Name: Rozmnażanie pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis w komarach Aedes aegypti (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Poznaj metodę rozmnażania pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis w komarach Aedes aegypti. Protokół obejmuje hodowlę larw, izolację zarodników i ocenę transmisji pionowej wynoszącej 96%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Spencerowi Blankenshipowi za pomoc w hodowli komarów. Dziękujemy również Jamesowi N. Radlowi i M. Dominique Magistrado za pomocne opinie na temat manuskryptu.

1. Dzień 0
<ol>
	<li>Wylęgać jaja Ae. aegypti zakażone E. aedis poprzez umieszczenie ich w tacy do wychowu larw z 1 litrem wody dejonizowanej (DI). Dodać 50 mg pokarmu dla ryb. 
	UWAGA: W momencie publikacji laboratoryjny szczep E. aedis jest dostępny tylko w laboratoriach aktywnie prowadzących badania nad pasożytem, ponieważ E. aedis nie nadaje się do długotrwałego przechowywania, a zakażone jaja nie są obecnie przechowywane w repozytoriach. Badacze zainteresowani pracą z E. aedis mogą skontaktować się z autorem korespondencyjnym, aby poprosić o zakażone jaja. 
	UWAGA: Wykluwanie dużej liczby zakażonych jaj na ogół nie jest konieczne; dziesięć larw Ae. aegypti zakażonych E. aedis wystarcza do podania dawki ≥ 1000 zdrowych larw. 
	UWAGA: We wszystkich częściach tego protokołu trzymaliśmy komary w następujących warunkach: 14 godzin/10 godzin cykl światła/ciemności, temperatura 27 °C i wilgotność względna 80%.</li>
</ol>
2. Dzień 1
<ol>
	<li>Po wykluciu zmniejsz gęstość larw do ~100 larw na tacę, w razie potrzeby tworząc nowe tace (również z 1 l wody DI).</li>
	<li>Dodaj kawałek suchej karmy dla kotów do każdej tacy. Uzupełnij jedzenie po wyczerpaniu, ale nie dostarczaj go w nadmiarze. Wystarczy jedna porcja karmy dla kotów (~200 mg) co trzy dni. 
	UWAGA: Dostosuj ilość pokarmu w zależności od konkretnych warunków chowu (tj. zmniejsz pokarm, jeśli woda staje się mętna lub larwy umierają, zwiększ pokarm, jeśli larwy są poważnie opóźnione w rozwoju). Można stosować inne schematy żywienia i/lub warunki chowu niż te sugerowane tutaj, ale może być konieczne dostosowanie czasu realizacji tego standardowego protokołu.</li>
</ol>
3. Dni 4\u20125
<ol>
	<li>Gdy zakażone larwy osiągną 3-4 stadium rozwojowe, wykluwają się zdrowe/niezakażone jaja Ae. aegypti na nowej tacy.</li>
	<li>Tył przy zagęszczeniach takich, aby zdrowe Ae. aegypti osiągnęły 2-3 stadium w 48–72 godzinach. W naszych rękach można to osiągnąć przy zagęszczeniu 200-300 larw na 1 l wody z dostępem ad libitum do pożywienia. Wylęganie się zdrowych jaj przez wiele dni może zagwarantować, że larwy są we właściwym stadium, gdy są potrzebne.</li>
</ol>
4. Dni 7\u20128: Transmisja pozioma
UWAGA: Dawkowanie E. aedis zdrowym larwom nie może być wykonane, dopóki jednojądrowe zarodniki nie osiągną wysokiej liczby u zakażonych larw (1 x 104 – 1 x 106 na larwę). Dzieje się to pod koniec czwartego stadium rozwojowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
<ol>
	<li>Zbierz i określ ilościowo jednojądrowe zarodniki.
	<ol>
		<li>Użyj pipety transferowej (może być konieczne przycięcie końcówki do większej średnicy), aby przenieść 10 zainfekowanych larw do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Usuń wodę hodowlaną za pomocą pipety transferowej i umyj raz, dodając ~1 ml czystej wody DI. Usunąć wodę z mycia pipetą, dodać 500 μl czystej wody demineralizowanej do 10 larw i homogenizować za pomocą tłuczka i homogenizatora mechanicznego.</li>
		<li>Określ ilościowo zarodniki za pomocą hemocytometru przy 400-krotnym powiększeniu. 
		UWAGA: Zarodniki jednojądrowe można rozpoznać po ich wyraźnym kształcie gruszkowatym (tj. kształcie gruszki; <silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dawkować zdrowe larwy Ae. aegypti z E. aedis.
	<ol>
		<li>Przygotuj świeżą gnojowicę pokarmu dla larw, mieszając 1,2 g sproszkowanej wątroby, 0,8 g drożdży piwnych i 100 ml wody. 
		UWAGA: Żywność nie musi być świeża, jeśli jest sterylizowana w autoklawie i przechowywana w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
		<li>Przenieś 100 zdrowych larw Ae. aegypti w 2. – 3. stadium do zlewek o pojemności 150 ml lub kubków na próbki.</li>
		<li>Dozuj do każdej zlewki 100 larw zarodniki 5 x 104 – 1 x 105.</li>
		<li>Dodać 2 ml gnojowicy pokarmowej dla larw i wody demineralizowanej do końcowej objętości 100 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 12–24 godzinach ekspozycji przenieś odsłonięte larwy do tac hodowlanych i z powrotem do dorosłości zgodnie ze standardowym protokołem hodowli16.</li>
</ol>
5. Monitorowanie i transmisja pionowa
<ol>
	<li>Monitorować larwy, którym podano dawkę, pod kątem przepoczwarzenia i przenosić poczwarki w miarę ich rozwoju do kubka wyłaniającego się w klatce. Cukier karmi dorosłych ad libitum (zgodnie z16,17). Dorosłe osobniki zostaną zarażone wirusem E. aedis.</li>
	<li>Nakarm krwią dorosłe osoby (zgodnie z16,17) i zbieraj jaja. Na tym etapie następuje pionowa transmisja E. aedis. 
	UWAGA: Jeśli dodatkowe posiłki z krwi zostaną dostarczone zaraz po zakończeniu składania jaj, samice mogą złożyć co najmniej jeden dodatkowy lęg jaj, zanim dorosłe osobniki doświadczą (często nagłej) wysokiego poziomu śmiertelności. </li>
	<li>Użyj tych jaj Ae. aegypti zakażonych E. aedis, aby kontynuować rozmnażanie, zaczynając od kroku 1 niniejszego protokołu. 
	UWAGA: Jaja mogą być przechowywane przez 2 – 3 miesiące w odpowiednich warunkach16.</li>
	<li>Oczyść wszystkie materiały, które miały kontakt z E. aedis za pomocą 10% wybielacza i autoklawowania (jeśli to możliwe), aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. Yellow fever. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever">https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever</a> (2019).</li>
<li>WHO. Dengue and severe dengue. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue">https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue</a> (2020).</li>
<li>Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+and+prevention+of+urban+arbovirus+epidemics+%3A+A+challenge+for+the+global+virology+community%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Prediction and prevention of urban arbovirus epidemics : A challenge for the global virology community.</a> Antiviral Research. 156, 80-84 (2018).</li>
<li>Rather, I. A., Parray, H. A., Lone, J. B., Paek, W. K., Lim, J., Bajpai, V. K., Park, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+Control+Strategies+to+Counter+Dengue+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Prevention and Control Strategies to Counter Dengue Virus Infection.</a> Frontiers In Cellular and Infection Microbiology. 7, 336(2017).</li>
<li>Becnel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edhazardia+aedis+%28Microsporidia%3A+Amblysporidae%29+as+a+biocontrol+agent+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+and+abstracts%2C+Vth+International+Colloquium+on+Invertebrate+Pathology+and+Microbial+Control%22%5BJournal%5D)">Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblysporidae) as a biocontrol agent of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Proceedings and abstracts, Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. , Adelaide, Australia. 20-24 (1990).</li>
<li>Becnel, J. J., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Edhazardia+aedis+%28Microsporidia%3A+Culicosporidae%29+on+a+seminatural+population+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Impact of Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae) on a seminatural population of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Biological Control. 18 (1), 39-48 (2000).</li>
<li>Becnel, J. J., Sprague, V., Fukuda, T., Hazard, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Edhazardia+aedis+%28Kudo%2C+1930%29+N.+G.%2C+N.+Comb.+%28Microsporida%3A+Amblyosporidae%29+in+the+mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protozoology%22%5BJournal%5D)">Development of Edhazardia aedis (Kudo, 1930) N. G., N. Comb. (Microsporida: Amblyosporidae) in the mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Protozoology. 36, 119-130 (1989).</li>
<li>Hembree, S. C., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+vertical+transmission+of+a+new+microsporidian+pathogen+of+Aedes+aegypti+from+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Mosquito+News%22%5BJournal%5D)">Observations on the vertical transmission of a new microsporidian pathogen of Aedes aegypti from Thailand.</a> Mosquito News. 42, 49-54 (1982).</li>
<li>Johnson, M. A., Becnel, J. J., Undeen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+sporulation+sequence+in+Edhazardia+aedis+%28Microsporidia%3A+Culicosporidae%29%2C+a+parasite+of+the+mosquito+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new sporulation sequence in Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae), a parasite of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Invertebrate Pathology. 70 (1), 69-75 (1997).</li>
<li>Becnel, J. J., Garcia, J. J., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edhazardia+aedis+%28Microspora%3A+Culicosporidae%29+effects+on+the+reproductive+capacity+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae) effects on the reproductive capacity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 32 (4), 549-553 (1995).</li>
<li>Becnel, J. J., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+host+range+and+specificity+of+Edhazardia+aedis+%28Microspora%3A+Culicosporidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae).</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 9 (3), 269-274 (1993).</li>
<li>Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+range+tests+with+Edhazardia+aedis+%28Microsporida%3A+Culicosporidae%29+against+northern+Nearctic+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Host range tests with Edhazardia aedis (Microsporida: Culicosporidae) against northern Nearctic mosquitoes.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 64 (1), 46-51 (1994).</li>
<li>Becnel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+Edhazardia+aedis+%28Microspora%3A+Amblyosporidae%29+for+nontarget+aquatic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Safety of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) for nontarget aquatic organisms.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 8 (3), 256-260 (1992).</li>
<li>Undeen, A. H., Becnel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+and+germination+of+Edhazardia+aedis+%28Microspora%3A+Amblyosporidae%29+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Longevity and germination of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) spores.</a> Biocontrol Science and Technology. 2, 247-256 (1992).</li>
<li>Massaro, P., Sobecki, R., Behling, C., Criswell, V., Zha, T., Devenzengo, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMassaro%2C+P+%22Automated+mass+rearing+system+for+insect+larvae%22">Automated mass rearing system for insect larvae</a>. , Pub. No. US 2018/0092339 A1. USA (2018).</li>
<li>Methods in Aedes Research. BEI Resources. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf">https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf</a> (2016).</li>
<li>Methods in Anopheles Research. BEI Resources. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf">https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf</a> (2014).</li>
<li>Desjardins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+host-pathogen+interactions+and+genome+evolution+in+two+generalist+and+specialist+microsporidian+pathogens+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Contrasting host-pathogen interactions and genome evolution in two generalist and specialist microsporidian pathogens of mosquitoes.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-12 (2015).</li>
<li>Hembree, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+Report+of+some+mosquito+pathogens+from+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Mosquito+News%22%5BJournal%5D)">Preliminary Report of some mosquito pathogens from Thailand.</a> Mosquito News. 39 (3), 575-582 (1979).</li>
<li>Solter, L. F., Becnel, J. J., Vávra, J. Research methods for entomopathogenic microsporidia and other protists. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolter%2C+LF+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. , Elsevier Ltd. 329-371 (2012).</li>
<li>Becnel, J. J., Undeen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+temperature+on+developmental+parameters+of+the+parasite%2Fhost+System+Edhazardia+aedis+%28Microsporidia%3A+Amblyosporidae%29+and+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Influence of temperature on developmental parameters of the parasite/host System Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblyosporidae) and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Invertebrate Pathology. 60, 299-303 (1992).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy tutaj metodę pierwotnie opisaną w Hembree i Ryan, 19828 dotyczącą hodowli komarów E. aedis microsporidia u komarów Ae. aegypti . Szczep E. aedis użyty w tym badaniu pochodził z oryginalnej kolekcji terenowej przeprowadzonej przez Stephena Hembree w Tajlandii w 1979 roku. Metoda ta wykorzystuje transmisję poziomą, która naturalnie występuje w cyklu transmisji E. aedis7, do kontrolowanego rozprzestrzeniania się pasożyta. Metoda ta może być wyzwaniem dla nowicjuszy, którzy nie są zaznajomieni z pojawianiem się zarodników, objawami infekcji larw lub koordynacją wymaganą do pomyślnego ukończenia wieloetapowego protokołu hodowli/dawkowania. Mamy nadzieję, że pomoce wizualne, które towarzyszą temu protokołowi, zmniejszą bariery wejścia dla badaczy, którzy chcą hodować E. aedis.
Rozmnożyliśmy E. aedis w Ae. aegypti, jak opisano powyżej, i określiliśmy ilościowo sukces pasożytnictwa w pokoleniu potomnym. Krótko mówiąc, wykluliśmy jaja Ae. aegypti zakażone E. aedis, wyhodowaliśmy je do4 stadium i zebraliśmy jednojądrowe zarodniki E. aedis z zainfekowanych larw. Następnie zainfekowaliśmy poziomo zdrowe larwy tymi zarodnikami poprzez spożycie doustne i wyhodowaliśmy poziomo zakażone larwy do dorosłości. Nakarmiliśmy krwią zakażonych dorosłych (pokolenie rodzicielskie) i zebraliśmy jaja (pokolenie potomne), które, jak przypuszczaliśmy, mogą być pionowo zakażone pasożytem E. aedis. Wykluliśmy jaja z pokolenia potomnego oraz zebraliśmy i zhomogenizowaliśmy podzbiór larw, gdy były w czwartymstadium rozwojowym. Określiliśmy ilościowo procent larw, które zostały zakażone E. aedis i całkowitą liczbę zarodników u wszystkich zakażonych osób. Stwierdziliśmy, że zdecydowana większość (96%) osobników była zainfekowana, a średnie obciążenie zarodnikami zakażonych larw wynosiło ~105. Dochodzimy do wniosku, że nasz protokół hodowli zaowocował bardzo udanym rozmnażaniem E. aedis w komarach Ae. aegypti.
Istnieje wiele aspektów tego protokołu, które mogą być szczególnie trudne dla niewtajemniczonego użytkownika. Poniżej przedstawiamy kilka dodatkowych informacji, które mogą być pomocne. W przypadku pytań dotyczących ogólnego chowu komarów, kompletny przewodnik po utrzymaniu kolonii Ae. aegypti wykracza poza zakres tego protokołu. Jednak wiele często zadawanych pytań można znaleźć w zasobach z Repozytorium Zasobów Badawczych Obrony Biologicznej i Pojawiających się Infekcji16,17, w tym wylęgu jaj, ogólnych potrzeb żywieniowych, warunków mieszkaniowych i środowiskowych oraz karmienia krwią. Jeśli chodzi o czas infekcji, larwy wyklute z zakażonych jaj nie wykazują oznak infekcji aż do późnego stadium 4. Zarodniki jednojądrowe pojawiają się szybko, w ciągu 1–2 dni. Larwy mogą wydawać się praktycznie niezakażone po 6 dniach od wyklucia, ale wysoce zakażone w 7 lub 8 dniu po wykluciu. Ponadto wizualizacja zarodników w homogenizowanych próbkach może być trudna, ponieważ w całych homogenatach komarów obecnych jest wiele innych drobnoustrojów, w tym inne eukariotyczne organizmy jednokomórkowe (np. drożdże) o podobnej wielkości jak jednojądrowe zarodniki E. aedis. Charakterystyczny kształt zarodników E. aedis (ryc. 2A) jest wysoce niezawodną metodą identyfikacji i pomoże odróżnić E. aedis od innych drobnoustrojów w homogenacie. Chociaż nie jest to konieczne do identyfikacji lub kwantyfikacji, jeśli pożądane jest oczyszczenie zarodników, można to osiągnąć poprzez wirowanie w gradionym gradicynie gęstości krzemionki koloidalnej, co pozwoli na oddzielenie zarodników E. aedis od innych elementów zanieczyszczających w homogenacie. Proces ten został szczegółowo opisany w Solter et al.20.
Temperatura i dieta stosowane w praktykach hodowlanych często różnią się w zależności od laboratorium, ale różnice prawdopodobnie nadal przyniosą udane rozmnażanie pasożytów. Niewielkie różnice w rodzaju pokarmu dla larw nie przeszkadzają w udanej infekcji, chociaż w tym protokole nie testowaliśmy wyraźnie różnych rodzajów pokarmu. Wpływ temperatury na infekcję został przebadany i stwierdzono, że zakażenie E. aedis jest odporne w szerokim zakresie temperatur21. Maksymalna produkcja zarodników miała miejsce w temperaturze 30,8 °C, ale nadal była wysoka w temperaturach chowu tak niskich jak 20 °C. Liczba zarodników była znacznie zmniejszona w wyższych temperaturach hodowli (36 °C), dlatego w tym protokole należy unikać tych temperatur.
Zanieczyszczenie jest zawsze problemem podczas pracy z pasożytami. E. aedis jest skutecznym pasożytem Ae. aegypti i dlatego musi być trzymany oddzielnie od niezakażonych kolonii laboratoryjnych, aby zapobiec zakażeniu. Jeśli to możliwe, zalecamy przechowywanie zakażonych komarów w oddzielnym inkubatorze. Zaleciliśmy również, aby materiały używane do pracy z mikrosporydiami (np. tacki na larwy, pipety transferowe, klatki, kubki do zbierania jaj) były przeznaczone do pracy z mikrosporydiami i nie były stosowane szerzej w całym owadzie. Wszystkie materiały hodowlane powinny być po użyciu wysterylizowane 10% wybielaczem, a autoklawowanie może być stosowane jako uzupełnienie sterylizacji wybielacza.

Aedes aegypti jest komarem będącym wektorem wielu arbowirusów (np. dengi, Zika, żółtej febry), które łącznie odpowiadają szacunkowo za setki milionów przypadków zachorowań każdego roku i ponad 30 000 zgonów1,2. Leczenie chorób wywoływanych przez te patogeny ogranicza się do opieki wspomagającej, a w przyszłości prawdopodobne jest pojawienie się kolejnych arbowirusów3. Kontrola wektora, jakim jest komar, ma zatem kluczowe znaczenie, ponieważ skutecznie zapobiega transmisji obecnych i wyłaniających się patogenów4. Tradycyjne strategie zwalczania wektorów opierają się głównie na chemicznych insektycydach, jednak oporność na wiele powszechnie stosowanych środków wymusiła zapotrzebowanie na nowe metody kontroli wektorów. Jednym z potencjalnych czynników, których właściwości w zakresie biologicznej kontroli Ae. aegypti zostały zbadane, jest pasożyt Edhazardia aedis5,6.
E. aedis, po raz pierwszy zidentyfikowany jako Nosema aedis przez Kudo w 1930 roku, jest mikrosporidialnym pasożytem komarów Ae. aegypti7. Rozwój i rozmnażanie E. aedis są stosunkowo złożone, a jego cykl życiowy może przebiegać na kilka sposobów7,8,9. Jeden z powszechnych cykli rozwojowych został szczegółowo opisany przez Becnel i wsp. w 1989 roku7 i jest wykorzystywany do propagacji laboratoryjnej (Rycina 1)8. W skrócie, cykl rozpoczyna się, gdy jaja Ae. aegypti zainfekowane wertykalnie przez E. aedis wykluwają się w zainfekowane larwy, które rozwijają jednojądrowe spory w ciałach tłuszczowych i zazwyczaj giną w stadium larwalnym lub poczwarki. Jednojądrowe spory uwalniane z martwych larw zanieczyszczają siedlisko i są spożywane przez zdrowe larwy Ae. aegypti. Spory te kiełkują głównie w przewodzie pokarmowym, infekując tkanki trawienne narażonych larw, co prowadzi do transmisji horyzontalnej. Horyzontalnie zainfekowane larwy rozwijają się w osobniki dorosłe (pokolenie rodzicielskie), w których tworzone są spory dwujądrowe. U samic spory dwujądrowe naciekają układ rozrodczy, a związana z nimi sporoplazma infekuje rozwijające się komórki jajowe. Jaja te wykluwają się następnie w zainfekowane larwy (pokolenie potomne), co skutkuje wertykalną transmisją pasożyta i kontynuacją cyklu opisanego powyżej.
Liczne badania analizowały potencjał E. aedis w zwalczaniu biologicznym. Wykazano, że infekcja E. aedis prowadzi do zmniejszenia zdolności rozrodczych samic Ae. aegypti10. Ponadto w eksperymencie półpolowym masowe uwalnianie E. aedis doprowadziło do całkowitej eradykacji testowej populacji Ae. aegypti utrzymywanej w siatkowej wolierze6. Choć E. aedis jest w stanie przejść niektóre etapy rozwoju u różnych gatunków komarów, jest on przenoszony pionowo wyłącznie u Ae. aegypti, co wskazuje na wysoki stopień specyficzności względem gospodarza11,12. Podobnie w laboratoryjnej ocenie potencjalnego ryzyka środowiskowego związanego z E. aedis, pasożytniczy mikrosporydium nie zainfekował nietarczowej fauny wodnej, w tym drapieżników, które spożyły larwy Ae. aegypti zainfekowane E. aedis13. Wyniki te podkreślają potencjał wykorzystania E. aedis w strategiach biologicznego zwalczania naturalnych populacji Ae. aegypti.
Pomimo faktu, że E. aedis rokuje nadzieje w zastosowaniach do zwalczania wektorów, istnieją trudności związane z jego hodowlą i wdrażaniem na szeroką skalę. Zarodniki E. aedis tracą zakaźność w czasie krótszym niż jeden dzień w niskich temperaturach (tj. 5 °C). Nawet w wyższych temperaturach (tj. 25 °C) zarodniki szybko tracą zakaźność w ciągu trzech tygodni14. Ponadto E. aedis musi być hodowany w żywych komarach Ae. aegypti, a precyzyjne dawkowanie zdrowych larw komarów jest niezbędne, aby zapewnić dopełnienie cyklu życiowego i zapobiec załamaniu populacji wykorzystywanej do hodowli8. Wymóg hodowli in vivo stanowi wyzwanie; jednakże niedawne postępy w masowym rozmnażaniu komarów i robotyce (np. Massaro et al.15) mogłyby umożliwić wielkoskalową produkcję zarodników E. aedis. Przewidujemy, że wizualizacja tej metodologii zwiększy dostępność protokołu hodowli E. aedis i pozwoli większej liczbie badaczy na zgłębianie podstaw biologicznych oraz potencjału aplikacyjnego tego systemu. Spodziewamy się również, że ułatwi to zacieśnienie współpracy z inżynierami, robotykami i szerszym sektorem technologicznym, co może przyczynić się do usprawnienia masowej hodowli E. aedis.
<img alt="Schemat cyklu życiowego komara; pozioma i pionowa transmisja patogenu u Aedes aegypti." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Propagacja E. aedis u Ae. aegypti. Propagacja E. aedis rozpoczyna się od wyklucia jaj zakażonych E. aedis. Zakażone larwy hoduje się do 4th stadium rozwojowego, następnie z tych larw izoluje się spory E. aedis, które są wykorzystywane do doustnej infekcji zdrowych larw 2nd/3rd stadium, wyhodowanych z niezakażonej partii jaj (transmisja pozioma). Larwy zakażone doustnie są następnie hodowane do stadium dorosłego (pokolenie rodzicielskie) i składają jaja zakażone E. aedis (transmisja pionowa). Z zakażonych jaj (pokolenie potomne) następuje następnie wyklucie, co pozwala na kontynuację cyklu infekcji i hodowli pasożyta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>120 ml Kubek na próbkę</td><td>McKesson</td><td>911759</td><td>Niedroga alternatywa dla zlewki</td></tr><tr><td>Zlewki 150 ml</td><td>VWR</td><td>10754-950</td><td>Do dozowania larw</td></tr><tr><td>2 uncje okrągłej szklanej butelki</td><td>VWR</td><td>10862-502</td><td>Butelka na 10% sacharozy w klatkach dla dorosłych 3</td></tr><tr><td>uncje kubek wynurzający</td><td>Henry-Schein</td><td>1201502</td><td>Do przenoszenia poczwarek do klatki</td></tr><tr><td>Klatki dla dorosłych komarów</td><td>Bioquip</td><td>1462 lub 1450ASV</td><td>Do pomieszczeń dla dorosłych</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td></td><td></td><td>Do sterylizacji</td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td></td><td></td><td>Do sterylizacji</td></tr><tr><td>Piwowar" s drożdże</td><td>Solgar</td><td></td><td>Do karmienia larw podczas dozowania</td></tr><tr><td>Kontrolowana komora hodowlana</td><td>Tritech</td><td>DT2-MP-47L</td><td>Niedroga mała komora hodowlana</td></tr><tr><td>Rolka bawełniana</td><td>VWR</td><td>470161-446</td><td>do butelek z cukrem</td></tr><tr><td>Defibrynowacyjna krew królika</td><td>Fisher</td><td>50863762</td><td>Dla dorosłych karmiących krwią</td></tr><tr><td>Disodowe ATP, krystaliczne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209-5G</td><td>Do karmienia krwią dorosłych</td></tr><tr><td>Sucha karma dla kotów</td><td>9Lives</td><td>Indoor Complete</td><td>Do ogólnej hodowli larw</td></tr><tr><td>Płatki pokarmowe</td><td>dla ryb TetraMin</td><td></td><td>Do ogólnej hodowli larw</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td>Do liczenia zarodników</td></tr><tr><td>Silnik homogenizatora/mieszalnika</td><td>VWR</td><td>47747-370</td><td>Do homogenizacji zakażonych larw</td></tr><tr><td> tace hodowlane</td><td>Sterillite</td><td>1961</td><td>Wymiary całkowite: 11 "x 6 5/8" x 2 3/4 "</td></tr><tr><td>Wątroba w proszku</td><td>NOW foods</td><td>2450</td><td>Do karmienia larw podczas dozowania</td></tr><tr><td>Pipeta 1 - 10 i mikro; L</td><td>VWR</td><td>89079-962</td><td>Do dozowania larw</td></tr><tr><td>Pipeta 100 - 1000&micro; L</td><td>VWR</td><td>89079-974</td><td>Do żywności podczas dozowania larw</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 1 - 10 i mikro; L</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td>Do dozowania larw</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 100 - 1000&micro; L</td><td>VWR</td><td>10017-048</td><td>Do pokarmu podczas dawkowania larw</td></tr><tr><td>Tłuczki plastikowe</td><td>VWR</td><td>89093-446</td><td>Do homogenizacji zakażonych larw</td></tr><tr><td>Sacharoza krystaliczna</td><td>Life Technologies</td><td>15503022</td><td>Do karmienia dorosłych</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>VWR</td><td>414004-033</td><td>Do przenoszenia larw należy przycinać końce</td></tr></tbody></table>

rozmnażanie pasożyta mikrosporydów edhazardia aedis w komarach aedes aegypti

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis to mikrosporydiczny pasożyt komarów Aedes aegypti, wektor choroby, który przenosi wiele arbowirusów, które powodują miliony przypadków chorób każdego roku. E. aedis powoduje śmiertelność i obniżoną sprawność rozrodczą komarów-wektorów i został zbadany pod kątem jego potencjału jako środka kontroli biologicznej. Przedstawiony przez nas protokół hodowli E. aedis opiera się na jego naturalnym cyklu infekcji, który obejmuje zarówno transmisję poziomą, jak i pionową na różnych etapach życia żywiciela komara. Komary Ae. aegypti są narażone na zarodniki w stadium larwalnym. Te zakażone larwy dojrzewają następnie do postaci dorosłych i przenoszą pasożyta pionowo na swoje potomstwo. Zainfekowane potomstwo jest następnie wykorzystywane jako źródło zarodników do przyszłej transmisji poziomej. Hodowla E. aedis może być wyzwaniem dla niewtajemniczonych, biorąc pod uwagę złożoność cyklu życiowego pasożyta, a ten protokół zawiera szczegółowe wskazówki i pomoce wizualne w celu wyjaśnienia.

E. aedis zakażone jaja Ae. aegypti Liverpool (LVP1b12) wykluto zgodnie z opisanym powyżej protokołem. W 4tym stadium larwalnym można było zaobserwować wizualne oznaki infekcji, w tym białe cysty zarodników w ciałach tłuszczowych zakażonych larw (przykład tego fenotypu przedstawiono na Rysunku 2B). Jednojądrowe zarodniki pozyskano z larw 4tego stadium poprzez homogenizację 10 larw w 500 µL wody DI. Zarodniki te miały kształt gruszkowaty i były łatwo widoczne przy 400x (Rysunek 2A). Przy użyciu hemocytometru obliczono liczbę zarodników wynoszącą 4,05 x 103 zarodników/µL. Następnie sto zdrowych larw Ae. aegypti zakażono horyzontalnie ~50 000 zarodników w 100 mL wody, aby uzyskać dawkę końcową ~500 zarodników/larwa. Larwy hodowano do stadium dorosłego (pokolenie rodzicielskie) i karmiono krwią królika pozbawioną fibrynogenu z dodatkiem 1% (v/v) 100 mM trifosforanu adenozyny. Zebrano jaja zakażone wertykalnie (pokolenie potomne) i wykluto je, aby kontynuować propagację E. aedis oraz określić skuteczność infekcji.
Siedem dni po wykluciu 25 larw pokolenia potomnego przeniesiono do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i przepłukano raz wodą destylowaną (DI). Poszczególne larwy homogenizowano w 250 µL wody DI, a następnie oceniono status infekcji oraz obciążenie E. aedis przy użyciu hemocytometru. Stwierdzono, że wskaźnik transmisji pionowej E. aedis w pokoleniu potomnym wyniósł 96%, a średnie obciążenie zarodnikami u osobników zainfekowanych siedem dni po wykluciu wynosiło 3,31 x 105 (zakres: 3,25 x 104 – 1,47 x 106; Rysunek 3).
<img alt="Analiza mikroskopowa, próbki zdrowe i zainfekowane, liczenie komórek przy użyciu siatki, identyfikacja infekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wizualizacja infekcji E. aedis u komarów Ae. aegypti. (A) Jednojądrowe gruszkowate zarodniki E. aedis. Dziesięć zainfekowanych E. aedis larw 4th stadium zostało zhomogenizowanych w 500 µL wody dejonizowanej około siedem dni po wykluciu. 10 µL homogenatu naniesiono na hemocytometr i oglądano przy powiększeniu 400X. Czerwone strzałki wskazują reprezentatywne jednojądrowe zarodniki E. aedis. (B) U zainfekowanych E. aedis larw 4th stadium w całym ciele tłuszczowym rozwijają się charakterystyczne białe cysty zarodników18. Często występują u nich również zdeformowane i rozciągnięte segmenty odwłoka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres częstości infekcji i graf liczby zarodników; analiza danych w zainfekowanych larwach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Protokół hodowli prowadzi do skutecznej infekcji E. aedis w pokoleniu potomnym. Larwy Ae. aegypti (n = 25) z pokolenia potomnego homogenizowano indywidualnie w 250 µL wody DI, a 10 µL homogenatu naniesiono na komorę countingową. Obecność zarodników jednojądrowych wskazywała na pozytywny wynik infekcji; w każdej pozytywnej próbce określono liczbę zarodników. (A) Częstość infekcji wśród larw potomnych. Kolor szary odpowiada larwom niezinfekowanym, a czarny zinfekowanym. Liczby wyświetlane na każdym fragmencie określają bezwzględną liczbę osobników w danej grupie. (B) Obciążenie zarodnikami dla każdego zinfekowanego osobnika. Czarne kropki reprezentują log10 przekształconą liczbę zarodników jednojądrowych dla każdej larwy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Protokół hodowli pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis. Pasożyt przechodzi z jednego pokolenia komarów Aedes aegypti do następnego poprzez przenoszenie poziome w stadium larwalnym, a następnie przenoszenie pionowe w stadium dorosłym. Żywe sporoplazmy przeżywają długotrwale w zakażonych jajach.

Rozmnażanie pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis w komarach Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Edhazardia aedis to pasożyt mikrosporydyczny, który w specyficzny sposób infekuje komary Aedes aegypti. Hodowla tego pasożyta może być wyzwaniem dla nowych badaczy ze względu na złożoność cyklu życiowego pasożyta. Protokół ten zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące hodowli E.aedis, w tym jak prawidłowo określić czas etapów procedury, zidentyfikować zakaźne zarodniki i rozmnażać następną generację pasożytów.Dokładny czas tego protokołu może być trudny i może wymagać pewnych prób i błędów. Identyfikacja zarodników może być również trudna. Pomoce wizualne zawarte w tym protokole powinny stanowić pomoc.Na początek wykluć jaja A.Aegypti zakażone E.aedis, umieszczając je na tacy do hodowli larw z jednym litrem dejonizowanej wody i dodając 50 miligramów pokarmu dla ryb. Trzymaj komary w temperaturze 27 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 80% w 14-godzinnym cyklu światła i 10-godzinnym ciemnym cyklu. Po wykluciu zmniejsz gęstość larw do około 100 larw na tacę, w razie potrzeby tworząc nowe tace.Dodaj kawałek suchej karmy dla kotów do każdej tacy. Uzupełnij karmę, gdy się wyczerpie, ale nie dostarczaj jej nadmiaru. Wystarczy jeden 200 miligramowy kawałek karmy dla kotów co trzy dni.Gdy zainfekowane larwy są w stadium od trzeciego do czwartego, wykluwają się z niezainfekowanych jaj A.aegypti na nowej tacy. Wyhoduj komary w takim zagęszczeniu, aby zdrowe A.aegypti osiągnęły od drugiego do trzeciego stadium rozwoju w ciągu 48 do 72 godzin. Wylęganie się zdrowych jaj przez wiele dni może zagwarantować, że larwy są we właściwym stadium, gdy są potrzebne.Aby zebrać i określić ilościowo jednojądrowe zarodniki, użyj pipety transferowej, aby przenieść 10 zainfekowanych larw czwartego stadium rozwojowego do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Usuń wodę hodowlaną za pomocą pipety transferowej i umyj larwy raz, dodając około jednego mililitra czystej wody dejonizowanej. Usuń wodę do mycia i dodaj 500 mikrolitrów czystej wody dejonizowanej do 10 larw i homogenizuj je za pomocą tłuczka i homogenizatora mechanicznego.Załaduj 10 mikrolitrów homogenatu na hemocytometr i oznacz ilościowo zarodniki w 400-krotnym powiększeniu. Przygotuj świeżą zawiesinę pokarmu dla larw, mieszając 1,2 grama proszku z wątroby, 0,8 grama drożdży piwnych i 100 mililitrów wody. Przenieś 100 od drugiego do trzeciego stadium zdrowego stadium rozwojowego A.aegypti do 150-mililitrowych zlewek lub kubków na próbki i dodaj pięć razy 10 do czwartego do jednego razy 10 do piątego zarodnika do każdej filiżanki za pomocą pipety.Dodaj dwa mililitry gnojowicy pokarmowej dla larw i wody dejonizowanej, aby uzyskać końcową objętość 100 mililitrów. Po 12 do 24 godzinach ekspozycji larwy należy przenieść do tac hodowlanych. Dodaj jedzenie i wychowuj je do dorosłości.Monitorować larwy, którym podano dawkę pod kątem przepoczwarzania i przenieść poczwarki do kubka do wyłaniającego się kubka w klatce. Cukier karmi dorosłych ad libitum. Krew karmi dorosłych zgodnie ze standardowymi protokołami dostępnymi za pośrednictwem BEI Resources.Zbieraj jaja od dorosłych karmionych krwią. Na tym etapie następuje pionowa transmisja E.aedis. Po zakończeniu wyczyść wszystkie materiały, które miały kontakt z E.aedis za pomocą 10% wybielacza i autoklawowania, aby zapobiec zanieczyszczeniu.Protokół ten przedstawia pełną procedurę niezbędną do rozmnażania E.aedis u komarów A.aegypti. Jaja A.aegypti zakażone E.aedis zostały wyklute, a larwy zostały wyhodowane do czwartego stadium rozwojowego. W czwartym stadium rozwojowym można było zaobserwować wizualne oznaki infekcji, takie jak białe sporocysty w ciałach tłuszczowych zakażonych larw.Zarodniki jednojądrowe zebrano z larw czwartego stadium przez homogenizację 10 larw w 500 mikrolitrach wody dejonizowanej. Zarodniki te miały kształt gruszki i były łatwo widoczne przy 400-krotnym powiększeniu. Obliczono liczbę zarodników na 4 050 zarodników na mikrolitr i wykorzystano te zarodniki do infekowania zdrowych larw poprzez transmisję poziomą.Status infekcji i ładunek E.aedis 25 larw pokolenia potomnego oceniano po siedmiu dniach od wyklucia. Stwierdzono, że pionowy wskaźnik infekcji E.aedis w pokoleniu potomnym wynosił 96%, a średnie obciążenie przetrwalnikami zakażonych osobników po siedmiu dniach od wyklucia wynosiło 3,31 razy 10 do piątego. Aby prawidłowo skoordynować stadium larw, zaleca się uwzględnienie pewnej zmienności w czasie odchowu.Dodatkowo, liczba zarodników szybko rośnie, więc jeśli nie wykryjesz zarodników, po prostu spróbuj ponownie następnego dnia. Powodzenia.

propagation-microsporidian-parasite-edhazardia-aedis-aedes-aegypti

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie Nijole Jasinskiene prezentuje metodologię wykorzystywaną do tworzenia transgenicznych komarów Aedes aegypti, które są wektorami gorączki Denga. Przedstawione zostają techniki prawidłowego przygotowania igieł do mikroiniekcji, wysuszania embrionów oraz przeprowadzania mikroiniekcji.

Mikroiniekcja zarodków A. aegypti w celu uzyskania transgenicznych komarów

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na wirusa dengue, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom wirusowym u komarów. Niniejszy protokół ilustruje sposób badania stopnia zakażenia komarów wirusem dengue. Przedstawiono techniki namnażania wirusa w kulturze, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.

Protokół infekcji denga w komarach (A. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

W tym wywiadzie George Dimopoulos skupia się na mechanizmach fizjologicznych wykorzystywanych przez komary do zwalczania infekcji wywoływanych przez Plasmodium falciparum oraz wirusa dengi. Wyjaśniono, w jaki sposób identyfikuje się u komarów kluczowe geny refrakcyjne, czyli geny nadające odporność na patogeny wektora, oraz jak tę wiedzę można wykorzystać do stworzenia transgenicznych komarów, które nie są w stanie przenosić pasożyta malarii ani wirusa dengi.

Tworzenie lepszego komara: Identyfikacja genów umożliwiających odporność na malarię i gorączkę dengi u komarów A. gambiae i A. aegypti

Komary Aedes aegypti zakażone Wolbachią są uwalniane do naturalnych populacji w celu zahamowania transmisji arbowirusów. Opisujemy metody hodowli Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia w laboratorium do eksperymentów i uwolnienia w terenie, podejmując środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji i selekcji laboratoryjnej.

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Technika sterylnych owadów (SIT) jest używana do kontrolowania określonych, ważnych z medycznego punktu widzenia populacji komarów, które mogą być odporne na chemiczne kontrole. W tym miejscu opisujemy metodę masowego chowu i przygotowania bezpłodnych samców komarów do wypuszczenia na wolność w operacyjnym programie SIT ukierunkowanym na komara Aedes aegypti.

Przygotowanie napromieniowanych i oznakowanych samców komarów Aedes aegypti do uwolnienia w operacyjnym programie techniki sterylnych owadów

Ta metodologia, która obejmowała karmienie doustne i infekcję iniekcją dopiersiową, mogła skutecznie ocenić wpływ barier środkowego jelita i/lub gruczołów ślinowych na infekcję arbowirusem.

Eksperymentalna infekcja wirusowa u dorosłych komarów przez karmienie doustne i mikroiniekcję

Malaria jest przenoszona przez inokulację stadium sporozoitu Plasmodium przez zakażone komary. Transgeniczne zarodźce pozwoliły nam lepiej zrozumieć biologię malarii i bezpośrednio przyczyniły się do opracowania szczepionki przeciwko malarii. W tym miejscu opisujemy uproszczoną metodologię generowania transgenicznych sporozoitów Plasmodium berghei.

Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei

Opisano procedury badania zachowań komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach za pomocą elektropenetracji AC-DC.

Elektropenetrografia AC-DC do badania zachowań sondujących i połykanych komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach

Poznaj metodę rozmnażania pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis w komarach Aedes aegypti. Protokół obejmuje hodowlę larw, izolację zarodników i ocenę transmisji pionowej wynoszącej 96%.

Rozmnażanie pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis w komarach Aedes aegypti

Przeglądaj więcej filmów