Name: Zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami Aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji zarodników Aspergillus do mózgu tylnego larw Danio rerio w celu wizualizacji odpowiedzi immunologicznej w czasie rzeczywistym. Ta technika umożliwia badanie interakcji patogen-gospodarz i odkrywanie nowych celów terapeutycznych w zakażeniach grzybiczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem nagrody K22AI134677. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

<ol><li>Latge, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus+and+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus and aspergillosis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).</li>
<li>Denning, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Invasive aspergillosis.</a> Clinical Infectious Diseases. 26 (4), 781-803 (1998).</li>
<li>Dagenais, T. R., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Aspergillus+fumigatus+in+Invasive+Aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).</li>
<li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillosis+case-fatality+rate%3A+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).</li>
<li>Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+animal+models+of+aspergillosis+in+studying+immunity+against+Aspergillus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Mycologie+M%C3%A9dicale%22%5BJournal%5D)">Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections.</a> Journal de Mycologie Médicale. 29 (1), 84-96 (2019).</li>
<li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).</li>
<li>Behnsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+dimensionality+controls+the+interaction+of+phagocytes+with+the+pathogenic+fungi+Aspergillus+fumigatus+and+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 13(2007).</li>
<li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Infection%3A+From+Pathogenesis+to+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li>
<li>Rosowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Host+for+Invasive+Fungal+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections.</a> Journal of Fungi. 4 (4), (2018).</li>
<li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).</li>
<li>Knox, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+phagocyte+responses+to+Aspergillus+fumigatus+conidia+and+hyphae+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae.</a> Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).</li>
<li>Rosowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+inhibit+Aspergillus+fumigatus+germination+and+neutrophil-mediated+fungal+killing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing.</a> PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229(2018).</li>
<li>Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus+establishes+infection+in+zebrafish+by+germination+of+phagocytized+conidia%2C+while+Aspergillus+niger+relies+on+extracellular+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12791(2019).</li>
<li>Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-glucan-dependent+shuttling+of+conidia+from+neutrophils+to+macrophages+occurs+during+fungal+infection+establishment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000113(2019).</li>
<li>Herbst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis-dependent+activation+of+a+TLR9-BTK-calcineurin-NFAT+pathway+co-ordinates+innate+immunity+to+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).</li>
<li>Shah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+Orchestrates+Lateral+Transfer+of+Aspergillus+fumigatus+during+Macrophage+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenate+sensitivity+of+a+laeA+mutant+is+restored+by+overexpression+of+the+bZIP+protein+MetR+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus.</a> Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifunctional+Small+Molecules+Enhance+Neutrophil+Activities+Against+Aspergillus+fumigatus+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro.</a> Frontiers in Immunology. 10, 644(2019).</li>
<li>Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+voriconazole+against+A.+fumigatus+infection+depends+on+host+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).</li>
<li>Herbst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+clinically+relevant+murine+model+of+solid-organ+transplant+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis.</a> Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).</li>
<li>Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+immune+cell+clearance+of+Aspergillus+fumigatus+spores+and+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae.</a> Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).</li>
<li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+Imaging+of+the+Innate+Immune+Response+in+a+Zebrafish+Larval+Model+of+Streptococcus+iniae+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52788(2015).</li>
<li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transparent+zebrafish%3A+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).</li>
<li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zWEDGI%3A+Wounding+and+Entrapment+Device+for+Imaging+Live+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Live+Imaging+Device+for+Improved+Experimental+Manipulation+of+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56340(2017).</li>
<li>Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+Antifungal+Drug+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Clinical+Microbiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Update on Antifungal Drug Resistance.</a> Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).</li>
</ol>

Brak konfliktów lub interesów finansowych do ujawnienia.

Opisany tutaj model infekcji jest korzystny dla analizy odpowiedzi immunologicznej gospodarza, interakcji gospodarz-patogen i patogenezy grzybów 12,13,14,15. Informacje te można uzyskać z obrazowania w wysokiej rozdzielczości patogenów znakowanych fluorescencyjnie i komórek gospodarza13, przeżywalności larw i trwałości CFU w czasie.
Technika mikroiniekcji ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego protokołu i może wymagać dostosowania w przypadku korzystania z różnych urządzeń i konfiguracji do mikroiniekcji. W szczególności ciśnienie i czas wstrzyknięcia to dwie główne zmienne, które można regulować, aby zapewnić, że objętość wyrzucana przez igłę wynosi ~3 nL. Rozmiar igły, określony przez przycięcie jej kleszczami, reguluje również liczbę wstrzykiwanych zarodników; Chociaż większy otwór może spowodować uszkodzenie tkanek larwy. Z drugiej strony, zbyt mały otwór nie pozwoli stosunkowo dużym zarodnikom (>2 μm) na zewnątrz i może prowadzić do zatkania igieł. W takim przypadku igłę można odchylić, aby uzyskać nieco większy otwór.
Inne protokoły mikroiniekcji bakterii wykorzystują PVP-40, aby pomóc w utrzymaniu jednorodnej mieszaniny iniekcyjnej, ale nie znaleźliśmy żadnej korzyści w stosowaniu tego nośnika z zarodnikami Aspergillus . Zatkanie igły można złagodzić, dokładnie mieszając preparat grzybowy, aby rozbić wszelkie grudki przed załadowaniem igły. Czasami zatkanie igły może również zostać usunięte poprzez tymczasowe zwiększenie ciśnienia lub czasu wstrzyknięcia i uruchomienie mikrowstrzykiwacza, gdy igła znajduje się w płynie otaczającym larwy. Następnie ciśnienie i czas wtrysku należy ponownie zmniejszyć do poprzednich poziomów. W innych przypadkach nie można usunąć zatoru i należy załadować nową igłę i ponownie skalibrować.
Protokół ten ma na celu wstrzyknięcie ~ 30–70 zarodników na larwę. Wiadomo, że w oparciu o stężenie preparatu zarodnikowego i wstrzykniętą objętość, liczba ta jest dość niska. Stwierdzono jednak empirycznie, że jest to liczba zarodników wstrzykniętych w tych warunkach. Nie wiadomo, dlaczego występuje ta różnica, ale może to być spowodowane zbrylaniem się zarodników w igle. Nasze własne próby wstrzyknięcia większej liczby zarodników były w dużej mierze nieskuteczne.
Aby upewnić się, że wstrzykuje się około 30–70 zarodników i utrzymać spójność wstrzyknięć we wszystkich larwach, należy sprawdzić liczbę zarodników, wstrzykując je do E3 otaczającego larwy. Powtarzaj to co pięć do sześciu larw we wszystkich wstrzyknięciach. Jeśli liczba zarodników wydaje się zmieniać, ciśnienie i/lub czas wstrzykiwania można dostosować, aby wstrzyknąć stałą liczbę zarodników do wielu larw. Należy jednak zachować ostrożność, aby dawka do wstrzykiwań pozostała głównie w tyłomózgowiu i nie wypełniała śródmózgowia i przodomózgowia.
Aby zapewnić miejscową infekcję, zawiesina zarodników powinna znajdować się w komorze tylnego mózgu. Można to uwidocznić za pomocą czerwonego zabarwienia fenolowego tuż po wstrzyknięciu, chociaż czerwony kolor rozprasza się z czasem. W przypadku wstrzyknięć obszar wokół pęcherzyka usznego służy do przebicia i dotarcia do komory pod kątem 45°–65°. Obszar ten nie ma głównych naczyń krwionośnych, powoduje mniejsze uszkodzenia tkanek i goi się natychmiast. Jeśli skóra nad komorą zostanie przebita, zawiesina zarodników może wyciekać, ponieważ igła, która musi być używana do wstrzykiwań zarodników Aspergillus , jest większa niż ta, która jest używana do zawiesin bakteryjnych. Nieskutecznie wstrzyknięte lub przypadkowo uszkodzone larwy można oznaczyć, kilkakrotnie wstrzykując do żółtka w celu utworzenia czerwonego znaku lub przeciągając larwę z rzędu za pomocą igły. Po wykonaniu zestawu wstrzyknięć larwy te należy usunąć i zutylizować, zanim reszta zostanie zmyta z płytki. E3 bez błękitu metylenowego służy do znieczulania larw przed wstrzyknięciem, a także do zatrzymywania larw po wstrzyknięciach, ponieważ błękit metylenowy działa przeciwgrzybiczo.
W momencie wstrzyknięcia liczba CFU reprezentuje liczbę żywotnych zarodników w zakażonym gospodarzu. Jeśli jednak zarodniki wykiełkują w strzępki, mogą one zostać rozbite na oddzielne żywotne "jednostki grzybowe" podczas homogenizacji i mogą dać początek wielu koloniom. Lub nieprzerwana wielokomórkowa strzępka może dać początek pojedynczej kolonii, co skutkuje uśrednionym, ale nieprecyzyjnym przedstawieniem obciążenia grzybami. Można temu zapobiec, łącząc liczbę CFU z mikroskopią podłużną poszczególnych larw, która dostarcza wizualnych danych o losie wstrzykniętych zarodników.
W porównaniu z systemem ssaków, model infekcji larwami danio pręgowanego jest szczególnie istotny ze względu na jego dostępność optyczną. Rekrutację i odpowiedź wrodzonych komórek odpornościowych można uwidocznić w żywym, nienaruszonym gospodarzu. Można to połączyć z genetycznym lub chemicznym hamowaniem celów molekularnych, aby przeanalizować, jak każdy cel wpływa na reakcję makrofagów lub neutrofili przeciwko zarodnikom Aspergillus u żywego zwierzęcia.
Podczas gdy model infekcji larwami danio pręgowanego Aspergillus nadal odgrywa zasadniczą rolę w opisywaniu różnych aspektów IA 12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, są też inne obszary ekspansji. Od strony gospodarza służy do opisywania odpowiedzi immunologicznych na poziomie komórkowym, ale można to rozszerzyć o analizę mechanizmów immunologicznych na poziomie molekularnym, łącząc go z ukierunkowanym morfolinem, CRISPR, stabilnymi liniami mutantów lub ekspozycją chemiczną. Jednym zastrzeżeniem jest to, że homologi dla wszystkich znanych składników wrodzonego szlaku immunologicznego ssaków nie zostały zidentyfikowane u danio pręgowanego.
Od strony patogenów opisano zjadliwość różnych gatunków i szczepów. Obiecującym kierunkiem przyszłych badań jest wykorzystanie zmutowanych szczepów Aspergillus do przetestowania, w jaki sposób określone geny lub białka przyczyniają się jako czynniki wirulencji. W ten sposób można opracować nowe leki przeciwgrzybicze ukierunkowane na te białka. Obecne leki przeciwgrzybicze mają niską skuteczność u ludzi, a u grzybów rośnie oporność na te leki28. Ten model in vivo może być wykorzystany do zbadania, dlaczego te leki zawodzą i jako model pośredni do testowania skuteczności nowych leków przeciwgrzybiczych. Ogólnie rzecz biorąc, odkrycia odkryte przy użyciu tego modelu mogą ułatwić w przyszłości opracowanie skutecznych metod leczenia pacjentów zakażonych Aspergillus.

Aspergillus fumigatus jest wszechobecnym grzybem saprofitycznym, a jego zarodniki unoszące się w powietrzu można znaleźć zarówno w pomieszczeniach, jak i na zewnątrz1. Zarodniki te są wdychane przez wszystkich, ale zostają skutecznie usunięte z płuc osób immunokompetentnych1,2. Jednak u osób ze zmienionymi chorobami płuc, takimi jak mukowiscydoza, może rozwinąć się aspergiloza oskrzelowo-płucna z powodu kiełkowania grzybów w płucach3. Najcięższa postać tej infekcji, inwazyjna aspergiloza (IA), dotyka osoby z obniżoną odpornością i wiąże się z przedostaniem się grzyba do innych narządów2,3. IA prowadzi do >50% zgonów zakażonych pacjentów, pomimo dostępności terapii przeciwgrzybiczych4. U osób immunokompetentnych wrodzona odpowiedź immunologiczna odgrywa główną rolę w usuwaniu wdychanych zarodników1. Jednak specyficzne mechanizmy, które przyczyniają się do tego wrodzonego klirensu immunologicznego, nie są dobrze poznane. Ważne jest, aby zrozumieć mechanizmy komórkowe i molekularne głównych wrodzonych komórek odpornościowych (tj. makrofagów i neutrofili) w klirensie Aspergillus, aby znaleźć nowe strategie terapeutyczne dla IA.
Podczas gdy modele ssaków odegrały kluczową rolę w identyfikacji czynników wirulencji grzybów i odpowiedzi immunologicznych gospodarza5,6, dostępność wizualna interakcji gospodarz-patogen na poziomie komórkowym jest ograniczona. Eksperymenty z hodowlami tkankowymi nie są w stanie w pełni podsumować złożonego środowiska wielokomórkowego i interakcji, które występują u całych zwierząt7. W związku z tym danio pręgowany zyskał popularność jako alternatywny organizm modelowy, który wypełnia tę lukę i ułatwia badanie interakcji gospodarz-patogen w żywym, nienaruszonym żywicielu podczas wielodniowej infekcji8,9. Wrodzony układ odpornościowy danio pręgowanego rozwija się już po 24 godzinach od zapłodnienia (hpf)10, a system adaptacyjny rozwija się po 4–6 tygodniach11, zapewniając okno czasowe, w którym można ocenić wrodzoną odpowiedź immunologiczną w izolacji. Wrodzone odpowiedzi immunologiczne są dobrze zachowane między ludźmi a danio pręgowanym11. Danio pręgowany ma wiele cech, które ułatwiają badanie tych reakcji, w tym przejrzystość optyczną (która pozwala na obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości nienaruszonych gospodarzy) i wykonalność genetyczną (co ułatwia molekularne badania mechanistyczne).
Opisany tutaj model infekcji larwalnego danio pręgowanego Aspergillus został pierwotnie opracowany przez Knox et al.12. Został on niedawno rozszerzony przez naszą grupę i inne podmioty w celu zbadania mechanizmów immunologicznych gospodarza12,13, interakcje gospodarz-patogen13,14,15, mechanizmy immunosupresji13,16,17, zjadliwość grzybów18, oraz Skuteczność leków przeciwgrzybiczych<klasa SUP="XREF">19,20. Model ten podsumowuje wiele aspektów ludzkiej aspergilozy. Podczas gdy larwy immunokompetentne są oporne, larwy z obniżoną odpornością mogą ulec infekcji12,13,16,17.
W tym modelu, miejscowa infekcja jest ustalana przez wstrzyknięcie zarodników do tylnej komory mózgu larwy, obszaru mniej zaludnionego przez fagocyty, a rekrutacja i zachowanie fagocytów mogą być oceniane12,13. Uważa się, że makrofagi działają jako pierwsza linia obrony przed zarodnikami Aspergillus u ludzi1 i modele ssaków6,21. Podobnie w modelu danio pręgowanego makrofagi są rekrutowane do wstrzykniętych zarodników Aspergillus, podczas gdy neutrofile są rekrutowane wtórnie w odpowiedzi na wzrost strzępek12,13,22. Z tego modelu dowiedziano się również, że Aspergillus może utrzymywać się w larwach immunokompetentnych typu dzikiego po ponad 7 dniach infekcji. Co więcej, cały przebieg infekcji może być śledzony u tych samych żywych zwierząt poprzez codzienne obrazowanie konfokalne.
Ten protokół opisuje technikę mikroiniekcji do wstrzykiwania zarodników do tylnej komory mózgu 2 dni po zapłodnieniu (2 dpf) larw. Infekcja jest następnie monitorowana przez okres do 7 dni, ponieważ larwy danio pręgowanego mogą żyć do 10 dpf bez żerowania. Immunosupresję można wywołać przez leczenie farmakologiczne, opisano również stosowanie leków na larwy. Na koniec opisano dwie metody śledzenia postępu infekcji, w tym oznaczanie ilościowe CFU z poszczególnych larw oraz codzienną konfigurację obrazowania na żywo.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny Co.</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Siatka do okularów</td><td>Mikroskop World</td><td>RETR10</td><td>Do kalibracji igieł, używany w</td></tr><tr><td>konfiguracji mikrowtryskiwaczy stereoskopowych: Jednostka ciśnienia zwrotnego</td><td>Zastosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>Przełącznik</td> nożny BPU <td></td></tr><tr><td></td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>FTSW</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw uchwytów na mikropipety</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>M-</td><td></td></tr><tr><td>Wtryskiwacz ciśnieniowy</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Konfiguracja mikromanipulatora: Mikromanipulator</td><td>Narashige (Tritech)</td> <td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny i płytka</td><td>Tritech</td><td>MINJ-HBMB</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ-745</td><td></td></tr><tr><td>Tissuelyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>Do homogenizacji larw<</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>silny>Materiał</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny>Komentarze/Opis</silny></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Sól</td> <td>sodowa ampicylinyFisher</td><td>AAJ6380706</td><td></td></tr><tr><td>BSA, frakcja V</td><td>VWR</td><td>AAJ65855-22</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Fisher</td><td>AAJ1792406</td><td></td></tr><tr><td>L Rozsiewacze</td><td>Fisher</td><td>14 665 230</td><td></td></tr><tr><td>Igły mikrokapilarne (bez filamentu)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet do mikroładowarek</td><td>VWR</td><td>89009-310</td><td>Aby załadować igłę zawiesiną Aspergillus</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>VWR</td><td>EM475855-1R</td><td>Do filtrowania zawiesiny Aspergillus</td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik</td><td>Fisher</td><td>AAL0669009</td><td>Aby zapobiec pigmentacji</td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa, 1% roztwór</td><td>Fisher</td><td>57254</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina (3-aminobenzoesan etylu, sól kwasu metanosulfonowego)</td><td>Fisher</td><td>AC118000500</td><td>Do znieczulania larw</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Media i roztwory</td><td>Components/Recipe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3 podłoża: 60x E3</td><td>17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,9 g CaCl2, 4,9 g MgSO4 &middot; 7H2O, do 1 l z H2O</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x E3</td><td>16,7 ml 60x bulion, 430 ul 0,05 M NaOH, do 1 l z H2O (opcjonalnie: + 3 ml 0,01% błękitu metylenowego)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy trikainy</td><td>2 g Trikaina, 5 g Na2HPO4 &middot; 7H2O, 4,2 ml 60X E3, do 500 ml z H2O, pH do 7,0-7,5 z NaOH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimalne podłoże glukozy (GMM) agar: agar GMM</td><td>10 g glukozy (dekstroza), 50 ml 20x sole azotanowe, 1 ml TE, do 1 l z H2O, pH do 6,5 z NaOH, + 16 g Agar, autoklaw</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x Sole azotanowe</td><td>120 g NaNO3, 10,4 g KCl, 10,4 g, MgSO4 &middot; 7H2O, 30,4 g, KH2PO4, do 1 L z H2O, autoklaw</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierwiastki śladowe (TE)</td><td>2,20 g ZnSO4 &middot; 7H2O, 1,10 g H3BO3, 0,50 g MnCl2 &middot; 4H2O, 0,16 g FeSO4 &middot; 7H2O, 0,16 g CoCl2 &middot; 6H2O, 0,16 g CuSO4 &middot; 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 &middot; 4H2O, 5,00 g Na2EDTA, do 100 ml z H2O, rozpuścić mieszając przez noc, autoklaw</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Inwazyjna aspergiloza (IA) jest jedną z najczęstszych infekcji grzybiczych wśród osób z obniżoną odpornością. Pomimo dostępności leków przeciwgrzybiczych, IA może powodować >50% śmiertelności u zakażonych pacjentów z obniżoną odpornością. Kluczowe znaczenie ma określenie zarówno czynników gospodarza, jak i patogenu, które przyczyniają się do podatności na infekcje i niskich wskaźników przeżycia u zakażonych pacjentów, w celu opracowania nowych metod leczenia. Wrodzone odpowiedzi immunologiczne odgrywają kluczową rolę w rozpoznawaniu i usuwaniu zarodników Aspergillus, chociaż niewiele wiadomo o dokładnych mechanizmach komórkowych i molekularnych. Potrzebne są wiarygodne modele do badania szczegółowych interakcji mechanistycznych między gospodarzem a patogenem. Przejrzystość optyczna i podatność genetyczna larw danio pręgowanego sprawiają, że są one intrygującym modelem do badania interakcji gospodarz-patogen wielu ludzkich infekcji bakteryjnych i grzybiczych w żywym i nienaruszonym żywicielu. Protokół ten opisuje model infekcji Aspergillus u larw danio pręgowanego. Najpierw zarodniki Aspergillus są izolowane i wstrzykiwane do tylnej komory mózgowia danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji. Następnie inhibitory chemiczne, takie jak leki immunosupresyjne, są dodawane bezpośrednio do wody larwalnej. Opisano dwie metody monitorowania infekcji u larw, którym wstrzyknięto, w tym: 1) homogenizacja larw w celu zliczenia jednostek tworzących kolonie (CFU) oraz 2) powtarzany, codzienny zestaw obrazowania na żywo. Ogólnie rzecz biorąc, techniki te mogą być wykorzystywane do mechanicznej analizy postępu infekcji Aspergillus in vivo i mogą być stosowane do różnych środowisk gospodarzy i szczepów Aspergillus w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen.

Po mikroiniekcji zarodników Aspergillus do tylnego mózgu larw danio pręgowanego, przebieg infekcji można monitorować za pomocą wielu testów, w tym oceny przeżywalności, oznaczania CFU oraz obrazowania na żywo. W teście przeżywalności monitorowano liczbę zainfekowanych larw, które przeżyły od 1 do 7 dpi. W przypadku nieleczonych larw typu dzikiego zaobserwowano bardzo niską śmiertelność, przy czym ~80%–100% larw przeżyło cały eksperyment (Rysunek 1). W przypadku larw z immunosupresją, np. wywołaną ekspozycją na lek kortykosteroidowy – deksametazon (10 µM), zaobserwowano znacząco obniżoną przeżywalność (Rysunek 1).
Podczas ilościowego oznaczania CFU w ciągu 7-dniowego eksperymentu u larw typu dzikiego zainfekowanych zarodnikami A. fumigatus, zaobserwowano utrzymywanie się zarodników, przy czym ich eliminacja następowała powoli w czasie (Rycina 2A). Liczbę zarodników przeżywających w 1, 2, 3, 5 i 7 dni po infekcji (dpi) znormalizowano do liczby zarodników wstrzykniętych w 0 dpi, aby porównać trwałość i szybkość eliminacji między powtórzeniami (Rycina 2B).
Transgeniczne linie ryb wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w leukocytach, wraz z zarodnikami Aspergillus wykazującymi ekspresję białek fluorescencyjnych, mogą być wykorzystywane do wizualizacji zarówno rekrutacji i zachowania leukocytów, jak i kiełkowania oraz wzrostu grzyba13. Po oznakowaniu makrofagów (np. Tg(mpeg1:H2B-GFP)), w około 50% larw zazwyczaj obserwowano agregację makrofagów, która rozpoczynała się w 2–3 dpi (Rysunek 3A). Rekrutacja neutrofili (Tg(lyz:BFP)) była zazwyczaj opóźniona i następowała głównie po kiełkowaniu grzyba (Rysunek 3A). Podczas gdy w większości larw obciążenie grzybicze utrzymywało się przez cały eksperyment (Rysunek 3A), obserwowano również przypadki eliminacji patogenu (Rysunek 3B). U niektórych larw, w późniejszej fazie infekcji, obserwowano obecność grzyba poza obszarem tylnego mózgu, co było wynikiem rozsiewu grzyba, prawdopodobnie za pośrednictwem makrofagów.
Obszar wokół pęcherzyka słuchowego jest jednym z możliwych miejsc, w których można zaobserwować tę dysseminację (Rycina 3C). Obserwacje te poddano ilościowej analizie u wielu pojedynczych larw w trakcie całego eksperymentu (Rycina 4). Zazwyczaj do 5 dpi kiełkowanie stwierdzano u ~60% larw (Rycina 4A). Powierzchnia skupisk fagocytów, rekrutacja makrofagów oraz rekrutacja neutrofili różnią się zarówno w czasie, jak i między larwami, przy czym w niektórych przypadkach trendy były wzrostowe przez cały czas trwania eksperymentu, a w innych procesy te wygasły z czasem (Rycina 4B,C,D).
<img alt="Wykres analizy przeżywalności; leczenie DMSO vs Dex; % przeżywalności gospodarza w czasie; istotność statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywna analiza przeżywalności zainfekowanych larw.Aspergillus-zainfekowane larwy poddano działaniu kontroli nośnika (DMSO) lub deksametazonu (Dex), a następnie monitorowano przeżywalność. Dane reprezentują trzy połączone powtórzenia. Średnie CFU w zastrzyku: DMSO = 30, Dex = 29 (wartość p oraz współczynnik hazardu obliczono za pomocą analizy regresji proporcjonalnego hazardu Coxa, ****p &lt; 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres pomiaru CFU; wykres redukcji obciążenia przetrwalnikami; dni po iniekcji; eksperyment mikrobiologiczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne wartości CFU z poszczególnych zainfekowanych larw bezpośrednio po iniekcji (0 dpi) oraz w trakcie przebiegu infekcji (2, 3, 5 i 7 dpi). Osiem zainfekowanych larw poddano homogenizacji i wysiano na podłoża w celu zliczenia CFU dla każdego punktu czasowego i powtórzenia. (A) Przykładowe dane z jednego powtórzenia. Każdy punkt reprezentuje jedną larwę, słupki reprezentują wartości średnie dla każdego punktu czasowego. (B) Wartości CFU znormalizowano do liczby CFU w 0 dpi dla każdego powtórzenia, a następnie połączono dane z trzech powtórzeń. Dane z różnych warunków eksperymentalnych porównano za pomocą analizy wariancji i przedstawiono w formie szacowanych średnich marginalnych oraz błędów standardowych. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną w porównaniu do CFU w 0 dpi (*p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ****p &lt; 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe A. fumigatus, makrofagów i neutrofili w larwach w różnych dniach po infekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy z eksperymentów nad infekcją.Larwy traktowane PTU z fluorescencyjnymi makrofagami (mpeg1:H2B-GFP) i neutrofilami (lyz:BFP) zostały wstrzyknięte z A. fumigatus wykazującym ekspresję RFP. Obrazy żywych, zainfekowanych larw były wielokrotnie pobierane w 2., 3. i 5. dniu po infekcji (dpi) przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Przedstawiono obrazy z maksymalną projekcją intensywności w osi Z. Schematy larw wskazują miejsce obrazowania dla każdego panelu. Wszystkie paski skali reprezentują 100 µm, z wyjątkiem pasków skali na wstawkach, które wynoszą 25 µm. (A) Przedstawione obrazy pochodzą z jednej larwy pobranej w 2., 3. i 5. dpi, co reprezentuje typowy przebieg infekcji. Wstawki pokazują kiełkowanie grzyba w 3. i 5. dniu. (B) Reprezentatywny obraz podgrupy larw zdolnych do zwalczenia infekcji, z niskim obciążeniem grzybiczym i niewielkim stanem zapalnym w 5. dpi. (C) Reprezentatywny obraz podgrupy larw, w których infekcja rozprzestrzenia się poza tylny mózg w późniejszych punktach czasowych. Na tym obrazie grzyb, makrofagi i neutrofile znajdują się wokół i poniżej pęcherzyka słuchowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy analizy infekcji larw; kiełkowanie zarodników, obszar fagocytów, makrofagi, neutrofile." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywna kwantyfikacja eksperymentów obrazowych. Analizie pod kątem kiełkowania grzybów i rekrutacji leukocytów poddano obrazy z układu eksperymentalnego przedstawionego na Rycini 3. (A) Larwy oceniano każdego dnia pod kątem obecności wykiełkowanych zarodników, a następnie obliczano procent larw z kiełkowaniem. (B,C,D) Każda pojedyncza larwa jest reprezentowana przez linię w innym kolorze. Pojawienie się i wielkość skupisk fagocytów (B), rekrutacja makrofagów (C) oraz rekrutacja neutrofili (D) były monitorowane w każdej larwie w ciągu 5-dniowego eksperymentu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje model infekcji Aspergillus u larw danio pręgowanego. Zarodniki Aspergillus są mikrowstrzykiwane do tyłomózgowia larw, a leczenie chemiczne stosuje się w celu wywołania immunosupresji. Postęp infekcji jest monitorowany za pomocą codziennego zestawu do obrazowania w celu monitorowania wzrostu grzybów i odpowiedzi immunologicznej, a także liczenia żywych zarodników przez posiewanie jednostek tworzących kolonie.

Zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami Aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Protokół ten demonstruje model infekcji larwalnego zebry aspergillus, który możemy wykorzystać do zbadania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych na tego grzyba. Główną zaletą modelu larwy danio pręgowanego jest to, że możemy wizualizować interakcje patogenów komórek odpornościowych i postęp infekcji wewnątrz żywego zwierzęcia gospodarza podczas wielodniowej infekcji. Wyniki tego modelu mogą mieć zastosowanie do odkrycia nowych celów terapeutycznych w leczeniu inwazyjnej aspergilozy u pacjentów z obniżoną odpornością.Mikroiniekcja zarodników do larw danio pręgowanego jest trudną techniką, która wymaga znacznej praktyki, zanim będzie można osiągnąć spójne i powtarzalne wyniki. Do wykonywania mikroiniekcji należy użyć zestawu dostarczonego z wtryskiwaczem ciśnieniowym, jednostką próżniową, przełącznikiem nożnym, uchwytem na mikropipety, mikromanipulatorem oraz podstawką magnetyczną i płytką. Wszystkie podłączone do źródła sprężonego powietrza.Otwórz zawór sprężonego powietrza. I włącz mikrowtryskiwacz. Ustaw ciśnienie na około 25 psi, wzmocnienie na 60 milisekund, a jednostkę ciśnienia próżniowego na 1 psi.Użyj końcówki pipety do mikropodajnika, aby załadować igłę do mikroiniekcji trzema do pięciu mikrolitrów PBS lub zawiesiny zarodników z czerwienią fenolową. Następnie zamontuj igłę na mikromanipulatorze. Aspergillus fumigatus jest oportunistycznym patogenem człowieka.Istnieje ryzyko przebicia skóry załadowaną igłą. Igła powinna być bardzo mocno przymocowana do mikrowstrzykiwacza, a badacze powinni zawsze nosić rękawiczki i zwracać szczególną uwagę na ruchy dłoni wokół igły, aby uniknąć nakłucia. Ustawić mikromanipulator tak, aby koniec igły był widoczny pod mikroskopem stereoskopowym przy najmniejszym powiększeniu.Powiększ do 4-krotnego powiększenia, utrzymując igłę w zasięgu wzroku. Następnie użyj ostrych kleszczy, aby przyciąć koniec igły. Nacisnąć pedał wstrzykiwania, aby wyświetlić wielkość kropli.I kontynuuj przycinanie igły, aż wydostanie się około trzech nanolitrów zawiesiny zarodników. Gdy wszystko będzie gotowe, odsunąć mikromanipulator i igłę na bok, aby uniknąć przypadkowego uderzenia w igłę podczas układania larw na płytce iniekcyjnej. Wylać trykainę E3 z płytki iniekcyjnej.I przenieś około 24 znieczulonych dwudniowych larw na płytkę z jak najmniejszą ilością E3. Następnie ułóż larwy zgodnie z kierunkiem, w którym są zwrócone, umieszczając wszystkie larwy skierowane w prawo w jednym rzędzie, a wszystkie skierowane w lewo w rzędzie poniżej. Przy mikroskopie ustawionym na najmniejsze powiększenie cofnij mikromanipulator tak, aby igła znajdowała się blisko larw pod kątem 30-60 stopni.Powiększ do największego powiększenia. I użyj pokręteł precyzyjnej regulacji, aby jeszcze bardziej wyregulować położenie igły. Wstrzyknąć zawiesinę zarodników do płynu obok larw, aby sprawdzić, czy z igły wydostaje się 30-70 zarodników.Następnie przesuń płytkę tak, aby igła znajdowała się bezpośrednio nad i znajdowała się w pobliżu pierwszych larw. Zaczynając od larw, które są skierowane w stronę igły. Włóż igłę przez tkankę wokół pęcherzyka usznego i przebij ją przez nią do komory tylnomózgowia, przesuwając płytkę w razie potrzeby, aby uzyskać właściwą orientację larwy.Sprawdź wzrokowo, czy koniec igły znajduje się pośrodku komory tyłomózgowia. Następnie naciśnij pedał nożny, aby wstrzyknąć zarodniki i delikatnie schować igłę. Po wstrzyknięciu wszystkich larw w obu rzędach należy ponownie usunąć igłę z drogi.I powiększ do mniejszego powiększenia. Czerwony barwnik fenolowy powinien być nadal widoczny w tyłomózgowiu każdej larwy. Usunąć wszelkie larwy po nieudanych wstrzyknięciach i przenieść pozostałe larwy na szalkę Petriego, zmywając je z talerza świeżym E3. Dwukrotnie przepłucz larwę E3 i upewnij się, że wyzdrowieją ze znieczulenia.Natychmiast po wstrzyknięciu przenieś osiem larw do pojedynczych probówek o pojemności 1,7 mililitra i poddaj je eutanazji. Przygotuj 1 ml PBS z ampicyliną i kanamycyną. Usuń jak najwięcej płynu z probówek z larwami.Następnie dodaj 90 mikrolitrów PBS z antybiotykami. Homogenizować larwy w TissueLyser przy 1800 oscylacjach na minutę przez sześć minut. Następnie obracaj je w dół z prędkością 17 000 razy G przez 30 sekund.Odpipetować homogenizowaną zawiesinę z każdej probówki do środka oznakowanej płytki GMM i rozprowadzić za pomocą jednorazowego rozsiewacza w kształcie litery L. Uważając, aby nie rozprowadzać się na krawędzi. Inkubuj płytki do góry nogami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni.Następnie policz liczbę utworzonych kolonii. Podziel pozostałe wstrzyknięte larwy na dwie 3,5-milimetrowe szalki. Jeden do leczenia farmakologicznego, a drugi do kontroli.Usuń jak najwięcej płynu i dodaj E3 za pomocą sterownika pojazdu do jednego naczynia. I E3 z traktowaniem, które interesuje drugiego. Użyj pipety, aby przenieść każdą larwę do dołka w 96-dołkowej płytce.I monitoruj ich przeżycie przez siedem dni. W dniu obrazowania przygotuj jedną 3,5-milimetrową szalkę Petriego ze 100 mikromolowym PTU i jedną z tricainą E3. Dodaj trikainę E3 do komór urządzenia Z-wedge E I użyj mikropipety P100, aby usunąć pęcherzyki powietrza z komór i kanału ograniczającego.Następnie usuń cały nadmiar trykainy E3 na zewnątrz komór. Odpipetować jedną larwę i przenieść ją do naczynia z E3 PTU. Następnie przenieś go do trykainy E3, popijając jak najmniejszą ilością płynu.Po 30 sekundach przenieść znieczulone larwy do komory załadowczej urządzenia do ranienia i uwięzienia. Usunąć trikainę E3 z komory do nawijania i wypuścić ją do komory załadowczej, aby przesunąć ogon larw do kanału ograniczającego. Upewnij się, że larwa jest umieszczona po swojej bocznej, grzbietowej lub grzbietowo-bocznej stronie, tak aby można było zobrazować tyłomózgowie za pomocą odwróconej soczewki obiektywu.Po zobrazowaniu larwy za pomocą mikroskopu konfokalnego należy uwolnić trikainę E3 do komory zarażania, aby wepchnąć larwę z kanału ograniczającego do komory ładowania. Podnieś larwę i przenieś ją z powrotem do naczynia z trickainą E3. Następnie przenieś go do naczynia z E3 PTU z jak najmniejszą ilością płynu.Opłucz go w PTU i przenieś z powrotem do płytki 48-dołkowej. Zarodniki Aspergillus zostały mikrowstrzyknięte do tyłomózgowia larw danio pręgowanego, monitorowano wynik infekcji. Bardzo mało zgonów zaobserwowano u larw typu dzikiego, przy czym od 80 do 100% larw przeżyło cały eksperyment.Znaczne skrócenie przeżywalności zaobserwowano u larw z obniżoną odpornością. Gdy określono ilościowo jednostki tworzące kolonie z zakażonych larw typu dzikiego, zaobserwowano trwałość zarodników i powolne usuwanie w czasie. Liczba zarodników, które przeżyły po jednym, dwóch, trzech, pięciu i siedmiu dniach po zakażeniu, została znormalizowana do liczby wstrzykniętych zarodników, w celu porównania trwałości i klirensu między replikami.Kiedy makrofagi zostały oznakowane, skupienie mikrofagów u około 50% larw obserwowano zwykle od dwóch do trzech dni po zakażeniu. Rekrutacja neutrofili była opóźniona, występowała głównie po wykiełkowaniu grzyba. Podczas gdy obciążenie grzybami utrzymywało się przez cały eksperyment u większości larw.U niektórych z nich zaobserwowano klirens po pięciu dniach od zakażenia. W innym podzbiorze larw zaobserwowano rozprzestrzenianie się grzybów na obszary poza tyłomózgowiem. Obszar wokół pęcherzyka usznego jest jednym z miejsc, w którym stwierdzono to rozprzestrzenianie się.Kiełkowanie grzybów było zwykle obserwowane przez pięć dni u 60% larw. Obszar skupiska fagocytów, rekrutacja makrofagów i rekrutacja neutrofili różniły się w czasie u wszystkich larw. Niektóre z nich wykazywały tendencję wzrostową w trakcie eksperymentu, a inne ustępowały z czasem.Procedura ta może być połączona z manipulacją genetyczną danio pręgowanego, taką jak CRISPR, w celu określenia zapotrzebowania na określone szlaki gospodarza w udanej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na aspergillus. Protokół ten pozwolił na wizualizację interakcji wrodzonych komórek odpornościowych aspergillus w czasie rzeczywistym, w żywych, nienaruszonych gospodarzach.

infection-zebrafish-larvae-with-aspergillus-spores-for-analysis-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Źródło: Zhang, X. i wsp., Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia model zarodka danio pręgowanego do badania infekcji związanych z wszczepionymi biomateriałami. Wstrzykiwanie Staphylococcus aureus mikrosferom polistyrenowym zwiększa przeżywalność bakterii, potwierdzając rolę wszczepionych materiałów w promowaniu infekcji.

Analiza in vivo zakażeń bakteryjnych związanych z implantami przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Źródło: Bernut, A. i in., Rozszyfrowanie i obrazowanie patogenezy oraz układania korzeni Mycobacterium abscessus w embrionach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2015).Ten film pokazuje protokół izolowania i ilościowego określania ropnia Mycobacterium z zakażonego zarodka danio pręgowanego. Procedura obejmuje eutanazję zarodków, lizę tkanek oraz homogenizację w celu uwolnienia bakterii, a następnie wirowanie i ponowną zawiesinę w buforze powierzchniowo czynnym. Na koniec zawiesina bakteryjna jest...

Izolacja i hodowla bakterii z zarodków danio dano w celu oceny obciążenia infekcją

Źródło: Bernut, A. i inni. Rozszyfrowanie i obrazowanie patogenezy oraz układania rdzenia ropnia Mycobacterium absceptus w zarodkach danio dano dano. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje protokół wykorzystujący transgeniczne zarodki danio danio ekspresyjne ekspresujące makrofagi fluorescencyjne i zakażone fluorescencyjnym szczepem Mycobacterium abscessus rough do wizualizacji interakcji żywiciel-patogen. Pokazuje, jak pozakomórkowe przewody umożliwiają unikanie odporności, wspierając...

Obrazowanie na żywo interakcji żywiciel-patogen w zarodkach danio dano zakażonych Mycobacterium abscessus

Źródło: Flores, E. i inni. Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji pokarmowych u larw danio danio. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje metodę ustalania modelu bakteryjnego zakażenia jelit przenoszonego przez żywność u larw danio pręgowanego poprzez karmienie ich paramecjami zakażonymi fluorescencyjnym E. coli.

Modelowanie infekcji jelit u larw danio pręgowanego przy użyciu bakterii przenoszonych przez żywność

Ten film demonstruje metodę ilościowego określania infekcji grzybiczej u larw danio pręgowanego. Zarodniki grzybów są mikrowstrzykiwane do larwalnej komory tyłomózgowia, a larwy są inkubowane, aby umożliwić rozwój infekcji. Zakażone larwy są zbierane w określonych odstępach czasu, a postęp infekcji ocenia się poprzez wyliczenie jednostek tworzących kolonie.

Technika ilościowego określania infekcji grzybiczej u larw danio pręgowanego

Wideo demonstruje technikę urządzenia do ranienia i uwięzienia danio pręgowanego do obserwacji fluorescencyjnie znakowanej infekcji patogenami grzybiczymi u larw danio pręgowanego. Początkowa infekcja przyciąga makrofagi, a gdy infekcja się utrzymuje, rekrutacja neutrofili postępuje w miejscu wstrzyknięcia.

Technika zWEDGI do wizualizacji larw danio pręgowanego zakażonych patogenami grzybiczymi

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

W tym protokole, fluorescencyjnie znakowane T. cruzi zostały wstrzyknięte do przezroczystych larw danio pręgowanego, a ruchliwość pasożyta zaobserwowano in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego.

Ustanowienie larw danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego do badania ruchliwości Trypanosoma cruzi in vivo

Niniejsze badanie opisuje model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej infekcji związanej z biomateriałem w czasie na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Model ten jest obiecującym systemem uzupełniającym modele zwierzęce ssaków, takie jak modele mysie, do badania zakażeń związanych z biomateriałem in vivo.

Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem

Poznaj metodę mikroiniekcji zarodników Aspergillus do mózgu tylnego larw Danio rerio w celu wizualizacji odpowiedzi immunologicznej w czasie rzeczywistym. Ta technika umożliwia badanie interakcji patogen-gospodarz i odkrywanie nowych celów terapeutycznych w zakażeniach grzybiczych.

Zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami Aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen

Przeglądaj więcej filmów