Deriwatyzacja kryształów białek za pomocą I3C za pomocą losowego przesiewania macierzy mikronasion
16 stycznia 2021
W artykule przedstawiono metodę generowania kryształów białek pochodzonych z I3C (5-amino-2,4,6-trijodoizoftalowy) za pomocą mikrozasiewania do generowania nowych warunków krystalizacji w rzadkich przesiewach matrycowych. Tacy można ustawić za pomocą robotów do dyspensowania płynów lub ręcznie.
Jest to protokół krystalizacji zaprojektowany w celu optymalizacji wzrostu kryształu białka przy jednoczesnej deriwatyzacji białka z cząsteczką fazową, aby określić jego strukturę za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Aby określić strukturę krystaliczną promieniowania rentgenowskiego całkowicie nowego białka, warunki krystalizacji są optymalizowane, aby uzyskać wysokiej jakości kryształy. W przypadku całkowicie nowego białka do kryształu należy wprowadzić ciężkie atomy, aby uzyskać sprowadzony kryształ.
Dane dyfrakcyjne rentgenowskie są zbierane z derywowanego kryształu i muszą być rozwiązane obliczeniowo, aby uzyskać strukturę krystaliczną rentgenowską. Krystalizacja i derywitazacja to oba pracochłonne procesy. Aby rozwiązać te wąskie gardła, opracowaliśmy zoptymalizowaną procedurę selekcji, która jednocześnie realizuje oba te cele.
Protokół ten wykorzystuje wcześniej opracowaną technikę znaną jako losowe przesiewanie macierzy mikroseed. Kryształy lub osad krystaliczny są rozdrabniane na mikronasiona, które mogą być użyte do rozpoczęcia wzrostu kryształów w całkowicie niezależnych warunkach. Jednocześnie wprowadzamy cząsteczkę fazową zwaną I3C do warunków krystalizacji.
Ta cząsteczka dostarcza duży anomaliczny sygnał, który pozwala rozwiązać strukturę przez fazowanie dyskusyjne o jednej długości fali. Dla użytkowników niezaznajomionych z eksperymentalnym rozmiarowaniem struktur kryształowych przedstawiamy przyjazny dla użytkownika pipeline programowy, który częściowo automatyzuje rozwiązanie strukturalne, dostosowując je do wykorzystania anomalnego sygnału z I3C. Pierwszym krokiem jest stworzenie akcji I3C.
Odmierz 120 miligramów I3C do rurki mikrowirówki. Dodaj 200 mikrolitrów dwumolowego wodorotlenku litu do rurki mikrowirówki. Podgrzewanie rurki w temperaturze od 40 do 60 stopni oraz wirowanie może być użyte do zachęcania do rozpuszczania.
Jednomolowy zapas roztworu litu I3C powinien być brązowy. Można zastosować dwie metody wprowadzenia I3C do zapasów białkowych. Lit I3C można dodać bezpośrednio do zapasu białkowego.
Można dodać od 3,75 do 30 mikrolitrów I3C do 150 mikrolitrów białka, aby uzyskać stężenie od pięciu do 14 milimolarnych. Niektóre białka mogą wytrącać się przy kontakcie z wysokim stężeniem I3C. W takich przypadkach do buforu rozcieńczającego białka można dodać lit I3C, który dopasowuje białko próbki do końcowego stężenia od 10 do 80 milimolarów.
Dodaj 150 mikrolitrów buforu rozcieńczającego białko do 150 mikrolitrów próbki białka. Szklana sonda do rozdrabniania kryształów wykonana jest ze szklanej pipety Pasteura. Używając palnika Bunsena na niebieskim płomieniu, podgrzewaj pipetę Pasteura w kierunku środka.
Używając pęsety, wyciągnij końce pipety Pasteura na cienką średnicę mniejszą niż 0,3 milimetra. Trzymaj ten segment w płomieniu, aby oddzielić pipetę w tym miejscu, a zaokrąglić koniec pipety, aby wykończyć szklaną sondę. To przykład, jak powinna wyglądać szklana pipeta.
Kryształowe kruszki można również zamawiać od zewnętrznych dostawców jako alternatywę dla własnego wytwarzania. Mikronasion powstaje przez rozdrabnianie kryształów białka lub wytrącenia krystalicznych. Umieść pięć rurek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL na lodzie. Pod mikroskopem świetlnym wybierz najlepsze kryształy morfologiczne lub osad krystaliczny, który można poświęcić.
Dla 96-dołków tacy krystalizacyjne otwierają odwiert przez przecięcie plastikowej taśmy uszczelniającej. Do wieszania tacek opadających pokrywę można zdjąć pęsetą i odwrócić na płaską powierzchnię. Przelej 70 mikrolitrów roztworu rezerwuarowego do jednej z rurek mikrowirówki i schłodz na lodzie.
Do pozostałych rurek przelej 90 mikrolitrów roztworu rezerwuarowego i wróć do lodu do schłodzenia. Jeśli zbiornik jest niewystarczający, można wytworzyć rezerwuar krystalizacyjny poprzez mieszanie odpowiednich odczynników i użyć go zamiast niego. Porusz kryształy w kropli krystalizacyjnej za pomocą szklanej sondy i dokładnie ją zmiażdż.
Postęp można monitorować pod mikroskopem, aż kryształy lub materiał krystaliczny nie są widoczne. Przelej całą ciecz z kropli do rurki mikrowirówki zawierającej 70 mikrolitrów roztworu rezerwuarowego. Mieszaj, pipetując w górę i w dół.
Przelej dwa do trzech mikrolitrów mieszaniny z powrotem do studni i przepłucz ją przez pipetowanie w górę i w dół. Przelej mieszankę z powrotem do rurki mikrowirówki. Ten krok płukania należy powtórzyć jeszcze raz.
Rurka mikrowirówki powinna być od tego miejsca chłodna, aby zapobiec topieniu mikronasion. Wiruj rurę z maksymalną prędkością czterech stopni przez około trzy minuty, regularnie chłodząc ją na lodzie, aby zapobiec przegrzaniu. Wykonaj jedno na dziesięć seryjnego rozcieńczenia nasion poprzez kolejne przelewanie 10 mikrolitrów między chłodzonym roztworzeniem rezerwaularnym.
Między rozcieńczeniami nasion rurka powinna być wirowana. Nasienne, które nie zostaną od razu wykorzystane, należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze ultra do 80 stopni. Losowy 96-dołkowy sito matrycy mikronasion można skonfigurować za pomocą robota do dozowania cieczy.
Umieść zapas nasienny, roztwór białka uzupełniony I3C i sito krystalizacyjne w robocie. Za pomocą robota przeniesiono 75 mikrolitrów z ekranu krystalizacyjnego do tacy na 96 dołków. Dodaj jeden mikrolitr do kropli krystalizacyjnej i 74 mikrolitry do zbiornika.
Przenieś jeden mikrolitr białka uzupełnionego I3C do kropli krystalizacyjnej. Przelej 0,1 mikrolitra materiału nasiennego do kropli krystalizacyjnej. Uszczelnij płytę taśmą uszczelniającą.
Wiszące sita można ustawić w 24 dobrze wiszących tackach do krystalizacji kroplów. Nasmaruj krawędzie wiszących otworów na spadki. Przelej 500 mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego do zbiornika.
W pobliżu środka szkła szklanego umieść jedną mikrolitrową kroplę roztworu krystalizacyjnego. Do tej kropli dodaj jeden mikrolitr białka wzbogacony o lit I3C oraz 0,1 mikrolitra nasion. Odwróć osłonę i dobrze uszczelnij krystalizację, wciskając osłonę w smar.
Tacy wiszące i uszczelniające są inkubowane w stałej temperaturze, aby umożliwić powstawanie kryształów. Powinny być regularnie kontrolowane pod mikroskopem pod kątem wzrostu kryształów. Po uzyskaniu, integracji i skalowaniu danych dyfrakcyjnych, zgodnie z wyjaśnieniem w dołączonym protokole, zautomatyzowany potok określania struktury krystalicznej Auto-Rickshaw może być użyty do rozwiązania problemu fazowego i modelowania białka.
Na stronie startowej Auto-Rickshaw kliknij przycisk "dalej". Wpisz swój instytucjonalny e-mail w formularzu Auto-Rickshaw i kliknij "Kontynuuj prowadzenie Auto-Rickshaw". Dla białek bez homologicznego szablonu moto uruchom protokół SAD Auto-Rickshaw w trybie zaawansowanym.
Wprowadź wymagane parametry. Wybierz białko jako typ cząsteczki. Wprowadź długość fali zbierania danych w angstremach.
Na przykład I jako element podstrukturalny, by wskazać atomy jodu, były użyte. Wybierz typ podstruktury I3C, aby wskazać, że I3C była cząsteczką fazową. Wybierz sub_direct jako metodę określania podkonstrukcji.
Wybierz trzy jako liczbę oczekiwanych podstruktur na monomer. Wpisz jeden jako granicę rezerwacji w wyszukiwaniu podstruktur. Pozwala to Auto-Rickshaw automatycznie określić odpowiedni próg rozdzielczości.
Wprowadź liczbę reszt w pojedynczym monomorze, grupę przestrzenną zbioru danych oraz liczbę cząsteczek w jednostce asymetrycznej na podstawie współczynnika Matthewsa. Wybierz odpowiedni poziom rozpowszechnienia danych rentgenowskich, który odpowiada Twoim potrzebom. Wprowadź anomalne dane jako pusty plik zbioru.
Wprowadź sekwencję białkową jako plik SEQ, PIR lub TXT. Wpisz swój instytucjonalny adres e-mail. Wyniki są dostarczane za pośrednictwem linku internetowego przesłanego na podany adres e-mail.
Jeśli Auto-Rickshaw nie rozwiąże konstrukcji za pomocą określonej podstruktury, weryfikacja podstruktury może pomóc w rozwiązywaniu problemów. Pobierz listę stron poświęconych ciężkim atomom ze strony wyników Auto-Rickshaw. Jest to hiperłącze zwane miejscami ciężkich atomów.
To pobierze plik tekstowy z witrynami o ciężkich atomach. Zmień rozszerzenie pliku z txt na pdb. Otwórz plik pdb w Coot.
Włącz symetrię, aby zobaczyć wszystkie ciężkie atomy z sąsiednich jednostek asymetrycznych. Zmierz odległości między ciężkimi atomami, w tym między jednostkami asymetrycznymi. I3C pojawi się jako trójkąt równoboczny o długości boków sześciu angstromów.
Obecność trójkąta o tych wymiarach wskazuje, że rozmieszczenie tych ciężkich atomów jest poprawne. Jeśli podstruktura przejazdu Auto-Rikszy jest nieprawidłowa, można przetestować inne ustawienia Auto-Riksz, zgodnie z protokołem pisanym. Metoda RMMS I3C została przetestowana na dwóch białkach: lizozymie białka jaj kurczaka przy użyciu HT testu Hampton Research oraz domenie białka lizyny Orf11 z bakteriofagu P68.
Dla każdego białka utworzono pełne ekrany odpowiadające ekranowi kontrolnemu bez I3C lub mikroseed, ekranowi z dodanym mikroseedem, ekranie z I3C, a na końcu ekranie z I3C i microseed. Dodanie I3C do ekranu kryształowego nie wydaje się zwiększać liczby uderzeń krystalizacji. W przypadku lizozymu białka jaj kury liczba warunków spadła z 31 do 26.
W doenie Orf11 na ekranie sterowania pojawił się warunek pojedynczego trafienia. Dodanie I3C na ekran dawało pojedyncze uderzenie w tych samych warunkach. Dodanie mikronasion do studni spowodowało znaczący wzrost liczby warunków trafienia, co skutkowało odpowiednio 2,1- i sześciokrotnym wzrostem lizozymu białka jaj kury oraz domeny Orf11.
Ten wynik jest zgodny z innymi badaniami testującymi RMMS. Co najważniejsze, dodanie I3C i mikronasion do ekranu zwiększyło również liczbę warunków trafienia w porównaniu do ekranu kontrolnego, wykazując odpowiednio 2,3- i siedmiokrotny wzrost lizozymu białka kury i domeny Orf11. Pokazuje to, że metoda RMMS I3C może efektywnie tworzyć nowe warunki dla kryształów pochodnych.
Kryształy z tych warunków można było pozyskać i wykorzystać do rozwiązania struktury krystalicznej. Zarówno strukturę domeny Orf11 lizozymu białka kurczaka, można było rozwiązać za pomocą fazowania SAD na potoku Auto-Rickshaw, wykorzystując anomalny sygnał z I3C, co wykazało skuteczną derywitację przez ekran RMMS I3C. Przedstawiliśmy prosty i wydajny protokół do produkcji wysokiej jakości kryształów pochodzonych z cząsteczką fazową I3C.
Minimalizuje liczbę przesiewów i kroków obsługi krystalicznych, dlatego jest szczególnie interesująca dla biologów strukturalnych badających nowe białka. Zdecydowanie zalecamy optymalizację wielkości kryształów poprzez testowanie różnych rozcieńczeń nasion wykonanych podczas przygotowywania nasion. Ten krok kończy się po wykonaniu wstępnych przesiew.
I3C jest szeroko dostępny i tanio w zakupie, dlatego uważamy, że ta metoda jest dostępna dla większości laboratoriów biologii strukturalnej.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół krystalizacji, który optymalizuje wzrost kryształów białka podczas ich pochodzenia z I3C do krystalografii rentgenowskiej. Metoda zastosowania losowego przesiewania matryc mikrosiewnych w celu poprawy warunków krystalizacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Krystalizacja białka
- Krystalografia rentgenowska
- Biologia strukturalna
Tło
- Krystalizacja jest niezbędna do wyznaczania struktur białek.
- Pochodzenie z atomami ciężkimi jest konieczne do fazowania w krystalografii rentgenowskiej.
- Tradycyjne metody mogą być pracochłonne i czasochłonne.
- Techniki mikrosiewne mogą poprawić wyniki krystalizacji.
Cel badania
- Opracowanie usprawnionego protokołu krystalizacji białek i pochodzenia.
- Wprowadzenie I3C jako cząsteczki fazującej w celu poprawy wyznaczania struktury rentgenowskiej.
- Dostarczenie przyjaznego dla użytkownika oprogramowania do rozwiązania struktury.
Zastosowanie metod
- Przygotowanie roztworów macierzystych I3C.
- Młócenie kryształów białka w celu stworzenia mikrosiew.
- Ustawienie ekranów krystalizacyjnych z wykorzystaniem robotów dozujących płyny.
- Monitorowanie wzrostu kryształów i optymalizacja warunków.
Główne wyniki
- Skuteczne wytwarzanie pochodzonych kryształów białka.
- Poprawa warunków krystalizacji poprzez mikrosiew.
- Skuteczna eksploatacja I3C do fazowania w krystalografii rentgenowskiej.
- Automatyzacja części procesu rozwiązania struktury.
Wnioski
- Protokół zwiększa efektywność krystalizacji białek.
- Mikrosiew znacznie poprawia jakość uzyskanych kryształów.
- I3C służy jako skuteczna cząsteczka fazująca do wyznaczania struktury.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in structural biology by combining protein crystallization with heavy-atom derivatization to enable experimental phasing for novel targets. By integrating random microseed matrix screening with I3C derivatization, it reduces the number of discrete steps required to obtain phase information, accelerating early-stage target validation. The approach supports de-risking of structural hypotheses in discovery pipelines where homology models are unavailable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables experimental phasing for novel proteins lacking homology models, supporting target validation through direct structure determination.
- Operational Value: Combines crystallization and derivatization in a single workflow, reducing hands-on time and sample handling.
- Predictive Value: The equilateral triangle arrangement of iodine atoms in I3C allows rapid validation of the anomalous substructure, increasing confidence in phased models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates derivatized crystal hits suitable for downstream data collection and phasing, enabling reliable electron density maps.
- Operational Value: Uses liquid dispensing robots to set up 96-well random microseed matrix screens, improving reproducibility and throughput.
- Scalability: Microseed stocks can be serially diluted and stored at -80°C, allowing reuse across multiple screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a path from crystallization to automated structure solution via the Auto-Rickshaw pipeline, supporting preclinical target characterization.
- Mechanistic De-risking: Successful SAD phasing using I3C-derived anomalous signal validates the structural model, reducing uncertainty in target mechanism.
- Disease-Relevant System: Demonstrated on hen egg white lysozyme and Orf11 lysin domain, showing applicability to diverse protein classes including antimicrobial targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, linking crystallization to structure solution for targets requiring experimental phasing, particularly when computational methods fail due to lack of templates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling 3D structure determination of novel proteins, clarifying binding sites and domain architecture.
- Screening: Produces reproducible crystallization conditions through microseeding, increasing hit rates for derivatized crystals as shown by 2.3- to 7-fold improvements over controls.
- Analytics: Outputs anomalous diffraction data suitable for SAD phasing, with substructure validation via I3C’s characteristic six-angstrom equilateral triangle.
- Translational Research: Connects to downstream validation through automated model building in Auto-Rickshaw, enabling progression to preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Microseed stocks and I3C protocols are standardized and storable, supporting platform reuse across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides experimental phase information, reducing reliance on molecular replacement and increasing success rate for novel targets.
- Operational Value: Streamlines workflow by combining two labor-intensive steps (crystallization and derivatization) into one integrated screen.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in target validation by enabling rapid structure determination.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target selection through high-quality, phased structures, supporting risk-adjusted advancement.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallization, microseeding, and handling of heavy atom compounds is required.
- Access to liquid dispensing robots, X-ray diffraction equipment, and structure solution software (Auto-Rickshaw, Coot) is necessary.
- Standardization across teams benefits from predefined I3C stock protocols and microseed storage procedures.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of I3C concentration to avoid precipitation, as noted for sensitive targets.
- Practical limitations include the need for initial crystal or precipitate to generate microseeds and the dependence on sufficient anomalous signal for SAD phasing.
