Stabilność i struktura głównego kompleksu zgodności tkankowej nietoperzy klasy I z heterologiczną_β 2-mikroglobuliną

W tym badaniu wykorzystaliśmy Bat MHC klasy I jako model do podsumowania metodologii i oceny wykonalności hybrydowego MHC klasy I skompleksowanego z heterologiczną mikroglobuliną beta-2. Wcześniejsze badania wykazały, że substytucja B2M u ssaków nie wpływa znacząco na prezentację peptydów. W rzeczywistości hybrydowy MHC klasy I może aktywować podobną strukturę i funkcję do oryginalnej cząsteczki.

Techniki te mogą być wykorzystane do ułatwienia funkcjonalnego i ustrukturyzowanego badania MHC I do oceny odpowiedzi tkanek podczas immunoterapii chorób zakaźnych i nowotworów. W celu transformacji kultury E. coli dodać 10 nanogramów plazmidu zawierającego nietoperz lub człowieka MHC klasy I beta dwuwodorowego mikroglobuliny do 100 mikrolitrów wyrównanej zawiesiny i kąpać zawiesinę w lodzie przez 30 minut. Pod koniec inkubacji bakterie poddawane są szokowi cieplnemu przez 90 sekund w temperaturze 42 stopni Celsjusza, a następnie wlewa się kulturę do łaźni lodowej na dwie minuty.

Następnie dodaj 800 mikrolitrów bulionu lizogenicznego do kultury i potrząsaj zawiesiną na platformie bujanej przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę. Pod koniec inkubacji rozprowadzić 100 mikrolitrów bakterii na odpowiednim ostrzu hodowli odpornym na antybiotyki. Następnego ranka wybierz pojedynczy niedawno przekształcony klon bakteryjny i zaszczep go trzema mililitrami LB z pożywką antybiotykową.

Umieść kulturę na platformie bujanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 12 do 16 godzin. Następnego ranka przenieś 500 mikrolitrów aktywowanego materiału bakteryjnego do 50 mililitrów LB z pożywką antybiotykową i zwróć bakterie do inkubatora na bieguny na noc. Podziel pozostały aktywowany bulion bakteryjny na 500 mikrolitrów podwielokrotności i dodaj każdą podwielokrotność do 500 mikrolitrów objętości 40% glicerolu, do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby wytworzyć duże ilości rekombinowanego białka, następnego ranka przenieś zawiesinę bakteryjną do dwóch litrów LB z pożywką antybiotykową w stosunku jeden do 100 i wróć do inkubatora kołyszącego, aż do osiągnięcia absorbancji 0,6 przy 600 nanometrach. Następnie dodaj jeden milimolowy IPTG do hodowli, aby wywołać ekspresję genu trans. Po czterech do sześciu godzinach indukcji przenieś kulturę bakteryjną do butelek w celu odwirowania i ponownie zawieś granulki komórek bakteryjnych w 60 mililitrach PBS na butelkę.

Następnie uwolnij wyrażone rekombinowane białko za pomocą ultradźwiękowego zakłócacza komórkowego 99 razy, przez sześć sekund i w odstępie 12 sekund przy 300 watach na sonikację. W celu oczyszczenia ciała należy zebrać sonikowane bakterie przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w odpowiedniej objętości buforu płuczącego na dwa dodatkowe wirowania. Po drugim przemyciu ponownie zawiesić ciała inkluzji i bufor do re-zawiesiny, a następnie odłożyć 20 mikrolitrów podwielokrotności próbki na stronę SDS w celu zbadania czystości ciała inkluzji.

Odwirować pozostałą próbkę i zważyć inkluzję zawierającą osad. Dodać bufor do rozpuszczenia do granulek do końcowego stężenia 30 miligramów inkluzji na mililitr buforu. I za pomocą mieszadła magnetycznego powoli mieszać roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż ciała inkluzyjne rozpuszczą się w buforze do rozpuszczania.

Po wyrzuceniu osadów należy przechowywać inkluzje w temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza. W przypadku ponownego fałdowania kompleksu MHC dodaj pięciomilimolowy zredukowany glutation i 0,5 milimolowy utleniony glutation w ilości od 250 do 300 mililitrów, bufor do ponownego fałdowania o czterech stopniach Celsjusza. I powoli mieszaj roztwór na mieszadle magnetycznym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 do 20 minut.

W przypadku rozcieńczenia łańcucha wodorowego MHC i beta dwóch mikroglobulin, załaduj ciało inkluzji do jednomililitrowej strzykawki i wstrzyknij całą mililitrową objętość roztworu ciała inkluzji do jednego litra buforu do ponownego składania w pobliżu mieszadła, aby uzyskać szybkie i skuteczne rozcieńczenie. Następnie rozpuść pięć miligramów na mililitr peptydu w sulfotlenku dimetylu i szybko wstrzyknij 200 mikrolitrów peptydu do roztworu do ponownego fałdowania, jak właśnie pokazano. Po 10 do 20 minutach powolnego mieszania wstrzyknąć trzy mililitry ciał inkluzyjnych łańcucha H do nowej litrowej objętości bufora do ponownego składania i pozwól na ponowne składanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez osiem do 10 godzin.

Aby określić stężenie ponownie złożonego białka, dodaj bufor wymienny do komory ciśnieniowej z membraną 10 kilodaltonowej oksydazy wielomiedziowej i skoncentruj bufor do objętości od 30 do 50 mililitrów. Przenieść roztwór do ponownego składania do probówki wirówkowej i usunąć osady przez odwirowanie. Ostrożnie przenieść supernat do komory i dalej zagęścić bufor do końcowej objętości około jednego mililitra.

Usunąć wszelkie końcowe zanieczyszczenia przez odwirowanie i przenieść supernat do sterylnej probówki. Użyj kolumny wykluczającej rozmiar dziesięciu trzystu GL, aby oczyścić białka, zbierając próbki w szczycie i analizując je za pomocą strony SDS. Zebrać pik kompleksu MHC i skoncentrować białko do końcowego stężenia 15 miligramów na mililitr.

Następnie rozcieńczyć kompleks do stężenia 7,5 miligrama na mililitr. Aby przeprowadzić krystalizację kompleksu MHC i peptydu przy użyciu techniki dyfuzji parowej w pozycji siedzącej, dodaj 0,8 mikrolitra próbki do komercyjnej płytki krystalicznej i uszczelnij płytkę. Zrównoważyć roztwór próbki ze 100 mikrolitrami roztworu w zbiorniku w temperaturze 4 lub 18 stopni Celsjusza i używać mikroskopu, aby regularnie obserwować wzrost kryształów przez następne sześć miesięcy.

W celu ochrony kriogenicznej, pod koniec eksperymentu, przenieś kryształy do roztworu do przechowywania zawierającego 20% glicerolu, a następnie szybko schłodź próbki w strumieniu azotu gazowego o temperaturze 100 stopni Kelvina. Następnie zbierz dane dyfrakcji rentgenowskiej zgodnie ze standardowymi protokołami. Aby określić strukturę kompleksów krystalicznych, należy otworzyć dane strukturalnej dyfrakcji rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości w programie Denzo w pakiecie oprogramowania HK L 2000 i wybrać początkowy model w banku danych białkowych.

Aby określić strukturę białka, otwórz dane w programie Phaser MR w CCP4 i użyj udoskonalonego modelu rentgenowskiego do wstępnego udoskonalenia stawów. Następnie użyj trybów samego uszlachetniania Phoenix i stawów do uszlachetniania samego promieniowania rentgenowskiego oraz połączonego neutronu do udoskonalania promieniowania rentgenowskiego. Po każdej rundzie udoskonalania ręcznie sprawdź model z mapami dodatniej gęstości jądrowej Fo-Fc i 2Fo-Fc w Coot.

W tych reprezentatywnych eksperymentach oceniano zdolności wiązania peptydu Hendra One wirusa Hendra pochodzącego z wirusa Hendra z łańcuchami wodorowymi MHC klasy I nietoperzy z homologiczną mikroglobuliną beta beta 2 i heterologiczną ludzką mikroglobuliną beta 2. W obu analizach kryształy o wysokiej rozdzielczości powstały w wyniku renaturyzacji łańcuchem lekkim beta dwóch mikroglobulin. W przypadku braku mikroglobuliny beta 2 kompleksy te nie powstają.

W łańcuchu wodorowym MHC klasy I Hendra wirus on, ludzka struktura mikroglobuliny beta dwa, konserwatywne reszty H31, D53, W60 i Y63 ludzkiej mikroglobuliny beta dwóch, które odpowiadają mikroglobulinie beta beta two, stykają się z dnem rowka wiążącego peptydy i konserwują reszty Q8, Y10, R12 i 24, które odpowiadają dwóm mikroglobulinom beta związanym z domeną alfa trzy. W ogólnej strukturze nietoperza i człowieka średnia kwadratowa pochodna reszt od jednego do 184 łańcuchów wodorowych wynosi 0,248 we wszystkich superpozycjach atomu alfa węgla, co wskazuje, że nie ma różnic między tymi dwoma kompleksami. Struktura ułożenia peptydów pokazuje, że potwierdzenia peptydów One wirusa Hendra w tych dwóch kompleksach są dość podobne.

Wyrównanie sekwencji pokazuje również, że aminokwasy beta dwóch mikroglobuliny z różnych gatunków są wysoce konserwatywne. Ważne jest, aby oferować kompleksy przeciwnika o wysokiej skuteczności raportowania. Dlatego tak ważne jest, aby wybrać odpowiednią mikroglobulinę beta two i stosować wysoce oczyszczone ciała inkluzyjne.

Protokół ten może być wykorzystany do uzyskania stabilnego kompleksu MTC I poprzez potencjalne podstawienie mikroglobulin beta dwóch u innych gatunków, a aby istnieć, mają strukturę i funkcję MTC I. Dane uzyskane z tych badań można wykorzystać do oceny odpowiedzi limfocytów T podczas chorób zakaźnych i immunoterapii nowotworów.