Name: Ocena właściwości angiogenetycznych komórek macierzystych podobnych do raka jajnika przy użyciu trójwymiarowego systemu kohodowli, NICO-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj trójwymiarowy system kohodowli NICO-1 do oceny właściwości angiogenetycznych komórek macierzystych raka jajnika. Ta metoda umożliwia badanie remodelowania mikrośrodowiska nowotworowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Grant-in-Aid for Scientific Research C (grant nr 19K09834 dla K.N.) z Ministerstwa Edukacji, Nauki i Kultury, Japonia.

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet Etyki ds. Dobra Człowieka. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę na wykorzystanie ich próbek do badań, a pobranie i wykorzystanie tkanek do tego badania zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań nad Ludzkim Genomem i Analizą Genów na Uniwersytecie Teikyo.
1. Izolacja i hodowla komórek macierzystych raka jajnika (OCSC) od pacjentów z rakiem jajnika i wodobrzuszem w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2
<ol>
	<li>Wyizoluj rakowe komórki macierzyste z wodobrzusza ludzkiego raka jajnika uzyskane za pomocą paracentezy. Zbierz co najmniej 100-250 ml wodobrzusza od pacjentów, aby pobrać wystarczającą liczbę rakowych komórek macierzystych. Dodatkowo oceń profile ekspresji markerów rakowych komórek macierzystych (tj. EpCAM, Kalretinina, CD133, CD44, CD45, ALDH1 i Oct4) oraz markerów raka jajnika (pAX-8, WT-1) za pomocą cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Odwirować wodobrzusze ludzkiego raka jajnika przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin po aspiracji wodobrzusza.</li>
		<li>Usunąć supernatant i dodać 2 ml pożywki OCSC i 8 ml 30% roztworu Histodenz/roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Przygotuj pożywkę OCSC: suplement StemPro hESC, DMEM⁄F-12 z L-glutaminą (pożywka GlutaMAX), 25% BSA, 100 μM 2-merkaptoetanolu, 8 ng/mL FGF BASIC, 10 μM insuliny i 20 μM Y-27632.</li>
		<li>Ostrożnie nałożyć 2 ml pożywki OCSC na roztwór komórkowy w kroku 1.1.2 w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 450 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej w wirniku z wiadrem wahadłowym bez hamowania.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść warstwę OCSC (niezakłóconą na interfazie) do nowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety transferowej.</li>
		<li>Napełnij PBS do 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w pożywce OCSC i nasiona na naczyniu hodowlanym o bardzo niskim stopniu przylegania; kultury powinny być utrzymywane w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
		<li>Zmieniaj podłoże co trzy dni. Ostrożnie odstaw naczynie hodowlane na około 1 minutę, wyrzuć część supernatantu i dodaj nową pożywkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejście BOK
	<ol>
		<li>Zebrać OCSC w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć supernatant, napełnić PBS i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć supernatant, dodać 1 ml roztworu do oddzielania komórek składającego się z enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych (np. AccuMax) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Dobrze wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Upewnij się, że komórki znajdują się w jednej zawiesinie.</li>
		<li>Dobrze wymieszać pipetując, napełnić PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce OCSC w celu późniejszego wysiewu na szalkach hodowlanych o bardzo niskim przyleganiu i utrzymania w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórek śródbłonka HUEhT-1
<ol>
	<li>Pasaż komórek HUEhT-1
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę z naczynia hodowlanego HUEhT-1 i umyć komórki PBS.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 0,025% trypsyny i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 5 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka 2, zebrać komórki w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce HUEhT-1 i wysiać komórki na szalkach hodowlanych pokrytych kolagenem, a następnie utrzymać w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
		<li>Zmieniaj podłoże co trzy dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie płytki do kokultury NICO-1 do testu formowania probówek przy użyciu komórek HUEhT-1
<ol>
	<li>Zmontuj NICO-1 i pokryj hydrożelem na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (Matrigel Matrix).
	<ol>
		<li>Zamontuj jedną stronę NICO-1 zgodnie z instrukcjami producenta i trzymaj na lodzie.</li>
		<li>Przykryj powierzchnię NICO-1 300 μl zimnego PBS, a następnie usuń bufor.</li>
		<li>Dodać 300 μl schłodzonego hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut.</li>
		<li>Aby zrównoważyć, zanurz filtr w 100% etanolu, a następnie umyj 13-milimetrowy filtr ICCP (0,6 μm) PBS przez 1 minutę.</li>
		<li>Zamontuj NICO-1, w tym obie główne części korpusu A (prawa komora) i B (lewa komora) wraz z O-ringiem i filtrem zrównoważonym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wprowadzanie komórek HUEhT-1 i CSC do systemu NICO-1
<ol>
	<li>Przygotuj zawiesiny komórek HUEhT-1 poprzez trypsynizację monowarstw komórek i ponowne zawieszenie komórek w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka z 2% płodową surowicą cielęcą.</li>
	<li>Dodaj 1,2 ml zawiesiny komórkowej (1,5 x 105 komórek) do każdej studzienki pokrytej hydrożelem na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej.</li>
	<li>Dodaj 1,5 ml OCSC hodowanych przez pięć dni do drugiego dołka.</li>
	<li>Inkubować NICO-1 w temperaturze 37 °C w 5% CO2 ; tworzenie się probówek można zaobserwować pod mikroskopem i tworzenie sieci na hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej mierzone za pomocą liczby rozgałęzień.</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%2C+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).</li>
<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+development+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li>
<li>Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+fate+in+cancer+growth%2C+progression+and+therapy+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal%2FActivin+signaling+drives+selfrenewal+and+tumorigenicity+of+pancreatic+cancer+stem+cells+and+provides+a+target+for+combined+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).</li>
<li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).</li>
<li>Ohata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+stem-like+cell+regulator+CD44+by+Rho+kinase+inhibition+contributes+to+the+maintenance+of+colon+cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+in+vitro+model+of+ovarian+cancer+stem-like+cells+with+an+enhanced+proliferative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity.</a> Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li>
<li>Zong, X., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+role+in+metastasis+and+opportunity+for+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 934(2019).</li>
<li>Lizárraga-Verdugo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+its+role+in+angiogenesis+and+vasculogenic+mimicry+in+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers.</a> Frontiers in oncology. 10, 413(2020).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Richardson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell-mediated+mesenchymal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation.</a> Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).</li>
<li>Plotnikov, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).</li>
<li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+of+IFN-gamma+in+priming+MSC-mediated+suppression+of+T+cell+proliferation+through+up-regulation+of+B7-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1.</a> Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).</li>
<li>Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+canine+mesenchymal+stem+cells+with+primary+bone-derived+osteoblasts+promotes+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cell%2Fmesenchymal+stem+cell+interaction+in+co-culture+and+its+implications+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).</li>
<li>Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+from+the+retropatellar+fat+pad+and+peripheral+blood+stimulate+ACL+fibroblast+migration%2C+proliferation%2C+and+collagen+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression.</a> Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+%26+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).</li>
<li>Burger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+bevacizumab+in+the+primary+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).</li>
<li>Goel, H., Mercurio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+targets+the+tumour+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">VEGF targets the tumour cell.</a> Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+bevacizumab+and+murine+VEGF-A%3A+a+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Prezentowany protokół opisuje, w jaki sposób naśladować mikrośrodowisko guza OCSC w warunkach in vitro. Podstawowym elementem metody jest wysoce powtarzalny model kokultury uzyskany przy użyciu systemu NICO-1, pośredniego systemu kokultury Transwell. Wiele z obecnie dostępnych modeli kokultury bada wpływ bezpośredniego kontaktu komórka-komórka na kohodowane populacje komórek 12,13,14,15,16,17,18.</su...

Rak jajnika jest ósmym najczęściej występującym nowotworem złośliwym u kobiet na świecie, z około 300 000 nowych diagnoz i szacunkowo 180 000 zgonów rocznie1. Przy wstępnym rozpoznaniu rak jajnika często objawia się ciężkimi objawami, u około 75% pacjentek jest już w stadium III-IV. W związku z tym 5-letni wskaźnik przeżycia wynosi <30%, a wskaźnik śmiertelności jest najwyższy wśród nowotworów ginekologicznych2, przy czym skuteczność leczenia raka jajnika jest w dużym stopniu zależna od czynników klinicznych, takich jak pomyślne przeprowadzenie operacji odciążającej, oporność na chemioterapię i nawrót po początkowej terapii.
Tkanki raka jajnika są zorganizowane hierarchicznie, przy czym nie wszystkie składniki guza są jednakowo zdolne do generowania potomstwa. Uważa się, że jedyne komórki zdolne do samoodnawiania się i wytwarzania heterogenicznej populacji komórek nowotworowych reprezentują rakowe komórki macierzyste (CSCs)3. Samoodnowie CSC i inicjacji guza towarzyszy promowanie angiogenezy w celu przebudowy mikrośrodowiska guza w celu utrzymania wspierającej niszy. Jednak poprzednie modele nie mogły być wykorzystane do analiz in vitro ze względu na ograniczoną odtwarzalność hodowli CSC pochodzących z próbek klinicznych ze względu na rozerwanie sferoid po wielokrotnym pasażowaniu. Ostatnio opracowano eksperymentalne metody hodowli CSC od pacjentów dla kilku zastosowań4,5,6,7. W szczególności, wykorzystując charakterystykę CSC do wzrostu poprzez tworzenie sferoid w płytkach o bardzo niskim przyczepie z pożywką wolną od surowicy, hodowane CSC są indukowane do ekspresji markera powierzchniowego komórek macierzystych, który nie ulega ekspresji w normalnych komórkach nowotworowych o potencjale różnicowania wieloliniowego8,9.
Ostatnie dane wykazały, że utrzymywanie się uśpionych (O)CSC jajników, które są wizualizowane jako rozsiew w otrzewnej, jest związane z ich regeneracją jako nawracających nowotworów10. Zrozumienie molekularnych i biologicznych cech OCSC może zatem pozwolić na skuteczne ukierunkowanie i eliminację tych komórek, co skutkuje potencjalną remisją guza. W szczególności niewiele wiadomo na temat komórkowych i molekularnych cech mechanistycznych ról CSCs w angiogenezie11. Dlatego w niniejszym protokole wykorzystaliśmy OCSC pochodzące od pacjentów w warunkach in vitro w celu zbadania właściwości angiogennych komórek śródbłonka przy użyciu modelu kohodowli, który może naśladować mikrośrodowisko guza CSC i komórek śródbłonka w miejscu przerzutów w warunkach klinicznych. Ostatecznie, ponieważ neowaskularyzacja stanowi krytyczny proces niezbędny do wspierania wzrostu guza i przerzutów, lepsze zrozumienie jej mechanizmu pozwoli na opracowanie nowej terapii celowanej dla OCSC w miejscu przerzutów.
Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji etapu neowaskularyzacji otaczającego CSC w sposób przebiegu czasowego. Zaletą protokołu jest umożliwienie w pełni odtwarzalnych badań przy użyciu systemu kohodowli 3D, NICO-1, co pozwala na obserwację wpływu na pacjentów zdolności do inicjacji guza pochodzącej z OCSC podczas angiogenezy komórek śródbłonka.

<table><tbody><tr><td>0,025% Trypsyna&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta</td><td>Thermo</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>1250 &micro; L Końcówka do pipety</td><td>QSP</td><td>T112XLRS-Q</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>Nunc</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Końcówka do pipety</td><td>QSP</td><td>T110RS-NEW</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipet</td><td>Thermo</td><td>170366N</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>tubka Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>AccuMAX</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>BioCoatTM Collagen I 60mm Naczynie</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wirówka KUBOTA</td><td>2800</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear Płaskie dno Ultra niskie nasadki Płytki wielodołkowe</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka 2&nbsp;</td><td>Komórka PromoCell</td><td>C-22011&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>WAKO</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>SIGMA</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>HUEhT-1 cell</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB1458</td><td></td></tr><tr><td>Filtr ICCP 0,6 i mikro; m</td><td>Laboratorium Ginrei.</td><td>2525-06</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, ludzka</td><td>SIGMA (Roche)</td><td>11376497001</td><td></td></tr><tr><td>Luminometr</td><td>PerkinElmer</td><td>ARVO MX-flad</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Yokogawa</td><td>CQ-1</td><td></td></tr><tr><td>NICO-1</td><td>Ginrei Lab.</td><td>2501-02</td><td></td></tr><tr><td>OptiPlate-96</td><td>Pipet transferowy OptiPlate-96 PerkinElmer</td><td>6005290</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Pipet transferowy StemPro hESC SFM</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>A1000701</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FALCON</td><td>357575</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>WAKO</td><td>253-00513</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena właściwości angiogenetycznych komórek macierzystych podobnych do raka jajnika przy użyciu trójwymiarowego systemu kohodowli, nico-1

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Rakowe komórki macierzyste (CSC) znajdują się w bezpiecznej niszy, stanowiąc mikrośrodowisko składające się z sąsiednich komórek zrębu, naczyń i macierzy zewnątrzkomórkowej. Zdolność CSC do udziału w rozwoju śródbłonka stanowi ważną cechę, która bezpośrednio przyczynia się do ogólnego zrozumienia mechanizmów nowotworzenia i przerzutów nowotworowych. Celem tej pracy jest ustanowienie powtarzalnej metodologii badania zdolności komórek macierzystych raka jajnika (OCSC) do inicjacji nowotworu. W tym artykule zbadaliśmy mechanizm neowaskularyzacji między komórkami śródbłonka a OCSC wraz ze zmianami morfologicznymi komórek śródbłonka przy użyciu modelu kohodowli in vitro NICO-1. Protokół ten umożliwia wizualizację etapu neowaskularyzacji otaczającego OCSC w sposób przebiegu czasowego. Technika ta może dostarczyć informacji na temat właściwości angiogenetycznych OCSC w przerzutach nowotworowych.

Zebraliśmy płyny z wodobrzusza pobrane od pacjentek z zaawansowanym rakiem jajnika podczas operacji lub paracentezy w celu przeprowadzenia długoterminowej stabilnej hodowli sferoidów. Przedstawiamy tutaj przypadki długoterminowej hodowli sferoidowej jajnikowych CSC, określonych jako CSC1 i CSC2. Obie linie komórkowe mają tę samą diagnozę i profile histologiczne. Mechaniczne role OCSC leżące u podstaw interakcji z komórkami śródbłonka, niezbędnej do indukcji neowaskularyzacji komórek śródb...

Komórki macierzyste raka jajnika (OCSC) są odpowiedzialne za inicjację, nawrót, oporność terapeutyczną i przerzuty. Uważa się, że nisza naczyniowa OCSC sprzyja samoodnowie OCSC, co prowadzi do chemooporności. Protokół ten stanowi podstawę do ustanowienia odtwarzalnego modelu niszy naczyniowej OCSC in vitro.

Ocena właściwości angiogenetycznych komórek macierzystych podobnych do raka jajnika przy użyciu trójwymiarowego systemu kohodowli, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Rak jajnika ma wysoką śmiertelność wśród nowotworów ginekologicznych. Komórki macierzyste raka jajnika i ich nisza naczyniowa są w stanie przebudować mikrośrodowisko guza. Jednak wcześniejsze modele komórek macierzystych raka jajnika nie pozwalały na szczegółową analizę ze względu na ich ograniczoną odtwarzalność.Zaletą naszego protokołu jest powtarzalność systemu kohodowli 3D, który ułatwia badanie wpływu zdolności do inicjacji guza pochodzącego z komórek macierzystych raka jajnika u pacjentki podczas angiogenezy. Procedurę zademonstruje Yuko Miyagawa, pracownik naukowy z naszego laboratorium. Aby wyizolować rakowe komórki macierzyste z ludzkiego wodobrzusza raka jajnika uzyskanego za pomocą paracentezy, zbierz od 100 do 250 mililitrów wodobrzusza pacjenta i odwiruj próbkę w ciągu 24 godzin od pozyskania.Ponownie zawiesić granulki w dwóch mililitrach pożywki OCSC i dodać osiem mililitrów 30% pożywki o gradientzie gęstości niejonowej w PBS do każdej próbki. Przenieś zawiesiny komórek do pojedynczych 15-mililitrowych probówek i ostrożnie nałóż dwa mililitry dodatkowej pożywki OCSC na roztwór komórkowy w każdej probówce. Oddziel komórki przez wirowanie w gradionym spadku gęstości i ostrożnie przenieś OCSC na interfazie do nowej 15-mililitrowej probówki.Umyj zebrane komórki pełną objętością PBS i ponownie zawieś granulki w świeżej pożywce OCSC. Wysiewaj komórki na szalkach hodowlanych o bardzo niskim przyczepie i inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po pięciu dniach hodowli zebrać komórki w jednej 15-mililitrowej probówce na płytkę przez odwirowanie.Po drugim odwirowaniu w PBS ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze roztworu do oddzielania komórek enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych na 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dobrze wymieszać pipetując i przywrócić liczbę komórek do 37 na kolejne pięć minut. Pod koniec inkubacji ponownie wymieszać komórki przez pipetowanie i napełnić probówkę PBS do przemycia przez odwirowanie.Następnie ponownie zawieś osad w pożywce OCSC i wysiewaj komórki na nowych szalkach hodowlanych o bardzo niskim przyłączeniu. Aby skonfigurować hodowlę komórek śródbłonka HUEhT-1, umyj komórki HUEhT-1 PBS i potraktuj komórki 0,025% trypsyny przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Gdy komórki się odłączą, przerwij reakcję za pomocą pięciu mililitrów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka dwa i zbierz komórki w 15-mililitrowej probówce do odwirowania.Następnie ponownie zawiesić osad w pożywce HUEhT-1 w stężeniu 1,5 na 10 do piątego stężenia i wysiać komórki na szalkach hodowlanych pokrytych kolagenem. Aby skonfigurować interaktywną płytkę do współhodowli do testu tworzenia probówek, zmontuj urządzenie NICO-1 zgodnie z instrukcjami producenta i umieść system na lodzie. Umyj zespół 300 mikrolitrami zimnego PBS przed dodaniem 300 mikrolitrów schłodzonego hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej do urządzenia na 60-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji zanurzyć sterylny 13-milimetrowy filtr w 100% etanolu, a następnie zanurzyć na minutę w PBS. Pod koniec inkubacji umieścić O-ring i filtr równoważący w odpowiednich komorach w korpusie zespołu. Po zmontowaniu urządzenia ponownie zawieś komórki HUEhT-1 w ilości 1,25 na 10 do piątej komórki na mililitr pożywki do wzrostu komórek śródbłonka uzupełnionej 2% stężeniem surowicy cielęcej płodu i dodaj 1,2 mililitra komórek do każdego hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej dobrze pokrytego.Następnie dodaj 1,5 mililitra pięciodniowego OCSC do jednego dołka i umieść system NICO-1 w inkubatorze do hodowli komórkowych. Tworzenie się probówek można zaobserwować za pomocą mikroskopii świetlnej, a sieci komórkowe tworzące się na hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej można zmierzyć, określając ilościowo liczbę gałęzi, które tworzą się w kokulturze w czasie. W tym miejscu można zaobserwować porównanie aktywności tworzenia rurek indukowanej przez dwa różne CSC.W tej analizie liczba utworzonych rurek naczyniowych dramatycznie wzrosła w czasie podczas wspólnej hodowli z drugą populacją CSC. Na tych obrazach można zaobserwować angiogenną właściwość HUEhT-1 po leczeniu czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego bez kohodowli CSC2 jako kontrolę pozytywną. W tym modelu kohodowli komórek śródbłonka OSCS przy użyciu systemu NICO-1, komórki HUEhT-1 były hodowane wspólnie z CSC2 przez 20 godzin.Jak zaobserwowano za pomocą poklatkowego obrazowania wideo, komórki HUEhT-1 utworzyły rurki naczyniowe w trakcie 20-godzinnej kohodowli CSC. Ostatnie odkrycia doprowadziły do klinicznego zastosowania inhibitorów PARP w raku jajnika, wadliwych w naprawie rekombinacji homologicznej, a także antyangiogennego bewacyzumabu. Nasz protokół wykorzystujący system kohodowli 3D może dostarczyć informacji na temat angiogennych właściwości komórek macierzystych raka jajnika w przerzutach guza.

evaluating-angiogenetic-properties-ovarian-cancer-stem-like-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

Opisujemy metodologie tworzenia heterotypowych trójwymiarowych modeli in vitro, składających się z fibroblastów jajnika oraz prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika lub komórek nabłonkowych raka jajnika. Omówiono zastosowanie tych modeli do badania oddziaływań stroma-nabłonek, które zachodzą podczas rozwoju raka jajnika.

Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Testy sferyczne in vitro są powszechnie używane do identyfikacji komórek macierzystych raka. Tutaj porównujemy testy sferyczne pojedyncze i wielokomórkowe. Bardziej pracochłonne testy jednokomórkowe lub suplementacja metylocelulozą dają dokładniejsze wyniki, podczas gdy testy wielokomórkowe wykonywane w płynnym podłożu mogą mieć duży wpływ na gęstość komórek.

Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych

Komórki inicjujące nowotwór (TICs) mogą stanowić realny cel terapeutyczny w leczeniu raka jajnika, choroby często nawracającej i śmiertelnej. Przedstawiamy protokół dla warunków hodowli, które wzbogacają tę wysoce nowotworową populację komórek.

Metody in vitro Wzbogacanie komórek inicjujących nowotwór raka jajnika

Tutaj prezentujemy protokół do budowy trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej, składającego się z pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka i fibroblastów pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, jako narzędzie do badania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie wczesnych etapów rozsiewu raka jajnika w organotypowym posiewie ludzkiej jamy otrzewnowej

Aby zbadać progresję guza jajnika w fizjologicznie istotnym modelu, wielokomórkowe sferoidy zostały wyhodowane w mikrourządzeniu pod symulowanym przepływem płynu. Ten dynamiczny model 3D emuluje środowisko wewnątrzotrzewnowe z komponentami komórkowymi i mechanicznymi, w których dochodzi do przerzutów raka jajnika.

Modelowanie wielokomórkowego zachowania sferoidalnego raka jajnika w dynamicznym mikrourządzeniu otrzewnowej 3D

Tutaj prezentujemy nowatorskie zastosowanie testu pierścienia aortalnego, w którym wstępnie znakowane komórki mezenchymalne są hodowane wspólnie z sieciami śródbłonka pochodzącymi z aorty szczura. Ta nowatorska metoda umożliwia wizualizację naprowadzania i integracji mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) z sieciami śródbłonka, ilościowe określenie właściwości sieci oraz ocenę immunofenotypów MSC i ekspresji genów.

Test kohodowli pierścienia aortalnego: wygodne narzędzie do oceny potencjału angiogennego mezenchymalnych komórek zrębu in vitro

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Model in vitro niszy naczyniowej szpiku kostnego jest tworzony przez wysiewanie komórek mezenchymalnych i śródbłonka na prefabrykowane hydrożele PEG 3D. Sieci śródbłonka, komponenty ECM i aktywność ALP w niszach różnią się w zależności od zastosowanego czynnika wzrostu. Platforma może być wykorzystywana do zaawansowanych modeli nowotworów.

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

Opisujemy metody izolowywania komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji stromy wzbogaconej jajnika oraz generowania organoidów somatycznych jajnika mysiego przy użyciu podejścia bez scaffoldu.

Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

Poznaj trójwymiarowy system kohodowli NICO-1 do oceny właściwości angiogenetycznych komórek macierzystych raka jajnika. Ta metoda umożliwia badanie remodelowania mikrośrodowiska nowotworowego.

Ocena właściwości angiogenetycznych komórek macierzystych podobnych do raka jajnika przy użyciu trójwymiarowego systemu kohodowli, NICO-1 (Wideo) | JoVE Journal

Ocena właściwości angiogenetycznych komórek macierzystych podobnych do raka jajnika przy użyciu trójwymiarowego systemu kohodowli, NICO-1

Przeglądaj więcej filmów