Name: Obrazowanie na żywo receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego podczas reakcji na ranę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo dynamiki receptorów chemokiny w neutrofilach Danio rerio podczas reakcji zapalnej. Protokół umożliwia wizualizację wewnętrznej trasy receptorów CXCR1 i CXCR2 w odpowiedzi na uraz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Christine Holt i Billowi Harrisowi za pomoc w mikroskopii konfokalnej. Dziękujemy Darrenowi Gilmourowi za konstrukcje szkieletowe zegara fluorescencyjnego i Annie Huttenlocher za wektor szkieletowy Tol2-Lyz. Dziękujemy Steve'owi Renshawowi za linię Tg(mpx:GFP)i114. Prace te były wspierane przez MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] oraz grant Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. był wspierany przez stypendium MRC DTP i częściowo przez Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Dotacja Isaac Newton Trust [12.21(a)i]. H.W. był wspierany przez stypendium MRC DTP. H.P. był wspierany przez Wellcome Trust PhD Grant (105391/Z/14/Z) oraz częściowo przez Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Grant Isaac Newton Trust [12.21(a)i] oraz MRC (MR/L019523/1).

<ol><li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense%3A+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li>
<li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li>
<li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511(2016).</li>
<li>Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArnon%2C+TI+%22Science%22">Science</a>. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li>
<li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387(2015).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Donà, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li>
<li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+dynamics+of+an+endogenous%2C+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li>
<li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+receptor+internalization%2C+signaling+level%2C+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li>
<li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).</li>
<li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li>
<li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592(2019).</li>
<li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166(2019).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115(2009).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics+and+Informatics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics</a>. , Elsevier. Burlington. (2004).</li>
<li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li>
<li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+contours+without+edges%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li>
<li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Textural+features+for+image+Classification%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li>
<li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+infection%3A+From+pathogenesis+to+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li>
<li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae%3A+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562(2010).</li>
<li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li>
<li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Zebrafish+and+CRISPR%2FCas9%3A+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703(2018).</li>
<li>Kienle, K., Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming%3A+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li>
<li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654(2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Opisana metoda pozwala na obrazowanie na żywo dynamiki receptorów w odpowiedzi na endogenne ligandy in situ podczas odpowiedzi zapalnej na uszkodzenie tkanek. Zastosowanie reporterów neutrofili Cxcr1/Cxcr2 można rozszerzyć na inne ustawienia fizjologiczne, takie jak infekcje, modele nowotworów lub inne rodzaje uszkodzeń tkanek 14,25,26,27. Ponadto transgeniczne linie ratunkowe, w których endogenny receptor jest tłumiony i ratowany przez egzogenny zmutowany receptor, mogą dostarczyć użytecznych narzędzi do analizy znaczenia określonych wzorców migracji neutrofili w odpowiedziach immunologicznych. Na przykład mutanty receptora Cxcr1, które mają upośledzoną desensytyzację, powodują bardziej widoczne grupowanie neutrofili w miejscach zapalnych14. Ten fenotyp wzmocnienia funkcji może być wykorzystany do zrozumienia roli gromadzenia neutrofili w różnych procesach fizjologicznych, np. gojeniu ran, chorobach zakaźnych lub ewolucji guza, a także eksperymentach z knockdownem/nokautem receptora dopełniacza. Metodologia ta stanowi również podstawę do rozszerzenia zakresu dostępnych podmiotów zgłaszających. Wybór reportera fluorescencyjnego jest ważny do rozważenia i zależy od kwestii biologicznej. Stwierdziliśmy, że konstytutywny obrót tych receptorów chemokiny w neutrofilach był wysoki w porównaniu z komórkami nabłonkowymi i że reporterzy o szybkim dojrzewaniu (np. sfGFP) byli zobowiązani do zgłaszania poziomów błony w stanie stacjonarnym i usuwania różnic po stymulacji neutrofili 8,14. Tak więc proporcje błonowe sfGFP / tagRFP nie mają zastosowania do pomiaru internalizacji indukowanej ligandem w tym typie komórki, ale wzór tagRFP umożliwia śledzenie wewnątrzkomórkowych losów receptora, co może być przydatne w niektórych badaniach. Odkryliśmy również, że bardziej skoncentrowany wewnątrzkomórkowy sygnał tagRFP jest przydatny do badań przesiewowych poszczególnych larw. Alternatywnym podejściem do pomiaru poziomów receptorów w błonie plazmatycznej byłaby koekspresja fluorescencyjnego markera błonowego w neutrofilach w tym samym transgenie9 lub w niezależnym transgenie14. W pierwszym scenariuszu transgen zapewniłby dodatkowy środek do badań przesiewowych ryb, a poziomy ekspresji byłyby porównywalne między markerem a receptorem. To drugie podejście byłoby bardziej modułowe, w tym sensie, że linia danio pręgowanego z reporterem receptorowym mogłaby być łączona z różnymi liniami reporterowymi. W obu przypadkach warto zauważyć, że kwantyfikacja poziomów receptorów w błonie jest trudna w zgrupowanych neutrofilach (patrz poniżej). Na koniec zauważamy, że możliwym rozszerzeniem tego protokołu byłoby kontynuowanie obrazowania na żywo za pomocą immunohistochemii w celu uzyskania bardziej szczegółowych analiz lokalizacji.
System transgenezy Tol2 jest dobrze ugruntowany7, a promotor lizozymu C jest szeroko stosowany do ekspresji neutrofili11,15. Podejście transgenezy jest zatem stosunkowo proste, a poziom ekspresji osiągnięty za pomocą tego promotora jest wystarczająco wysoki, aby zapewnić wystarczający kontrast do analizy dynamiki receptora. Możliwym ograniczeniem jest to, że poziom ekspresji nie podsumowuje poziomów ekspresji receptorów endogennych. Nowe technologie CRISPR mogą zostać wykorzystane do ustanowienia linii knock-in dla receptorów o szczególnym znaczeniu28. Technologie te są nadal kłopotliwe i mogą nie gwarantować wymaganych poziomów ekspresji dla obrazowania subkomórkowego, ale ich pomyślny rozwój byłby ważnym przełomem w zrozumieniu endogennej dynamiki sygnalizacji. Walidacje funkcjonalne są ważne dla interpretacji danych z konstruktami receptorów transgenicznych. Na przykład testy rozpoznawania ligandów można wykorzystać do ustalenia, że fluorescencyjne białko fuzyjne jest funkcjonalne, a uratowanie fenotypów nokautu można wykorzystać do ustalenia, że poziomy ekspresji transgenicznych neutrofili są zgodne z funkcjonalnością14. Wreszcie, bardziej bezpośrednim sposobem walidacji fuzji receptorów byłoby zastosowanie testu funkcjonalnego in vitro z znakowanym receptorem wraz z nieznakowanymi wersjami14.
Podejście oparte na kwantyfikacji rozwiązuje konkretne trudności związane z dokładną segmentacją błon w neutrofilach in vivo. W komórkach o charakterze nabłonkowym kwantyfikacja poziomów receptorów może być wykonywana automatycznie poprzez normalizację poziomów receptorów błonowych do markera kontrolnego, który może być wyrażany w tandemie lub oddzielnie9. Rzeczywiście, zastosowaliśmy takie podejście, stosując test rozpoznawania ligandów w gastrulujących zarodkach14. Jednak neutrofile ulegają złożonym, szybkim zmianom kształtu komórek in vivo, co utrudnia segmentację błony zarówno w 2D, jak i3D 14. Jest to jeszcze trudniejsze w przypadku grupowania neutrofili, co występuje w wielu warunkach fizjologicznych29. Metryka kontrastu pokonuje to ograniczenie, ponieważ nie wymaga segmentacji błony, ale zamiast tego odzwierciedla ogólny stan rozmieszczenia receptorów w komórce (błoniasty / gładki vs pęcherzykowy / kropkowany). Ważne jest, aby pamiętać, że na metrykę kontrastu może mieć wpływ ogólny kontrast obrazu, dlatego wymagana jest normalizacja wartości poszczególnych komórek do wewnętrznego odniesienia, aby uwzględnić zmienność sygnału w różnych zarodkach/próbkach. Na przykład, użyliśmy średniej wartości kontrastu komórek niereagujących neutrofili w CHT (tj. neutrofili, które pozostają nieruchome i nie migrują do płetwy brzusznej)14. Dodatkową możliwością byłaby normalizacja za pomocą wartości kontrastu markera kontrolnego w tej samej komórce. Zapewniłoby to rozwiązanie, gdy wewnętrzne odniesienie do komórek niereagujących nie jest dostępne i prawdopodobnie mogłoby rozwiązać drobniejsze różnice ilościowe w dynamice receptorów między różnymi warunkami.
Lokalizacja obrazowania to kolejna zmienna, którą należy wziąć pod uwagę. Powodem, dla którego wybrano tutaj ranę płetwy brzusznej, w przeciwieństwie do częściej stosowanego modelu rany płetwy ogonowej16,30, jest to, że miejsce zranienia znajduje się w pobliżu miejsca zamieszkania neutrofili/pochodzenia migracyjnego. Przyspiesza to czas trwania testu, ponieważ dotarcie neutrofili zajmuje stosunkowo niewiele czasu. Dodatkowo daje możliwość uchwycenia zachowania komórek zarówno na początku migracji (CHT), jak i w docelowym miejscu zainteresowania (rana). Jest to tutaj istotne, ponieważ rozdzielczość przestrzenna i czasowa wymagana do obrazowania subkomórkowego jest trudna do połączenia z dużym polem widzenia lub skanowaniem wielopozycyjnym. W ten sposób test rany płetwy brzusznej pozwala na śledzenie ewolucji odpowiedzi migracyjnej od początku migracji i jednoczesne wychwytywanie niespecyficznych fluktuacji receptorów w komórkach, które nie reagują. Jak wspomniano powyżej, ta ostatnia metoda jest przydatna do celów kwantyfikacji, ponieważ stanowi wewnętrzne odniesienie dla dynamiki niespecyficznej. W innych systemach uzyskanie takiego wewnętrznego odniesienia może nie być możliwe, w którym to przypadku wartości kontrastu współwyrażonego markera błonowego stanowiłyby alternatywną kontrolę.
Podsumowując, przewidujemy, że metodologia ta ma zastosowanie do innych systemów i może być stosowana do różnych celów. Na przykład te same reportery mogą być wykorzystywane w innych warunkach zapalnych, takich jak infekcje lub inne modele choroby. Repertuar linii reporterowych receptorów danio pręgowanego można rozszerzyć na inne receptory sygnałowe, aby zrozumieć mechanizmy sygnalizacji lub przedstawić dynamikę ligandów in vivo. Podejście to można połączyć z technikami knockdown/knockout w celu zbadania mechanistycznych podstaw obserwowanej dynamiki. Na przykład zaburzenie ekspresji liganda może wskazywać na zależność liganda od obserwowanej dynamiki receptora. Przewidujemy, że w przyszłości system będzie mógł być dalej udoskonalany w celu uwzględnienia funkcji wstawiania zgłoszeń typu knock-in. Ostatecznie, odkrycia wykorzystujące tę metodologię dostarczyłyby nowych informacji cennych nie tylko w społeczności danio pręgowanego, biorąc pod uwagę ochronę tych receptorów sygnałowych u ssaków i względne wyzwanie związane z prowadzeniem tych badań na większych organizmach.

Migracja leukocytów ma ogromne znaczenie dla odpowiedzi immunologicznej. Komórki odpornościowe są prototypowymi komórkami migrującymi, które są niezwykle zdolne do przechodzenia przez tkanki i naczynia krwionośne oraz wyczuwania szeregu chemicznych wskazówek do migracji kierunkowej w kierunku drobnoustrojów lub innych ważnych komórek gospodarza. Prawidłowe wskazówki opierają się na rozpoznaniu chemoatraktantów, wśród których chemokiny stanowią najbardziej znaczącą kategorię1. Chemokiny są rozpoznawane przez wysoce specyficzne receptory sprzężone z siedmiobłonowym białkiem G. Po związaniu chemokiny receptory chemokiny zmieniają konformację, co prowadzi do aktywacji powiązanych trimerycznych białek G i ich dysocjacji na funkcjonalne podjednostki sygnalizacyjne, które promują zmiany cytoszkieletu i ukierunkowaną migrację1. Po drugie, receptory chemokiny są fosforylowane, a ta modyfikacja prowadzi do odczulenia na atraktant, po którym może nastąpić szybkie ponowne uwrażliwienie/recykling lub degradacja wewnątrzkomórkowa i regulacja w dół z powierzchni komórki2. Ta dynamika receptorów wpływa na czas trwania i dawkę sygnalizacji odbieranej przez komórki, ale sposób, w jaki wpływają one na zachowanie migracji leukocytów, był trudny do wyjaśnienia in vivo.
Śledzenie dynamiki receptorów w żywych leukocytach w tradycyjnych systemach ssaków napotyka kilka wyzwań. W przypadku badań na żywo fuzje receptorów z białkami fluorescencyjnymi muszą ulegać ekspresji w komórkach. Jest to trudne w przypadku leukocytów pierwotnych, szczególnie w neutrofilach, a dotychczasowe badania wykorzystywały zastępcze linie komórkowe neutrofili do ekspresji receptorów chemokin3,4. Generowanie transgenicznych modeli myszy, w których leukocyty wyrażają receptor fluorescencyjny lub zmutowane receptory z defektami transportu informacyjnego5,6, wiąże się ze znacznymi inwestycjami czasu i zasobów. Nawet w tych przypadkach rozdzielczość obrazowania i kontrast dla obrazowania dynamiki receptorów u żywego zwierzęcia mogą być ograniczone, a w badaniach wykorzystano immunohistochemię na nieruchomych skrawkach tkanki5. Biorąc pod uwagę te wyzwania techniczne, nasza wiedza na temat tego, w jaki sposób dynamika receptorów chemoatraktantu wpływa na zachowanie komórek w żywych tkankach, jest obecnie ograniczona.
Tutaj przedstawiamy metodologię monitorowania transportu receptorów u neutrofili danio pręgowanego. Danio pręgowany jest genetycznie podatny, podobnie jak myszy, ale transgeneza jest stosunkowo prostsza dzięki zastosowaniu wydajnych systemów transpozonów i bezpośredniej manipulacji zygotą7. Przezroczysta larwa jest idealnie podatna na obrazowanie. Dynamika receptora chemokiny została uwidoczniona w pierwotnych komórkach rozrodczych i zawiązkach linii bocznej poprzez ekspresję odpowiednich fuzji z fluorescencyjnymi reporterami8,9,10. Larwy danio pręgowanego są wyposażone w dojrzałe neutrofile, które mają wysoce konserwatywne właściwości genetyczne i komórkowe w stosunku do neutrofili ssaków. Dynamika sygnalizacji subkomórkowej, taka jak dynamika cytoszkieletu i regulatory polaryzacji, została zobrazowana w tych komórkach poprzez wygenerowanie odpowiednich linii transgenicznych11,12,13. Ostatnio zobrazowaliśmy i przeanalizowaliśmy funkcjonalnie dynamikę receptora chemokiny w neutrofilach w przebiegu reakcji zapalnych na uszkodzenie tkanek14. W tym miejscu opisujemy generowanie transgenicznych linii reporterowych do sygnalizacji chemokiny w neutrofilach, przygotowanie zarodków do obrazowania na żywo, test ran do badania sygnalizacji neutrofili oraz protokół pozyskiwania i analizy obrazów. Udostępniamy również protokół poboczny do testowania odpowiedzi receptorów chemokiny na kandydujące ligandy, co jest przydatne przy próbie ustalenia wzorców rozpoznawania ligandów w niescharakteryzowanych receptorach. Techniki te mogą być stosowane w połączeniu z dalszymi manipulacjami genetycznymi, takimi jak hamowanie endogennej ekspresji chemokiny lub generowanie zmutowanych receptorów ze zmienionym transportem indukowanym ligandem, w celu zbadania, w jaki sposób specyficzna dynamika sygnalizacji wpływa na zachowanie leukocytów in vivo. Linie transgeniczne wyrażające fluorescencyjnie znakowane receptory chemokiny mogą być również wykorzystywane jako reportery dla endogennych gradientów chemokin, które w przeciwnym razie są trudne do wykrycia przez bezpośrednie barwienie przeciwciałami. Opisana metodologia daje możliwości rozszerzenia generacji reporterów na inne receptory sygnalizacji immunologicznej.

<table><tbody><tr><td>1-fenylo-2-tiomocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL Probówka wirówkowa CellStar</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>Szkło kapilarne Clark</td><td>Aparat Harvard</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline Thin Bleach</td><td>Naukowe materiały laboratoryjne</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>Luneta sekcyjna</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Grzałka blokowa Dri</td><td>Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, Jubilerzy Dumont No. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia mikrostudzienkowe ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Mikroskop konfokalny</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Błękit</td> <td>metylenowySigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>System mikroiniekcji</td><td>Końcówki</td> do pipet Parker <td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Thermo-Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem Olympus IX81</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego (120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Zestaw do ogonowania</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mały pędzel malarski</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Applied Research Moduł</td><td></td> laserowy LMM5 <td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela chirurgicznego nr 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Volocity</td><td></td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU10 skaner konfokalny z wirującym dyskiem</td><td>Yokogawa</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego podczas reakcji na ranę

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Prowadzenie leukocytów za pomocą gradientów chemicznych jest niezbędne dla odpowiedzi immunologicznej. Neutrofile są pierwszymi komórkami, które są rekrutowane do miejsc uszkodzenia tkanek, gdzie pełnią kluczowe funkcje przeciwdrobnoustrojowe. Ich transport do tych loci jest koordynowany przez kilka zapalnych chemoatraktantów, w tym chemokiny. Na poziomie molekularnym sygnalizacja chemoatraktantu jest regulowana przez wewnątrzkomórkowy transport odpowiednich receptorów. Nie jest jednak jasne, w jaki sposób subkomórkowe zmiany w receptorach chemokiny wpływają na dynamikę migracji leukocytów na poziomie komórkowym i tkankowym. W tym miejscu opisano metodologię obrazowania na żywo i analizy ilościowej dynamiki receptora chemokiny w neutrofilach podczas reakcji zapalnych na uszkodzenie tkanek. Narzędzia te ujawniły, że zróżnicowany transport receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego koordynuje grupowanie i dyspersję neutrofili w miejscach uszkodzenia tkanek. Ma to implikacje dla naszego zrozumienia, w jaki sposób reakcje zapalne ustępują samoistnie. Opisane narzędzia mogą zostać wykorzystane do zrozumienia wzorców migracji neutrofili w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych, a metodologia może zostać rozszerzona na inne receptory sygnałowe.

Zranieniu płetwy brzusznej towarzyszy szybka mobilizacja neutrofili z CHT do płetwy brzusznej i ich gromadzenie się na brzegu rany w ciągu 30–60 min (Rycina 1). Zwizualizowano rozkład dwóch receptorów chemokin, Cxcr1 i Cxcr2, które są eksprymowane przez neutrofile danio pręgowanego24 oraz rozpoznają Cxcl8a i Cxcl8b14, z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii dyskowej. Wygenerowano dwie odpowiadające im linie transgeniczne, Tg(lyz:Cxcr1-FT) i Tg(lyz:Cxcr2-FT), w której neutrofile wykazują ekspresję konstruktu czasownika fluorescencyjnego (FT) receptora, tj. fuzji z tandemem sfGFP i tagRFP (Rycina 2 or referencja14). Zastosowanie dwóch fluoroforów miało na celu umożliwienie monitorowania szerokiego zakresu losów receptorów oraz określenie czasu obrotu białek w błonie komórkowej, ponieważ nowo syntetyzowane receptory emitowałyby zieloną fluorescencję, a wraz z upływem czasu stopniowo stawałyby się czerwone.8,14Stwierdzono jednak, że receptory te charakteryzują się szybkim konstytutywnym obrotem w błonie plazmatycznej neutrofili, a czas ich rezydencji był krótszy niż czas dojrzewania tagRFP; w stanie stacjonarnym sfGFP wykazywało lokalizację błonową, natomiast tagRFP lokalizację pęcherzykową (Wideo uzupełniające 1 oraz referencje14). W związku z tym skupiliśmy się na rozmieszczeniu sfGFP, aby monitorować indukowaną ligandem internalizację w miejscach uszkodzenia tkanki. Wzorzec rozmieszczenia receptora ilościowo określono za pomocą wskaźnika kontrastu, który określa różnice w intensywności między sąsiednimi pikselami. Przyjęto założenie, że gdy rozmieszczenie receptora ma charakter błonowy i gładki, wartość kontrastu jest niska. Gdy rozmieszczenie receptora ma charakter pęcherzykowy i bardziej punktowy, wartość kontrastu jest wysoka (Rycina 3).
Alternatywną metodą jest ilościowe określenie stosunku poziomów receptora (intensywność sfGFP) do poziomów kontrolnego markera błonowego, np. błonowego CFP (mCFP) (Rysunek 3). Obie metody mogą wykryć internalizację receptorów, co objawia się bardziej pęcherzykowym wzorcem rozmieszczenia receptorów w całej komórce (wyższa wartość kontrastu) lub niższym poziomem receptorów w błonie (niższy stosunek sfGFP/mCFP). Jednak parametr kontrastu mógł również wykryć internalizację receptorów w skupiskach neutrofili w miejscu rany, w których segmentacja błony była mniej dokładna i nie była możliwa do zastosowania (Rysunek 3). Dzięki zastosowaniu tego parametru byliśmy w stanie ilościowo określić widoczne różnice w transportach Cxcr1 i Cxcr2 w neutrofilach w miejscu rany (Rysunek 4 oraz Wideo uzupełniające 2). Cxcr1-FT uległ internalizacji w komórkach znajdujących się w miejscu rany, podczas gdy Cxcr2-FT pozostał w błonie neutrofili w miejscu rany (Rysunek 4A-C, Wideo uzupełniające 2 oraz Wideo uzupełniające 3). Supresja Cxcl8a i Cxcl8b, poprzez zastosowanie morfolino, w różny sposób wpłynęła na internalizację Cxcr1-FT w miejscu rany (Rysunek 4C,D). Aby dodatkowo potwierdzić, że Cxcr1-FT reaguje na Cxcl8a, przeprowadziliśmy testy odpowiedzi na chemokiny we wczesnych embrionach. Stwierdzono, że Cxcr1-FT uległ wyraźnej internalizacji w embrionach, w których współwyrażano Cxcl8a (Rysunek 5). Podsumowując, wyniki te wskazują, że opisane metody mogą być wykorzystane do pomiaru indukowanej chemokinami internalizacji receptorów w neutrofilach oraz do ustalenia tożsamości liganda pośredniczącego w tych efektach.
<img alt="Schemat migracji neutrofili i obraz mikroskopowy pokazujący odpowiedź na ranę w naczyniach zebrafish." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Migracja neutrofili do ran płetwy brzusznej. (A) (Po lewej) Schemat larwy w 3 dpf pokazujący lokalizację tkanki krwiotwórczej ogona (CHT), krążenia żylnego (VC, kolor niebieski), płetwy brzusznej (VF) i miejsca rany. (Po prawej) Schemat przedstawiający obszar rany (W), gdzie neutrofile są mobilizowane z CHT i gromadzą się w miejscu rany. Splot żyły ogonowej (CVP) tkanki CHT zaznaczono na niebiesko. (B) Obraz w polu jasnym (po lewej) i projekcja konfokalna (po prawej) pokazujące ranę płetwy brzusznej i rozkład neutrofili w larwach Tg(mpx:GFP) 2 h po powstaniu rany. Linie przerywane wskazują zarysy VF i CHT. Pasek skali = 25 µm. Schemat i obraz fluorescencyjny zmodyfikowane z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Chemotaksja i mobilizacja transgenicznych rybek zebrafish, schemat promotora lyz, mikroskopia fluorescencyjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obrazowanie na żywo transportu receptorów chemokin w neutrofilach.(A) Konstrukcje użyte do neutrofilowej specyficznej ekspresji transgenicznej Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) oraz Cxcr2-FT. Projekcje konfokalne neutrofili w głowie transgenicznej larwy w 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), góra; Tg(lyz:Cxcr2-FT), dół) pokazujące kanały tRFP (magenta) i sfGFP (zieleń). Pasek skali = 20 µm. (B) Schemat anatomiczny larwy w 3 dpf, jak na Rycini 1A. Poniżej larwy znajdują się schematy przedstawiające obszar rany (W) z neutrofilami mobilizowanymi z CHT (góra) lub wykonującymi chemotaksję po wejściu do płetwy brzusznej (dół). Przerywany kwadrat wskazuje obszar obrazowany na migawkach po prawej stronie. (C) Neutrofile w larwach Tg(lyz:Cxcr1-FT) (pokazano sfGFP) podczas mobilizacji z CHT (panele górne) lub chemotaksji w kierunku rany (panele dolne). Strzałki wskazują te same komórki w czasie. Punkty czasowe na obrazie po prawej to minuty, które upłynęły od obrazu po lewej. Pasek skali = 10 µm. (D) Schematyczne przedstawienie podejścia eksperymentalnego do obrazowania na żywo transportu receptorów chemokin. Panele A-C zmodyfikowane z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces segmentacji konturów komórek; analiza kontrastu GFP i stosunku CFP/GFP; obrazy mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykłady kwantyfikacji dynamiki receptorów. Pojedyncze (niebieskie) lub zgrupowane neutrofile (zielone) w ranach lub neutrofile niemobilizowane w CHT (czerwone, pomarańczowe) zostały poddane segmentacji i analizie za pomocą różnych metod w celu porównania wyników. Te same przykładowe komórki zostały przeanalizowane dwiema metodami, aby powiązać obraz z zakresem wyekstrahowanych wartości. (A) Powierzchnia wybranych przykładowych komórek została wysegmentowana na podstawie definicji konturu w kanale sfGFP. (B) Kontrast obliczono dla przykładowych komórek przedstawionych w części A. (C) Membrana wybranych przykładowych komórek została wysegmentowana na podstawie definicji konturu w kanale CFP. Następnie przeprowadzono analizę ratiometryczną sfGFP/CFP. (D) Stosunek sfGFP/CFP obliczono dla przykładowych komórek przedstawionych w części C. Słupki błędów reprezentują S.E.M. z pojedynczych komórek; w przypadkach n&gt;1 wartości te nie zostały użyte do analizy statystycznej, a jedynie w celu zilustrowania pomiarów uzyskanych różnymi metodami kwantyfikacji. Pasek skali = 10 µm. Rycina zmodyfikowana z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe i wykres odpowiedzi na ranę u danio pręgowanego; ekspresja sfGFP; analiza Cxcr1/Cxcr2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Zróżnicowana dynamika Cxcr1 i Cxcr2 w odpowiedzi na zranienie. (A) Projekcja konfokalna neutrofili w larwach Tg(lyz:Cxcr1-FT) lub Tg(lyz:Cxcr2-FT) w miejscu rany w 80 min po zranieniu (pokazano kanał sfGFP). Pasek skali = 10 µm.  (B) Powiększony neutrofil Cxcr1-FT (lewo) oraz Cxcr2-FT (prawo) w miejscu rany. Zielony receptor przedstawiono w kolorze szarym. Pasek skali = 5 µm. (C) Znormalizowany kontrast (kontrast pojedynczego neutrofila znormalizowany do średniego kontrastu komórek niemobilizowanych w CHT). cxcl8a odnosi się do wstrzyknięcia morpholino blokującego splicing wraz z morpholino blokującym translację cxcl8a. cxcl8b odnosi się do wstrzyknięcia morpholino blokującego splicing dla cxcl8b. Dla Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 komórki (CHT), n=47 komórki (rana) z 8 larw. Dla Tg(lyz:Cxcr1-FT) z morpholinami: n=28 komórek (Cxcl8a-MO) z 5 larw, n=16 komórek (Cxcl8b-MO) z 5 larw. Dla Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 komórek (CHT) i n=20 komórek (rana) z 3 larw. Dane zostały połączone z niezależnych larw uzyskanych w 1-5 sesjach obrazowania. Test Kruskala-Wallisa z testem wielokrotnych porównań Dunna dla Tg(lyz:Cxcr1-FT), dwustronny nieparzysty test Manna-Whitneya dla Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Projekcja konfokalna neutrofili w transgenicznych larwach Tg(lyz:Cxcr1-FT) traktowanych morpholiną (MO) cxcl8a (lewo) oraz MO cxcl8b (prawo) reagujących na rany płetwy (kanał sfGFP pokazany na zielono). Migawka wykonana w punktach czasowych odpowiadających równemu poziomowi akumulacji neutrofili (85 min po zranieniu na obrazie po lewej i 45 min po zranieniu na obrazie po prawej). Pasek skali = 10 µm. Rycina zmodyfikowana na podstawie ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej: znakowane białka, wiązanie receptor-ligand, lokalizacja komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Analiza odpowiedzi na chemokiny we wczesnych embrionach. Przekroje konfokalne z laserowym skanowaniem gastrulujących embrionów, ukazujące ekspresję i rozmieszczenie Cxcr1-FT. 100 pg mRNA Cxcr1-FT wstrzyknięto do jaj w stadium jednej komórki z dodatkiem lub bez dodatku 150 pg mRNA Cxcl8a. Zielone i czerwone receptory przedstawiono w oddzielnych kanałach. Kontrolny marker błonowy CFP (mCFP) pokazano w kanale cyjanowym. Pasek skali = 20 μm. Rysunek zmodyfikowany z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Film uzupełniający 1: Transgeniczne neutrofile w głowie larwy Tg(lyz:Cxcr1-FT) (po lewej) i Tg(lyz:Cxcr2-FT) (po prawej) w 3 dpf. sfGFP (zielony), tagRFP (magenta). Odstęp między klatkami wynosi 30 sec, a częstotliwość klatek to 5 fps. Pasek skali = 20 μm. Materiał wideo pochodzi z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film uzupełniający 2: Neutrofile w larwach transgenicznych Tg(lyz:Cxcr1-FT) (lewo) i Tg(lyz:Cxcr2-FT) (prawo) reagujące na rany płetwy. Film rozpoczyna się w ciągu 10 min po zranieniu i trwa 60 min. sfGFP (zielony), tagRFP (magenta). Interwał między klatkami wynosi 30 sec, a liczba klatek na sekundę to 10 fps. CHT = tkanka krwiotwórcza ogonowa. VF = płetwa brzuszna. Pasek skali = 25 μm. Wideo pochodzi z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Dodatkowy film 3. Dodatkowe przykłady neutrofili z ranionej larwy transgenicznej Tg(lyz:Cxcr1- FT) (inna larva niż ta pokazana w Filmie 2), zarejestrowane w wyższej rozdzielczości, ukazujące internalizację receptorów (kanał sfGFP pokazany na zielono) podczas mobilizacji w CHT lub podczas wnikania i chemotaksji w płetwie brzusznej. Odstęp między klatkami wynosi 30 sec, a częstotliwość klatek 2 fps. Pasek skali = 10 μm. Film pochodzi z ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Plik uzupełniający 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>
Plik uzupełniający 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj opisujemy protokoły do wykonywania obrazowania na żywo i analizy ilościowej dynamiki receptorów chemoatraktantu u neutrofili danio pręgowanego

Obrazowanie na żywo receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego podczas reakcji na ranę

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Neutrofile są ważnymi komórkami zapalnymi, które naciekają rany w odpowiedzi na lokalnie wytwarzane ligandy chemiczne. Protokół ten umożliwia wizualizację dynamiki receptora w odpowiedzi na takie ligandy in vivo. Zastosowanie reporterów receptorów chemokiny można rozszerzyć na inne warunki fizjologiczne, takie jak modele infekcji i nowotworów oraz na inne komórki odpornościowe.Metoda ta umożliwia śledzenie, kiedy i gdzie w tkance leukocyty wyczuwają cząsteczki atraktantu chemicznego. Może to umożliwić lepsze zrozumienie, w jaki sposób rozwijają się i ustępują reakcje immunologiczne. Wykonanie zranienia płetwy brzusznej u larw danio pręgowanego wymaga drobnej manipulacji larwami, dlatego wymagana jest pewna praktyka w przypadku larw nieprzeznaczonych do celów eksperymentalnych.W 2,5 do 3,5 dnia po zapłodnieniu umieść znieczulone larwy danio pręgowanego pod fluorescencyjną lunetą preparacyjną i wybierz larwy z ekspresją receptora transgenicznego. Przenieś wybrane larwy na 120-milimetrową szalkę Petriego zawierającą pożywkę E3 uzupełnioną Trikainą i użyj sterylnego skalpela, aby przeciąć płetwę brzuszną każdej larwy wystarczająco głęboko, aby spowodować znaczną rekrutację neutrofili bez przecinania naczyń tkanki krwiotwórczej ogona. Dodaj 500 mikrolitrów 2X Tricaine do naczynia ze szklanym dnem, a następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu agarozy i wymieszaj, delikatnie mieszając końcówką pipety.Za pomocą pipety przenieś zranione, znieczulone larwy danio pręgowanego do naczynia i ustaw zarodek na boki, delikatnie dociskając w dół, tak aby część ogonowa ryby znajdowała się jak najbliżej szklanego dna. Gdy zarodek znajdzie się na swoim miejscu, pozwól agarozie ostygnąć. Po pięciu do 10 minutach delikatnie dotknij żelu małym pędzlem, aby potwierdzić zestalenie i dodaj do płytki dwa mililitry pożywki E3 uzupełnionej 0,2 miligrama na mililitr Trikainy.Zobrazuj miejsce rany za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. Tak szybko, jak to możliwe, po zawiązaniu się agarozy, przenieś zarodek na platformę wirującego dysku do obrazowania konfokalnego i użyj joysticka stolika i obiektywu mikroskopu, aby zlokalizować rybę. Korzystając z obiektywu o powiększeniu od 30 do 40x, skup się na obszarze rany i wybierz pole, które chcesz zobrazować wokół rany.Wybierz laser i dostosuj czas ekspozycji, a następnie ustaw timelapse co 30 sekund na żądany czas i uzyskaj obraz w jasnym polu, aby udokumentować pole widzenia. Aby określić ilościowo internalizację receptora neutrofilowego w miejscu rany, otwórz zestawy danych obrazów na Fidżi i użyj suwaka czasu, aby wybrać reprezentatywny przedział czasowy zainteresowania dla każdego zestawu danych. W MATLAB utwórz nowy skrypt i dołącz funkcje do odczytywania obrazów, otwierania i ręcznego wybierania interesujących miejsc.Uruchom skrypt, aby otworzyć ramkę zainteresowania i kliknij neutrofile do analizy. Zapisz oszacowanie ich centroidów, zarówno w ranie płetwy brzusznej, jak i w tkance krwiotwórczej ogona. Podziel neutrofile na segmenty w każdej klatce przy użyciu techniki aktywnych konturów i utwórz skrypt, aby dodać obliczenia macierzy współwystępowania poziomu szarości dla każdego neutrofili, w tym obliczenie kontrastu neutrofili na podstawie macierzy współwystępowania poziomu szarości.Dodaj polecenia, aby zapisać wartości oddzielnie dla poszczególnych neutrofili w płetwie brzusznej, w tym obliczenie średniej wartości kontrastu neutrofili ze wszystkich neutrofili tkanki krwiotwórczej ogona. Uwzględnij normalizację wartości kontrastu poszczególnych neutrofili w miejscu rany do obliczonego średniego kontrastu neutrofili w tkance krwiotwórczej ogonowej, aby uzyskać znormalizowany kontrast, który odzwierciedla, jak punktowy jest wygląd receptora w poszczególnych reagujących komórkach w stosunku do komórek kontrolnych, które nie reagują. Następnie kliknij przycisk uruchom, aby uruchomić skrypt.Po zranieniu płetwy brzusznej następuje szybka mobilizacja neutrofili z tkanki krwiotwórczej ogona do płetwy brzusznej i skupienie się na brzegu rany w ciągu 30 do 60 minut od indukcji urazu. W tej analizie receptory chemokiny CXCR1 i CXCR2 wyrażane przez neutrofile danio pręgowanego zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Wzorzec rozmieszczenia receptorów określono ilościowo za pomocą metryki kontrastu, która informuje o różnicach w intensywności między sąsiednimi pikselami.Alternatywną metodą jest ilościowe określenie stosunku poziomów receptorów do poziomów kontrolowanego markera błonowego. Korzystając z metryki kontrastu do wykrywania internalizacji receptora w skupiskach neutrofili w ranie, można określić ilościowo widoczne różnice między transportem CXCR1 i CXCR2 w neutrofilach w miejscu rany. Na przykład w tej analizie fluorescencyjnie znakowana internalizacja CXCR1 w komórkach zlokalizowanych w miejscu rany wzrastała z czasem, podczas gdy znakowana fluorescencyjnie CXCR2 pozostawała na błonach neutrofili w ranie.Supresja ligandów CXCR1 i CXCR2 poprzez leczenie morfolinem powoduje różnicową internalizację CXCR1 znakowaną fluorescencyjnie w miejscu rany. Ponadto we wczesnych zarodkach znakowany fluorescencyjnie CXCR1 jest wyraźnie internalizowany w zarodkach, w których ligand receptora ulega koekspresji. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że obrazowanie powinno być wykonane tak szybko, jak to możliwe po zranieniu, aby uchwycić dynamikę receptora podczas rekrutacji neutrofili do ran.Po zobrazowaniu receptorów chemokiny u normalnych larw, naukowcy mogą przeprowadzić obrazowanie porównawcze zmutowanych larw z rozregulowanym stanem zapalnym.

live-imaging-chemokine-receptors-zebrafish-neutrophils-during-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

W niniejszej pracy opisujemy nowatorski wysokoprzepustowy test chemicznie indukowanego stanu zapalnego, którego celem jest identyfikacja bioaktywnych substancji immunomodulujących. Skutecznie połączyliśmy zautomatyzowaną mikroskopię z autorskimi skryptami oprogramowania, co umożliwia automatyczną kwantyfikację odpowiedzi zapalnej, a także dalsze przetwarzanie, analizę, wydobywanie i przechowywanie danych.

Usprawnianie odkrywania leków: zautomatyzowany wysokotreściowy test stanu zapalnego u rybek danio pręgowanych

Ten film demonstruje śledzenie rekrutacji leukocytów za pomocą transgenicznych larw danio pręgowanego wykazujących ekspresję fotokonwertowalnego białka zielonej fluorescencji. Wstępne wstrzyknięcie bakterii znakowanych czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym do pęcherzyka usznego i wywołanie fotokonwersji umożliwia obserwację migracji leukocytów, fagocytozy i dyspersji w organizmie, dostarczając cennych informacji na temat dynamiki odpowiedzi immunologicznej.

Śledzenie leukocytów w oparciu o fotokonwersję u transgenicznego danio pręgowanego zakażonego bakteriami

Wideo demonstruje technikę urządzenia do ranienia i uwięzienia danio pręgowanego do obserwacji fluorescencyjnie znakowanej infekcji patogenami grzybiczymi u larw danio pręgowanego. Początkowa infekcja przyciąga makrofagi, a gdy infekcja się utrzymuje, rekrutacja neutrofili postępuje w miejscu wstrzyknięcia.

Technika zWEDGI do wizualizacji larw danio pręgowanego zakażonych patogenami grzybiczymi

Badanie najwcześniejszych zdarzeń progresji komórek przednowotworowych i interakcji wrodzonych komórek odpornościowych jest kluczowe dla zrozumienia i leczenia raka. W tym miejscu opisujemy metodę warunkowego wywoływania przemian komórek nabłonkowych i późniejszego obrazowania na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi HRASG12V u larw danio pręgowanego.

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół generowania i obrazowania zlokalizowanej infekcji bakteryjnej w pęcherzyku zewnętrznym danio pręgowanego.

Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

Pokazano systemiczne i zlokalizowane modele infekcji wirusa grypy A u ludzi. Korzystając z modelu infekcji ogólnoustrojowej, danio pręgowany może być używany do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych. Korzystając z modelu infekcji zlokalizowanej, danio pręgowany może być wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza.

Wykorzystanie modeli wirusa grypy pręgowanej u ludzi do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych i scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania ran na żywo i związanej z tym reakcji zapalnej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej in vivo. Metoda ta wykorzystuje stadium poczwarki rozwoju Drosophila, aby umożliwić długoterminowe obrazowanie i śledzenie określonych populacji komórek w czasie i jest kompatybilna z wydajną inaktywacją genów za pośrednictwem RNAi.

Długoterminowe śledzenie in vivo dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach Drosophila

Aby przetestować wpływ chemokiny na rekrutację makrofagów in vivo, do wykrycia ektopowej ekspresji chemokiny użyto całej hybrydyzacji in situ, a do oznaczania makrofagów użyto barwienia immunologicznego. Obrazowanie na żywo wykorzystano do obserwacji migracji makrofagów w czasie rzeczywistym.

Ektopowy model ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo

Danio pręgowany celujący w reaktywne elektrofile i utleniacze (Z-REX) to oparta na biologii chemicznej metoda badania reaktywnej sygnalizacji małocząsteczkowej. Technikę tę można zastosować do żywych ryb na różnych etapach rozwoju. Tutaj łączymy standardowe testy u danio pręgowanego z Z-REX do analizy szlaku sygnałowego.

Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów

Poznaj metodę obrazowania na żywo dynamiki receptorów chemokiny w neutrofilach Danio rerio podczas reakcji zapalnej. Protokół umożliwia wizualizację wewnętrznej trasy receptorów CXCR1 i CXCR2 w odpowiedzi na uraz.

Obrazowanie na żywo receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego podczas reakcji na ranę

Przeglądaj więcej filmów