Name: Celowanie in vivo w ksenoprzeszczepowane ludzkie komórki rakowe za pomocą funkcjonalizowanych fluorescencyjnych nanocząstek krzemionki u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę celowania nanocząstek w ludzkie komórki rakowe in vivo przy użyciu modelu danio pręgowanego. Technika ta umożliwia ocenę skuteczności nanocząstek fluorescencyjnych i selekcję optymalnych kandydatów do dalszych badań klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Pani Kaylee Smith, Pani Lauren Kwok i Panu Alexandrowi Floru za korektę manuskryptu. H.F. dziękuje za wsparcie od NIH (CA134743 i CA215059), American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) oraz St. Baldrick's Foundation. F.J.F.L. dziękuje za stypendium od Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S dziękuje za wsparcie NSF (grant CBET 1605405) i NIH R41AI142890.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Boston University School of Medicine zgodnie z protokołem #: PROTO201800543.
1. Generacja zarodków zebry zebry Casper
<ol>
	<li>Wybierz dorosłe ryby Casper, które mają co najmniej 3 miesiące do naturalnej hodowli, aby wygenerować przezroczyste zarodki zebry zebryka.</li>
	<li>Napełnij dwukomorowe zbiorniki godowe wodą rybną wieczorem, oddziel górne zbiorniki za pomocą przegród, umieść jednego samca ryby po jednej stronie komory, a jedną lub dwie samice po drugiej stronie komory i pozostaw ryby oddzielone na noc przegrodami.</li>
	<li>Wyciągnij przegrody następnego ranka o 8:00, kiedy światła są włączone. Dodaj sztuczne rośliny wzbogacające i lekko przechyl górną komorę, aby uzyskać płytki obszar wody. Pozwól rybom rozmnażać się przez 3-4 godziny.</li>
	<li>Podnieś górne komory zbiorników łączących, w których znajdują się ryby i włóż je z powrotem do oryginalnych zbiorników.</li>
	<li>Zbieraj jaja znajdujące się w dolnych komorach, przelewając wodę przez siatkę. Przenieść jaja na sterylną szalkę Petriego o gęstości nie większej niż 200 jaj na szalkę. Usuń martwe lub niezapłodnione jaja i napełnij naczynie do 2/3 świeżą wodą rybną. 
	UWAGA: Zapłodnione i zdrowe jaja powinny być przezroczyste i okrągłe. Wszelkie jaja, które są mętne, białe lub zniekształcone, należy usunąć. Woda dla ryb pozyskiwana jest ze zbiorników rybnych w obiekcie rybnym.</li>
	<li>Inkubować zarodki w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego ranka należy wybielić zarodki przy użyciu standardowego protokołu opisanego w The Zebrafish Book16, a następnie umieścić zarodki z powrotem w inkubatorze (krok opcjonalny).</li>
	<li>Po południu wyjąć 24 zarodki hpf z inkubatora i dokonać dechorionacji zarodków za pomocą pronazy.
	<ol>
		<li>Usunąć jak najwięcej wody rybnej z zarodków na szalce Petriego i dodać kilka kropli roztworu pronazy (1 mg/ml w wodzie dla ryb) do szalki. Delikatnie zakręć szalką Petriego. Gdy kosmówka wykazuje oznaki rozpadu, należy kilkakrotnie pipetować zarodki w górę iw dół, aby rozbić zarodki i uwolnić zarodki.</li>
		<li>Natychmiast dodaj świeżą wodę rybną do szalki Petriego, aby zakończyć proces, gdy większość zarodków wyjdzie z kosmówki. Opłucz zarodki jeszcze 3 razy za pomocą wody rybnej, aby usunąć pływające kosmówki. Umieść zarodki z powrotem w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie ludzkich komórek nowotworowych do przeszczepu
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę inkubatora dokładnie na 35,5 °C. Monitoruj inkubator, aby zapewnić stałą i stabilną temperaturę za pomocą termometru wewnątrz inkubatora.</li>
	<li>Autoklaw 1 l wody rybnej w szklanej butelce. Przygotuj 3% roztwór agarozy, dodając 3 g agarozy do elektroforezy do 100 ml autoklawowanej wody dla ryb i podgrzewając w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
	<ol>
		<li>Wlej gorący roztwór agarozy do szalki Petriego, aż będzie wypełniona w 3/4. Umieść formę do mikroiniekcji na agarozie. Upewnij się, że forma nie styka się z dnem szalki Petriego i nie tworzy się pod nią bąbelki.</li>
		<li>Poczekaj, aż roztwór stwardnieje i ostrożnie usuń formę z płyty. Napełnij płytkę autoklawowaną wodą rybną i przechowuj płytkę w temperaturze 4 °C. Przed pobraniem komórek HeLa podgrzej płytkę agarozową i wodę rybną w inkubatorze o temperaturze 35,5 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pociągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,0 mm x 0,78 mm na ściągaczu do pipet, stosując następujące ustawienia: ciśnienie na 500, ciepło na 560, pociągnięcie na 100, prędkość na 100 i czas/opóźnienie na 200. Igły na szpachli należy przechowywać na dużej szalce Petriego, którą przetarto ręcznikiem etanolowym. 
	UWAGA: Ciągnięte igły są bardzo ostre i delikatne. Zachowaj ostrożność podczas obsługi.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy metanosulfonianu trikainy (MS222, 4 mg/ml), rozpuszczając MS222 w autoklawowanej wodzie dla ryb. Dobrze wymieszać przed użyciem. Rozcieńczyć roztwór podstawowy MS222 w stosunku 1:100 w wodzie dla ryb (tj. dodać 200 μl roztworu podstawowego MS222 do 20 ml wody dla ryb do końcowego stężenia 40 μg/ml) w celu znieczulenia zarodków do następujących procedur.</li>
	<li>Hodowla hZnakuj komórki HeLa, transdukując je PLenti6.2_miRFP670 lentiwirusem przy użyciu opisanego protokołu17. Pobrać komórki RFP+ HeLa 30 min-1 h przed przeszczepem. 
	UWAGA: Ludzkie komórki HeLa hodowano w inkubatorze do hodowli tkankowych do 70% zbiegu w kompletnym pożywce wzrostowej (pożywka DMEM z 10% FBS) w temperaturze 37 °C uzupełnionej 5% CO2 .
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę z komórek HeLa przez aspirację do hodowli tkankowej. Krótko przepłucz warstwę komórkową sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie ślady surowicy.</li>
		<li>Dodać 3,0 ml sterylnego roztworu trypsyny-EDTA do kolby T-75 i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 3-5 minut, aby ułatwić trawienie enzymatyczne. Obserwuj kolbę pod mikroskopem, aż ~80% komórek zostanie zawieszonych.</li>
		<li>Dodać 6-8 ml kompletnej pożywki wzrostowej do kolby. Zebrać komórki do sterylnej probówki o pojemności 15 ml, delikatnie pipetując. Wirować przy 135 x g przez 5 min.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki HeLa w 3 ml kompletnej pożywki wzrostowej. Powtórz powyższy krok prania 2x. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej i policzyć komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Ponownie odwiruj komórki, usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o stężeniu 5 x 107 komórek/ml. Utrzymuj komórki w cieple, trzymając rurkę jedną ręką podczas transportu do obiektu rybnego. 
		UWAGA: Zawsze utrzymuj komórki w cieple, przechowując je w inkubatorze w temperaturze 35,5 °C przed lub w trakcie wstrzykiwania zarodków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przeszczepianie ludzkich komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Przed przeszczepem oczyść miejsce pracy za pomocą ręczników etanolowych (np. nożyczek, pęsety, plastikowych pipet, żyletek).</li>
	<li>Wyrównaj zarodki w rowkach płytki agarozowej za pomocą plastikowej pipety. Połóż zarodki na boku z przodem skierowanym do przodu. 
	UWAGA: Upewnij się, że woda dla ryb zakrywa zarodki. Odłóż niektóre embriony na bok, aby nie wstrzykiwać komórek rakowych i użyj ich jako kontroli.</li>
	<li>Włącz źródło powietrza i mikrowtryskiwacz. Wyjmij komórki HeLa z inkubatora i pipetuj komórki w górę i w dół 20-30 razy za pomocą końcówki P200. Natychmiast załaduj 3 μl mieszaniny komórek do igły za pomocą żelowej końcówki ładującej z odciętym końcem. Ostrożnie włóż końcówkę w kierunku ostrego dolnego końca igły. W razie potrzeby potrząśnij igłą, aby upewnić się, że mieszanina komórek przesuwa się w dół igły, aby wypełnić ostry koniec.
	<ol>
		<li>Włożyć igłę do uchwytu igły. Użyj pęsety, aby ostrożnie otworzyć końcówkę igły. Dostosuj ciśnienie i czas działania mikrowtryskiwacza, aby wypchnąć wszystkie pęcherzyki powietrza znajdujące się wewnątrz końcówki igły. Zmniejszyć ciśnienie i czas wstrzykiwania do momentu, gdy wielkość kropelek do wstrzykiwań osiągnie ~1 nL.</li>
		<li>Umieścić płytkę do wstrzykiwań pod mikroskopem w odpowiedniej pozycji, tak aby żółtkowa strona zarodków była skierowana w stronę igły. Znieczulić zarodki, dodając pięć kropli rozcieńczonego roztworu MS222 (40 μg/ml).</li>
		<li>Ustawić wstrzykiwacz i pozwolić, aby igła dotknęła jamy okołoopyleninowej każdego zarodka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć mieszaninę komórek do zarodków w unaczynionym obszarze pod jamą okołonogową, naciskając pedał nożny.</li>
	<li>Ręką niedominującą przesunąć płytkę iniekcyjną do następnego zarodka. Użyj dominującej ręki, aby wysunąć i schować wtryskiwacz, jednocześnie naciskając pedał nożny, aby kontynuować wstrzykiwanie. Odpipetować kilka kropli sterylnej wody rybnej na zarodki, które zostały wstrzyknięte. Po zakończeniu wstrzykiwania wszystkich zarodków na płytkę, należy zmyć je sterylną wodą dla ryb, umieścić na sterylnej szalce Petriego i natychmiast przenieść do inkubatora o temperaturze 35,5 °C.</li>
	<li>Po 3 godzinach należy zbadać wstrzyknięte zarodki i usunąć martwe.</li>
	<li>Żywe zarodki należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 35,5 °C i inkubować przez 20-24 godziny, aby umożliwić komórkom HeLa rozprzestrzenienie się z miejsca wstrzyknięcia na inne części ciała. 
	UWAGA: Zarodki są trzymane w inkubatorze o temperaturze 35,5 °C, aby umożliwić przeżycie i migrację ludzkich komórek rakowych, ponieważ komórki nie radzą sobie dobrze w temperaturze 28,5 °C, w której zwykle inkubuje się zarodki ryb.</li>
</ol>
4. Wstrzykiwanie nanocząsteczek lub pojazdu
<ol>
	<li>Znieczulenie przeszczepionych zarodków należy znieczulić następnego ranka pięcioma kroplami rozcieńczonego roztworu MS222. Nie należy dodawać zbyt dużej ilości MS222, ponieważ spowoduje to śmierć zarodków. Pod mikroskopem fluorescencyjnym ostrożnie podnieś zarodki z przerzutami komórek HeLa RFP+ do ogona i umieść je na nowej szalce Petriego ze sterylną wodą dla ryb.</li>
	<li>Przygotować igły do wstrzykiwań zgodnie z wcześniejszym opisem w punkcie 2, stosując następujące ustawienia: ciśnienie na 500, ciepło na 645, pociągnięcie na 60, prędkość na 50 i czas/opóźnienie na 100.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 3.1-3.3, aby wyrównać zarodki i załadować nośnik (np.H2O) lub roztwór nanocząstek do igły.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,5 nl roztworu nanocząstek o stężeniu 1 mg/ml za okiem i kontynuować wstrzykiwanie zgodnie z opisem w krokach 3.5-3.6 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). To miejsce za oczami jest wzbogacone naczyniami włosowatymi, dzięki czemu nanocząsteczki mogą dostać się do krążenia.</li>
	<li>Postępując zgodnie z podobną procedurą, wstrzyknij nośnik (np.H2O), który został użyty do zawieszenia nanocząstek do zarodków z przeszczepionymi komórkami HeLa i tych bez (tj. kontrolnych) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A, C).</li>
	<li>Inkubować wszystkie wstrzyknięte zarodki w temperaturze 35,5 °C.</li>
</ol>
5. Obrazowanie i śledzenie nanocząsteczek i komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Zbadaj wstrzyknięte zarodki pod mikroskopem fluorescencyjnym w 0, 30, 60, 90, 120, 180 i 210 minutach po wstrzyknięciu nanocząstek, aby monitorować ich rozmieszczenie w krążeniu i stopień celowania w komórki rakowe. Celowanie nanocząstek w komórki nowotworowe można zaobserwować już po 30 minutach od wstrzyknięcia, w zależności od rodzaju badanej nanocząstki.</li>
	<li>Pobrać pipetą 2-3 zarodki na szalkę Petriego i unieruchomić je, dodając pięć kropli rozcieńczonego roztworu MS222 (40 μg/ml). Gdy zarodki przestaną pływać, usuń większość wody, aby zarodki mogły leżeć na boku.</li>
	<li>Użyj pipety z cienką, miękką szczoteczką przymocowaną do jej końca, aby wyrównać zarodki tak, aby leżały na boku, z przednią częścią skierowaną do przodu i widocznym tylko jednym okiem.</li>
	<li>Wyobraź sobie zarodki w kanałach czerwonym, niebieskim i jasnym polu przy małym powiększeniu (2x), aby uchwycić cały zarodek i powtórz w większym powiększeniu (6,4x), aby uchwycić obszar ogona. Skoncentruj zarodek pod czerwonym kanałem, aby uniknąć krwawienia nanocząstek. 
	UWAGA: Zarodki nie mogą się poruszać podczas obrazowania. Każdy ruch doprowadzi do rozmycia obrazów i niemożności nałożenia na siebie obrazów z różnych kanałów.</li>
	<li>Natychmiast po obrazowaniu należy dodać świeżą wodę z ryb do zarodków i umieścić je z powrotem w inkubatorze. Powtórz kroki 5.2-5.4, aby zobrazować zarodki w różnych punktach czasowych.</li>
</ol>

<ol><li>Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+carriers+for+drug+delivery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Cells%2C+Nanomedicine%2C+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).</li>
<li>Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+nanoparticles+for+drug+delivery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer.</a> Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).</li>
<li>Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Target+Therapy%22%5BJournal%5D)">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7(2018).</li>
<li>Chinen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+Probes+for+the+Detection+of+Cancer+Biomarkers%2C+Cells%2C+and+Tissues+by+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chemal+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence.</a> Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).</li>
<li>Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabright+fluorescent+mesoporous+silica+nanoparticles+for+prescreening+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer.</a> Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).</li>
<li>Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models%3A+closing+the+gap+between+preclinical+data+and+trial+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes.</a> Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).</li>
<li>Sharkey, F. E., Fogh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+the+use+of+nude+mice+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Considerations in the use of nude mice for cancer research.</a> Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).</li>
<li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51677(2014).</li>
<li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li>
<li>Liu, S., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Pathology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for cancer.</a> Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%3A+a+gene+expression+profiling%2C+in+situ+hybridization+and+immunological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Anderson, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TCA+cycle+transferase+DLST+is+important+for+MYC-mediated+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis.</a> Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).</li>
<li>Peerzade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabright+fluorescent+silica+nanoparticles+for+in+vivo+targeting+of+xenografted+human+tumors+and+cancer+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish.</a> Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).</li>
<li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+%28Kidlington%29%22%5BJournal%5D)">Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).</li>
<li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+on+ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Data in Brief. 22, 383-391 (2019).</li>
<li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+medium+and+passaging+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li>
<li>Rao, P. N., Engelberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hela+Cells%3A+Effects+of+Temperature+on+the+Life+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle.</a> Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews+of+the+Cambridge+Philosophical+Society%22%5BJournal%5D)">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).</li>
</ol>

I.S. deklaruje zainteresowanie spółką NanoScience Solutions, LLC (odbiorca grantu STTR NIH R41AI142890). Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisany tutaj protokół wykorzystuje danio pręgowanego jako system in vivo do testowania zdolności nanocząstek do rozpoznawania i celowania w przerzutowe ludzkie komórki rakowe. Na pomyślne przeprowadzenie eksperymentów może mieć wpływ kilka czynników. Po pierwsze, zarodki muszą być w pełni rozwinięte przy 48 hpf. Prawidłowy etap rozwojowy zarodków umożliwia im przetrwanie i przetrwanie przeszczepu ludzkich komórek nowotworowych. Zarodki młodsze niż 48 hpf mają znacznie niższy wskaźnik przeżycia w porównaniu ze starszymi ...

Rozwój nanocząsteczek, które są zdolne do wykrywania, namierzania i niszczenia komórek rakowych, jest bardzo interesujący zarówno dla fizyków, jak i badaczy biomedycznych. Pojawienie się nanomedycyny doprowadziło do opracowania kilku nanocząstek, takich jak te sprzężone z ligandami celującymi i/lub lekami chemioterapeutycznymi1,2,3. Dodane właściwości nanocząstek umożliwiają ich interakcję z systemem biologicznym, wykrywanie i monitorowanie zdarzeń biologicznych z wysoką wydajnością i dokładnością wraz z zastosowaniami terapeutycznymi. Nanocząstki złota i tlenku żelaza są stosowane głównie w zastosowaniach związanych z tomografią komputerową i rezonansem magnetycznym. Podczas gdy aktywność enzymatyczna nanocząstek złota i tlenku żelaza pozwala na wykrywanie komórek rakowych za pomocą testów kolorymetrycznych, nanocząstki fluorescencyjne dobrze nadają się do zastosowań w obrazowaniu in vivo4. Wśród nich szczególnie korzystne są ultrajasne nanocząstki fluorescencyjne, ze względu na ich zdolność do wczesnego wykrywania nowotworów przy mniejszej liczbie cząstek i zmniejszonej toksyczności5.
Pomimo tych zalet, nanocząstki wymagają eksperymentów z wykorzystaniem modeli zwierzęcych in vivo w celu wyboru odpowiednich nanomateriałów i optymalizacji procesu syntezy. Ponadto, podobnie jak leki, nanocząstki opierają się na modelach zwierzęcych do badań przedklinicznych w celu określenia ich skuteczności i toksyczności. Najczęściej stosowanym modelem przedklinicznym jest mysz, która jest ssakiem, którego utrzymanie wiąże się ze stosunkowo wysokimi kosztami. Do badań nad rakiem zwykle używa się myszy modyfikowanych genetycznie lub myszy ksenoprzeszczepionych6,7. Czas trwania tych eksperymentów często wynosi od tygodni do miesięcy. W szczególności w przypadku badań nad przerzutami nowotworowymi komórki rakowe są bezpośrednio wstrzykiwane do układu krążenia myszy w miejscach takich jak żyły ogonowe i śledziona8,9,10. Modele te reprezentują tylko końcowe etapy przerzutów, gdy komórki nowotworowe wynaczyniają się i kolonizują odległe narządy. Ponadto, ze względu na problemy z widocznością, szczególnie trudne jest monitorowanie migracji komórek nowotworowych i celowanie w nanocząstki komórek nowotworowych u myszy.
Danio rerio danio pręgowany (Danio rerio) stał się potężnym systemem kręgowców do badań nad rakiem ze względu na swoją wysoką płodność, niski koszt, szybki rozwój, przejrzystość optyczną i ochronę genetyczną11,12. Kolejną przewagą danio pręgowanego nad modelem mysim jest zapłodnienie jaj ryb ex utero, co pozwala na monitorowanie zarodków przez cały okres ich rozwoju. Rozwój embrionalny u danio pręgowanego jest szybki, a w ciągu 24 godzin po zapłodnieniu (hpf) płaszczyzna ciała kręgowców już się uformowała13. Do 72 hpf jaja wykluwają się z kosmówki, przechodząc z etapu embrionalnego do narybku. Przezroczystość danio pręgowanego, w szczególności szczepu Casper14, daje wyjątkową okazję do wizualizacji migracji komórek rakowych oraz ich rozpoznawania i celowania przez nanocząstki u żywego zwierzęcia. Wreszcie, danio pręgowany rozwija swój wrodzony układ odpornościowy o 48 hpf, przy czym adaptacyjny układ odpornościowy pozostaje w tyle i staje się funkcjonalny dopiero po 28 dniach od zapłodnienia15. Ta luka czasowa jest idealna do przeszczepiania różnych typów ludzkich komórek rakowych do zarodków danio pręgowanego bez doświadczania odrzucenia immunologicznego.
Opisana tutaj jest metoda, która wykorzystuje przejrzystość i szybki rozwój danio pręgowanego, aby zademonstrować rozpoznawanie i celowanie w ludzkie komórki rakowe za pomocą fluorescencyjnych nanocząsteczek in vivo. W tym teście ludzkie komórki raka szyjki macicy (komórki HeLa) genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji białka czerwonej fluorescencji zostały wstrzyknięte do unaczynionego obszaru w jamie okołopęcherzowej 48 zarodków hpf. Po 20-24 godzinach komórki HeLa rozprzestrzeniły się już po zarodkach przez układ krążenia ryb. Zarodkom z widocznymi przerzutami wstrzyknięto mikroiniekcję ~0,5 nL roztworu nanocząstek bezpośrednio za okiem, gdzie znajduje się bogate łożysko kapilarne. Korzystając z tej techniki, ultrajasne fluorescencyjne nanocząstki krzemionki mogą celować w komórki HeLa już po 20-30 minutach od wstrzyknięcia. Ze względu na swoją prostotę i skuteczność, danio pręgowany stanowi solidny model in vivo do testowania różnych nanocząstek pod kątem ich zdolności do celowania w określone komórki rakowe.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>KSE scientific</td><td>BMK-A1705</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>1,0 mm OD x 0,78 mm</td><td></td></tr><tr><td>Komputer i monitor</td><td>ThinkCentre</td><td>X000335</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>sprzedawany przez Fisher</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do ryb</td><td>VWR</td><td>35960-056</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>marki Fishersci</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do mikroładowarki</td><td>Eppendorf</td><td>E5242956003</td><td>sprzedawana przez Fisher</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MMPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Olympus MVX-10</td> Końcówka <td>Olympus</td><td>MVX-10</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Marka</td> <td>Fishersci<a href="https://www.fishersci.com/shop/products/corning-universal-fit-pipet-tips-bulk-packed-6/07200293?keyword=true" target="_blank">07-200-293</a></td><td></td></tr><tr><td>PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>sprzedawany przez Fisher</td></tr><tr><td>Petri szalka Corning</td><td></td><td>SB93102</td><td>sprzedawany przez Fisher</td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta</td><td>marki Fishersci</td><td>50-998-100</td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.addgene.org/113726/" target="_blank">pLenti6.2_miRFP670</a></td><td>Addgene</td><td>13726</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa pico</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYSPV820</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche-Sigma-Fisher</td><td>50-100-3275</td><td>Produkt Roche firmy Sigma - sprzedawany przez Fisher</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>marki Fishersci</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny SZ51</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy</td><td>Western Chemicals</td><td>NC0872873</td><td>sprzedawane przez Fisher</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td>sprzedawany przez</td></tr><tr><td>pęsetę</td><td>Fisher marki Fishersci</td><td>12-000-122</td><td></td></tr></tbody></table>

celowanie in vivo w ksenoprzeszczepowane ludzkie komórki rakowe za pomocą funkcjonalizowanych fluorescencyjnych nanocząstek krzemionki u danio pręgowanego

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Rozwój nanocząsteczek zdolnych do wykrywania, namierzania i niszczenia komórek nowotworowych jest bardzo interesujący w dziedzinie nanomedycyny. Modele zwierzęce in vivo są niezbędne do połączenia nanotechnologii z jej zastosowaniem biomedycznym. Mysz reprezentuje tradycyjny model zwierzęcy do badań przedklinicznych; Jednak myszy są stosunkowo drogie w utrzymaniu i mają długie cykle eksperymentalne ze względu na ograniczone potomstwo każdej matki. Danio pręgowany stał się potężnym systemem modelowym dla badań rozwojowych i biomedycznych, w tym badań nad rakiem. W szczególności, ze względu na przezroczystość optyczną i szybki rozwój, zarodki danio pręgowanego dobrze nadają się do monitorowania in vivo w czasie rzeczywistym zachowania komórek nowotworowych i ich interakcji z ich mikrośrodowiskiem. Metoda ta została opracowana w celu sekwencyjnego wprowadzania ludzkich komórek rakowych i funkcjonalizowanych nanocząstek do przezroczystych zarodków zebry zebry Casper oraz monitorowania in vivo rozpoznawania i celowania w komórki rakowe za pomocą nanocząstek w czasie rzeczywistym. Ten zoptymalizowany protokół pokazuje, że znakowane fluorescencyjnie nanocząstki, które są funkcjonalizowane grupami folianów, mogą specyficznie rozpoznawać i celować w przerzutowe ludzkie komórki nabłonka szyjki macicy znakowane innym fluorochromem. Proces rozpoznawania i celowania może nastąpić już po 30 minutach od wstrzyknięcia badanych nanocząstek. Cały eksperyment wymaga jedynie wyhodowania kilku par dorosłych ryb i trwa mniej niż 4 dni. Co więcej, zarodki danio pręgowanego nie mają funkcjonalnego adaptacyjnego układu odpornościowego, co pozwala na wszczepienie szerokiej gamy ludzkich komórek rakowych. W związku z tym użyteczność opisanego tutaj protokołu umożliwia testowanie nanocząstek na różnych typach ludzkich komórek nowotworowych, ułatwiając wybór optymalnych nanocząstek w każdym konkretnym kontekście nowotworu do przyszłych testów na ssakach i w klinice.

Schemat protokołu na Rysunku 1 przedstawia ogólne procedury zastosowane w niniejszym badaniu. Przezroczyste dorosłe ryby Casper (samce i samice) rozmnażano w celu uzyskania embrionów (sekcja 1). Komórki HeLa RFP+ wstrzykiwano w obszar unaczyniony pod jamą okożółtkową embrionów danio pręgowanego w 48 hpf; embriony niewstrzyknięte służyły jako kontrole (sekcja 3). W przypadku osób doświadczonych w mikroiniekcjach przeżywalność embrionów jest często wys...

Opisana tutaj jest metoda wykorzystania embrionów danio pręgowanego do badania zdolności funkcjonalizowanych nanocząsteczek do celowania w ludzkie komórki rakowe in vivo. Metoda ta pozwala na ocenę i wybór optymalnych nanocząstek do przyszłych badań na dużych zwierzętach oraz w badaniach klinicznych.

Celowanie in vivo w ksenoprzeszczepowane ludzkie komórki rakowe za pomocą funkcjonalizowanych fluorescencyjnych nanocząstek krzemionki u danio pręgowanego

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Procedura ta pozwala naukowcom ocenić i wybrać optymalne nanocząstki do badań na dużych zwierzętach i badań klinicznych. Ta prosta metoda pomaga określić, czy nanocząstka może celować w ludzkie komórki rakowe in vivo, a jeśli tak, to jak skuteczne jest to celowanie. Procedury zademonstrują dr Xiodan Qin, doktor habilitowany, oraz pan Andrew Lam, technik badawczy z naszego laboratorium.Napełnij wieczorem dwa zbiorniki komorowe wodą dla ryb i oddziel górne zbiorniki za pomocą przegród. Umieść samca danio pręgowanego po jednej stronie komory, a jedną lub dwie samice danio pręgowanego po drugiej stronie komory. Usuń przegrody o 8:00 rano następnego dnia.Dodaj sztuczne rośliny wzbogacające i lekko przechyl górną komorę, aby uzyskać płytki obszar wody. Pozwól danio pręgowanemu rozmnażać się przez trzy do czterech godzin i zbierz jaja z dolnej komory, przelewając wodę przez siatkę. Przenieś jajka na szalkę Petriego, na której nie ma więcej niż 200 jajek na szalkę.Usuń wszelkie martwe lub niezapłodnione jaja. Napełnij naczynie w dwóch trzecich świeżą wodą rybną i umieść je w inkubatorze. Po 24 godzinach wyjmij naczynie z inkubatora i usuń z niego jak najwięcej wody.Dodaj kilka kropli jednego miligrama na mililitr roztworu pronazy i delikatnie zakręć naczyniem. Kiedy kosmówka wykazuje oznaki rozpadu, należy kilkakrotnie pipetować zarodki w górę iw dół, aby rozbić kosmówkę i uwolnić zarodki. Gdy większość zarodków wyjdzie z kosmówki, natychmiast dodaj świeżą wodę z ryb, aby zakończyć proces.Opłucz zarodki trzykrotnie wodą rybną, aby usunąć pływające kosmówki Zwróć zarodki do inkubatora. Przygotuj 3% roztwór agarozy, dodając trzy gramy agarozy do elektroforezy do 100 mililitrów autoklawowanej wody dla ryb. Podgrzewaj agarozę i wodę w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści.Aby utworzyć płytkę wtryskową, wlej gorący roztwór agarozy do szalki Petriego, aż będzie pełna w trzech czwartych i umieść mikroformę wtryskową na agarozie. Po zestaleniu się agarozy ostrożnie usuń pleśń. Napełnij powstałą płytkę iniekcyjną autoklawowaną wodą dla ryb i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aby wykonać igły do wstrzykiwań, należy pociągnąć kapilary ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej jednego milimetra na 0,78 milimetra za pomocą ściągacza do pipet. Igły iniekcyjne należy przechowywać na szpachli na dużej szalce Petriego, którą przetarto ręcznikiem etanolowym. Przed pobraniem komórek HeLa należy ponownie podgrzać płytkę iniekcyjną i wodę dla ryb w inkubatorze w temperaturze 35,5 stopni Celsjusza.30 minut do godziny przed przeszczepem zbierz komórki HeLa. Pracując w kapturze do hodowli tkankowych, usunąć pożywkę z kolby przez aspirację. Przepłukać komórki sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie ślady pożywki.Dodaj trzy mililitry sterylnej trypsyny EDTA do kolby i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Obserwować kolbę pod mikroskopem w celu monitorowania postępu trawienia enzymatycznego. Gdy około 80% komórek zostanie zawieszonych, dodaj do kolby od sześciu do ośmiu mililitrów pożywki wzrostowej.Zebrać komórki, delikatnie pipetując, i przenieść je do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować probówkę o stężeniu 135 razy G przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki HeLa w trzech mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej.Po dwukrotnym powtórzeniu kroków mycia, ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze kompletnej pożywki wzrostowej. Następnie policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. Po ponownym odwirowaniu komórek usunąć supernatant.Ponownie zawiesić komórki w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej o stężeniu pięć razy 10 do siódmych komórek na mililitr. Utrzymuj komórki w cieple, trzymając rurkę w jednej ręce podczas transportu do obiektu rybnego. Za pomocą plastikowej pipety umieścić zarodki danio pręgowanego na płytce iniekcyjnej.Połóż zarodki na bokach z przednią skierowaną do przodu wyrównaną z rowkami na płytce. Włącz źródło powietrza i mikrowtryskiwacz. Po pobraniu komórek HeLa z inkubatora, należy pipetować komórki w górę i w dół od 20 do 30 razy za pomocą P200.Za pomocą końcówki ładującej żel z odciętym końcem, natychmiast załaduj trzy mikrolitry zawiesiny komórek HeLa do jednej z igieł iniekcyjnych. Wprowadzić igłę do uchwytu igły i umieścić płytkę iniekcyjną pod mikroskopem. Wstrzyknąć mieszaninę komórek do zarodka w unaczynionym obszarze pod jamą okołonogową, naciskając pedał nożny.Następnie naniec na zarodek pipetą kilka kropel sterylnej wody rybnej. Aby kontynuować proces wstrzykiwania, należy przesunąć płytkę iniekcyjną ręką niedominującą do następnego zarodka, a następnie ręką dominującą wysunąć i schować wstrzykiwacz, jednocześnie naciskając pedał nożny. Zakończyć wstrzyknięcie wszystkich zarodków na płytkę i umyć zarodki sterylną wodą rybią na sterylnej szalce Petriego.Natychmiast inkubuj naczynie w temperaturze 35,5 stopnia Celsjusza. Po trzech godzinach zbadaj wstrzyknięte zarodki i usuń martwe. Następnego dnia przygotuj igły iniekcyjne dla nanocząstek i przechowuj je na szpachli na dużej szalce Petriego.Pracując pod mikroskopem fluorescencyjnym, ostrożnie podnieś zarodki z przerzutami do ogona i umieść je na nowej płytce iniekcyjnej ze sterylną wodą dla ryb. Dla każdego danio pręgowanego z przerzutami do ogona wstrzyknąć roztwór nanocząsteczek lub wodę za okiem. Wstrzyknąć również roztwór nanocząsteczek za oczami danio pręgowanego w grupie kontrolnej, która nie otrzymała przeszczepu HeLa, i inkubować wszystkie wstrzyknięte zarodki w temperaturze 35,5 stopni Celsjusza.Natychmiast po wstrzyknięciu i ponownie w odstępach 30 do 60 minut, przenieść dwa do trzech zarodków na szalkę Petriego i unieruchomić je, dodając pięć kropli rozcieńczonego roztworu MS222. Gdy zarodki przestaną pływać, usuń większość wody, aby zarodki mogły leżeć na boku. Za pomocą pipety z cienką, miękką szczoteczką przymocowaną do jej końca, wyrównaj zarodki tak, aby leżały przodem skierowanym do przodu i widoczne było tylko jedno oko.Korzystając z 2-krotnego powiększenia, uchwyć obrazy całego zarodka na kanałach czerwonym, niebieskim i Brightfield. Aby uchwycić obszar ogona, zobrazuj zarodki w powiększeniu 6,4x. Skoncentruj zarodek pod czerwonym kanałem, aby uniknąć krwawienia nanocząstek.Natychmiast po obrazowaniu należy dodać świeżą wodę rybną do zarodków i wstawić je z powrotem do inkubatora. Zarodki danio pręgowanego, którym wstrzyknięto i zarodki kontrolne, zobrazowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Czerwone kropki to przerzutowe ludzkie komórki raka szyjki macicy, podczas gdy niebieskie kropki reprezentują nanocząsteczki.W jednej grupie kontrolnej danio pręgowany, któremu wstrzyknięto komórki rakowe, ale nie nanocząsteczki, fluorescencyjne komórki HeLa były widoczne w kanale czerwonym i nie wykryto żadnych specyficznych sygnałów fluorescencyjnych w kanale niebieskim. W drugiej grupie kontrolnej danio pręgowanemu wstrzyknięto nanocząsteczki, ale nie komórki rakowe. Niebieskie nanocząstki fluorescencyjne były rozmieszczone w całym układzie krążenia.Nie było widać specyficznego czerwonego kwiatostanu. Kiedy danio pręgowany z przerzutami do ogona wstrzyknięto nanocząsteczki, nałożone obrazy z kanałów czerwonego i niebieskiego pokazują kolokalizację komórek HeLa i nanocząstek. Po wykonaniu tej metody możemy przeanalizować obciążenie guzem i przeżycie komórek rakowych, zwierzęta z wstrzykiwaniem nanocząstek i bez nich, aby dostosować ich zdolność do zabijania komórek rakowych.Technika ta może ułatwić wybór optymalnej nanocząstki, która może specyficznie rozpoznać komórkę nowotworową in vivo, prowadząc do wczesnego wykrywania raka i przerzutów do raka.

in-vivo-targeting-xenografted-human-cancer-cells-with-functionalized

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania komórek raka piersi do przestrzeni okołobiałkowej transgenicznych embrionów danio pręgowanego. Po inkubacji wizualizujemy zarodek pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby obserwować inwazję, rozprzestrzenianie się i przerzuty komórek rakowych.

Analiza inwazyjności zPDX: badanie inwazyjnego zachowania przerzutowych komórek rakowych w ksenoprzeszczepach zarodków danio pręgowanego

Ten film opisuje test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego w celu oceny powstawania nowotworów in vivo i zbadania efektu środków terapeutycznych.

Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego: metoda oceny skuteczności przeciwnowotworowej leków na rakotwórczość u danio pręgowanego in vivo

Ten film opisuje metodę przeszczepu komórek nowotworowych z modelu dawcy czerniaka do biorcy z obniżoną odpornością, zebry Casper. Pomaga uwidocznić wszczepienie i proliferację guza u ryb biorcy.

Test przeszczepu podskórnego: metoda przeszczepiania komórek czerniaka od dawcy do biorcy modelu danio pręgowanego

Ta metoda wykorzystuje embriony danio pręgowanego do skutecznego testowania inwazyjnej zdolności komórek rakowych do naczyń krwionośnych. Fluorescencyjne komórki rakowe są wstrzykiwane do zatoki przedsercowej lub woreczka żółtkowego rozwijających się zarodków. Inwazję naczyniową i wynaczynienie komórek rakowych ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej obszaru ogonowego od 24 do 96 godzin później.

Badanie inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek nowotworowych u danio pręgowanego (Danio rerio)

Tutaj opisujemy modele ksenoprzeszczepu danio pręgowanego za pomocą dwóch różnych miejsc iniekcji, tj. przestrzeni perivitelinowej i kanału Cuviera, aby zbadać inwazyjne zachowanie i ocenić potencjał wewnątrznaczyniowy i wynaczynieniowy ludzkich komórek raka piersi, odpowiednio.

Inwazyjne zachowanie ludzkich komórek raka piersi u embrionalnego danio pręgowanego

Celem tej metody jest wygenerowanie in vivo modelu angiogenezy guza poprzez ksenografowanie komórek nowotworowych ssaków do zarodka danio pręgowanego, który ma fluorescencyjnie znakowane naczynia krwionośne. Obrazując ksenoprzeszczep i związane z nim naczynia, można uzyskać ilościowy pomiar odpowiedzi angiogennej.

Obrazowanie in vivo i kwantyfikacja odpowiedzi angiogennej gospodarza w ksenoprzeszczepach guza danio pręgowanego

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Modele przedkliniczne mają na celu poszerzenie wiedzy na temat biologii nowotworów i przewidywanie skuteczności leczenia. W artykule opisano wytwarzanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (zPDX) na podstawie danio pręgowanego z fragmentami tkanki nowotworowej. ZPDX leczono chemioterapią, której efekt terapeutyczny oceniano pod kątem apoptozy komórek przeszczepionej tkanki.

Opracowanie ksenoprzeszczepów raka trzustki od pacjentów danio pręgowanego do testów wrażliwości na chemoterapię

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

Poznaj metodę celowania nanocząstek w ludzkie komórki rakowe in vivo przy użyciu modelu danio pręgowanego. Technika ta umożliwia ocenę skuteczności nanocząstek fluorescencyjnych i selekcję optymalnych kandydatów do dalszych badań klinicznych.

Celowanie in vivo w ksenoprzeszczepowane ludzkie komórki rakowe za pomocą funkcjonalizowanych fluorescencyjnych nanocząstek krzemionki u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Celowanie in vivo w ksenoprzeszczepowane ludzkie komórki rakowe za pomocą funkcjonalizowanych fluorescencyjnych nanocząstek krzemionki u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów