Name: Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Poznaj metodę dotętniczego dostarczania komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy po niedokrwieniu. Technika ta umożliwia szeroką dystrybucję komórek nerwowych i ich wykrywanie do 30 dni, oferując obiecującą terapię udarową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez: AHA Award 14SDG20480186 dla LC, Zespół ds. innowacji tematycznych Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Shanxi 2019-QN07 dla BZ oraz grant Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust 14-12A dla KES i LC.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kentucky, a także podjęto odpowiednie starania, aby zminimalizować stres lub ból związany z operacją.
1. Przygotowanie cewnika iniekcyjnego i haków chirurgicznych
<ol>
	<li>Zbuduj cewnik do iniekcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Zbierz niezbędne materiały, w tym: rurki MRE010, MRE025 i MRE050, igły iniekcyjne 20 G, 26 G i 27 G (<klasa mocna = "xfig" >Rysunek 2A), papier ścierny o ziarnistości 600, superglue i dwuskładnikowa 5-minutowa żywica epoksydowa.
	<ol>
		<li>Odciąć igły 20 G i 26 G w odległości 1 cm od piasty igły i wypolerować koniec na papierze ściernym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Przepłukać igły 10 ml podwójnie destylowanej wody, aby oczyścić otwór igły. 
		UWAGA: Używane są dwa różne projekty (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Konstrukcja 1 ma pojedyncze złącze i służy do wstrzykiwania roztworów lub zawiesin. Konstrukcja 2 posiada złącza Luer lock 20 G i 26 G do wstrzykiwania komórek (igła 20 G) i przepłukiwania martwej objętości (igła 26 G) w celu zapewnienia dostarczenia pełnej objętości roztworu zawierającego NSC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzór 1: Włożyć cewnik MRE010 o długości 3-4 cm do cewnika MRE025 o długości 15 cm i zabezpieczyć klejem superglue.
	<ol>
		<li>Podłącz drugi koniec rurki MRE025 do segmentu cewnika MRE050 i zabezpiecz klejem superglue. Włóż stępioną igłę 20 G do pozostałego końca cewnika MRE050 i zabezpiecz klejem superglue (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1).</li>
		<li>Dodatkowo wzmocnij miejsca połączeń klejem epoksydowym. Ta konstrukcja cewnika jest optymalna do wstrzykiwania odczynników (takich jak roztwory chemiczne lub leki lub inne leki biologiczne, takie jak cytokiny).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzór 2: Włóż cewnik MRE010 o długości 3-4 cm do cewnika MRE025 o długości 15 cm i zabezpiecz klejem superglue.
	<ol>
		<li>Podłącz drugi koniec rurki MRE025 do segmentu cewnika MRE050 i zabezpiecz klejem superglue. Włóż stępioną igłę 20 G do pozostałego końca cewnika MRE050 i zabezpiecz klejem superglue.</li>
		<li>Włóż stępioną igłę 26 G do probówki MRE050 w pobliżu końcówki pierwszej igły, zgodnie z kierunkiem przepływu wtrysku i zabezpiecz klejem superglue (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2C). Wzmocnij obie igły i segment rurki MRE050 przezroczystą żywicą epoksydową (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C). Taka konstrukcja umożliwia wstrzyknięcie roztworu nośnika przez igłę 2 (26 G) po wstrzyknięciu NSC przez igłę 1 (20 G) w celu wypłukania martwej objętości cewnika do krążenia mózgowego, uzyskując bardziej precyzyjną kontrolę objętości wstrzyknięć.</li>
		<li>Do wstrzykiwania NSC należy użyć igły 20 G, aby zminimalizować uszkodzenia NSC, które mogłyby niekorzystnie wpłynąć na ich żywotność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zbudowaniu przepłucz cewniki 10 ml podwójnie destylowanej wody, a następnie 70% etanolu, a następnie zanurz je w 70% etanolu przez noc.</li>
	<li>Przed zabiegiem należy usunąć cewniki z 70% etanolu i przepłukać 10 ml sterylnego PBS, a następnie umieścić je w autoklawizowanej skrzynce z narzędziami chirurgicznymi do przechowywania i transportu.</li>
	<li>Przygotowanie haczyków chirurgicznych
	<ol>
		<li>Wytnij trzon igły o długości 1,5-2 cm z igły 27 G i wypoleruj oba końce na papierze ściernym, aż będzie matowy. Następnie użyj małego zacisku hemostatycznego, aby zgiąć wałek w hak na jednym końcu i w kształt pierścienia na drugim końcu.</li>
		<li>Przełóż cewnik MRE025 o długości 10-15 cm przez pierścień i zabezpiecz przezroczystą taśmą chirurgiczną (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D). Wykonaj jeszcze 2 haczyki tą samą metodą.</li>
		<li>Namocz wszystkie haczyki i systemy cewników w 70% etanolu do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt: dostawa, trzymanie, adaptacja do środowiska
<ol>
	<li>W badaniu wykorzystano samce i samice myszy C57BL/6 (10-12 tygodni, n=10/punkt czasowy) oraz szczury Wistar (10-12 tygodni, n=10).</li>
	<li>Umieść je w kontrolowanym środowiskowo wiwarium dla zwierząt z jedzeniem i wodą ad libitum.</li>
	<li>Pozwól im przystosować się do środowiska co najmniej 1 tydzień przed zabiegiem mózgu. 
	UWAGA: Jedna mysz i jeden szczur zmarły w wieku 1 dni po operacji udaru, a jedna mysz została poddana eutanazji w 3 dniu po udarze przed wstrzyknięciem NSC z powodów humanitarnych z powodu ciężkiego paraliżu.</li>
</ol>
3. Hodowla mysich i szczurzych nerwowych komórek macierzystych (NSC)
UWAGA: NSC zostały odizolowane i hodowane zgodnie z ustalonym protokołem20.
<ol>
	<li>mysz
	<ol>
		<li>Wyizoluj NSC typu dzikiego (WT) i znakowane GFP z kory embrionalnej E18 od samic myszy C57BL / 6 w ciąży w czasie połączonych z samcami myszy GFP-dodatnich (B6 ACTb-EGFP). Aby zidentyfikować zarodki GFP (+), należy obserwować pobrane zarodki pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu kanału FITC. Zarodki GFP (+) dają zielony sygnał fluorescencji, podczas gdy zarodki WT wykazują tylko słabą autofluorescencję (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>szczur
	<ol>
		<li>Wyizolować NSC ze strefy podkomorowej (SVZ) młodych dorosłych szczurów WT. Oznacz je DiI tuż przed wstrzyknięciem, postępując zgodnie z instrukcjami producenta21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj myszy lub szczury NSC, aż rozwiną się w neurosfery i przejdź przez nie, gdy średnica kuli osiągnie około 100 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Do wstrzykiwań między przejściami 3 i 5 należy stosować NSC.</li>
	<li>Sprawdź ich właściwości komórek macierzystych za pomocą panelu markerów embrionalnych komórek macierzystych (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>W dniu wstrzyknięcia zebrać kulki NSC i zdysocjować z roztworem do odrywania komórek, zawiesić w PBS wolnym od wapnia i magnezu do stężenia 10-7 komórek/ml i umieścić na mokrym lodzie do momentu wstrzyknięcia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie chirurgiczne
<ol>
	<li>Przed zabiegiem należy zaznaczyć kropkę na komercyjnym szwie MCAO srebrnym markerem w odległości 9 mm (dla myszy) lub 15 mm (dla szczurów) od końcówki, aby uzyskać odniesienie do długości wprowadzenia podczas operacji. Autoklaw w autoklawie narzędzi chirurgicznych (nożyczki, kleszcze) i narzędzia przed każdym zabiegiem i sterylizuj je na gorąco w sterylizatorze z kulkami szklanymi między operacjami.</li>
	<li>Wywołać znieczulenie u zwierząt za pomocą 5% izofluranu poprzez inhalację i utrzymać znieczulenie za pomocą 1-2% izofluranu. Oceń głębokość znieczulenia poprzez obserwację warunków ogólnych (wzorzec oddychania, ruch wąsów i spontaniczna postawa korekcyjna ciała), odruchu rogówkowego i reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Połóż zwierzę na wznak na poduszce grzewczej i przygotuj miejsce operacji na zwierzęciu, przycinając i szorując roztworem betadyny, a następnie 70% etanolem. Chroń oczy zwierzęcia przed wysuszeniem, stosując maść okulistyczną (np. maść na sztuczne łzy) podczas zabiegu.</li>
	<li>Niech chirurdzy dokładnie wyszorują ręce peelingiem bakteriobójczym i załóż maskę, sterylne rękawiczki i czysty fartuch laboratoryjny.</li>
</ol>
5. Operacja udaru z powodu niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO)
UWAGA: Operacje mające na celu wywołanie udaru niedokrwiennego u jednej półkuli myszy lub szczura są podobne pod tym względem, że szew jest wprowadzany do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) w celu zablokowania przepływu krwi (Rysunek 4)17,18,19,22. Jednak tętnica wybrana do wprowadzenia szwów różni się w zależności od dostępnej przestrzeni operacyjnej wymaganej do późniejszego wstrzyknięcia komórek macierzystych. Szczur ma wystarczająco dużo miejsca w segmencie tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), aby umożliwić dwie oddzielne, sekwencyjne operacje (udar i wstrzyknięcie NSC), ale mysz nie ma, co wymaga alternatywnego podejścia. Wywołane udarem zmiany przepływu krwi w mózgu, rozmiar zawału mózgu i deficyty neurologiczne zostały zgłoszone tak, jak w poprzednich raportach autorów17,18,19.
<ol>
	<li>Aby wywołać udar niedokrwienny, należy rozpocząć operacje zarówno na myszach, jak i szczurach od nacięcia w linii środkowej w obszarze szyjki macicy i izolacji lewej tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), ECA i ICA (<silna klasa = "xfig">Ryc. 4). Zachowaj ostrożność, aby nie rozciągać, nie przesuwać ani nie ściskać CCA lub nerwu błędnego. Ponieważ wybór tętnicy i etapy chirurgiczne są później różne, operacja MCAO na myszy i szczurze zostanie opisana osobno.</li>
	<li>Operacja MCAO na myszy (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A)
	<ol>
		<li>Umieść trzy plecione nylonowe szwy 6-0 pod CCA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A, krok 1) i wykonaj jeden ciasny węzeł chirurgiczny, aby zamknąć naczynie jak najdalej od rozwidlenia za pomocą proksymalnego sznurka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A, krok 2). Przytnij końce szwów.</li>
		<li>Zrób węzeł ślizgowy po dystalnej stronie CCA (uwaga: nie zaciskaj zbyt mocno, ponieważ zostanie zwolniony w kroku 6) i jeden luźny węzeł pomiędzy dwoma zaciśniętymi węzłami (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A, krok 2).</li>
		<li>Wytnij małe nacięcie (~ 1/4 - 1/3 obwodu) w pobliżu bliższego węzła na CCA za pomocą mikronożyczek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A, krok 3) i ostrożnie włóż komercyjny szew nylonowy 7-0 pokryty gumą silikonową (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A, krok 4). Zabezpiecz ten szew środkowym sznurkiem, zaciskając go wystarczająco (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A, krok 5), aby zapewnić brak wycieku krwi z nacięcia i ruch włókna nylonowego pokrytego gumą silikonową przez przepływ wsteczny z ICA, jednocześnie umożliwiając przesuwanie szwu w kierunku ECA za pomocą delikatnego naciśnięcia pęsetą.</li>
		<li>Zwolnij górny (dystalny) węzeł ślizgowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A, krok 6) i wsuń nylonowy szew do ICA, aż jego końcówka przejdzie przez rozwidlenie na 9 mm (używając srebrnego markera na szwie jako odniesienia). Zaciśnij dwa górne węzły, aby zabezpieczyć szew i zapobiec cofaniu się krwi.</li>
		<li>Wyjmij filament 1 godzinę później (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A, krok 7) i podwiąż CCA za pomocą środkowego węzła, aby zapobiec krwawieniu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A, kroki 5-7 w odwrotnej kolejności, końcowe wyniki jak pokazano w kroku 8). Zwolnij górny węzeł. Zamknij ranę szwem chirurgicznym 4-0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Operacja MCAO na szczurze (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B)
	<ol>
		<li>Umieść dwa plecione szwy nylonowe 6-0 pod ECA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B, krok 1) i wykonaj jeden ciasny węzeł na dystalnym końcu tak daleko, jak to możliwe (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B, krok 2).</li>
		<li>Umieść klipsy naczyń na ICA i CCA, aby zablokować przepływ krwi tętniczej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B, krok 3). Węzeł slipknot może być używany jako alternatywa dla klipsa do naczynia.</li>
		<li>Wykonaj małe nacięcie na ECA za pomocą mikronożyczek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B, kroki 3-4), włóż komercyjne nylonowe włókno 6-0 pokryte gumą silikonową (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B, krok 5) i odpowiednio zabezpiecz węzłem ślizgowym na ECA.</li>
		<li>Zwolnij zacisk naczynia na ICA, wsuń włókno do ICA, aż srebrny znacznik (15 mm) osiągnie rozwidlenie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B, krok 6), a następnie zabezpiecz szew 2. węzłem na ECA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B, krok 6).</li>
		<li>Po 1 godzinie niedokrwienia wycofaj to włókno i podwiąż nacięcie, aby zapobiec krwawieniu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B, krok 7), usuń klips do naczynia z CCA (wynik końcowy jak w kroku 8) i zamknij ranę szwem chirurgicznym 4-0.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Odzyskiwanie
<ol>
	<li>Po operacji udaru należy umieścić zwierzęta na poduszce grzewczej, aż w pełni odzyskają przytomność.</li>
	<li>Zapewnić analgezję poprzez wstrzyknięcie podskórne. Powrót zwierząt do ich domowych klatek z dostępem do wody i pożywienia ad libitum.</li>
</ol>
7. Wstrzyknięcie dotętnicze
<ol>
	<li>Umyj cały cewnik 70% etanolem i moczyć przez noc do użycia. Tuż przed wstrzyknięciem należy połączyć blokadę Luer igły ze sterylną strzykawką i przemyć całą stronę światła układu cewnika 10 ml jałowego PBS.</li>
	<li>Okno czasowe i przygotowanie do iniekcji NSC 
	UWAGA: Opierając się na doświadczeniu i raportach innych zespołów badawczych, czas wstrzyknięcia NSC ma kluczowe znaczenie dla przeżycia zarówno pacjentów, jak i egzogennych NSC. W naszym badaniu pilotażowym wstrzyknięcie NSC we wczesnych punktach czasowych (w ciągu pierwszych 6 godzin po reperfuzji) prowadziło do wyższej śmiertelności. W związku z tym przetestowaliśmy późniejsze punkty czasowe wstrzyknięcia i ustaliliśmy, że okno czasowe między 2 d (48 h) a 3 d (72 h) po udarze jest bezpieczne i tolerowane dla zwierząt oraz jest skuteczne w osiąganiu intraparenchymalnego rozkładu NSC. Wyniki przedstawione w niniejszym dokumencie pochodzą od zwierząt, którym wstrzyknięto NSC w 3 dniu po urazie.
	<ol>
		<li>Ustawić szybkość wstrzykiwania pompy strzykawkowej na 20 μl/min dla myszy i 50 μl/min dla szczurów. Nadmierna prędkość lub czas trwania wstrzyknięcia może powodować ogólnoustrojowe przeciążenie objętościowe, na które myszy są bardziej podatne niż szczury.</li>
		<li>Krótko mówiąc, po 3 dniach od operacji udaru znieczulij zwierzęta izofluranem i połóż je na wznak na poduszce grzewczej.</li>
		<li>Ponownie otwórz ranę szyjki macicy i ponownie odsłonij ECA, ICA i CCA (<silna klasa="xfig">Rysunek 5, krok 1). Podobnie jak w przypadku operacji udarowych, należy określić drogę wstrzyknięcia w zależności od gatunku. Użyj CCA do wstrzyknięcia NSC do myszy i ECA do klasy rat23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknięcie dotętnicze przez CCA u myszy
	<ol>
		<li>Umieść dwa plecione nylonowe szwy 6-0 pod CCA. Utwórz luźny węzeł ślizgowy z każdym z nich między rozwidleniem a dolnymi węzłami z poprzedniej operacji udaru (<silna klasa="xfig">Rysunek 5, krok 2).</li>
		<li>Zaciśnij górny węzeł ślizgowy, a następnie wykonaj małe nacięcie powyżej dolnego węzła (<silna klasa="xfig">Rysunek 5, krok 3). Wprowadzić cewnik MRE010 przez nacięcie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5, krok 4) i zabezpieczyć środkowym węzłem bez blokowania przepływu iniekcji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5, krok 5). Cofanie się krwi powinno być widoczne w cewniku po zwolnieniu górnego węzła i regulacji położenia cewnika.</li>
		<li>Umieścić klips do naczynia w ECA, wstrzyknąć 1 x 106 GFP-NSC przez ten cewnik z prędkością 20 μl/min przez 5 minut za pomocą pompy strzykawkowej, a następnie przepłukać 50-100 μl PBS z tą samą prędkością.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu podwiązać CCA powyżej nacięcia za pomocą górnego węzła poślizgowego i wycofać cewnik MRE010 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5, krok 6). Zaciśnij i przytnij środkowy węzeł i górny węzeł. Zdemontować zacisk naczynia z ECA. Zapoznaj się z ostatnim obrazem w Rysunek 5, krok 7.</li>
		<li>Zamknij ranę szwem chirurgicznym 4-0.</li>
		<li>Po zapewnieniu odpowiedniej rekonwalescencji na poduszce grzewczej i podskórnym wstrzyknięciu przeciwbólowym, zwierzęta należy umieścić z powrotem w ich domowej klatce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknięcie dotętnicze przez ECA u szczura
	<ol>
		<li>Tymczasowo zasłoń ECA i CCA za pomocą klipsów do naczyń (<silna klasa="xfig">Rysunek 5, krok 2).</li>
		<li>Wykonaj małe nacięcie po bliższej stronie ECA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5, krok 3), włóż cewnik MRE010 i zabezpiecz węzłem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5, krok 4).</li>
		<li>Usuń oba zaciski naczyń, wstrzyknij 5 x 106 NSC w 100 μl PBS przy 50 μl/min przez 2 minuty, a następnie przepłucz 50-100 μl PBS (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5, krok 5) z tą samą prędkością, używając zmotoryzowanej pompy strzykawkowej.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu ponownie zamknij CCA i ECA za pomocą klipsów naczyniowych i podwiąż ECA po bliższej stronie drugiego nacięcia po wycofaniu cewnika iniekcyjnego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5, krok 6).</li>
		<li>Usuń dwa klipsy do naczyń krwionośnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 5, krok 7) i zamknij ranę szwem chirurgicznym 4-0.</li>
		<li>Po zapewnieniu odpowiedniej rekonwalescencji na poduszce grzewczej i podskórnym wstrzyknięciu przeciwbólowym, zwierzęta należy umieścić z powrotem w ich domowej klatce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test histologiczny
	<ol>
		<li>Zbierz mózgi myszy i szczurów, które otrzymały udar niedokrwienny, a następnie wstrzyknięcie NSC lub roztworu nośnika po eutanazji i perfuzji wewnątrzsercowej z 4% paraformaldehydem w 1 dniu (mysz i szczur), 7 dni (mysz) i 30 dni (mysz) po wstrzyknięciu. Każda z tych czterech grup składała się z 5 zwierząt z NSC i 5 zwierząt, którym wstrzyknięto pojazd.</li>
		<li>Napraw mózgi na noc i kriokonserwuj w 30% sacharozie przez 3 dni.</li>
		<li>Osadź mózgi w OCT, pokrój na plasterki o grubości 40 μm i zbadaj rozkład NSC po barwieniu immunologicznym markerami specyficznymi dla komórek, w tym kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju (GFAP, astrocyty), Tuj1 (dojrzałe neurony) i podwójną kortyną (DCX, niedojrzałe neurony). 
		UWAGA: Ze względu na brak szczepu szczura, który wykazuje ekspresję GFP, zastosowaliśmy DiI, przejściowy znacznik fluorescencyjny, dla NSC szczurów, który pozwala tylko na stosunkowo krótkotrwałą obserwację. W związku z tym dystrybucję NSC badano tylko po 1 dniu po udarze u szczurów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+research+in+2017%3A+surgical+progress+and+stem-cell+advances%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances.</a> The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).</li>
<li>Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+therapy+for+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation therapy for stroke.</a> Stroke. 38, 817-826 (2007).</li>
<li>Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+therapy+for+subacute+and+chronic+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9, 154(2018).</li>
<li>Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customized+Brain+Cells+for+Stroke+Patients+Using+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells.</a> Stroke. 49, 1091-1098 (2018).</li>
<li>Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Stem+Cells+the+Next+Generation+of+Stroke+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics.</a> Stroke. 49, 1056-1057 (2018).</li>
<li>Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Therapy+for+Chronic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cell Therapy for Chronic Stroke.</a> Stroke. 49, 1066-1074 (2018).</li>
<li>Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trial+design+for+stem+cell+therapies+in+stroke%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned.</a> Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).</li>
<li>Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-Arterial+Delivery+of+Cell+Therapies+for+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke.</a> Stroke. 49, 1075-1082 (2018).</li>
<li>Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-arterial+delivery+of+cell+therapies+for+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke.</a> Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).</li>
<li>Argibay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraarterial+route+increases+the+risk+of+cerebral+lesions+after+mesenchymal+cell+administration+in+animal+model+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia.</a> Scientific Reports. 7, 40758(2017).</li>
<li>Kelly, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+human+fetal+neural+stem+cells+survive%2C+migrate%2C+and+differentiate+in+ischemic+rat+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).</li>
<li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).</li>
<li>Fischer, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+passage+is+a+major+obstacle+for+intravenous+stem+cell+delivery%3A+the+pulmonary+first-pass+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect.</a> Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).</li>
<li>Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+in+ischemic+stroke%3A+role+of+IV+and+intra-arterial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy.</a> Neurology. 79, 207-212 (2012).</li>
<li>Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+delivery+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Stroke+Research%22%5BJournal%5D)">Intracranial delivery of stem cells.</a> Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).</li>
<li>Boltze, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dark+Side+of+the+Force+-+Constraints+and+Complications+of+Cell+Therapies+for+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke.</a> Frontiers in Neurology. 6, 155(2015).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+noncontact+speckle+contrast+diffuse+correlation+tomography+of+cerebral+blood+flow+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats.</a> Neuroimage. 198, 160-169 (2019).</li>
<li>Wong, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+Cerebral+Ischemic+Injury+in+Smad1+Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice.</a> PLoS One. 10, 0136967(2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+telomerase+activity+aggravates+the+blood-brain+barrier+disruption+and+neuroinflammatory+responses+in+a+model+of+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke.</a> Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).</li>
<li>Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+doublecortin-expressing+population+in+the+developing+and+adult+brain+contains+multipotential+precursors+in+addition+to+neuronal-lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells.</a> The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3, 20130001(2013).</li>
<li>Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Ischemic+Stroke+and+Ischemia-reperfusion+in+Mice+Using+the+Middle+Artery+Occlusion+Technique+and+Visualization+of+Infarct+Area%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Microsurgery+Infusion+Technique+for+Targeted+Substance+Delivery+into+the+CNS+via+the+Internal+Carotid+Artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Chua, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-arterial+injection+of+neural+stem+cells+using+a+microneedle+technique+does+not+cause+microembolic+strokes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).</li>
<li>Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+for+cell+transplantation+into+the+central+nervous+system%3A+Design+considerations+and+emerging+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Neurology+International%22%5BJournal%5D)">Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies.</a> Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).</li>
<li>Duma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intracerebroventricular+%28ICV%29+injection+of+autologous%2C+non-engineered%2C+adipose-derived+stromal+vascular+fraction+%28ADSVF%29+for+neurodegenerative+disorders%3A+results+of+a+3-year+phase+1+study+of+113+injections+in+31+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients.</a> Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).</li>
</ol>

Terapia komórkami macierzystymi w chorobach neurologicznych jest wciąż na wczesnym etapie badań. Jednym z głównych problemów jest to, że nie ma ustalonej metody wystarczającego dostarczania SC lub NSC do mózgu.
Chociaż egzogenne SC/NSC można wykryć w mózgu po wstrzyknięciu dożylnym (IV), dootrzewnowym (IP) lub śródmiąższowym/domózgowym, każde podejście do podawania ma wady. Szacuje się, że wykrywalna populacja w mózgu jest bardzo niska w przypadku wstrzyknięcia obwodowego (IV lub IP), stanowią...

Terapia komórkami macierzystymi (SC) ma ogromny potencjał w leczeniu chorób neurologicznych, w tym udaru, urazów głowy i demencji1,2,3,4,5,6. Jednak skuteczna metoda dostarczania egzogennych SC do chorego mózgu pozostaje problematyczna2,6,7,8,9,10,11,12,13. SC dostarczane obwodowymi drogami, w tym dożylnie (IV) lub dootrzewnowe (IP), podlegają pierwszej filtracji w mikrokrążeniu, zwłaszcza w płucach, wątrobie, śledzionie i mięśniach8,9,13,14, co zwiększa prawdopodobieństwo akumulacji komórek w obszarach niedocelowych. Inwazyjna metoda iniekcji domózgowej powoduje miejscowe uszkodzenie tkanki mózgowej i bardzo ograniczoną dystrybucję SC w pobliżu miejsca wstrzyknięcia2,6,8,14,15,16. Niedawno opracowaliśmy metodę iniekcji dotętniczej opartej na cewniku w celu dostarczania egzogennych neuronalnych SC (NSC), która jest opisana tutaj stosowana w modelu ogniskowego udaru niedokrwiennego u gryzoni. Indukujemy przejściowe (1 h) uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne w jednej półkuli za pomocą filamentu pokrytego gumą silikonową, aby zamknąć lewą środkową tętnicę mózgową (MCA) u myszy lub szczura17,18,19. W tym modelu zaobserwowaliśmy w sposób powtarzalny około 75-85% depresję przepływu krwi w mózgu (CBF) w półkuli ipsilateralnej za pomocą laserowego dopplera lub laserowego obrazowania plamkowego17,19, co daje stałe deficyty neurologiczne17,18,19.
Dla oszczędności czasu, wideo jest ustawione na odtwarzanie z dwukrotnie większą prędkością, a rutynowe procedury chirurgiczne, takie jak przygotowanie skóry i zamykanie ran za pomocą szwu oraz użycie i konfiguracja pompy strzykawkowej z napędem silnikowym, nie są prezentowane. Sposób dotętniczego dostarczania NSC przedstawiono w kontekście modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO) eksperymentalnego udaru mózgu u gryzoni. Dlatego uwzględniamy procedurę przejściowego udaru niedokrwiennego, aby później zademonstrować, w jaki sposób druga operacja, wstrzyknięcie dotętnicze, jest wykonywana przy użyciu poprzedniego miejsca operacyjnego u tego samego zwierzęcia. Wykonalność dotętniczego podawania NSC w modelach udaru gryzoni wykazano poprzez ocenę dystrybucji i przeżycia egzogennych NSC. Skuteczność terapii NSC w łagodzeniu patologii mózgu i dysfunkcji neurologicznych zostanie opisana oddzielnie.

<table><tbody><tr><td>Igła 20 G</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305175</td><td>przygotowanie cewnika iniekcyjnego</td></tr><tr><td>igła 26 G</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305111</td><td>przygotowanie cewnika iniekcyjnego</td></tr><tr><td>igła 27 G</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305136</td><td>przygotowanie cewnika iniekcyjnego</td></tr><tr><td>4-0 NFS-2 szew z igłą</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56905</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>6-0 szew nylonowy</td><td>Teleflex/Braintree Scientific</td><td>104-s</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7922</td> ostrze <td>roztworu do odrywania komórek</td></tr><tr><td></td><td>Bard-Parker</td><td>10</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Buprenorphine-SR Lab</td><td>ZooPharm</td><td>Buprenorphine-SR Lab&reg;</td><td>analgezja (0,6-1 mg/kg powyżej 3 dni)</td></tr><tr><td>Bez wapnia/magnisum PBS</td><td>VWR</td><td>02-0119-0500</td><td>NSC dysocjacja</td></tr><tr><td>przeciwciało DCX</td><td>Millipore</td><td>AB2253</td><td>immunostaining</td></tr><tr><td>przeciwciało GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>180063</td><td>barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50562-1</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Filament MCAO dla myszy</td><td>Doccol</td><td>702223PK5Re</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Filament MCAO dla szczura</td><td>Doccol</td><td>503334PK5Re</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Cewnik MRE010</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE010</td><td>przygotowanie cewnika iniekcyjnego</td></tr><tr><td>Cewnik MRE025</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE025</td><td>przygotowanie cewnika iniekcyjnego</td></tr><tr><td>Cewnik MRE050</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE050</td><td>przygotowanie cewnika iniekcyjnego</td></tr><tr><td>Nu-Tears Maść</td><td>NuLife Pharmaceuticals</td><td>Nu-Tears Maść pielęgnacja</td><td>oczu podczas zabiegu</td></tr><tr><td>S& Kleszcze T - Końcówki SuperGrip JF-5TC Kątowe</td><td>narzędzia naukowe</td><td>00649-11</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>S& Kleszcze T - Końcówki SuperGrip JF-5TC Proste</td><td>narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>00632-11</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Pacer Technology</td><td>15187</td><td>przygotowanie cewnika iniekcyjnego</td></tr><tr><td>pompa strzykawkowa</td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>Przeciwciało Tuj1</td><td>Millipore</td><td>MAb1637</td><td>dwuskładnikowa</td></tr><tr><td>żywica epoksydowa</td> do barwienia immunologicznego <td>Devcon</td><td>20445</td><td>przygotowanie cewnika iniekcyjnego</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>chirurgia</td></tr><tr><td>zaciski naczyniowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>00400-03</td><td>chirurgia</td></tr> <tr><td></td><td>Mikroskop Zeiss</td><td>Mikroskopia Zeiss</td><td>Axio Imager 2</td></tr></tbody></table>

dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Terapia neuronalnymi komórkami macierzystymi (NSC) jest innowacyjną metodą leczenia udaru, urazowego uszkodzenia mózgu i zaburzeń neurodegeneracyjnych. W porównaniu z podawaniem wewnątrzczaszkowym, dotętnicze podawanie NSC jest mniej inwazyjne i powoduje bardziej rozproszoną dystrybucję NSC w miąższu mózgu. Co więcej, dostarczanie dotętnicze umożliwia efekt pierwszego przejścia w krążeniu mózgowym, zmniejszając możliwość uwięzienia komórek w narządach obwodowych, takich jak wątroba i śledziona, co jest powikłaniem związanym z zastrzykami obwodowymi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodologię, zarówno u myszy, jak i szczurów, dostarczania NSC przez tętnicę szyjną wspólną (mysz) lub tętnicę szyjną zewnętrzną (szczur) do półkuli ipsilateralnej po udarze niedokrwiennym. Korzystając z NSC znakowanych GFP, ilustrujemy rozległą dystrybucję osiągniętą w całej półkuli ipsibocznej gryzoni po 1 dniu, 1 tygodniu i 4 tygodniach po porodzie niedokrwiennym, z większą gęstością w miejscu uszkodzenia niedokrwiennego lub w jego pobliżu. Oprócz długoterminowego przeżycia pokazujemy dowody na różnicowanie się komórek znakowanych GFP po 4 tygodniach. Opisane tutaj podejście do dostarczania dotętniczego dla NSC może być również stosowane do podawania związków terapeutycznych, a zatem ma szerokie zastosowanie w różnych modelach uszkodzeń i chorób OUN u wielu gatunków.

Oznakowane GFP komórki NSC zostały łatwo wykryte w niedokrwiennym mózgu, głównie w półkuli ipsilateralnej, zwłaszcza w penumbrze oraz wzdłuż krawędzi uszkodzenia (Rysunek 6). Badacz podczas obrazowania i analizy działał w trybie pojedynczej ślepej próby.
Na przykład w 1 d po wstrzyknięciu w hipokampie myszy wykryto komórki NSC. Podgrupa komórek NSC wykazała koekspresję markera niedojrzałych neuronów DCX w zakręcie zębatym nawet w tym wczesnym punkcie czasowym (<st...

Zgłaszana jest metoda dostarczania nerwowych komórek macierzystych, przystosowanych do wstrzykiwania roztworów lub zawiesin, przez wspólną tętnicę szyjną (mysz) lub tętnicę szyjną zewnętrzną (szczur) po udarze niedokrwiennym. Wstrzyknięte komórki są szeroko rozmieszczone w miąższu mózgu i można je wykryć do 30 dni po porodzie.

Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Udar mózgu jest główną przyczyną śmiertelności i niepełnosprawności na całym świecie. Chociaż tromboliza i chirurgiczne usunięcie niedrożności naczyń mózgowych mogą być wykonywane u wybranych pacjentów, nadal istnieje pilna potrzeba skutecznych terapii udaru mózgu. W tym miejscu demonstrujemy cewnikowe, dotętnicze dostarczanie komórek macierzystych do półkuli niedokrwiennej jako potencjalny schemat terapii udaru mózgu.Najpierw przedstawiamy, jak przygotować cewnik iniekcyjny i haczyki chirurgiczne. Zaprojektowaliśmy dwa rodzaje cewników iniekcyjnych do iniekcji dotętniczej. Konstrukcja pierwsza służy do wstrzykiwania roztworu lub zawiesiny, która nie wymaga przepłukiwania probówki.Konstrukcja druga umożliwia wstrzyknięcie nerwowych komórek macierzystych, a następnie przepłukanie martwej objętości w celu dostarczenia pełnej objętości. Do zbudowania zestawu cewników iniekcyjnych potrzebne będą igły o rozmiarze 26 i 20, cewnik MRE 25 o długości od 10 do 15 centymetrów oraz cewniki MRE 50 i MRE 10 o długości trzech centymetrów. Odetnij obie końcówki igieł i wypoleruj metalowy koniec papierem ściernym, aby ponownie otworzyć rurkę i wygładzić krawędzie, a następnie spłucz wodą destylowaną, aby oczyścić otwór i zmyć zanieczyszczenia.Rysunek przedstawia zamknięty koniec igły o rozmiarze 20 po odcięciu końcówki igły, która po wypolerowaniu jest ponownie otwierana z gładkim otworem. Pod mikroskopem włóż igłę o rozmiarze 20 do końca rurki MRE 50. Zegnij igłę o rozmiarze 26, a następnie przebij rurkę poniżej końca końcówki igły o rozmiarze 20.Zabezpiecz igłę o rozmiarze 26 za pomocą super kleju. Następnie osadź dwie piasty igły oraz rurkę i żywicę epoksydową, aby zbudować solidny blok zwiększający wytrzymałość. Potrzebne będą również trzy haczyki chirurgiczne, aby utrzymać tkankę w odpowiedniej pozycji, aby uzyskać lepszą ekspozycję miejsc operowanych.Wytnij trzon igły o długości od półtora do dwóch centymetrów z igły o rozmiarze 27 i wypoleruj oba końce papierem ściernym, aż będzie matowy. Użyj małego hemostatycznego zacisku, aby zgiąć wałek w hak na jednym końcu i w kształcie pierścienia na drugim końcu. Przełóż cewnik MRE 25 o długości od 10 do 15 centymetrów przez pierścień i zabezpiecz przezroczystą taśmą chirurgiczną.Zrób jeszcze dwa haczyki tą samą metodą. Haczyki i system cewników należy namoczyć przez noc w siedemdziesięcioprocentowym etanolu w celu sterylizacji. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Kentucky.Używamy laryngologicznego embrionalnego mózgu myszy do hodowli GFP, dodatnich nerwowych komórek macierzystych. Zarodki GFP dodatnie można łatwo uwidocznić w kanale FITC pod mikroskopem fluorescencyjnym. Podczas gdy zarodki typu dzikiego nie wykazują fluorescencji przy tej samej ekspozycji.Autofluorescencja zarodków typu dzikiego jest widoczna tylko wtedy, gdy czas ekspozycji wydłuża się 100-krotnie. Kora embrionalna jest pobierana i wykorzystywana do zakładania kultur nerwowych komórek macierzystych zgodnie z protokołem producenta. Te nerwowe komórki macierzyste mogą tworzyć neurosfery i mogą przechodzić przez 10 pokoleń i mogą różnicować się w neurony glejowe.Panel markerów embrionalnych komórek macierzystych, takich jak nanog, SSEA1, Oct4 i Sox3, może być wykorzystany do identyfikacji właściwości komórek macierzystych w neurosferach. Neurosfery hodowano w pożywkach, zgodnie z protokołem producenta i stosowano między pasażami trzecim a piątym w celu dostarczania nerwowych komórek macierzystych. Udar niedokrwienny wywołano w lewej półkuli zarówno u myszy, jak i szczurów, przy użyciu opartej na włóknach okluzji środkowej tętnicy mózgowej, MCAO z pewnymi modyfikacjami w zależności od gatunku.U myszy włókno jest wprowadzane przez tętnicę szyjną wspólną, CCA i wprowadzane do tętnicy szyjnej wewnętrznej, ICA. Podczas gdy u szczurów włókno jest wprowadzane przez tętnicę szyjną zewnętrzną, ECA do ICA ze względu na większą przestrzeń roboczą. Tutaj pokazujemy operację na myszach.Po wykonaniu nacięcia w linii środkowej wzdłuż szyi oddziel leżące poniżej tkanki za pomocą rozwarstwienia. Użyj trzech haczyków mikrochirurgicznych wykonanych z trzonków igieł o rozmiarze 27, aby uzyskać lepsze pole widzenia. kwadrat wskazuje obszar operacyjny do następnego kroku.Warstwa mięśniowa powyżej lewego CCA jest ostrożnie otwarta, aby odsłonić lewe CCA i nerw błędny. Podążaj za CCA, aż dotrzesz do bifurkacji i zidentyfikuj ją. Należy zachować ostrożność, aby nie rozciągać, nie przemieszczać ani nie ściskać tego CCA lub nerwu błędnego.Ostrożnie otwórz przezroczystą tkankę łączną, zakrywającą CCA i nerw błędny. Zwolnij przestrzeń pod tym CCA za pomocą końcówki kleszczy i odizoluj trzpień CCA tak bardzo, jak to możliwe. Nawlecz dwuniciowy nylonowy sześcian chirurgiczny z plecionymi sześcioma O pod CCA.Wytnij środkowy punkt, aby pozostawić szwy pod CCA. Umieść kolejny nylonowy szew pod CCA. Zawiąż węzeł ślizgowy na górnym szwie, utrzymując go luźnym.Oddziel dwa dolne szwy. Zawiąż węzeł poślizgowy ze środkowym szwem, na razie trzymając go luźno. Zawiąż węzeł chirurgiczny dolnym szwem i przesuń go do bliższego końca tak daleko, jak to możliwe.Przytnij końce szwów. Dalsze eksponowanie CCA poza bifurkacją. Dociśnij górny luźny węzeł ślizgowy do rozwidlenia i zaciśnij go, aby zapobiec cofaniu się krwi.Połóż nylonowy szew MCAO pokryty gumą silikonową 70 obok CCA. Za pomocą mikronożyczek wytnij małe nacięcie na CCA, obok dolnego węzła. Włóż końcówkę szwu MCAO do CCA przez to nacięcie i przesuń ją do górnego węzła.Dostosuj położenie środkowego węzła i zaciśnij go, aż będzie mógł utrzymać szew MCAO na miejscu. Nie zaciskaj nadmiernie węzła. Zwolnij górny węzeł, ale w tym samym miejscu wykonaj kolejny luźny węzeł poślizgowy.Wsuń szew MCAO do ICA. Upewnij się, że szew MCAO przechodzi przez rozwidlenie do ICA. Ścieżka szwu powinna być stosunkowo prosta, wchodząc głębiej w tkankę w miarę jej postępu.Sprawdź srebrny marker na końcu szwu. Upewnij się, że dociera do rozwidlenia. Sprawdź ponownie kierunek szwu MCAO.Wyreguluj górne i środkowe węzły, aby upewnić się, że nie ma wycieku krwi. Dalej przesuwaj szew MCAO, zaciśnij dwa górne węzły, aby zabezpieczyć szew MCAO na miejscu. Rozpocznij rejestrowanie czasu dla jednej godziny niedokrwienia.Po godzinie niedokrwienia znieczulamy zwierzę i ponownie otwieramy ranę skóry. Odsłoń obszar operacyjny. Zlokalizuj górny i środkowy węzeł ślizgowy.Delikatnie zwolnij górny węzeł. Delikatnie wyciągnij szew MCAO, aż biała część z gumy silikonowej dotrze do środkowego węzła. Zaciśnij górny węzeł, aby utrzymać szew MCAO na miejscu, aby uniknąć krwawienia.Delikatnie zwolnij środkowy węzeł ślizgowy. Wyciągnij szew MCAO, aż jego koniec przejdzie przez górny węzeł. Zaciśnij górny węzeł.Umieść środkowy węzeł ślizgowy tuż nad nacięciem na CCA. Dokręć środkowy węzeł ślizgowy. Usuń górny węzeł.Przyciąć końce szwu środkowego węzła. Zamknij ranę skóry i pozwól zwierzęciu dojść do siebie. Opierając się na naszym doświadczeniu, nerwowe komórki macierzyste bezpiecznie wstrzykiwane tą drogą tętniczą w okresie od jednego do trzech dni po udarze.Ponownie, istnieją niewielkie różnice między operacjami na myszach i szczurach w celu wstrzyknięcia nerwowych komórek macierzystych. A tutaj pokazujemy operację na myszach. W trzecim dniu po udarze należy znieczulić zwierzę, ponownie otworzyć ranę i ponownie odsłonić CCA.Połóż dwuniciowy szew chirurgiczny pod CCA i przetnij go w środku, aby uzyskać dwa szwy. Umieść oba szwy prawidłowo. Zrób węzeł z górnym szwem.Umieść go tuż pod rozwidleniem. Dokręć górny węzeł ślizgowy. Zrób kolejny węzeł ze środkowym szwem.Wytnij małe nacięcie tuż nad przyciętym węzłem pozostałym po operacji udaru. Przyciąć końcówkę cewnika MRE 10 pod kątem około 45 stopni. Użyj tego ostrego końca, aby wejść w nacięcie na CCA.Należy uważać, aby prawidłowo wyregulować kąt wejścia i siłę używaną do wprowadzenia cewnika. W przeciwnym razie cewnik może nie dostać się do CCA lub może go przebić. Włóż cewnik i przesuwaj, aż końcówka dotrze do górnego węzła.Zaciśnij środkowy węzeł, aby utrzymać cewnik na miejscu i upewnić się, że nie ma połączenia krwi. Zwolnij górny węzeł. Zrób węzeł poślizgowy z górnym szwem.Dostosuj kąt cewnika w CCA i pozycje obu węzłów, aż widoczny będzie szybki przepływ wsteczny krwi, co wskazuje na pomyślną komunikację między cewnikiem a przepływem CCA. Uruchomić pompę strzykawkową. Krew w cewniku zostanie wypłukana z powrotem do CCA.Wstrzyknięcie należy przerwać po pięciu minutach. Podwiązywać górny węzeł. Zwolnij środkowy węzeł i wyjmij cewnik.Podwiązuj środkowy węzeł. Przytnij wszystkie węzły. Zamknij ranę i pozwól zwierzęciu dojść do siebie.Po wstrzyknięciu dotętniczym, nerwowe komórki macierzyste znakowane GFP znajdują się głównie w półkuli ipsilateralnej. Tutaj pokazujemy rozkład w zakręcie zębatym hipokampa po jednym dniu po wstrzyknięciu. W półkuli ipsilateralnej niektóre z dodatnich nerwowych komórek macierzystych GFP zlokalizowanych w korze i prążkowiu wyrażają podwójną kortę, marker niedojrzałych neuronów.Są to reprezentatywne obrazy zwierząt pozorowanych i po udarze mózgu z wstrzyknięciem lub bez wstrzyknięcia nerwowych komórek macierzystych po siedmiu dniach od wstrzyknięcia. Po 30 dniach od porodu tylko niewielka autofluorescencja może być wykryta przez kanał FITC u zwierząt, które otrzymują wstrzyknięcie do nośnika. Podczas gdy u zwierząt, którym wstrzyknięto komórki macierzyste, neuronalne komórki macierzyste znakowane GFP można znaleźć w uszkodzonym mózgu z ekspresją różnych markerów komórkowych, takich jak marker gleo GFP lub marker neuronalny tujuan.Białe strzałki na każdym obrazie wskazują neuronalne komórki macierzyste wykazujące ekspresję odpowiednio markerów GFP lub tujuan. Podsumowując, wstrzyknięcie dotętnicze jest wykonalną metodą dostarczania nerwowych komórek macierzystych do terapii udaru. Nerwowe komórki macierzyste mogą przetrwać i różnicować się w różne typy komórek w uszkodzonym mózgu.I wreszcie, wprowadzona tutaj metoda iniekcji dotętniczej może być również stosowana do dostarczania roztworów i zawiesin.

intra-arterial-delivery-neural-stem-cells-to-rat-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje niewirusową metodę dostarczania konstruktów genetycznych do określonego obszaru żywego mózgu gryzonia. Metoda obejmuje przygotowanie plazmidu, wykonanie mikropipety, operację na noworodkach szczura, mikroiniekcję konstruktu oraz elektroporację in vivo.

Dostarczanie genów do postnatalnego mózgu szczura poprzez niekomorowe wstrzykiwanie plazmidów i elektroporację

Opisany w niniejszym protokole model wstrzykiwania autologicznej krwi w celu wywołania krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy wykorzystuje technikę podwójnego wstrzyknięcia, aby zminimalizować ryzyko refluksu krwi wzdłuż kanału igły, nie stosuje przeciwkrzepliwych w systemie pompowania oraz eliminuje całą przestrzeń martwą i rozszerzalne przewody w układzie.

Wtryskiwanie autologicznej krwi w celu modelowania spontanicznego krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy

Podwiązanie tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest techniką służącą do badania ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. W tej metodzie tętnica środkowa mózgu zostaje odsłonięta poprzez kraniotomię, a następnie podwiązana za pomocą kauteryzacji. Metoda ta zapewnia wysoką powtarzalność objętości zawału oraz zwiększoną przeżywalność pooperacyjną w porównaniu z innymi dostępnymi metodami.

Zastosowanie trwałego podwiązania środkowej tętnicy mózgowej u myszy

Przedkliniczne modele krwotoku śródmózgowego są wykorzystywane do naśladowania pewnych aspektów klinicznej choroby. W ten sposób można badać mechanizmy urazów i potencjalne strategie terapeutyczne. W tym protokole opisano dwa modele krwotoku śródmózgowego, doprążkowiowe (zwoje podstawy) iniekcje krwi autologicznej lub kolagenazy.

Doprążkowiowe wstrzyknięcie krwi autologicznej lub kolagenazy Clostridium jako mysie modele krwotoku śródmózgowego

Ten artykuł opisuje metodologię podawania krótkich okresów przerywanego niedotlenienia młodym myszom lub szczurom w dniach 1-8 po urodzeniu. Takie podejście skutecznie wywołuje silny "efekt primingu" na poziomie tkankowym na hodowanych nerwowych komórkach progenitorowych, które są zbierane w ciągu 30 minut od ekspozycji na hipoksję.

Dostarczanie in vivo ostrej przerywanej hipoksji u noworodków gryzoni do głównych kultur neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących ze strefy podkomorowej

Aby zbadać reorganizację mózgu w warunkach patologicznych, użyliśmy pomp miniosmotycznych do bezpośredniego dostarczania białka do mózgu, omijając barierę krew-mózg. Następnie wstrzykuje się znaczniki dróg oddechowych w celu zbadania zmian w połączeniach mózgowych pod wpływem białka.

Implantacja pomp miniosmotycznych i dostarczanie znaczników dróg oddechowych w celu zbadania reorganizacji mózgu w stanach patofizjologicznych

Komórki macierzyste są obiecującymi nośnikami terapeutycznymi w leczeniu guzów mózgu ze względu na ich wewnętrzny tropizm nowotworowy. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg i wykazuje duży potencjał w zakresie translacji klinicznej. W artykule podsumowano podstawowe zasady podawania donosowych komórek macierzystych w mysim modelu glejaka.

Donosowe podawanie terapeutycznych komórek macierzystych do glejaka w modelu mysim

Tutaj opisujemy metodę dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego szczura poprzez wszczepienie cewnika w śródoponową przestrzeń lędźwiową kręgosłupa. Koncentrujemy się na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych, chociaż ta metoda nadaje się również do dostarczania innych metod terapeutycznych.

Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura

Komórki macierzyste są stale badane jako potencjalne metody leczenia osób z uszkodzeniem mięśnia sercowego, jednak ich zmniejszona żywotność i retencja w uszkodzonej tkance może wpłynąć na ich długoterminową skuteczność. W tym manuskrypcie opisujemy alternatywną metodę dostarczania komórek macierzystych w mysim modelu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego.

Opóźnione dostarczanie komórek macierzystych do mięśnia sercowego po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym w modelu mysim

Naprawa tętnicy wewnątrzszyjnej w modelu mysim po wstrzyknięciu przywraca przepływ krwi do tętnicy bez negatywnego wpływu na dystrybucję wstrzykniętego materiału. Naprawa miejsca wstrzyknięcia ułatwia kolejne wstrzyknięcia przez tę samą tętnicę i zapobiega niedokrwieniu mózgu u szczepów myszy, które nie mają pełnego koła Willisa.

Ułatwienie powtórnych iniekcji do tętnicy szyjnej w modelach mysich za pomocą nowatorskiej techniki naprawy miejsca wstrzyknięcia

Poznaj metodę dotętniczego dostarczania komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy po niedokrwieniu. Technika ta umożliwia szeroką dystrybucję komórek nerwowych i ich wykrywanie do 30 dni, oferując obiecującą terapię udarową.

Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu

Przeglądaj więcej filmów