tych samych parametrów dla każdej studni. W celu analizy obrazów otwórz narzędzie CellProfiler analyst i wybierz V2_THpos.
plik właściwości. Aby posortować komórki podzielone na segmenty na fosfoserynę, 129, alfa synukleinę, komórki dodatnie i ujemne, najpierw ustaw liczbę komórek pobierania na 50 losowych komórek i kliknij pobierz, aby załadować obrazy podzielonych na segmenty komórek. Przeciągnij co najmniej 30 komórek do odpowiedniego kosza u dołu okna.
Wybierz opcję Użyj szybkiego, łagodnego zwiększania z regułami maksymalnej liczby 50 lub losowymi klasyfikatorami lasu, a następnie kliknij przycisk Trenuj. Ustaw pobieranie na 50 komórek dodatnich i kliknij pobierz, aby uzyskać przykład dodatnich komórek synukleiny fosfoseryny 129 alfa ocenionych zgodnie z klasyfikatorem pociągu lub ustaw pobieranie na 50 komórek ujemnych i kliknij pobierz, aby uzyskać przykład ujemnych komórek fosfoseryny 129 alfa synukleiny zgodnie z klasyfikatorem pociągu. Gdy wyniki będą zadowalające, kliknij wynik wszystko, aby wygenerować tabelę wyników podsumowującą liczbę dodatnich i ujemnych neuronów dopaminowych fosfoseryny 129 alfa synukleiny w każdym dołku.
Kilka dni po posiewie można zaobserwować jednorodnie rozprowadzoną kulturę za pomocą mikroskopii świetlnej w mikrowyspie utworzonej przed posiewem. Neurony pierwotne osiadają jednorodnie na pokrytym dnie płytki i tworzą projekcje neuronalne. Na tym zdjęciu można zaobserwować małe skupisko komórek o średnicy mniejszej niż 150 mikrometrów.
Barwienie immunologiczne kontrolnych, nieleczonych pierwotnych hodowli środkowej części mózgowia myszy markerami komórek neuronalnych 15 dni po posiewie ujawnia ograniczone przyleganie komórek w obrębie mikrowysp w środku dołków płytki. Neurony dopaminowe znakowane immunologicznie markerem hydroksylazy tyrozynowej rozprzestrzeniają się po mikrowyspie w monowarstwie oddzielonej od siebie bez zbrylania. W kulturach traktowanych fibrylami pS129 można również zaobserwować dodatnie inkluzje pS129 alfa synukleiny.
Leczenie fibrylami uformowanymi in vitro przez siedem dni nie powoduje znaczącego spadku liczby neuronów dodatnich pod względem hydroksylazy tyrozynowej w porównaniu z innymi grupami eksperymentalnymi. Leczenie czynnikiem neurotroficznym pochodzącym z linii komórek glejowych zmniejsza jednak odsetek dodatniej inkluzji pS129 alfa-synukleiny, zawierającej neurony dopaminowe dodatnie pod względem hydroksylazy tyrozyny. Przed utworzeniem mikrowysp upewnij się, że studzienki pokryte ornityną Poly-L są solidnie umyte.
Pamiętaj również, aby używać świeżych pożywek podczas powlekania nowych kultur mózgu. Metodę tę można połączyć z edycją genów i inhibitorami farmakologicznymi w celu zbadania wpływu określonych genów i fal myślowych na agregację nukleonów. Rutynowo używamy tej metody do badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych cząsteczek, które hamują akumulację alfa synukleiny.
Wykazali działanie TDN chroniące przed akumulacją i obecnie analizują kilka małych cząsteczek kandydujących.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół służący do badania akumulacji α-synukleiny w pierwotnych neuronach dopaminergicznych myszy. Model wykorzystuje wstępnie uformowane włókna α-synukleiny w celu indukcji akumulacji agregatów fosforylowanej α-synukleiny. Dzięki zautomatyzowanemu obrazowaniu i obiektywnej analizie, ten solidny protokół nadaje się do przesiewania potencjalnych kandydatów na leki ukierunkowanych na hamowanie akumulacji α-synukleiny w skali od średniej do wysokiej przepustowości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad chorobą Parkinsona
Wstęp
- Gromadzenie się α-synukleiny jest powiązane z chorobami neurodegeneracyjnymi, w tym z chorobą Parkinsona.
- Znane jest, że agregaty fosforylowanej α-synukleiny zaburzają funkcje neuronalne.
- Obecne terapie ukierunkowane na ograniczanie akumulacji α-synukleiny są ograniczone.
- Niniejszy protokół ma na celu standaryzację badań nad molekularnymi mechanizmami gromadzenia się α-synukleiny.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnego modelu do badania akumulacji α-synukleiny w neuronach dopaminergicznych.
- Umożliwienie wysokoprzepustowego przesiewania leków hamujących tę akumulację.
- Zbadanie podstawowych mechanizmów biologicznych przyczyniających się do neurodegeneracji.
Zastosowane Metody
- Kultura komórkowa pierwotnych neuronów embrionalnego śródmózgowia z embrionów myszy w dniu 13.5.
- Indukcja agregacji α-synucleiny poprzez zastosowanie prefabrykowanych fibryli.
- Wykorzystanie zautomatyzowanego obrazowania do ilościowego określania agregatów α-synucleiny z użyciem oprogramowania CellProfiler do analizy obrazów.
- Kluczowe etapy obejmują przygotowanie mikro wysp do hodowli komórkowej, dodawanie fibryli w określonych dniach oraz ustawienia akwizycji obrazu.
Główne wyniki
- Protokół ten skutecznie umożliwia spójną akumulację α-synuclein w neuronach dopaminergicznych.
- Automatyczne obrazowanie pozwala na wyraźne odróżnienie komórek pozytywnych i negatywnych pod kątem obecności fosforylowanej α-synuclein.
- Wyniki wspierają badania nad nowymi celami terapeutycznymi w walce z neurodegeneracją związaną z α-synuclein.
Wnioski
- Niniejsze badanie ustanawia wartościowe narzędzie do eksploracji interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na akumulację α-synukleiny.
- Protokół ten pogłębia naszą wiedzę na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw neurodegeneracji.
- Przyszłe zastosowania mogą prowadzić do opracowania nowych terapii chorób takich jak choroba Parkinsona.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół ustanawia solidny, powtarzalny model badania akumulacji α-synukleiny w pierwotnych neuronach dopaminergicznych, umożliwiając mechanistyczną weryfikację celów terapeutycznych w badaniach nad chorobą Parkinsona. Dzięki połączeniu indukcji za pomocą prefabrykowanych włókien z automatycznym obrazowaniem i obiektywną analizą, metoda ta wspiera przesiewowe badania związków hamujących patologiczną agregację białek o średniej i wysokiej przepustowości. Podejście to zapewnia wiarygodność prognostyczną w procesie walidacji celów i identyfikacji związków wiodących w programach opracowywania leków na neurodegenerację.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych dotyczących mechanizmów agregacji α-synukleiny w systemach neuronalnych istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną platformę do funkcjonalnej walidacji celów molekularnych z wykorzystaniem endogennej fosforylowanej α-synukleiny jako ilościowego odczytu.
- Wartość predykcyjna: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez modelowanie histopatologii przypominającej ciałka Lewy'ego w neuronach pierwotnych, co ułatwia selekcję strategii modulacyjnych w portfelu badawczym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Tworzy zwalidowane systemy biologiczne w formacie 96-dołkowym, odpowiednie do późniejszego przesiewania związków i badań nad manipulacjami genetycznymi.
- Wyniki ilościowe: Zapewnia zautomatyzowany, obiektywny pomiar liczby neuronów dopaminergicznych dodatnich pod kątem fosfo-α-synucleiny na dołek, co umożliwia standaryzację i powtarzalność testu.
- Skalowalność: Projekt hodowli na mikro-wysepkach zwiększa odporność i moc eksperymentalną, wspierając ponowne wykorzystanie platformy w kampaniach poszukiwania leków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Wykorzystuje pierwotne embrionalne neurony dopaminergiczne śródmózgowia myszy do modelowania patologii α-synukleiny związanej z chorobą Parkinsona z dopasowaniem do translacyjnych biomarkerów.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia badanie mechanizmów powstawania i eliminacji inkluzji α-synukleiny, co wspiera decyzje dotyczące rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka.
- Ciągłość translacyjna: Łączy modulację celu w fazie odkrywania z oceną przedkliniczną poprzez spójne odczyty fenotypowe.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – co jest wspierane przez jej kompatybilność z badaniami nad perturbacjami farmakologicznymi i genetycznymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie kontrolowanej indukcji oraz kwantyfikacji akumulacji α-synuclein w neuronach dopaminergicznych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testu, powtarzalność i wyniki ilościowe, które są niezbędne do wiarygodnej oceny związków w formatach o średniej i wysokiej przepustowości.
- Analityka: Umożliwia zautomatyzowane obrazowanie oraz analizę opartą na oprogramowaniu CellProfiler, co pozwala na uzyskanie porównywalnych odczytów statystycznych dla różnych warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki zastosowaniu neuronalnych modeli istotnych dla przebiegu choroby oraz punktów końcowych zgodnych z biomarkerami (pS129 α-synuclein).
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania w badaniach nad modulacją α-synuclein, zamiast stosowania techniki jednorazowej, co maksymalizuje zwrot z inwestycji (ROI) w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna w walidacji celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w patologii α-synukleiny oraz ograniczanie ryzyka związanego z celem terapeutycznym.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność procesów hodowli neuronalnych oraz obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji typu go/no-go, efektywność kapitałowa w kampaniach przesiewowych oraz ograniczenie ryzyka biologicznego na późnych etapach programów dotyczących neurodegeneracji.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na ilościowej modulacji akumulacji patologicznych białek.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie pierwotnych hodowli komórek neuronalnych, technik sterylnych oraz pracy z preformowanymi fibrylami w celu uniknięcia kontaminacji.
- Zależne od infrastruktury obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging) i zautomatyzowanych narzędzi analizy (np. CellProfiler) w celu zapewnienia obiektywnej kwantyfikacji.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji warunków hodowli, przygotowania fibryli oraz parametrów obrazowania dla zapewnienia powtarzalności wyników.
- Wiąże się z koniecznością adaptacji protokołu przy rozszerzaniu badań na inne modele neuronalne lub tła genetyczne poza pierwotne neurony dopaminergiczne śródmózgowia myszy.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność starannej optymalizacji stężenia fibryli i czasu ekspozycji, aby uniknąć nieswoistej toksyczności przy jednoczesnym zachowaniu czułości fenotypowej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:11
Primary Embryonic Midbrain Culture Plate Preparation
1:53
Primary E13.5 Embryonic Midbrain Culture Setup
4:32
Seeding with Pre-Formed Fibrils (PFFs) and Semi-automated Immunofluorescence Imaging
6:21
High-Content Image Analysis
7:42
Results: Representative Midbrain Culture Characterization and Analysis
9:13
Conclusion
