Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu
June 26th, 2020
Zgłaszana jest metoda dostarczania nerwowych komórek macierzystych, przystosowanych do wstrzykiwania roztworów lub zawiesin, przez wspólną tętnicę szyjną (mysz) lub tętnicę szyjną zewnętrzną (szczur) po udarze niedokrwiennym. Wstrzyknięte komórki są szeroko rozmieszczone w miąższu mózgu i można je wykryć do 30 dni po porodzie.
Udar mózgu jest główną przyczyną śmiertelności i niepełnosprawności na całym świecie. Chociaż tromboliza i chirurgiczne usunięcie niedrożności naczyń mózgowych mogą być wykonywane u wybranych pacjentów, nadal istnieje pilna potrzeba skutecznych terapii udaru mózgu. W tym miejscu demonstrujemy cewnikowe, dotętnicze dostarczanie komórek macierzystych do półkuli niedokrwiennej jako potencjalny schemat terapii udaru mózgu.
Najpierw przedstawiamy, jak przygotować cewnik iniekcyjny i haczyki chirurgiczne. Zaprojektowaliśmy dwa rodzaje cewników iniekcyjnych do iniekcji dotętniczej. Konstrukcja pierwsza służy do wstrzykiwania roztworu lub zawiesiny, która nie wymaga przepłukiwania probówki.
Konstrukcja druga umożliwia wstrzyknięcie nerwowych komórek macierzystych, a następnie przepłukanie martwej objętości w celu dostarczenia pełnej objętości. Do zbudowania zestawu cewników iniekcyjnych potrzebne będą igły o rozmiarze 26 i 20, cewnik MRE 25 o długości od 10 do 15 centymetrów oraz cewniki MRE 50 i MRE 10 o długości trzech centymetrów. Odetnij obie końcówki igieł i wypoleruj metalowy koniec papierem ściernym, aby ponownie otworzyć rurkę i wygładzić krawędzie, a następnie spłucz wodą destylowaną, aby oczyścić otwór i zmyć zanieczyszczenia.
Rysunek przedstawia zamknięty koniec igły o rozmiarze 20 po odcięciu końcówki igły, która po wypolerowaniu jest ponownie otwierana z gładkim otworem. Pod mikroskopem włóż igłę o rozmiarze 20 do końca rurki MRE 50. Zegnij igłę o rozmiarze 26, a następnie przebij rurkę poniżej końca końcówki igły o rozmiarze 20.
Zabezpiecz igłę o rozmiarze 26 za pomocą super kleju. Następnie osadź dwie piasty igły oraz rurkę i żywicę epoksydową, aby zbudować solidny blok zwiększający wytrzymałość. Potrzebne będą również trzy haczyki chirurgiczne, aby utrzymać tkankę w odpowiedniej pozycji, aby uzyskać lepszą ekspozycję miejsc operowanych.
Wytnij trzon igły o długości od półtora do dwóch centymetrów z igły o rozmiarze 27 i wypoleruj oba końce papierem ściernym, aż będzie matowy. Użyj małego hemostatycznego zacisku, aby zgiąć wałek w hak na jednym końcu i w kształcie pierścienia na drugim końcu. Przełóż cewnik MRE 25 o długości od 10 do 15 centymetrów przez pierścień i zabezpiecz przezroczystą taśmą chirurgiczną.
Zrób jeszcze dwa haczyki tą samą metodą. Haczyki i system cewników należy namoczyć przez noc w siedemdziesięcioprocentowym etanolu w celu sterylizacji. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Kentucky.
Używamy laryngologicznego embrionalnego mózgu myszy do hodowli GFP, dodatnich nerwowych komórek macierzystych. Zarodki GFP dodatnie można łatwo uwidocznić w kanale FITC pod mikroskopem fluorescencyjnym. Podczas gdy zarodki typu dzikiego nie wykazują fluorescencji przy tej samej ekspozycji.
Autofluorescencja zarodków typu dzikiego jest widoczna tylko wtedy, gdy czas ekspozycji wydłuża się 100-krotnie. Kora embrionalna jest pobierana i wykorzystywana do zakładania kultur nerwowych komórek macierzystych zgodnie z protokołem producenta. Te nerwowe komórki macierzyste mogą tworzyć neurosfery i mogą przechodzić przez 10 pokoleń i mogą różnicować się w neurony glejowe.
Panel markerów embrionalnych komórek macierzystych, takich jak nanog, SSEA1, Oct4 i Sox3, może być wykorzystany do identyfikacji właściwości komórek macierzystych w neurosferach. Neurosfery hodowano w pożywkach, zgodnie z protokołem producenta i stosowano między pasażami trzecim a piątym w celu dostarczania nerwowych komórek macierzystych. Udar niedokrwienny wywołano w lewej półkuli zarówno u myszy, jak i szczurów, przy użyciu opartej na włóknach okluzji środkowej tętnicy mózgowej, MCAO z pewnymi modyfikacjami w zależności od gatunku.
U myszy włókno jest wprowadzane przez tętnicę szyjną wspólną, CCA i wprowadzane do tętnicy szyjnej wewnętrznej, ICA. Podczas gdy u szczurów włókno jest wprowadzane przez tętnicę szyjną zewnętrzną, ECA do ICA ze względu na większą przestrzeń roboczą. Tutaj pokazujemy operację na myszach.
Po wykonaniu nacięcia w linii środkowej wzdłuż szyi oddziel leżące poniżej tkanki za pomocą rozwarstwienia. Użyj trzech haczyków mikrochirurgicznych wykonanych z trzonków igieł o rozmiarze 27, aby uzyskać lepsze pole widzenia. kwadrat wskazuje obszar operacyjny do następnego kroku.
Warstwa mięśniowa powyżej lewego CCA jest ostrożnie otwarta, aby odsłonić lewe CCA i nerw błędny. Podążaj za CCA, aż dotrzesz do bifurkacji i zidentyfikuj ją. Należy zachować ostrożność, aby nie rozciągać, nie przemieszczać ani nie ściskać tego CCA lub nerwu błędnego.
Ostrożnie otwórz przezroczystą tkankę łączną, zakrywającą CCA i nerw błędny. Zwolnij przestrzeń pod tym CCA za pomocą końcówki kleszczy i odizoluj trzpień CCA tak bardzo, jak to możliwe. Nawlecz dwuniciowy nylonowy sześcian chirurgiczny z plecionymi sześcioma O pod CCA.
Wytnij środkowy punkt, aby pozostawić szwy pod CCA. Umieść kolejny nylonowy szew pod CCA. Zawiąż węzeł ślizgowy na górnym szwie, utrzymując go luźnym.
Oddziel dwa dolne szwy. Zawiąż węzeł poślizgowy ze środkowym szwem, na razie trzymając go luźno. Zawiąż węzeł chirurgiczny dolnym szwem i przesuń go do bliższego końca tak daleko, jak to możliwe.
Przytnij końce szwów. Dalsze eksponowanie CCA poza bifurkacją. Dociśnij górny luźny węzeł ślizgowy do rozwidlenia i zaciśnij go, aby zapobiec cofaniu się krwi.
Połóż nylonowy szew MCAO pokryty gumą silikonową 70 obok CCA. Za pomocą mikronożyczek wytnij małe nacięcie na CCA, obok dolnego węzła. Włóż końcówkę szwu MCAO do CCA przez to nacięcie i przesuń ją do górnego węzła.
Dostosuj położenie środkowego węzła i zaciśnij go, aż będzie mógł utrzymać szew MCAO na miejscu. Nie zaciskaj nadmiernie węzła. Zwolnij górny węzeł, ale w tym samym miejscu wykonaj kolejny luźny węzeł poślizgowy.
Wsuń szew MCAO do ICA. Upewnij się, że szew MCAO przechodzi przez rozwidlenie do ICA. Ścieżka szwu powinna być stosunkowo prosta, wchodząc głębiej w tkankę w miarę jej postępu.
Sprawdź srebrny marker na końcu szwu. Upewnij się, że dociera do rozwidlenia. Sprawdź ponownie kierunek szwu MCAO.
Wyreguluj górne i środkowe węzły, aby upewnić się, że nie ma wycieku krwi. Dalej przesuwaj szew MCAO, zaciśnij dwa górne węzły, aby zabezpieczyć szew MCAO na miejscu. Rozpocznij rejestrowanie czasu dla jednej godziny niedokrwienia.
Po godzinie niedokrwienia znieczulamy zwierzę i ponownie otwieramy ranę skóry. Odsłoń obszar operacyjny. Zlokalizuj górny i środkowy węzeł ślizgowy.
Delikatnie zwolnij górny węzeł. Delikatnie wyciągnij szew MCAO, aż biała część z gumy silikonowej dotrze do środkowego węzła. Zaciśnij górny węzeł, aby utrzymać szew MCAO na miejscu, aby uniknąć krwawienia.
Delikatnie zwolnij środkowy węzeł ślizgowy. Wyciągnij szew MCAO, aż jego koniec przejdzie przez górny węzeł. Zaciśnij górny węzeł.
Umieść środkowy węzeł ślizgowy tuż nad nacięciem na CCA. Dokręć środkowy węzeł ślizgowy. Usuń górny węzeł.
Przyciąć końce szwu środkowego węzła. Zamknij ranę skóry i pozwól zwierzęciu dojść do siebie. Opierając się na naszym doświadczeniu, nerwowe komórki macierzyste bezpiecznie wstrzykiwane tą drogą tętniczą w okresie od jednego do trzech dni po udarze.
Ponownie, istnieją niewielkie różnice między operacjami na myszach i szczurach w celu wstrzyknięcia nerwowych komórek macierzystych. A tutaj pokazujemy operację na myszach. W trzecim dniu po udarze należy znieczulić zwierzę, ponownie otworzyć ranę i ponownie odsłonić CCA.
Połóż dwuniciowy szew chirurgiczny pod CCA i przetnij go w środku, aby uzyskać dwa szwy. Umieść oba szwy prawidłowo. Zrób węzeł z górnym szwem.
Umieść go tuż pod rozwidleniem. Dokręć górny węzeł ślizgowy. Zrób kolejny węzeł ze środkowym szwem.
Wytnij małe nacięcie tuż nad przyciętym węzłem pozostałym po operacji udaru. Przyciąć końcówkę cewnika MRE 10 pod kątem około 45 stopni. Użyj tego ostrego końca, aby wejść w nacięcie na CCA.
Należy uważać, aby prawidłowo wyregulować kąt wejścia i siłę używaną do wprowadzenia cewnika. W przeciwnym razie cewnik może nie dostać się do CCA lub może go przebić. Włóż cewnik i przesuwaj, aż końcówka dotrze do górnego węzła.
Zaciśnij środkowy węzeł, aby utrzymać cewnik na miejscu i upewnić się, że nie ma połączenia krwi. Zwolnij górny węzeł. Zrób węzeł poślizgowy z górnym szwem.
Dostosuj kąt cewnika w CCA i pozycje obu węzłów, aż widoczny będzie szybki przepływ wsteczny krwi, co wskazuje na pomyślną komunikację między cewnikiem a przepływem CCA. Uruchomić pompę strzykawkową. Krew w cewniku zostanie wypłukana z powrotem do CCA.
Wstrzyknięcie należy przerwać po pięciu minutach. Podwiązywać górny węzeł. Zwolnij środkowy węzeł i wyjmij cewnik.
Podwiązuj środkowy węzeł. Przytnij wszystkie węzły. Zamknij ranę i pozwól zwierzęciu dojść do siebie.
Po wstrzyknięciu dotętniczym, nerwowe komórki macierzyste znakowane GFP znajdują się głównie w półkuli ipsilateralnej. Tutaj pokazujemy rozkład w zakręcie zębatym hipokampa po jednym dniu po wstrzyknięciu. W półkuli ipsilateralnej niektóre z dodatnich nerwowych komórek macierzystych GFP zlokalizowanych w korze i prążkowiu wyrażają podwójną kortę, marker niedojrzałych neuronów.
Są to reprezentatywne obrazy zwierząt pozorowanych i po udarze mózgu z wstrzyknięciem lub bez wstrzyknięcia nerwowych komórek macierzystych po siedmiu dniach od wstrzyknięcia. Po 30 dniach od porodu tylko niewielka autofluorescencja może być wykryta przez kanał FITC u zwierząt, które otrzymują wstrzyknięcie do nośnika. Podczas gdy u zwierząt, którym wstrzyknięto komórki macierzyste, neuronalne komórki macierzyste znakowane GFP można znaleźć w uszkodzonym mózgu z ekspresją różnych markerów komórkowych, takich jak marker gleo GFP lub marker neuronalny tujuan.
Białe strzałki na każdym obrazie wskazują neuronalne komórki macierzyste wykazujące ekspresję odpowiednio markerów GFP lub tujuan. Podsumowując, wstrzyknięcie dotętnicze jest wykonalną metodą dostarczania nerwowych komórek macierzystych do terapii udaru. Nerwowe komórki macierzyste mogą przetrwać i różnicować się w różne typy komórek w uszkodzonym mózgu.
I wreszcie, wprowadzona tutaj metoda iniekcji dotętniczej może być również stosowana do dostarczania roztworów i zawiesin.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia metodę dostarczania komórek macierzystych nerwowo-mózgowych przez wspólną tętnicę szyjną u myszy i zewnętrzną tętnicę szyjną u szczurów po udarze niedokrwiennym. Wstrzyknięte komórki wykazują szerokie rozprzestrzenienie się w mózgu i mogą być wykrywane przez do 30 dni po dostarczeniu, oferując potencjalną terapeutyczną drogę.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Terapia komórkowa
- Powrót do zdrowia po udarze
Tło
- Udar jest główną przyczyną śmiertelności i niepełnosprawności na całym świecie.
- Obecne terapie są ograniczone i istnieje potrzeba skutecznych alternatyw.
- Terapia komórkami macierzystymi daje nadzieję na powrót do zdrowia po udarze.
Cel badania
- Opracowanie metody opartej na cewnikach do śródtętniczego wprowadzania komórek macierzystych nerwowo-mózgowych.
- Zbadanie rozprzestrzeniania się i przeżywalności tych komórek w niedokrwionym mózgu.
- Zbadanie tej metody jako potencjalnego leczenia udaru niedokrwiennego.
Zastosowane metody
- Badanie wykorzystuje wstrzyknięcia oparte na cewnikach do dostarczania komórek macierzystych do mózgu.
- Komórki macierzyste nerwowo-mózgowe są hodowane z mózgu embrionalnego myszy i charakteryzowane.
- Udar niedokrwienny jest wywoływany za pomocą zmodyfikowanej metody okluzji środkowej tętnicy mózgowej (MCAO).
- Szczególne techniki chirurgiczne są szczegółowo opisane w kwestii implantacji cewnika i dostarczania komórek macierzystych.
- Monitorowane czasy wykrywania komórek rozciągają się do 30 dni po wstrzyknięciu.
Główne wyniki
- Komórki macierzyste nerwowo-mózgowe dostarczone przez wspólną/zewnętrzną tętnicę szyjną są szeroko rozprzestrzenione w mózgu.
- Komórki pozostają wykrywalne do 30 dni po dostarczeniu, co wskazuje na ich żywotność.
- Wnioski wskazują na zwiększone perspektywy powrotu do zdrowia pacjentów po udarze dzięki tej metodzie dostarczania.
Wnioski
- To badanie demonstruje żywotną metodę utrzymania komórek macierzystych nerwowo-mózgowych w mózgu po udarze.
- Metoda wykazuje potencjał dla postępów w terapii udaru z wykorzystaniem podejść opartych na komórkach.
- Podkreśla znaczenie eksploracji nowych dróg leczenia niedokrwiennego uszkodzenia mózgu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Intra-arterial delivery of neural stem cells offers a less invasive route with broader brain distribution compared to intracranial injection, addressing a key challenge in cell therapy for ischemic stroke. This approach supports target validation by enabling widespread engraftment in the ischemic hemisphere, which is critical for assessing therapeutic potential in preclinical models. The method enhances predictive confidence in stem cell survival and differentiation, providing a translatable platform for de-risking CNS-targeted regenerative therapies in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neural stem cell engraftment and distribution in the ischemic brain, supporting target validation through direct observation of cell localization near injury sites.
- Operational Value: Provides a reproducible surgical procedure for consistent delivery via carotid arteries, reducing variability in preclinical stem cell studies.
- Predictive Value: Facilitates assessment of long-term cell survival and differentiation up to 30 days, informing go/no-go decisions in stem cell therapy development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable GFP-labeled cell readouts across brain regions over time, enabling standardized assay development for stem cell biodistribution.
- Operational Value: Supports scalable catheter-based delivery compatible with high-content imaging workflows for tracking cell fate in rodent models.
- Assay Readiness: Produces diffuse, hemisphere-wide distribution that improves reliability of downstream functional and histological readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates differentiation of delivered neural stem cells into glial and neuronal lineages, supporting mechanistic de-risking of cell-based therapies.
- Translational Continuity: Enables evaluation of cell therapy effects from acute to chronic phases post-stroke, aligning with preclinical validation timelines.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides evidence of long-term engraftment without ectopic trapping in peripheral organs, improving safety profile assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The intra-arterial delivery method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing in ischemic models and supporting lead identification through quantifiable cell engraftment and differentiation outputs.
- Discovery Biology: Supports functional validation of neural stem cells by enabling delivery to the ischemic brain and tracking survival, migration, and differentiation.
- Screening: Generates reproducible, quantitative biodistribution data essential for assay standardization and cross-study comparison.
- Analytics: Provides time-resolved fluorescent readouts (GFP) that allow teams to compare engraftment efficiency across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects early engraftment data to long-term survival and lineage commitment, informing preclinical efficacy assessments.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized surgical platform adaptable to other cell types or therapeutic compounds, promoting cross-project utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by demonstrating widespread, sustained engraftment of neural stem cells in the target ischemic region.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible delivery via catheter-based technique, minimizing procedural variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, quantifiable evidence of cell survival and differentiation in disease-relevant models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of stem cell candidates by demonstrating durable brain engraftment without peripheral sequestration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques, including carotid artery isolation and catheter insertion.
- Depends on specialized instrumentation such as microsurgical hooks, suture materials, and fluorescence imaging systems for cell tracking.
- Necessitates cross-team standardization of surgical protocols to ensure consistency in stem cell delivery across studies.
- Involves adaptation considerations when translating between mouse and rat models due to anatomical differences in carotid access.
- Limited by the technical complexity of arterial catheterization, which may affect throughput in large-scale screening campaigns.
