Name: Stabilność i struktura głównego kompleksu zgodności tkankowej nietoperzy klasy I z heterologicznąβ 2-mikroglobuliną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Poznaj metodologię uzyskiwania stabilnych kompleksów MHC klasy I z heterologiczną β2-mikroglobuliną u nietoperzy. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej w chorobach zakaźnych i immunoterapii nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez otwarty fundusz państwowego kluczowego laboratorium Biotechnologii Farmaceutycznej, Nan-jing University, Chiny (Grant no. KF-GN-201905), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (granty 81971501). William J. Liu jest wspierany przez Excellent Young Scientist Program NSFC (81822040) oraz Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

1. Przygotowanie konstrukcji wyrażeń
<ol>
	<li>Pobierz sekwencje genów MHC klasy I (w tym geny przewidywane) od nietoperzy z bazy danych NCBI.</li>
	<li>Pobierz sekwencje łańcuchów ciężkich MHC I ssaków wyższych z bazy danych polimorfizmu immunologicznego (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) i bazy danych UniProt (www.uniprot.org).</li>
	<li>Aby uzyskać rozpuszczalne kompleksy MHC, należy zmutaginizować sekwencje w celu usunięcia regionów cytozolowych i transbłonowych.</li>
	<li>Sklonuj geny kodujące ektodomeny nietoperza Ptal-N*01:01 (GenBank no. KT98792919) (pozostałości 1–277) i nietoperzβ 2m (nr GenBank. XP_006920478.1) (reszty 1–98) odpowiednio na wektory pET-28a (Novagen, Pekin, Chiny).</li>
	<li>Wstawienie zoptymalizowanych (dla Escherichia coli) sekwencji wstawiono między miejsca NcoI i EcoR1 zmodyfikowanego wektora pET-28a.</li>
	<li>Skonstruuj ludzkie plazmidy o ekspresjiβ2 m, jak opisano wcześniej20.</li>
</ol>
2. Synteza peptydów
<ol>
	<li>Przewidywanie peptydów
	<ol>
		<li>Jak opisano wcześniej10, aby przebadać peptydy, które mogą wiązać się z Ptal-N*01:01, przewiduj potencjalne peptydy za pomocą ciał białkowych wirusa hendra (HeV) związanego z nietoperzami. Aby uzyskać peptydy o wysokim powinowactwie na podstawie modelu strukturalnego z serwera online, serwer NetMHCpan 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 i Rosetta FlexPepDock22 przewidziały potencjalne wiązanie w wybranej frakcji peptydowej. Ponadto można również korzystać z innego oprogramowania i baz danych, w tym BIMAS, bazy danych epitopów immunologicznych (IEDB), NetCTL 1.2 i SYFPEITHI, z których wszystkie integrują przewidywanie powinowactwa wiązania peptyd-MHC klasy I, transportera związanego z wydajnością transportu przetwarzania antygenu (TAP), proteasomalnego C-końcowego rozszczepienia i czasu połowicznego dysocjacji cząsteczek peptydu-HLA klasy I w ich odczytach.</li>
		<li>Aby przewidzieć peptydy o wysokim poziomie wiązania, należy użyć zarówno serwera NetMHCpan, jak i serwera Rosetta FlexPepDock. 
		UWAGA: Niestety, żadne z opracowanych prognoz nie zgadzało się z danymi eksperymentalnymi. Może to wskazywać, że obecne prognozy dotyczące peptydów wiążących MHC nie były odpowiednie dla ssaków innych niż ludzie i myszy, takich jak nietoperze, które mogą mieć inny sposób wiązania peptydów. Dlatego musimy połączyć różne oprogramowanie prognostyczne i wyniki eksperymentalne do kompleksowej analizy, aby uzyskać peptydy o wysokim powinowactwie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i konserwacja peptydów
	<ol>
		<li>Zamiast generować niestandardowe peptydy, korzystaj z wyspecjalizowanych dostawców usług. Kupuj wszystkie peptydy komercyjnie, korzystając z narzędzi do przewidywania peptydów, które mają wyższy wynik wiązania. Czystość peptydów określono na >95% za pomocą HPLC i spektrometrii mas.</li>
		<li>Wszystkie zakupione peptydy należy przechowywać w postaci liofilizowanego proszku w temperaturze -80 °C i przed użyciem rozpuścić w dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oczyszczanie ciał inkluzyjnych
<ol>
	<li>Transformacja E. coli
	<ol>
		<li>Przekształć 10 ng plazmidu zawierającego łańcuch MHC I Ptal-N * 01:01 H nietoperza lub β człowieka o długości2m lub nietoperza β2m w 100 μl BL21(DE3) E. coli. Kąp się w lodzie przez 30 min.</li>
		<li>Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 90 s, a następnie kąpiel w lodzie przez 2 min.</li>
		<li>Dodać 800 μl bulionu lizogenicznego (LB: ekstrakt drożdżowy, trypton i NaCl; patrz tabela materiałów) do kroku 3.1.2 i wstrząsać z prędkością 200 obrotów na minutę (obr./min) na platformie bujającej w temperaturze 37 °C przez 20 min.</li>
		<li>Nanieść 100 μl zawiesiny bakteryjnej na płytkę zawierającą odpowiednią oporność na antybiotyki (ampicylina: 100 ng/ml), która jest taka sama jak w poprzednich konstruktach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaszczepianie kultur
	<ol>
		<li>Wybierz pojedynczy, niedawno przekształcony klon bakteryjny do 3 ml LB z pożywką antybiotykową (ampicylina: 100 ng/ml) i hodowlą w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min na platformie kołyszącej, aby aktywować bakterie. Kultury można zaszczepiać późno w nocy, aby były gotowe do indukcji następnego ranka.</li>
		<li>Na jedną noc wcześniej przenieść 500 μl aktywowanego materiału bakteryjnego do 50 ml LB z pożywką antybiotykową (ampicylina: 100 ng/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min. Dla wygody podczas przygotowywania następnego inokulatu, zamrozić pozostały aktywowany materiał bakteryjny w 1 ml podwielokrotności (500 μl kultury z 500 μl 40% glicerolu) w temperaturze -80 °C do czasu, gdy potrzebne będzie następne przygotowanie.</li>
		<li>Aby wytworzyć duże ilości białka rekombinowanego, należy przenieść preparat bakteryjny do 2 l LB z pożywką antybiotykową (ampicylina: 100 ng/ml) w stosunku 1:100, inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min. Hodowlę aż do osiągnięcia absorbancji 0,6 przy długości fali 600 nm. Dodać 1 mM izopropylo-1-tio-β-D-galaktopyranozydu (IPTG) (zmieniać stężenie IPTG dla różnych MHC, głównie między 0,1 mM-1 mM) do kolby w celu indukcji ekspresji białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieraj bakterie
	<ol>
		<li>Przenieść bakterie do butelek wirowych i odwirować przy 5000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Od tej pory wszystkie czynności powinny być wykonywane w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić bakterie w 60 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) i uwolnić wyrażone rekombinowane białko za pomocą ultradźwiękowego zakłócacza komórek. 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, program, który ustawiamy na tym urządzeniu, to ultradźwiękowy 6S, interwał 12S, 300 W, 99 razy).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie organów inkluzyjnych
	<ol>
		<li>Odwirować sonikowaną zawiesinę bakteryjną o sile 12 000 x g przez 30 min. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu płuczącego (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Powtórz ten proces jeszcze raz.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 x g przez 10–20 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić ciała inkluzyjne w buforze do resuspensji (50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Pobrać próbkę o objętości 20 μl (ciała inkluzyjne w buforze do sporządzania zawiesiny) dla SDS-PAGE w celu zbadania czystości ciał inkluzyjnych.</li>
		<li>Odwirować pozostały preparat w sile 12 000 x g przez 10–20 minut. Wyrzucić supernatant. Zważyć osad zawierający inkluzje i dodać bufor do rozpuszczania (6 M Gua-HCl, 10% gliceryny, 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) do końcowego stężenia 30 mg/ml. Mieszać powoli za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 4 °C, aż do rozpuszczenia inkluzji w buforze do rozpuszczania.</li>
		<li>Wirować 12 000 x g przez 10–20 minut. Wyrzuć osady.Przechowywać inkluzje w temperaturze -20 °C lub -80 °C. 
		UWAGA: Przed przystąpieniem do oczyszczania ciał inkluzyjnych należy potwierdzić, że indukcja i ekspresja rekombinowanego białka zakończyły się sukcesem. Pobrać próbki z każdej hodowli (pobrane przed i po indukcji IPTG) na żelu białkowym; 15% SDS-PAGE (sds-PAGE skoncentrowana guma:H2O, 30% akrylamid, 1 M Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 10% APS i TEMED; Żel separacyjny SDS-PAGE:H2O, 30% akrylamid, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS i TEMED; patrz Tabela materiałów ) dla β2m, 10% SDS-PAGE dla łańcucha H.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ponowne składanie kompleksu MHC
UWAGA: Efektywność ponownie złożonych ciał inkluzyjnych wpłynie na wydajność uzyskanego białka. Składanie konkuruje z polimeryzacją, dlatego ogólnie przyjmuje się, że ponowne fałdowanie przy niskich stężeniach białka jest najbardziej skuteczną metodą. W niniejszej pracy stężenie ciał inkluzyjnych wynosi 30 mg/ml.
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do ponownego składania.
	<ol>
		<li>Zmieniaj skład buforu do ponownego fałdowania w zależności od białka. Na przykład pH, siła jonowa, warunki redoks i obecność ligandów będą miały wpływ na wyniki ponownego fałdowania. Najczęściej stosuje się na bazie Tris lub HEPES o neutralnym pH o stężeniu NaCl 50-500 mM, ale zależy to również od białka docelowego. Poniżej znajduje się formuła buforu ponownego składania używana w tym artykule.</li>
		<li>Przygotować bufor do składania ze 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 400 mM L-argininy, 2 mM EDTA-2Na.</li>
		<li>Schłodzić bufor do temperatury 4 °C w kolbie o pojemności 250–300 ml, a następnie dodać 5 mM zredukowanego glutationu (GSH) i 0,5 mM utlenionego glutationu (GSSG). Mieszać powoli za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 4 °C przez kolejne 10–20 minut przed dodaniem ciał inkluzyjnych i peptydów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wtryskiwanie i rozcieńczanie łańcucha MHC H i β2m 
	UWAGA: Temperatura, w której odbywa się ponowne składanie, może się różnić, chociaż generalnie, aby zminimalizować agregację, najlepiej jest 4 °C. Używamy rozcieńczenia do ponownego złożenia białek.
	<ol>
		<li>Za pomocą igły ze strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć 1 ml ciał inkluzyjnych hβ2m lub ciał inkluzyjnych bβ2m odpowiednio do dwóch do ponownego składania (każdy o pojemności 1 litra). Wstrzykiwać w pobliżu energicznie obracającego się pręta mieszającego, aby uzyskać szybkie i skuteczne rozcieńczenie. β2m składa się stosunkowo łatwo i pozostaje stabilny nawet w przypadku braku prowadnika H.</li>
		<li>Po rozpuszczeniu β2m w roztworze do ponownego fałdowania, należy rozpuścić peptydy (5 mg/ml) w DMSO i szybko wstrzyknąć 200 μl do roztworu do ponownego fałdowania. Mieszaj powoli przez 10–20 minut przed dodaniem łańcucha H.</li>
		<li>Wstrzyknąć łańcuch H zgodnie z tą samą procedurą opisaną powyżej dla β2m. Łańcuch H jest bardzo niestabilny; Dlatego kolejność wstrzykiwania jest dość ważna. Wstrzyknąć 3 ml ciał inkluzyjnych łańcucha H do dwóch różnych do ponownego składania (każdy o pojemności 1 litra) odpowiednio o wartości hβ2m lub bβ2m. Kolejne wstrzykiwanie małych porcji zamiast jednorazowego stosowania całej ilości białka zwiększa wydajność ponownie sfałdowanego MHC. Ponowne składanie należy odczekać, aż będzie trwało w temperaturze 4 °C przez 8–10 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stężenie ponownie sfałdowanego białka
	<ol>
		<li>Stosować ultrafiltrację w komorze ciśnieniowej z membraną MMCO o mocy 10 kDa w celu zagęszczenia białek fałdowych. Ta metoda jest wygodna i może być połączona z wymianą bufora. Dodać bufor wymienny (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8,0) do komory i stężyć do końcowej objętości 30–50 ml.</li>
		<li>Przenieść roztwór do ponownego składania do probówki wirówkowej, wirować z prędkością 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia osadów.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść supernatant i zagęścić go dalej do końcowej objętości ~1 ml.</li>
		<li>Wirować przy 12 000x g przez 10–20 minut. Przenieść supernatant do sterylnej probówki i oczyścić białka za pomocą kolumny wykluczającej wielkość 10/300 GL.</li>
		<li>Pobrać próbki w momencie piku i przeanalizować je za pomocą SDS–PAGE (15% żel poliakrylamidowy).</li>
		<li>Zebrać pik kompleksu MHC i stężyć do końcowego stężenia 15 mg/ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć kompleks do 7,5 mg/ml i 15 mg/ml w celu krystalizacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Krystalizacja, gromadzenie i przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Przeprowadzić krystalizację skompleksowanego MHC i peptydu przy użyciu techniki dyfuzji parowej w pozycji siedzącej.</li>
	<li>Przesiewaj kompleksy Ptal-N*01:01/peptide za pomocą dostępnych na rynku zestawów kryształowych (np. Zestaw Crystal Screen I/II, zestaw Index Screen, zestaw PEGIon I/II i zestaw PEGRx).</li>
	<li>Uszczelnić otrzymany roztwór i zrównoważyć ze 100 μl roztworu w zbiorniku w temperaturze 4 lub 18 °C.</li>
	<li>Obserwuj wzrost kryształów w kulturze przez 3 dni, 1 tydzień, 2 tygodnie, 1 miesiąc, 3 miesiące i 6 miesięcy. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy każda kropla w kryształowej płytce zawiera kryształy. 
	UWAGA: Kryształy Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) zaobserwowano w 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) i 25% (w/v) glikolu polietylenowym 3,350 w stężeniu 7,5 mg/mL. Kryształy Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) obserwowano w 0,1 M HEPES, pH 7,0, 2% w/v glikolu polietylenowego 3,350 w stężeniu 7,5 mg/mL.</li>
	<li>W celu ochrony kriogenicznej przenieś kryształy do roztworu magazynującego zawierającego 20% glicerolu, a następnie szybko schładzaj w strumieniu gazowego azotu o temperaturze 100 K.</li>
	<li>Zbierz dane dyfrakcji rentgenowskiej z linii badawczej BL19U w ośrodku promieniowania synchrotronowego w Szanghaju (Szanghaj, Chiny).</li>
</ol>
6. Wyznaczanie i analiza struktury
<ol>
	<li>Dzięki danym strukturalnym o wysokiej rozdzielczości, przetwarzaj i skaluj siłę kolekcji za pomocą programu Denzo i pakietu oprogramowania HKL2000 (https://hkl-xray.com/)23.</li>
	<li>Po wybraniu lepszego modelu początkowego w Banku Danych o Białkach (PDB), określ struktury za pomocą wymiany molekularnej za pomocą programu Phaser MR w CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). Wykorzystanym modelem była struktura koordynowana z kodem Banku Danych o Białkach (PDB) 5F1I.</li>
	<li>Użyj udoskonalonego modelu rentgenowskiego do wstępnego udoskonalenia spoiny. Użyj trybów samego uszlachetniania Phenix i stawów odpowiednio dla samego promieniowania rentgenowskiego oraz wspólnego udoskonalania neutronów i promieniowania rentgenowskiego.</li>
	<li>Po każdej rundzie udoskonalania ręcznie sprawdź model z mapami dodatniej gęstości jądrowej Fo − Fc i 2Fo − Fc w klasie Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Ułatwia to prawidłowe rozmieszczenie wód i niektórych atomów D. Wszystkie figury budowli zostały stworzone przez firmę PyMOL (http://www.pymol.org/).</li>
</ol>

<ol><li>Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+known+unknowns+of+antigen+processing+and+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The known unknowns of antigen processing and presentation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).</li>
<li>Bjorkman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+class+I+histocompatibility+antigen%2C+HLA-A2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2.</a> Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).</li>
<li>Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+Daudi+cell+HLA+expression+by+transfection+of+the+mouse+beta+2-microglobulin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).</li>
<li>Zijlstra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+2-microglobulin+deficient+mice+lack+CD4-8%2B+cytolytic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells.</a> Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).</li>
<li>Gao, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+complex+between+human+CD8alpha%28alpha%29+and+HLA-A2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2.</a> Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).</li>
<li>Bjorkman, P. J., Parham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+diversity+of+class+I+major+histocompatibility+complex+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).</li>
<li>Achour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+the+differential+stability+and+receptor+specificity+of+H-2Db+in+complex+with+murine+versus+human+beta+2-microglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin.</a> Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).</li>
<li>Kubota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+serum+beta+2-microglobulin+with+H-2+class+I+heavy+chains+on+the+surface+of+mouse+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture.</a> Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).</li>
<li>Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+2-microglobulin+from+serum+associates+with+MHC+class+I+antigens+on+the+surface+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells.</a> Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).</li>
<li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+presentation+by+bat+MHC+class+I+provides+new+insight+into+the+antiviral+immunity+of+bats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000436(2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+diverse+peptide+accommodation+by+the+rhesus+macaque+MHC+class+I+molecule+Mamu-B%2A17%3A+insights+into+immune+protection+from+simian+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).</li>
<li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+glimpse+of+the+peptide+presentation+by+rhesus+macaque+MHC+class+I%3A+crystal+structures+of+Mamu-A%2A01+complexed+with+two+immunogenic+SIV+epitopes+and+insights+into+CTL+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+peptide+presentation+of+rhesus+macaque+major+histocompatibility+complex+class+I+Mamu-A%2A02+revealed+by+two+peptide+complex+structures+and+insights+into+immune+escape+of+simian+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).</li>
<li>Liu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+T+cell+responses+featured+by+concordant+recognition+of+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus-derived+CD8%2B+T+cell+epitopes+and+host+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC.</a> Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).</li>
<li>Mitaksov, V., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+definition+of+the+H-2Kd+peptide-binding+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversified+anchoring+features+the+peptide+presentation+of+DLA-88%2A50801%3A+first+structural+insight+into+domestic+dog+MHC+class+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I.</a> Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+conformations+of+a+rinderpest+virus+epitope+presented+by+bovine+major+histocompatibility+complex+class+I+N%2A01801%3A+a+host+strategy+to+present+featured+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides.</a> Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).</li>
<li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+illumination+of+equine+MHC+class+I+molecules+highlights+unconventional+epitope+presentation+manner+that+is+evolved+in+equine+leukocyte+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles.</a> Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).</li>
<li>Wynne, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+antigen+processing+machinery+and+endogenous+peptide+presentation+of+a+bat+MHC+class+I+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule.</a> Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+cross-allele+presentation+by+HLA-A%2A0301+and+HLA-A%2A1101+revealed+by+two+HIV-derived+peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes.</a> Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).</li>
<li>Hoof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetMHCpan%2C+a+method+for+MHC+class+I+binding+prediction+beyond+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.</a> Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosetta++FlexPepDock+ab-initio%3A+simultaneous+folding%2C+docking+and+refinement+of+peptides+onto+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors.</a> PLoS One. 6 (4), 18934(2011).</li>
<li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).</li>
<li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+%26+NMR+system%3A+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Glithero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+two+H-2Db%2Fglycopeptide+complexes+suggest+a+molecular+basis+for+CTL+cross-reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity.</a> Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).</li>
<li>Tungatt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+influenza-specific+local+CD8+T-cells+in+the+respiratory+tract+after+aerosol+delivery+of+vaccine+antigen+or+virus+in+the+Babraham+inbred+pig%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig.</a> PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017(2018).</li>
<li>McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+of+ER+retrieval+of+MHC+class+I+by+cowpox%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox.</a> PLoS Biology. 10 (11), 1001432(2012).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+protections+against+human-infecting+avian+influenza+viruses+correlate+to+biased+cross-T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li>
<li>Zhao, L., Cao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cell+therapy+for+cancer+in+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Search+Results%22%5BJournal%5D)">Engineered T cell therapy for cancer in the clinic.</a> Search Results. 10, 2250(2019).</li>
<li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CLUSTAL_X+windows+interface%3A+flexible+strategies+for+multiple+sequence+alignment+aided+by+quality+analysis+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.</a> Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).</li>
<li>Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESPript%2FENDscript%3A+Extracting+and+rendering+sequence+and+3D+information+from+atomic+structures+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Budowa hybrydowego kompleksu białkowego poprzez heterologiczną substytucję z różnych taksonów jest powszechną strategią badań funkcjonalnych i strukturalnych, gdy kompleks homologiczny nie jest dostępny, na przykład w MHC I i jego ligandach. Podsumowanie dotyczące metodologii i technologii jest jednak ograniczone. W artykule przeanalizowano strukturę nietoperza MHC I, Ptal-N*01:01, stabilizowaną przez bβ2m lub hβ2m. Stwierdzono, że kluczowe aminokwasy β2m wiążące się z Ptal-N*01:01 są zac...

Główny kompleks zgodności tkankowej (MHC) występuje u wszystkich kręgowców i jest zestawem genów, które determinują odporność komórkową na zakaźne patogeny. MHC klasy I przedstawia endogenne peptydy, takie jak składniki wirusowe wytwarzane po zakażeniu wirusem, do receptorów limfocytów T (TCR) na powierzchni limfocytów T CD8 + w celu pośredniczenia w odporności komórkowej i uczestniczenia w regulacji immunologicznej1. Badanie strukturalne wiązania MHC I z peptydami dostarcza informacji na temat motywów wiązania peptydów i cech prezentacji przez cząsteczki MHC I, co odgrywa istotną rolę w ocenie odpowiedzi immunologicznej limfocytów T CD8 + i opracowywaniu szczepionek.
Od czasu pierwszej krystalizacji i strukturalnego określenia molekularnego MHC I przez Bjorkmana i wsp.2, analiza struktury krystalicznej cząsteczek MHC I znacznie przyczyniła się do lepszego zrozumienia sposobu wiązania peptydów z cząsteczkami MHC I i pomaga zrozumieć oddziaływanie lekkich łańcuchów z ciężkimi łańcuchami i peptydami. Seria badań uzupełniających wykazała, że chociaż geny kodujące łańcuch lekki nie są związane z MHC, łańcuch lekki jest kluczowym białkiem do składania cząsteczek MHC I3,4. Oddziałuje z trzema domenami cząsteczek MHC klasy I na wielu powierzchniach. Gdy łańcuch lekki jest nieobecny, cząsteczki MHC klasy I nie mogą być prawidłowo wyrażane na powierzchni komórek prezentujących antygen i nie mogą wchodzić w interakcje z TCR w celu wywierania swoich funkcji immunologicznych.
MHC I składa się z ciężkiego łańcucha (łańcuch H) i lekkiego łańcucha (tj.β 2-mikroglobuliny (β2m)), i jest składany poprzez wiązanie z odpowiednim peptydem5. Zewnątrzkomórkowy segment łańcucha H składa się z domen α1, α2 i α36. Domeny α1 i α2 tworzą rowek wiążący peptydy (PBG). Łańcuch βo długości 2m działa jako podjednostka strukturalna kompleksu montażowego w MHC I, stabilizując konformację kompleksu, i jest molekularnym opiekunem dla składania łańcucha MHC I H7,8,9. Seria badań wykazała, że MHC I H łańcuchy od różnych ssaków, takich jak nietoperze (Chiroptera) (Ptal-N*01:: 01)10, makak rezus (naczelne) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mysz (Rodentia) (H-2Kd)14,15, pies (Carnivora) (DLA-88*50801)16, bydło (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 i końskie (Perissodactyla) (Eqca-N*00602 i Eqca-N*00601)18 mogą łączyć się z heterologicznymi β2m (Tabela 1). Te hybrydowe cząsteczki są często wykorzystywane w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych. Jednak metodologia badania funkcjonalnego i strukturalnego hybrydowego MHC I o β heterologicznym2m nie została jeszcze podsumowana. Tymczasem podstawa strukturalna wymiany β2m między różnymi taksonami pozostaje niejasna.
Tutaj podsumowano procedurę wyrażania MHC I, ponownego fałdowania, krystalizacji, zbierania danych o kryształach i określania struktury. Ponadto analizowane są potencjalne podstawienia β2m od różnych gatunków poprzez porównanie konformacji strukturalnej MHC I stabilizowanej przez homologiczne i heterologiczne β2m. Metody te będą pomocne w dalszych badaniach strukturalnych MHC I i ocenie odpowiedzi immunologicznej limfocytów T CD8 + w nowotworach i chorobach zakaźnych.

<table><tbody><tr><td>Membrana 10 kDa MMCO</td><td>Merck milipore</td><td>PLGC07610</td><td></td></tr><tr><td>30% akryloamidu</td><td>LABLEAD</td><td>A3291-500ml * 5</td><td></td></tr><tr><td>5 razy; Białko SDS Ładowanie</td><td>Novoprotein</td><td>PM099-01A</td><td></td></tr><tr><td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff</td><td>Merck millipore</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Inalco</td><td>1758-9314</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) szczep</td><td>TIANGEN</td><td>CB105-02</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP</td><td>219605580</td><td>Nosić odpowiednie rękawice i ochronę oczu/twarzy. W przypadku kontaktu z oczami natychmiast przemyć dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza.</td></tr><tr><td>Rękawice</td> i gogle DTT <td>Solarbio</td><td>D1070</td><td>należy nosić i obsługiwać w wentylowanej kuchni. W przypadku kontaktu z oczami natychmiast przemyć dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza.</td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>KeyGEN BioTECH</td><td>KGT515500</td><td></td></tr><tr><td>Gliceryna</td><td>HUSHI</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>GSH</td><td>Amresco</td><td>0399-250G</td><td></td></tr><tr><td>GSSG</td><td>Amresco</td><td>0524-100G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny</td><td>Amresco</td><td>E424-5KG</td><td></td></tr><tr><td>h&beta; 2m</td><td>nasze laboratorium</td><td></td><td>Zhang, S. i wsp. Strukturalne podstawy prezentacji alleli krzyżowych przez HLA-A*0301 i HLA-A*1101 ujawnione przez dwa kompleksy peptydowe pochodzące z HIV. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Inalco</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek L-argininy</td><td>Amresco</td><td>0877-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio</td><td>S8210</td><td></td></tr><tr><td>Marker białkowy</td><td>Fermentas</td><td>26614</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Boao Rui Jing</td><td>A112130</td><td></td></tr><tr><td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice</td> i gogle TEMED <td>Thermo</td><td>17919</td><td>należy nosić i obsługiwać w wentylowanej kuchni.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biolinijka</td><td>RH30056-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

stabilność i struktura głównego kompleksu zgodności tkankowej nietoperzy klasy i z heterologicznąβ 2-mikroglobuliną

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

Główny kompleks zgodności tkankowej (MHC) odgrywa kluczową rolę w prezentacji peptydu antygenowego i odpowiedziach immunologicznych limfocytów T na choroby zakaźne i rozwój nowotworu. Hybrydowy MHC I skompleksowany z heterologicznym β podstawieniem 2-mikroglobuliny (β2m) z różnych gatunków można ustabilizować in vitro. Jest to realny sposób badania MHC I ssaków, gdy β homologiczny2m nie jest dostępny. Tymczasem wskazuje się, że β ssaków substytucja2m nie wpływa istotnie na prezentację peptydów. Istnieje jednak ograniczone podsumowanie dotyczące metodologii i technologii hybrydowego MHC I skompleksowanego z heterologicznąβ 2-mikroglobuliną (β2m). W artykule przedstawiono metody oceny możliwości substytucji heterologicznej β2m w badaniu MHC I. Metody te obejmują przygotowanie konstrukcji wyrażeń; oczyszczanie ciał inkluzyjnych i ponowne składanie kompleksu MHC; oznaczanie termostabilności białek; przesiewanie kryształów i oznaczanie struktury. Badanie to dostarcza zaleceń dotyczących zrozumienia funkcji i struktury MHC I, a także ma znaczenie dla oceny odpowiedzi limfocytów T podczas immunoterapii chorób zakaźnych i nowotworów.

W poprzednich badaniach wykazano, że pochodzący z HeV peptyd HeV1 (DFANTFLP) był prezentowany przez Ptal-N*01:0110,19. W niniejszej pracy oceniono zdolność wiązania tego peptydu z Ptal-N*01:01 w obecności homologicznej batiej β2m (bβ2<...

Protokół opisuje eksperymentalne metody uzyskiwania stabilnego głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I poprzez potencjalne β podstawienia 2-mikroglobuliny (β2m) od różnych gatunków. Przeprowadzono porównanie strukturalne MHC I stabilizowanego β homologicznym i heterologicznym 2 m.

Stabilność i struktura głównego kompleksu zgodności tkankowej nietoperzy klasy I z heterologicznąβ 2-mikroglobuliną

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

W tym badaniu wykorzystaliśmy Bat MHC klasy I jako model do podsumowania metodologii i oceny wykonalności hybrydowego MHC klasy I skompleksowanego z heterologiczną mikroglobuliną beta-2. Wcześniejsze badania wykazały, że substytucja B2M u ssaków nie wpływa znacząco na prezentację peptydów. W rzeczywistości hybrydowy MHC klasy I może aktywować podobną strukturę i funkcję do oryginalnej cząsteczki.Techniki te mogą być wykorzystane do ułatwienia funkcjonalnego i ustrukturyzowanego badania MHC I do oceny odpowiedzi tkanek podczas immunoterapii chorób zakaźnych i nowotworów. W celu transformacji kultury E. coli dodać 10 nanogramów plazmidu zawierającego nietoperz lub człowieka MHC klasy I beta dwuwodorowego mikroglobuliny do 100 mikrolitrów wyrównanej zawiesiny i kąpać zawiesinę w lodzie przez 30 minut. Pod koniec inkubacji bakterie poddawane są szokowi cieplnemu przez 90 sekund w temperaturze 42 stopni Celsjusza, a następnie wlewa się kulturę do łaźni lodowej na dwie minuty.Następnie dodaj 800 mikrolitrów bulionu lizogenicznego do kultury i potrząsaj zawiesiną na platformie bujanej przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę. Pod koniec inkubacji rozprowadzić 100 mikrolitrów bakterii na odpowiednim ostrzu hodowli odpornym na antybiotyki. Następnego ranka wybierz pojedynczy niedawno przekształcony klon bakteryjny i zaszczep go trzema mililitrami LB z pożywką antybiotykową.Umieść kulturę na platformie bujanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 12 do 16 godzin. Następnego ranka przenieś 500 mikrolitrów aktywowanego materiału bakteryjnego do 50 mililitrów LB z pożywką antybiotykową i zwróć bakterie do inkubatora na bieguny na noc. Podziel pozostały aktywowany bulion bakteryjny na 500 mikrolitrów podwielokrotności i dodaj każdą podwielokrotność do 500 mikrolitrów objętości 40% glicerolu, do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby wytworzyć duże ilości rekombinowanego białka, następnego ranka przenieś zawiesinę bakteryjną do dwóch litrów LB z pożywką antybiotykową w stosunku jeden do 100 i wróć do inkubatora kołyszącego, aż do osiągnięcia absorbancji 0,6 przy 600 nanometrach. Następnie dodaj jeden milimolowy IPTG do hodowli, aby wywołać ekspresję genu trans. Po czterech do sześciu godzinach indukcji przenieś kulturę bakteryjną do butelek w celu odwirowania i ponownie zawieś granulki komórek bakteryjnych w 60 mililitrach PBS na butelkę.Następnie uwolnij wyrażone rekombinowane białko za pomocą ultradźwiękowego zakłócacza komórkowego 99 razy, przez sześć sekund i w odstępie 12 sekund przy 300 watach na sonikację. W celu oczyszczenia ciała należy zebrać sonikowane bakterie przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w odpowiedniej objętości buforu płuczącego na dwa dodatkowe wirowania. Po drugim przemyciu ponownie zawiesić ciała inkluzji i bufor do re-zawiesiny, a następnie odłożyć 20 mikrolitrów podwielokrotności próbki na stronę SDS w celu zbadania czystości ciała inkluzji.Odwirować pozostałą próbkę i zważyć inkluzję zawierającą osad. Dodać bufor do rozpuszczenia do granulek do końcowego stężenia 30 miligramów inkluzji na mililitr buforu. I za pomocą mieszadła magnetycznego powoli mieszać roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż ciała inkluzyjne rozpuszczą się w buforze do rozpuszczania.Po wyrzuceniu osadów należy przechowywać inkluzje w temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza. W przypadku ponownego fałdowania kompleksu MHC dodaj pięciomilimolowy zredukowany glutation i 0,5 milimolowy utleniony glutation w ilości od 250 do 300 mililitrów, bufor do ponownego fałdowania o czterech stopniach Celsjusza. I powoli mieszaj roztwór na mieszadle magnetycznym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 do 20 minut.W przypadku rozcieńczenia łańcucha wodorowego MHC i beta dwóch mikroglobulin, załaduj ciało inkluzji do jednomililitrowej strzykawki i wstrzyknij całą mililitrową objętość roztworu ciała inkluzji do jednego litra buforu do ponownego składania w pobliżu mieszadła, aby uzyskać szybkie i skuteczne rozcieńczenie. Następnie rozpuść pięć miligramów na mililitr peptydu w sulfotlenku dimetylu i szybko wstrzyknij 200 mikrolitrów peptydu do roztworu do ponownego fałdowania, jak właśnie pokazano. Po 10 do 20 minutach powolnego mieszania wstrzyknąć trzy mililitry ciał inkluzyjnych łańcucha H do nowej litrowej objętości bufora do ponownego składania i pozwól na ponowne składanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez osiem do 10 godzin.Aby określić stężenie ponownie złożonego białka, dodaj bufor wymienny do komory ciśnieniowej z membraną 10 kilodaltonowej oksydazy wielomiedziowej i skoncentruj bufor do objętości od 30 do 50 mililitrów. Przenieść roztwór do ponownego składania do probówki wirówkowej i usunąć osady przez odwirowanie. Ostrożnie przenieść supernat do komory i dalej zagęścić bufor do końcowej objętości około jednego mililitra.Usunąć wszelkie końcowe zanieczyszczenia przez odwirowanie i przenieść supernat do sterylnej probówki. Użyj kolumny wykluczającej rozmiar dziesięciu trzystu GL, aby oczyścić białka, zbierając próbki w szczycie i analizując je za pomocą strony SDS. Zebrać pik kompleksu MHC i skoncentrować białko do końcowego stężenia 15 miligramów na mililitr.Następnie rozcieńczyć kompleks do stężenia 7,5 miligrama na mililitr. Aby przeprowadzić krystalizację kompleksu MHC i peptydu przy użyciu techniki dyfuzji parowej w pozycji siedzącej, dodaj 0,8 mikrolitra próbki do komercyjnej płytki krystalicznej i uszczelnij płytkę. Zrównoważyć roztwór próbki ze 100 mikrolitrami roztworu w zbiorniku w temperaturze 4 lub 18 stopni Celsjusza i używać mikroskopu, aby regularnie obserwować wzrost kryształów przez następne sześć miesięcy.W celu ochrony kriogenicznej, pod koniec eksperymentu, przenieś kryształy do roztworu do przechowywania zawierającego 20% glicerolu, a następnie szybko schłodź próbki w strumieniu azotu gazowego o temperaturze 100 stopni Kelvina. Następnie zbierz dane dyfrakcji rentgenowskiej zgodnie ze standardowymi protokołami. Aby określić strukturę kompleksów krystalicznych, należy otworzyć dane strukturalnej dyfrakcji rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości w programie Denzo w pakiecie oprogramowania HK L 2000 i wybrać początkowy model w banku danych białkowych.Aby określić strukturę białka, otwórz dane w programie Phaser MR w CCP4 i użyj udoskonalonego modelu rentgenowskiego do wstępnego udoskonalenia stawów. Następnie użyj trybów samego uszlachetniania Phoenix i stawów do uszlachetniania samego promieniowania rentgenowskiego oraz połączonego neutronu do udoskonalania promieniowania rentgenowskiego. Po każdej rundzie udoskonalania ręcznie sprawdź model z mapami dodatniej gęstości jądrowej Fo-Fc i 2Fo-Fc w Coot.W tych reprezentatywnych eksperymentach oceniano zdolności wiązania peptydu Hendra One wirusa Hendra pochodzącego z wirusa Hendra z łańcuchami wodorowymi MHC klasy I nietoperzy z homologiczną mikroglobuliną beta beta 2 i heterologiczną ludzką mikroglobuliną beta 2. W obu analizach kryształy o wysokiej rozdzielczości powstały w wyniku renaturyzacji łańcuchem lekkim beta dwóch mikroglobulin. W przypadku braku mikroglobuliny beta 2 kompleksy te nie powstają.W łańcuchu wodorowym MHC klasy I Hendra wirus on, ludzka struktura mikroglobuliny beta dwa, konserwatywne reszty H31, D53, W60 i Y63 ludzkiej mikroglobuliny beta dwóch, które odpowiadają mikroglobulinie beta beta two, stykają się z dnem rowka wiążącego peptydy i konserwują reszty Q8, Y10, R12 i 24, które odpowiadają dwóm mikroglobulinom beta związanym z domeną alfa trzy. W ogólnej strukturze nietoperza i człowieka średnia kwadratowa pochodna reszt od jednego do 184 łańcuchów wodorowych wynosi 0,248 we wszystkich superpozycjach atomu alfa węgla, co wskazuje, że nie ma różnic między tymi dwoma kompleksami. Struktura ułożenia peptydów pokazuje, że potwierdzenia peptydów One wirusa Hendra w tych dwóch kompleksach są dość podobne.Wyrównanie sekwencji pokazuje również, że aminokwasy beta dwóch mikroglobuliny z różnych gatunków są wysoce konserwatywne. Ważne jest, aby oferować kompleksy przeciwnika o wysokiej skuteczności raportowania. Dlatego tak ważne jest, aby wybrać odpowiednią mikroglobulinę beta two i stosować wysoce oczyszczone ciała inkluzyjne.Protokół ten może być wykorzystany do uzyskania stabilnego kompleksu MTC I poprzez potencjalne podstawienie mikroglobulin beta dwóch u innych gatunków, a aby istnieć, mają strukturę i funkcję MTC I. Dane uzyskane z tych badań można wykorzystać do oceny odpowiedzi limfocytów T podczas chorób zakaźnych i immunoterapii nowotworów.

stability-structure-bat-major-histocompatibility-complex-class-i-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projektowanie epitopów immunogennych. Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do płytek 384-dołkowych. Ten opłacalny format powinien okazać się przydatny w dziedzinie deimmunizacji białek oraz projektowania i opracowywania szczepionek.

Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Tutaj opisujemy metody, które powszechnie stosujemy w laboratorium, aby określić, jak natura interakcji między receptorem limfocytów T a antygenami nowotworowymi, prezentowana przez ludzkie antygeny leukocytów, reguluje funkcjonalność komórek T; metody te obejmują produkcję białek, krystalografię rentgenowską, biofizykę i eksperymenty z funkcjonalnymi komórkami T.

Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej, biofizyki i testów funkcjonalnych do określenia mechanizmów rządzących rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez receptory komórek T

Opisano protokół oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunouprzywilejowanych mysiego modelu Ifnar1-/- dla infekcji wirusem Zika (ZIKV). Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania komórkowych mechanizmów ochrony i immunopatogenezy szczepionek ZIKV, a także jest cenna dla oceny ich skuteczności.

Ocena odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w narządach z uprawnieniami immunologicznymi zakażonych myszy Ifnar1-/-

Ten protokół opisuje użycie jednołańcuchowych kompleksów MHC klasy I do badania interakcji molekularnych w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8+: generowanie zmodyfikowanych komórek prezentujących antygen wyrażających konstrukty jednołańcuchowe, hodowla klonu ludzkich komórek T CD8+ i eksperymenty z aktywacją limfocytów T.

Zastosowanie technologii jednołańcuchowej MHC do badania koagonizmu w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8 +

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Ten protokół opisuje metodę hodowli pierwotnych neuronów hipokampa z embrionalnego mózgu myszy. Ekspresja głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I na zewnątrzkomórkowej powierzchni hodowanych neuronów jest następnie oceniana za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Ocena ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I na pierwotnych mysich neuronach hipokampa za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania kompleksów peptydowych MHC klasy I i klasy II z linii komórkowych myszy i ludzi, dostarczając wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Protokół koncentruje się na przygotowaniu próbki przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał.

Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji endogennej tubuliny z komórek ssaków, które mogą nie mieć lub zawierać specyficzne enzymy modyfikujące mikrotubule, w celu uzyskania mikrotubul wzbogaconych o określoną modyfikację. Następnie opisujemy, w jaki sposób wyekstrahowane mikrotubule można ozdobić oczyszczonymi białkami wiążącymi mikrotubule w celu przygotowania siatek do mikroskopii krioelektronowej.

Ekstrakcja zmodyfikowanych mikrotubul z komórek ssaków w celu badania kompleksów mikrotubula-białko za pomocą mikroskopii krioelektronowej

Tutaj oferujemy praktyczną procedurę preparowania i przeprowadzania analiz histologicznych oraz analiz ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej.

Rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej

Poznaj metodologię uzyskiwania stabilnych kompleksów MHC klasy I z heterologiczną β2-mikroglobuliną u nietoperzy. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej w chorobach zakaźnych i immunoterapii nowotworowej.

Stabilność i struktura głównego kompleksu zgodności tkankowej nietoperzy klasy I z heterologiczną_β 2-mikroglobuliną

Przeglądaj więcej filmów