Name: Proste wykrywanie rzęsek pierwotnych za pomocą immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji do wykrywania rzęsek pierwotnych w fibroblastach. Protokół obejmuje fiksację, barwienie i obrazowanie mikroskopowe, umożliwiając badanie wpływu stresu metabolicznego i promieniowania na struktury rzęskowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Obrony Republiki Czeskiej - Długoterminowy plan rozwoju organizacji Medyczne aspekty broni masowego rażenia Wydziału Wojskowych Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Obronnego; Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu, Republika Czeska (Konkretny Projekt Badawczy No: SV/ FVZ201703) oraz PROGRES Q40/06. Podziękowania należą się również Danielowi Diazowi za życzliwą pomoc w powtórce języka angielskiego.

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, roztworów i potraw
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie (22 x 22 mm). Przygotuj 6 dołków. Rozmrozić płodową surowicę bydlęcą (FBS) i antybiotyk penicylinę/streptomycynę i ogrzać pożywkę hodowlaną do temperatury pokojowej (RT). Użyj trypsyny-EDTA (0,25%) i 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z wapniem i magnezem), aby przejść przez komórki.</li>
	<li>Przygotować świeży 4% paraformaldehyd (PFA) w dH2O (800 mg PFA w 20 ml dH2O). PFA musi być świeżo przygotowany do każdego eksperymentu. Wymieszać i podgrzewać roztwór w temperaturze 55 °C przez 30 minut w okapie. Schłodzić w temperaturze pokojowej. Dodać 1 M wodorotlenek sodu, aż roztwór stanie się klarowny (pH = 7,2–7,4). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia. 
	Uwaga: PFA jest toksyczny; Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej i przygotuj się w kapturze chemicznym.</li>
	<li>Przygotuj 500 ml pożywki hodowlanej, DMEM (pożywka Dulbecco's Modified Eagle's Medium) zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 2% glutaminy.</li>
	<li>Przygotować 13 ml 1% roztworu żelatyny w sterylnym dH2O (130 mg żelatyny w 13 ml dH2O). Użyj 2 ml 1% żelatyny na każdą studzienkę w 6-dołkowej płytce. Utrzymuj sterylność.</li>
	<li>Wyczyść okap z przepływem laminarnym przy użyciu 70% etanolu. Umieść wymagany materiał w okapie z przepływem laminarnym przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa do barwienia immunocytochemicznego
<ol>
	<li>Rozmrozić komórki (w tym badaniu C2C12, MEF, NHLF i fibroblasty skóry) przy użyciu standardowych technik i umieścić je w kolbie T75 uzupełnionej ~10-12 ml przygotowanej pożywki. Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 / wilgotności względnej (RH), aż komórki osiągną 70% zbieżności.</li>
	<li>Wyjmij komórki z inkubatora i umieść je w okapie z przepływem laminarnym. Usuń pożywkę hodowlaną i krótko przepłucz komórki 2x 1x PBS. Dodać ~2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do kolby T75 i inkubować w temperaturze 37 °C przez ~5 min. Okresowo sprawdzaj pod mikroskopem odwróconym, aby monitorować odwarstwienie komórek. 
	UWAGA: Czas inkubacji zależy od linii komórkowej i dlatego musi być określony empirycznie.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić komórki w 10 ml pożywki hodowlanej, ostrożnie pipetując, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. W razie potrzeby ponownie przepłukać kolbę.</li>
	<li>Umieść zawiesinę komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i odwiruj przez 5 minut przy ~200 x g. Zdekantować supernatant, dodać 10 ml pożywki hodowlanej i delikatnie zawiesić osad. Pobrać 20 μl zawiesiny komórkowej i wymieszać w stosunku 1:1 z błękitem trypanowym i odliczyć w cytometrze zgodnie ze standardową metodą.</li>
	<li>Umieść jedno szkiełko nakrywkowe w każdym dołku płytki 6-dołkowej za pomocą pęsety. Pokryj szkiełka nakrywkowe żelatyną, wlewając ~ 2 ml do studzienek. Pomoże to komórkom przyczepić się do szkiełek nakrywkowych. Usuń roztwór żelatyny i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu na kilka minut. Szkiełka nakrywkowe są teraz gotowe do hodowli komórek. Natychmiast rozpocznij uprawę.</li>
	<li>Wysiewaj 100 000 fibroblastów do każdej studzienki i dodaj 2 ml pożywki hodowlanej. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C/5% CO2/90% wilgotności względnej. W tym momencie komórki mogą być poddawane obróbce zgodnie z potrzebami użytkownika. Zabiegi mające na celu wywołanie rzęski zostały wcześniej opisane4,5. 
	UWAGA: Początkowa liczba wysiewu zależy od czasu podwojenia komórek i powinna być odpowiednio określona.</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne rzęsek pierwotnych in vitro
<ol>
	<li>Podgrzej 4% paraformaldehyd do RT. Przygotuj pipety Pasteura, 1x PBS (RT), pojemnik na odpady, 15 ml stożkowe probówki, mikropipety (0,5–10 μl, 20–200 μl i 100–1 000 μl) i końcówki. Pobrać komórki z inkubatora i umieścić je na ławce. 
	UWAGA: Procedura barwienia nie musi być wykonywana w sterylnych warunkach. Wszystkie rozwiązania muszą znajdować się w RT.</li>
	<li>Usuń media z każdej studzienki. Pozostaw szkiełko nakrywkowe w studzience. Bardzo delikatnie umyj komórki 3x 2 ml 1x PBS. Za pomocą pipety Pasteura dodaj 2 ml 4% PFA do każdej studzienki, aby utrwalić komórki. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć PFA i przemyć 3x 1x PBS. 
	UWAGA: W okresie inkubacji należy zawsze użyć wystarczającej objętości, aby pokryć całe szkiełko nakrywkowe. Nigdy nie pozwól, aby komórki wyschły. Nigdy nie wylewaj żadnego z roztworów bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Przygotować 0,5% Triton X-100 w 13 ml 1x PBS 10 minut przed użyciem. Dodaj 2 ml do każdej studzienki. Inkubować przez 15 minut. Umyj delikatnie 4x z 1x PBS. 
	UWAGA: Triton X-100 jest nierozpuszczalny w PBS w temperaturze pokojowej. Podgrzej 0,5% roztwór Triton X-100 do temperatury 37 °C w łaźni wodnej, aby go rozpuścić.</li>
	<li>Rozmrozić kozią surowicę 5 minut przed użyciem. Rozcieńczyć kozią surowicę w 1x PBS w stosunku 1:20 jako roztwór blokujący. Dodać 150 μl do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować przez 20 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: W razie potrzeby wydłuż okres blokady do 60 minut. Nie myj komórek po zablokowaniu kozią surowicą.</li>
	<li>Rozmrozić przeciwciała pierwszorzędowe (tj. antyacetylowaną alfa-tubulinę i anty-gamma tubulinę) 5 minut przed użyciem. Rozcieńczyć przeciwciała oddzielnie w 1x PBS w następujący sposób: mysia antyacetylowana alfa tubulina w stosunku 1:800 i królicza anty-gamma tubulina w stosunku 1:300. Usuń roztwór blokujący. Nie prać. Dodać 150 μl obu rozcieńczeń przeciwciał do szkiełek nakrywkowych i inkubować przez 60 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: W przypadku inkubacji przez noc należy użyć 500–1 000 μl roztworów przeciwciał pierwotnych, uszczelnić płytkę 6-dołkową folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C. Alternatywnie należy użyć 150 μl przeciwciała i inkubować w komorze wilgotnościowej.</li>
	<li>Usuń przeciwciała pierwszorzędowe. Umyj szkiełka nakrywkowe bardzo delikatnie 3x za pomocą 2 ml 1x PBS. Przygotuj przeciwciała drugorzędowe w 1x PBS, oddzielnie rozcieńczając Cy3 anty-mysi owiec i kozy Alexa Fluor488 anty-królika w stosunku 1:300. Dodać 150 μl obu rozcieńczeń przeciwciał drugorzędowych do szkiełek nakrywkowych. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. 
	UWAGA: Inkubuj w ciemności, aby uniknąć fotowybielania. W razie potrzeby można zastosować inne kombinacje przeciwciał drugorzędowych.</li>
	<li>Przygotuj roztwór DAPI (4', 6-diamidyno-2-fenyloindol) zgodnie z instrukcjami producenta. Nadmiar porcji przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć 10 μl z podwielokrotności podstawowej (1:5 000) w 50 ml 1x PBS. Dodać 2 ml tego rozcieńczenia do szkiełek nakrywkowych. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. 
	UWAGA: Ważne jest, aby inkubować komórki w ciemności, aby uniknąć fotowybielania. Rozcieńczenie DAPI można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Przygotuj 2 igły, szkiełka, pęsety i podłoża montażowe. Oznacz slajdy etykietami.</li>
	<li>Usuń roztwór DAPI ze studzienek. Umyć 3x za pomocą 1x PBS. Umieść jedną kroplę nośnika montażowego na każdym szkiełku. Użyj igły, aby delikatnie podnieść szkiełko nakrywkowe z dna studzienki. Odwróć szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety i delikatnie umieść je na kropli nośnika montażowego. Ostrożnie usuń wszelkie bąbelki.</li>
	<li>Chroń szkiełka przed światłem i przechowuj je przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Użyj mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego o dużym powiększeniu, aby uwidocznić rzęski pierwotne. 
	UWAGA: Szkiełka można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.</li>
</ol>

<ol><li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+primary+cilia%3A+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells%2C+but+a+%22sleeping+beauty%22+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Primary+cilia%22">Primary cilia</a>. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).</li>
<li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li>
<li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li>
<li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).</li>
<li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li>
<li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+show+a+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li>
<li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption%2C+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li>
<li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase%2C+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li>
<li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cilium%3A+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li>
<li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autophagy-Cilia+Axis%3A+An+Intricate+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905(2019).</li>
<li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtt%2C+C+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).</li>
<li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li>
<li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+%28ACDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1(2019).</li>
<li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKim%2C+JH+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22">Biochimica et Biophysica Acta</a>. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).</li>
<li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer%3A+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li>
<li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li>
<li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).</li>
<li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5(2017).</li>
<li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11(2015).</li>
<li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kilku autorów opisało różne metody wykrywania rzęsek pierwotnych, czasami opisując również różne metody utrwalania, które mogą wpływać na ich wykrywanie 6,20,21,22. Niezależnie od tego trudno jest znaleźć kompletny i prosty protokół wykrywania. Łatwa dostępność takiej metody byłaby niewątpliwie bardzo pomocna w badaniu rzęsek pierwotnych, zwłaszcza we wczesnych etapach badań lub w szybkiej i ł...

Pierwotne rzęski to czuciowe, pojedyncze, związane z błoną, nieruchome struktury związane z macierzystą centriolem komórki. Rzęski pierwotne znajdują się na większości komórek kręgowców, z wyjątkiem czerwonych krwinek, adipocytów1 i hepatocytów2. Rzęski pierwotne powstają jako wydłużony aksonem złożony z mikrotubul, którego głównym składnikiem jest α-tubulina. Aksonem wyrasta z ciała podstawnego, które jest zbudowane z γ-tubuliny. Długość rzęsek pierwotnych waha się od 2 do 10 μm; Jednak jego wymiary mogą ulec zmianie podczas glicylacji, głodu, niedotlenienia, stresu cytotoksycznego lub po ekspozycji na promieniowanie jonizujące3,4,5,6,7. Zazwyczaj komórki mają tylko jedną rzęskę pierwotną, która bierze udział w morfogenezie i szlakach sygnalizacji komórkowej ważnych dla proliferacji i różnicowania komórek8,9.
Pierwotne rzęski są dynamicznie regulowane podczas progresji cyklu komórkowego, szczególnie podczas faz G0/G1, i resorbowane przed wejściem w mitozę w procesie związanym z deacetylacją tubuliny, w której pośredniczy HDAC6 (deacetylaza histonów 6)10. Dokładny moment resorpcji rzęsek pierwotnych zależy od typu komórki i ekspresji genów bezpośrednio zaangażowanych w ten proces, takich jak Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. W zależności od typu komórki, rzęski pierwotne wyrażają różne typy receptorów, kanałów jonowych i aktywnych szlaków sygnałowych. Należą do nich najważniejsze receptory sygnałowe wpływające na proliferację i przeżycie, EGFR, PDGFR i FGFR. Uwzględniono również niektóre szlaki sygnałowe, które mogą wpływać na funkcję jednego lub więcej narządów, w tym Hedgehog, Notch i Wnt. Dzięki tym receptorom i szlakom sygnałowym rzęski pierwotne pełnią również funkcję chemosensoryczną. Ta funkcja umożliwia rzęskom pierwotnym wykrywanie specyficznych ligandów dla Notch, hormonów i substancji biologicznie czynnych, takich jak serotonina lub somatostatyna. Inne specyficzne funkcje wykazywane przez rzęski pierwotne o różnej długości obejmują reakcję na zmiany temperatury, grawitacji i osmolalności14.
Pierwotne rzęski mogą być wizualizowane za pomocą różnych metod, takich jak wizualizacja na żywo, transmisyjna mikroskopia elektronowa, obrazowanie 3D, lub za pomocą oprogramowania do automatycznego wykrywania rzęsek pierwotnych5,15,16,17. Metody te są jednak wysoce specjalistyczne, a trwające badania wymagają podstawowych, szybkich i łatwych metod barwienia rzęsek pierwotnych na każdym etapie badań. Opisana jest łatwa i użyteczna metoda wykrywania rzęsek pierwotnych w hodowanych komórkach.

<table><tbody><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>TPP</td><td>92406</td><td>Wymiary 128x86x22 mm</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-546-047</td><td>AffiniPure F(ab')? Fragment kozy anty-króliczej IgG</td></tr><tr><td>antytubuliny i gamma;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>Poliklonalny królik anty-mysi IgG2a</td></tr><tr><td>C2C12</td><td></td><td>ATCC CRL-1772</td><td>Myoblast (mysz)</td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2181</td><td>Anti-Mouse IgG (cała cząsteczka) F(ab&prime;)2 fragment&ndash; Przeciwciało Cy3 wytwarzane u owiec</td></tr><tr><td>Dapi (dichlorowodorek 4&,6-diamidyn-2-fenyloindolu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s Zmodyfikowany orzeł i ostry; s medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>11960044</td><td>Wysoka zawartość glukozy, Bez glutaminy, Gibco</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>z MgCl2 i CaCl2, Sterylnie filtrowany, Nadaje się do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000044</td><td>Sterylnie filtrowana, Gibco</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEF</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1039</td><td>Mysi fibroblast zarodkowy</td></tr><tr><td>Monoklonalna antyacetylowana tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>Monoklonalne przeciwciało antyacetylowane tubuliny wytwarzane u myszy</td></tr><tr><td>NHLF</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td>Pierwotne fibroblasty płuc (ludzkie)</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny na ml w 0,9% NaCl, sterylnie filtrowany</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Anti Blaknięcie Mountant</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasty skóry</td><td>Uprzejmie podarowany z Uniwersytetu Karola, Wydziału Lekarskiego w Hradec Kr&aacute; Miłość&eacute;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe kwadratowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>22X22-1,5</td><td>Szkło borokrzemowe, 22x22mm, kwadratowe</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200072</td><td>Sterylnie filtrowane, Gibco</td></tr></tbody></table>

proste wykrywanie rzęsek pierwotnych za pomocą immunofluorescencji

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Pierwotne rzęski są dynamicznie regulowane podczas progresji cyklu komórkowego, szczególnie podczas faz G0/G1 cyklu komórkowego, będąc resorbowane przed mitozą. Rzęski pierwotne można wizualizować za pomocą wysoce wyrafinowanych metod, w tym transmisyjnej mikroskopii elektronowej, obrazowania 3D lub za pomocą oprogramowania do automatycznego wykrywania rzęsek pierwotnych. Jednak do wykonania tych metod potrzebne jest barwienie immunofluorescencyjne rzęsek pierwotnych. W niniejszej publikacji opisano protokół łatwego wykrywania rzęsek pierwotnych in vitro poprzez barwienie acetylowanej alfa tubuliny (aksonem) i gamma tubuliny (ciało podstawne). Ten protokół barwienia immunofluorescencyjnego jest stosunkowo prosty i daje wysokiej jakości obrazy. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób cztery linie komórkowe (C2C12, MEF, NHLF i fibroblasty skóry) wyrażające rzęski pierwotne zostały utrwalone, wybarwione immunologicznie i zobrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego.

Barwienie immunofluorescencyjne rzęsek pierwotnych jest stosunkowo prostą procedurą, która pozwala na uzyskanie wysokiej jakości obrazów. W ramach tych eksperymentów fibroblasty wykazujące obecność rzęsek pierwotnych zostały utrwalone, poddane immunostainingowi i zobrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Rzęskę pierwotną wykryto z wykorzystaniem acetylowanej α-tubuliny oraz γ-tubuliny. Ocena rzęsek pierwotnych może być przeprowadzana na różnych poziomach, a...

Pierwotne rzęski to struktury zewnątrzkomórkowe związane z centriolem. Pierwotne wykrywanie rzęsek za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego jest stosunkowo prostą procedurą, która pozwala uzyskać obrazy o niezwykle wysokiej jakości. W tym protokole fibroblasty wyrażające rzęski pierwotne zostały utrwalone, wybarwione immunologicznie i zobrazowane w mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym.

Proste wykrywanie rzęsek pierwotnych za pomocą immunofluorescencji

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Protokół ten pozwala na szybkie i łatwe wykrycie rzęsek pierwotnych w hodowanych komórkach w ramach różnych przedsięwzięć badawczych. Metoda może być stosowana w zaburzeniach, które wpływają na podstawowe ciała rzęsek pierwotnych. Procedura ta może być również stosowana do barwienia rzęsek pierwotnych w tkance zatopionej w parafinie lub do innych eksperymentów, w których potrzebna jest fluorescencja.Rozpocznij od autoklawowania szkiełek nakrywkowych o wymiarach 22 na 22 milimetry i przygotowania materiałów do eksperymentu. Rozmrozić FBS i penicylinę streptomycynę i ogrzać pożywkę hodowlaną do temperatury pokojowej. Pasaż komórki za pomocą trypsyny, EDTA i PBS.Przygotuj świeży 4% paraformaldehyd, pożywkę hodowlaną i 1% roztwór żelatyny, zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Następnie wyczyść okap z przepływem laminarnym 70% etanolem i umieść w nim wszystkie wymagane materiały. Paraformaldehyd jest niezwykle niebezpieczny.Przez cały czas należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej, które należy nosić wyłącznie w kapturze chemicznym. Po wyhodowaniu pożądanych komórek do 70% konfluencji wyjmij je z inkubatora i umieść w okapie z przepływem laminarnym. Usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przepłukać komórki PBS.Dodaj około dwóch mililitrów 0,25% trypsyny EDTA do kolby hodowlanej i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Okresowo sprawdzaj komórki pod odwróconym mikroskopem, aby monitorować odwarstwienie. Gdy komórki się odłączą, delikatnie zawieś je ponownie w 10 mililitrach pożywki hodowlanej, ostrożnie pipetując, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwiruj ją przy 200 razy G' przez pięć minut. Zdekantować supernatant, a następnie dodać 10 mililitrów pożywki hodowlanej i delikatnie ponownie zawiesić osad. Weź 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i wymieszaj ją z błękitem trypanowym w stosunku objętościowym jeden do jednego.Następnie policz komórki za pomocą standardowej hemocytometrii. Umieścić szkiełko nakrywkowe w każdym dołku płytki sześciodołkowej i pokryć szkiełko nakrywkowe dwoma mililitrami roztworu żelatyny, który pomoże komórkom przyczepionym do szkiełka nakrywkowego. Usuń żelatynę i pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut.Wysiewaj 100 000 fibroblastów do każdej studzienki i dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej. Następnie inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięciu procentach dwutlenku węgla i 90% wilgotności względnej. Po inkubacji potraktuj komórki w celu wywołania rzęskowości.Podgrzej 4% paraformaldehyd do temperatury pokojowej i przygotuj pipety pastwiskowe, ABS, pojemnik na odpady, 15-mililitrowe stożkowe probówki, mikropipety i końcówki. Wyjmij komórki z inkubatora i umieść je na stole laboratoryjnym. Usuń nośnik z każdej studzienki, pozostawiając szkiełko nakrywkowe.Delikatnie umyj komórki trzy razy dwoma mililitrami PBS. Następnie dodaj dwa mililitry 4% PFA do każdej studzienki, aby utrwalić komórki. Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, następnie usunąć PFA i powtórzyć mycie z PBS.Dodaj dwa mililitry 0,5% Triton X-100 do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez 15 minut. Następnie umyj studzienki czterokrotnie PBS. Aby przygotować roztwór blokujący, rozmrażaj kozią surowicę przez pięć minut i rozcieńczaj ją w PBS w stosunku od 1 do 20.Dodać 150 mikrolitrów tego roztworu do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować płytkę przez 20 minut. Rozmrażać pierwszorzędowe przeciwciała przez pięć minut i rozcieńczać je oddzielnie w PBS, jak opisano w manuskrypcie tekstu. Usunąć roztwór blokujący ze szkiełek nakrywkowych i dodać 150 mikrolitrów obu roztworów przeciwciał.Następnie inkubuj płytkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i delikatnie umyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie dwoma mililitrami PBS. Rozcieńczyć Cy3 Sheep Anti-Mouse i Alexa fluor 488 Goat anti-Rabbit w PBS, w stosunku jeden do 300, i dodać 150 mikrolitrów obu drugorzędowych roztworów przeciwciał do szkiełka nakrywkowego.Przygotować roboczy roztwór DAPI, rozcieńczając 10 mikrolitrów wywaru w 50 mililitrach PBS i dodać dwa mililitry tego rozcieńczenia do szkiełek nakrywkowych. Inkubować płytkę przez pięć minut w ciemności, w temperaturze pokojowej. Przed umieszczeniem szkiełek nakrywkowych na szkiełkach należy przygotować dwie igły, pęsetę i nośniki montażowe, a następnie oznaczyć wszystkie szkiełka.Usuń roztwór DAPI ze studzienek i umyj je trzykrotnie PBS. Umieść jedną kroplę nośnika montażowego na każdym szkiełku. Użyj igły, aby delikatnie podnieść szkiełko nakrywkowe z dna studzienki.Następnie odwróć go i delikatnie umieść na kropli nośnika montażowego za pomocą pęsety. Ostrożnie usuń wszelkie bąbelki. Chroń szkiełka przed światłem i przechowuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia użyj mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego o dużym powiększeniu, aby uwidocznić rzęski pierwotne. Protokół ten został wykorzystany do utrwalenia immunostainu i zobrazowania różnych linii komórkowych wyrażających rzęski pierwotne. Gdy mysie mioblasty były wystawione na promieniowanie jonizujące w różnych dawkach, stwierdzono, że wyższe dawki indukują pojawienie się wielu rzęsek pierwotnych.Podczas gdy niskie dawki powodowały pojawienie się pojedynczych rzęsek pierwotnych. Podobnie, gdy ludzkie fibroblasty płuc były napromieniowywane niską dawką, pojedyncze rzęski pierwotne wykrywano za pomocą immunofluorescencji. Wzrost rzęsek pierwotnych zaobserwowano w fibroblastach embrionalnych myszy, które były głodzone, co pokazuje, że stres metaboliczny wpływa na incydenty rzęsek pierwotnych.Kiedy fibroblasty skóry były traktowane 120 nanomolową doksorubicyną, wykazywały ekspresję pojedynczej rzęski pierwotnej. Wyższe dawki wywołują pojawienie się wielu rzęsek pierwotnych. Fibroblasty traktowane 1,25 nanomolowym taksolem również wykazywały ekspresję pojedynczej rzęski pierwotnej.Ale wiele rzęsek nie zostało wykrytych po leczeniu wyższymi dawkami. Otwierając ten protokół, upewnij się, że przestrzegasz wszystkich przepisów dotyczących środków ochrony osobistej. Należy pamiętać o potrzebach hodowlanych wybranej linii komórkowej i starannie dobierać przeciwciała.Ta procedura nie może być bezpośrednio następowana przez inne procedury, ponieważ komórki są nieodwracalne. Zamiast tego należy zaprogramować równoległe eksperymenty.

simple-detection-of-primary-cilia-by-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej

Rzęski węchowych neuronów czuciowych zawierają białka kaskady transdukcji sygnału, ale szczegółowa analiza przestrzenna ich rozmieszczenia jest trudna w kriosekcjach. Opisujemy tutaj zoptymalizowane podejście do znakowania całego mocowania i wizualizacji en face białek rzęskowych.

Znakowanie całego mocowania rzęsek w głównym układzie węchowym myszy

Tutaj prezentujemy protokół oparty na immunohistologicznej detekcji białka c-FOS, klasycznej technice używanej do identyfikacji populacji neuronów zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo.

Wykrywanie immunohistologiczne białka c-FOS: użyteczne narzędzie jako marker centralnych szlaków zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo

Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.

Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Wykorzystanie sztucznej inteligencji (Ai) do analizy obrazów jawi się jako potężne, mniej stronnicze i szybkie podejście w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami. Tutaj wyszkoliliśmy Ai, aby rozpoznawała organellę komórkową, pierwotne rzęski i analizowała właściwości, takie jak długość i intensywność barwienia, w rygorystyczny i powtarzalny sposób.

Podejścia sztucznej inteligencji do oceny rzęsek pierwotnych

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych

Szybka analiza mikroskopii wideo jest stosunkowo łatwym do przeprowadzenia, szybkim, opłacalnym i, w doświadczonych rękach, znacznie niezawodnym narzędziem do diagnostyki pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek, które powinno być dostępne w każdym ośrodku zajmującym się diagnostyką i leczeniem ciężkich chorób płuc.

Szybka analiza wideomikroskopii w diagnostyce pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek

Ta metoda opisuje wykorzystanie endogennego sygnału w transgenicznym modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2 do obrazowania pierwotnych rzęsek in situ, w trzech wymiarach na dużych obszarach zmineralizowanej tkanki, od pobrania tkanki do analizy organizacji rzęsek. Protokół ten może być również stosowany do innych rodzajów tkanek.

Obrazowanie wolumetryczne i analiza rzęsek pierwotnych w tkance mięśniowo-szkieletowej przy użyciu modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2

Zaburzenia laminopatii często prowadzą do zmian w otoczce jądrowej, co może powodować pęcherzyki jądrowe i wycieki. W badaniu przedstawiono metodę immunofluorescencji do wizualizacji blaszki jądrowej wraz z dwuniciowym DNA (dsDNA), zapewniając środki do oceny struktury i integralności jądra w komórkach ssaków.

Wykrywanie pęcherzyków jądrowych i wycieku DNA w komórkach ssaków za pomocą immunofluorescencji

Poznaj metodę immunofluorescencji do wykrywania rzęsek pierwotnych w fibroblastach. Protokół obejmuje fiksację, barwienie i obrazowanie mikroskopowe, umożliwiając badanie wpływu stresu metabolicznego i promieniowania na struktury rzęskowe.

Proste wykrywanie rzęsek pierwotnych za pomocą immunofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów