Name: Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Poznaj mikroiniekcję zarodków muchy piaskowej Phlebotomus papatasi do mutagenezy CRISPR/Cas9. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów w wektorach chorób i rozwój strategii kontroli wektorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Vanessie Meldener-Harrell za krytyczną lekturę rękopisu.

Wykorzystanie myszy jako źródła krwi do karmienia muchy piaskowej zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health (NIH). Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania NIAID, NIH (numer protokołu LPD 68E). Bezkręgowce nie są objęte wytycznymi NIH.
1. Przygotowanie igieł (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Pociągnij igły i skoś zgodnie z opisem w Meuti i Harrell19. Krótko mówiąc, pociągnij igły za dwustopniowy ściągacz do mikropipet szklanych, używając kapilar ze szkła borokrzemianowego.</li>
	<li>Naostrz igły, ukosując na mokro na ukosie do mikropipet, używając bardzo drobnego kamienia.</li>
</ol>
2. Pobieranie zarodków i mikromanipulacja (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Pięć dni przed dniem wstrzyknięcia, krew karmi samice muchy piaskowej, tak jak jest to rutynowe w celu utrzymania kolonii. Szczegółowe informacje na temat procedur hodowli kolonii much piaskowych i wymaganego materiału można znaleźć w Lawyer et al.1 Utrzymuj owady w inkubatorach w temperaturze 70% wilgotności i 26 °C podczas ich rozwoju.
	<ol>
		<li>Pewnego dnia po karmieniu krwią złap karmione krwią samice w grupach po 100-150 sztuk w gipsowych doniczkach z bocznym portem. Utrzymuj samice, karmiąc je roztworem cukru (30% sacharozy – objętość wystarczająca do namoczenia małego wacika), co jest typowe dla utrzymania kolonii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W 2-3 dniu po karmieniu krwią NIE zwilżaj doniczek gipsowych. Trzymanie samic na suchym podłożu zapobiegnie przedwczesnemu składaniu jaj, ponieważ samice wolą składać jaja w wilgotnym środowisku.</li>
	<li>W 5 dniu po karmieniu krwią wykonaj pobranie zarodka, mikromanipulację i mikroiniekcję. Wprowadzić wilgotną bibułę filtracyjną do komory do składania jaj. Świeżo złożone zarodki nie mają w pełni rozwiniętej kosmówki i wydają się białe. Podczas zabiegu należy używać czarnej bibuły filtracyjnej, aby ułatwić wizualizację białych zarodków.</li>
	<li>Przenieś małą grupę samic z gipsowego garnka do komory składania jaj przez boczne porty za pomocą aspiratora doustnego. Obecność wilgotnego podłoża (bibuły filtracyjnej) skłania samice do składania jaj.</li>
	<li>Po 30-60 minutach ostrożnie wyjmij z komory bibułę filtracyjną z nowo złożonymi zarodkami. Przechowuj bibułę filtracyjną i zarodki na szalce Petriego do 3 godzin. W tym czasie należy regularnie oceniać poziom wilgotności bibuły filtracyjnej, aby upewnić się, że pozostaje ona wilgotna. W tym czasie powtórz kroki od 2.4 do 2.6 z nowymi grupami samic i zbierz jak najwięcej zarodków.</li>
	<li>Przygotuj szkiełka mikroskopowe do wstrzyknięcia: ręcznie zbieraj jaja jedno po drugim bardzo cienkim pędzlem i ostrożnie przenieś je na inny kawałek wilgotnej czarnej bibuły filtracyjnej umieszczony na szkiełku mikroskopowym zwieńczonym szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
	<ol>
		<li>Dodać wodę do bibuły filtracyjnej, wystarczająco dużo, aby zarodki były wilgotne, ale nie powodując ich odpływania od szkiełka nakrywkowego lub zasysania pod szkiełko nakrywkowe. Ułóż zarodki na szkiełku nakrywkowym. Szkiełko nakrywkowe działa jak zabezpieczenie, zapobiegając stoczeniu się jaj podczas wstrzykiwania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zastrzyki z zarodków (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Wstrzyknięcia należy rozpocząć od 2,5 do 3 godzin po rozpoczęciu pobierania komórek jajowych. Wstrzyknięcia należy wykonywać w temperaturze pokojowej i wilgotności otoczenia w laboratorium.</li>
	<li>Upewnij się, że wyrównane zarodki mają wystarczającą ilość wody, aby były wilgotne. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zarodki były wilgotne podczas wstrzyknięć. Jeśli nie są wilgotne podczas procesu wstrzykiwania, wstrzyknięcia stają się trudne, ponieważ igła ma problemy z przebiciem zarodka. Prawidłowa ilość wody to punkt, w którym zarodki mają wokół siebie łąkotkę wody, ale szkiełko nakrywkowe nie unosi się na powierzchni wody, co powoduje, że zarodki przepychają się pod szkiełko nakrywkowe. Bardzo ważne jest monitorowanie ilości wody wokół zarodków podczas wstrzyknięć. W razie potrzeby dodaj wodę, aby zarodki były wilgotne.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj wodę, zwilżając szczotkę wodą i przenosząc wodę na tylny koniec bibuły filtracyjnej. Dodawanie wody w ten sposób pozwala na dodawanie wody w powolny i kontrolowany sposób, tak aby dodać tylko tyle, aby zarodki były wilgotne. Zbyt dużo wody może spowodować, że zarodki będą unosić się poza wyrównaniem, co utrudni wstrzyknięcie zarodków.</li>
	<li>Mieszać do wstrzykiwań z powrotem do igły do mikroiniekcji. Dodać około 0,5 do 1 μl mieszanki iniekcyjnej do igły za pomocą ręcznie rysowanego wypełniacza igłowego borokrzemianowego, można również użyć końcówek do pipet z żelem. Mieszanina iniekcyjna składa się z jednego lub kilku przewodników RNA (80 ng/μL każdy) zaprojektowanych do celowania w określone locus zmieszane z dostępnym na rynku rekombinowanym białkiem Cas9 (300 ng/μL).</li>
	<li>Zaczynając od ciśnienia iniekcji wynoszącego 30 psi, nacisnąć spust wtrysku, aby usunąć powietrze z końcówki igły. Spowoduje to wypchnięcie mieszanki iniekcyjnej do końcówki igły, umożliwiając przepływ mieszanki iniekcyjnej. W tym momencie powoli zwiększaj mocowanie/stałe ciśnienie, aż materiał do wstrzykiwania zacznie płynąć, a następnie wycofaj się z trzymania/stałego ciśnienia, tak aby znajdowało się tuż poniżej punktu mieszanki iniekcyjnej wypływającej z igły. Bramkowane ustawienie powinno dostarczyć tylko tyle materiału do iniekcji, aby można było zobaczyć, jak niewielka ilość materiału dostaje się do zarodka. 
	UWAGA: Początkowo testowano wstrzykiwanie zarodków muchy piaskowej pod olej halowęglowy, podobnie jak w przypadku innych protokołów stosowanych w przypadku Drosophila i komarów, jednak procent przeżycia w przypadku tych zastrzyków był bardzo niski. Przeżywalność uległa poprawie, przechodząc na iniekcje na wilgotną bibułę filtracyjną, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Wbić igłę w bok zarodka. Użyj szkiełka nakrywkowego za zarodkiem jako zabezpieczenia, które pomoże igle przebić zarodek. Dostarczyć niewielką ilość mieszanki do wstrzykiwań do zarodka przed delikatnym wyjęciem igły.</li>
	<li>Natychmiast po wyjęciu igły należy nacisnąć wstrzykiwacz, aby usunąć zasypany materiał z końcówki igły. Pomoże to zapobiec zatykaniu się igły.</li>
	<li>Przejdź do następnego zarodka. Pomiędzy każdym wstrzyknięciem należy upewnić się, że bibuła filtracyjna jest wilgotna, a igła nie jest zatkana.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków policz liczbę wstrzykniętych zarodków, aby prowadzić bieżącą liczbę.</li>
	<li>Usuń szkiełko nakrywkowe, dodając wodę do bibuły filtracyjnej, aby szkiełko nakrywkowe unosiło się. W tym momencie użyj sondy (drewniany aplikator w sztyfcie z pinezką do owadów przyklejoną do końcówki), aby przytrzymać bibułę filtracyjną na miejscu, podczas gdy palec jest używany do odciągania szkiełka nakrywkowego od wstrzykniętych zarodków.</li>
	<li>Zetrzyj nadmiar wody z bibuły filtracyjnej po usunięciu szkiełka nakrywkowego.</li>
</ol>
4. Hodowla po iniekcji (G0) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4)
<ol>
	<li>Przenieś bibułę filtracyjną z zarodkami na kilka warstw wilgotnej bibuły filtracyjnej umieszczonej na szalce Petriego w celu utrzymania wilgotności. Trzymaj zarodki w tym miejscu przez czas potrzebny do wstrzyknięcia innych zarodków. W ten sposób zarodki mogą być trzymane maksymalnie przez 3 godziny. Po wstrzyknięciu powoli brązowieją.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków należy je ręcznie przenieść do wcześniej zwilżonych małych gipsowych doniczek. Nie umieszczaj zbyt wielu zarodków w każdej doniczce i zachowaj odległość między nimi, aby uniknąć ewentualnego zanieczyszczenia grzybiczego między osobnikami. Przykryj doniczki sitkiem i przechowuj je tak, jak zwykle robi się to w przypadku jaj kolonii much piaskowych, utrzymywanych w inkubatorach przy wilgotności 70% i temperaturze 26 °C, podczas ich rozwoju.</li>
	<li>W 1. dniu po wstrzyknięciu należy usunąć wszystkie uszkodzone i martwe zarodki za pomocą pędzla. Dodaj 100 μl 0,5% kwasu propionowego, kropla po kropli, na gipsowe doniczki zawierające wstrzyknięte zarodki, aby ograniczyć zanieczyszczenie grzybicze. Uwalnianie cytoplazmy z zarodków uszkodzonych podczas procesu iniekcji jest szczególnie korzystne dla rozwoju grzybów.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj doniczki gipsowe i usuwaj wszelkie złe lub martwe zarodki. Jeśli obecny jest grzyb, usuń wszystkie zainfekowane zarodki i dodaj kilka kropli 0,5% kwasu propionowego.</li>
	<li>Larwy wylęgają się między 8 a 12 dniem po wstrzyknięciu. Dwa razy dziennie przenieś nowo powstałe larwy do nowych gipsowych doniczek, w grupach po maksymalnie 5-10 sztuk. Dodaj niewielką ilość jedzenia i sprawdzaj jedzenie 2-3 razy w tygodniu.
	<ol>
		<li>Uważnie monitoruj ilość pokarmu dla larw, ponieważ zbyt duża ilość znacznie zwiększa ryzyko skażenia grzybami. Larwy much piaskowych przeżywają lepiej w grupach, jednak mogą być kanibalami, jeśli nie ma wystarczającej ilości pożywienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kiedy larwy przepoczwarzają się, oddziel je według płci, aby samice pozostały dziewicami. Jeśli jest dużo ocalałych, odrzuć samce i zachowaj tylko samice. 
	UWAGA: Zarówno mężczyźni, jak i samice mogą być nosicielami i przenosić mutacje. Ponieważ jednak samice muszą być utrzymywane w stanie dziewiczym przed ich skrzyżowaniem, łatwiej jest używać tylko samic, którym wstrzyknięto G0, aby uniknąć konieczności rozdzielania owadów wt według płci. Samce G0 mogą być trzymane jako zapasowe, jeśli liczba dorosłych osobników, które przeżyły, są niskie i w tym przypadku będą kojarzone z posortowanymi dziewiczymi samicami.</li>
</ol>
5. Selekcja i badanie przesiewowe zmutowanych alleli (<silna klasa="xfig">Rysunek 5)
<ol>
	<li>Masowo krzyżuj samice G0 z samcami wt w klatce. Nakarm je krwią w całości, tak jak robiłoby się to w przypadku normalnego utrzymania kolonii.</li>
	<li>Jednego dnia po karmieniu krwią przenieś każdą samicę G0 z 2-3 samcami do indywidualnych rurek gipsowych za pomocą aspiratora doustnego. Nakarm muchy cukrem na małym waciku zmienianym codziennie i użyj strzykawki z wodą, aby upewnić się, że wilgotność gipsu jest odpowiednia do składania jaj.</li>
	<li>Po złożeniu jaj przez samice G0 (odpowiadających G1), zbierz ich ciała w osobnych, opatrzonych adnotacjami probówkach Eppendorfa w celu późniejszego genotypowania. Utrzymuj zarodki, jak zwykle robi się to w przypadku kolonii wt.</li>
	<li>Wyodrębnij DNA od samic G0 wybraną metodą.</li>
	<li>Badanie przesiewowe DNA pod kątem obecności mutacji, na przykład poprzez zaprojektowanie testu PCR przy użyciu starterów otaczających region oczekiwanych cięć CRISPR.</li>
	<li>Przechowywać tylko zarodki G1 złożone przez samice G0 wykazujące oznaki transformacji. Kiedy te zarodki G1 rozwiną się w poczwarki, oddziel je według płci i zachowaj tylko samice. Skrzyżuj samice G1 z tej samej samicy G0 do samców wt, nakarm je krwią, a następnie przenieś w małych grupach po 2-3 samice i 4-5 samców do małych pojemników. 
	UWAGA: Wszystkie osobniki G1 mają szansę być nosicielami unikalnej mutacji, więc jeśli liczba osobników, które przeżyły, nie jest zbyt duża, lepiej jest krzyżować samice G1 indywidualnie z samcami WT. Przypadek kilku samic będących nosicielami innej mutacji obecnej w tej samej probówce jest rzadki, ale może wystąpić. Jeśli taki przypadek zostanie zaobserwowany po genotypowaniu, samice potomstwa G2 powinny być następnie kryte indywidualnie z samcami wt. Ten schemat krycia pozwala uniknąć możliwości wielu mutacji u potomstwa.</li>
	<li>Po złożeniu jaj zbierz ciała samic G1 i przebadaj je pod kątem mutacji. Trzymaj tylko te rurki, w których co najmniej jedna samica wykazywała oznaki mutacji.</li>
	<li>Dla późniejszych pokoleń wykonuj pojedyncze pary krzyżówek. Po złożeniu jaj przebadaj rodziców pod kątem obecności mutacji. Powtarzaj w każdym pokoleniu, aż oboje rodzice będą homozygotyczni pod względem tej samej mutacji. Po zidentyfikowaniu będą założycielami homozygotycznego stada mutantów.</li>
</ol>

<ol><li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+%28Diptera%2C+Psychodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42(2017).</li>
<li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9%3A+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li>
<li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+Mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+the+Immune+Deficiency+Pathway+Impacts+Vector+Competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major.</a> MBio. 10 (4), (2019).</li>
<li>Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aedes+aegypti+toll+pathway+controls+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098(2008).</li>
<li>Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toll+immune+signaling+pathway+control+conserved+anti-dengue+defenses+across+diverse+Ae.+aegypti+strains+and+against+multiple+dengue+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes.</a> Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).</li>
<li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota%2C+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561(2012).</li>
<li>Hu, C., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+regulate+trypanosome+parasite+infection+of+the+tsetse+fly+Glossina+morsitans+morsitans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).</li>
<li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+PGRPLC-mediated+defense+against+bacteria+modulates+infections+with+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542(2009).</li>
<li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+signaling+pathways+regulating+bacterial+and+malaria+parasite+infection+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).</li>
<li>Telleria, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspar-like+gene+depletion+reduces+Leishmania+infection+in+sand+fly+host+Lutzomyia+longipalpis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).</li>
<li>Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+phlebotomine+sand+flies%3A+Xanthine+dehydrogenase+knock+down+by+dsRNA+microinjections%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).</li>
<li>Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+trypsin+expression+in+Lutzomyia+longipalpis+using+RNAi+enhances+the+survival+of+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+and+Vectors%22%5BJournal%5D)">Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania.</a> Parasites and Vectors. 2 (1), 62(2009).</li>
<li>Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+scavenging+by+catalase+is+important+for+female+Lutzomyia+longipalpis+fecundity+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality.</a> PLoS One. 6 (3), 17486(2011).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+DNA+Repair+Pathways+to+Improve+Precision+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).</li>
<li>Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sand+fly+embryo+microinjection+for+gene+editing+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769(2018).</li>
<li>Meuti, M., Harrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+and+Injecting+Embryos+of+Culex+Mosquitoes+to+Generate+Null+Mutations+Using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9.</a> JoVE. (163), e61651(2020).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008(2018).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+in+the+Silverleaf+Whitefly+%28Bemisia+tabaci%29%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li>
<li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-Mediated+Gene-Editing+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi+by+ReMOT+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Genomes+and+Genetics+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control.</a> Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).</li>
</ol>

Przedstawiamy tutaj niedawno opracowaną metodę mikroiniekcji zarodka do celowanej mutagenezy za pomocą CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych Phlebotomus papatasi. Mikroiniekcja zarodków do modyfikacji genetycznej owadów została opracowana u Drosophila w połowie lat 80. XX wiekui jest obecnie rutynowo stosowana u wielu różnych owadów. Inne metody dostarczania materiałów do modyfikacji genetycznej zostały opracowane do stosowania u owadów, takie jak ReMOT 20,21,22...

Choroby przenoszone przez wektory są głównym zagrożeniem dla zdrowia publicznego w ciągłej ewolucji. Według Światowej Organizacji Zdrowia setki gatunków wektorów rozprzestrzenionych w bardzo różnych rodzinach filogenetycznych (np. komary, kleszcze, pchły) są odpowiedzialne za przenoszenie ogromnej liczby patogenów drobnoustrojowych, co powoduje ponad 700 000 zgonów ludzi rocznie. Wśród owadów wektorów dużą grupę stanowią muchy piaskowe flebotominowe (Diptera, Psychodidae), w których znajduje się 80 sprawdzonych gatunków wektorów wykazujących wyraźne cechy fenotypowe i zdolności wektorowe występujące w różnych regionach geograficznych. Są one wektorami pasożytów pierwotniaków z rodzaju Leishmania, powodując około 1,3 miliona nowych przypadków leiszmaniozy i od 20 000 do 30 000 zgonów rocznie. Wyniki kliniczne leiszmaniozy są zróżnicowane, a objawy wahają się od samoograniczających się zmian skórnych po rozsiew trzewnych, które są śmiertelne w przypadku braku leczenia.
Muchy piaskowe to wyłącznie owady lądowe. Ich cykl życiowy, stosunkowo długi w porównaniu z innymi muchówkami, trwa do trzech miesięcy, w zależności od różnych parametrów, takich jak temperatura, wilgotność i odżywianie. Składa się z jednego stadium embrionalnego (od 6 do 11 dni), czterech stadiów larwalnych (trwających łącznie od 23 do 25 dni) i jednego stadium poczwarki (od 9 do 10 dni), po którym następuje metamorfoza, a następnie dorosłość. Muchy piaskowe wymagają wilgotnego i ciepłego środowiska do hodowli. Zarówno samce, jak i samice żywią się cukrami, pozyskiwanymi w naturze z nektarów kwiatowych. Tylko samice żywią się krwią, ponieważ do produkcji jaj potrzebują białka uzyskanego z mączki z krwi1.
Ważnym celem badań jest określenie charakteru interakcji wektor/pasożyt, które prowadzą do rozwoju zakaźnych infekcji. Podobnie jak w przypadku innych owadów-wektorów, wykazano, że parametry nieodłącznie związane z muchami piaskowymi wpływają na ich kompetencję wektorową, którą definiuje się jako zdolność do przenoszenia i przenoszenia patogenów na swoich gospodarzy. Na przykład ekspresja galektyn przez komórki jelita środkowego muchy piaskowej Phlebotomus papatasi, działające jako receptory rozpoznające składniki powierzchniowe pasożyta, może bezpośrednio wpływać na ich kompetencję wektorową dla Leishmania major2,3. Szlak odpowiedzi immunologicznej owadów, niedobór odporności (IMD), ma również kluczowe znaczenie dla kompetencji wektora muchy piaskowej Phlebotomus papatasi dla Leishmania major4. Krytyczna rola szlaków odpowiedzi immunologicznej owadów wektorów w kontrolowaniu przenoszenia zakaźnych patogenów została podobnie opisana u komarów Aedes aegypti5,6,7, u muchy tse-tse Glossina morsitans8, oraz u komarów Anopheles gambiae9,10.
Badania interakcji muchy piaskowej z Leishmania były ograniczone przez brak metod modyfikacji ekspresji genów dostosowanych do stosowania u tych owadów. Do niedawna przeprowadzano jedynie regulację w dół genów za pomocą małego interferującego RNA (siRNA)11,12,13,14 do niedawna. Technika ta, ograniczona śmiertelnością związaną z mikroiniekcją dorosłych samic, prowadzi jedynie do częściowej utraty funkcji, która nie może być przekazywana z pokolenia na pokolenie.
Technologia CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała funkcjonalne badania genomiczne w organizmach niemodelowych, takich jak muszki piaskowe. Zmodyfikowany z adaptacyjnego układu odpornościowego u prokariontów do obrony przed bakteriofagami15,16, system CRISPR Cas9 został szybko zaadaptowany jako narzędzie do edycji genomu dla lepszych organizmów eukariotycznych, w tym owadów. Zasada celowanej edycji genomu CRISPR/Cas9 opiera się na komplementarności pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA) do określonego locus genomowego. Nukleaza Cas9 wiąże się z sgRNA i tworzy pęknięcie dwuniciowego DNA (dsDNA) w genomowym DNA, w którym sgRNA wiąże się ze swoją komplementarną sekwencją. Kompleks Cas9-sgRNA jest kierowany do sekwencji docelowej przez 17 do 20 komplementarnych zasad w sgRNA do wybranego locus, przerwanie dsDNA może być następnie naprawione przez dwie niezależne ścieżki: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR) 17. Naprawa NHEJ polega na prostym zamknięciu przerwy, ale często prowadzi do małych zdarzeń wstawiania/usuwania. Naprawa DNA za pomocą HDR wykorzystuje cząsteczkę DNA dawcy dzielącą homologię z docelowym DNA jako matrycę do naprawy. Owady posiadają obie maszyny.
Technologia CRISPR/Cas9 może generować mutacje w wybranym locus, poprzez szlak naprawczy NHEJ; lub w przypadku bardziej złożonych strategii edycji genomu, takich jak knock-in lub reportery ekspresji, poprzez ścieżkę HDR z odpowiednim szablonem dawcy. U muszek piaskowych zerowe zmutowane allele czynnika odpowiedzi immunologicznej Relish zostały wygenerowane za pośrednictwem CRISPR za pośrednictwem NHEJ w Phlebotomus papatasi4. Zarodki muchy piaskowej zostały również wstrzyknięte w innym badaniu z mieszanką CRISPR/Cas9 ukierunkowaną na gen kodujący kolor żółty. Mimo to nie wyprodukowano żadnego dorosłego nosiciela mutacji18. Opisujemy tutaj szczegółową metodę ukierunkowanej mutagenezy muchy piaskowej za pomocą CRISPR/Cas9 za pośrednictwem NHEJ, ze szczególnym naciskiem na mikroiniekcję zarodka, która jest kluczowym etapem protokołu.

<table><tbody><tr><td>Bibuła filtracyjna 4,25 CM PK100</td><td>VWR</td><td>28342-012</td><td>Pokrój na prostokąty o wymiarach około 46 x 22 mm. Umieszcza się je między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym i działają jako wilgotna warstwa podstawowa dla zarodków podczas wstrzyknięcia.</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-543A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Do wyrównywania zarodków</td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>szklane Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Warstwa podstawowa zestawu do mikroiniekcji Rysunek 2A</td></tr><tr><td>Klatka na owady</td><td>wykonana na zamówienie lub kilka opcji</td><td></td> <td>komercyjnychklatka z poliwęglanu dla dorosłych trzymających i kryjących Lawyera, Phillipa, Mireille Killick-Kendrick, Tobina Rowlanda, Edgara Rowtona i Petra Volfa. &ldquo; Kolonizacja laboratoryjna i masowa hodowla muchówek piaskowych flebotominowych (Diptera, Psychodidae)." Pasożyt 24. Dostęp 6 sierpnia 2020 r. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Pokarm dla larw</td><td>wykonany</td><td></td><td>na zamówienie z mieszanki karmy dla królików i odchodów królika Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton i Petr Volf. " Kolonizacja laboratoryjna i masowa hodowla muchówek piaskowych flebotominowych (Diptera, Psychodidae)." Pasożyt 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Mikrokapsułki 100 ml</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Służy do napełniania igieł do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Aspirator do jamy ustnej</td><td>John W. Hock Company</td> Aspirator do jamy ustnej <td>Model 612</td><td>z filtrem HEPA</td></tr><tr><td>Olympus SZX12</td><td>Olympus Life Sciences Mikroskop</td><td></td><td>mikroiniekcyjny</td></tr><tr><td>Firma Ovipots</td><td>Nalge</td><td></td><td>Doniczki wykonane są ze słoików po plolypropylenie o pojemności 125 ml lub 500 ml o prostych ściankach, zmodyfikowanych poprzez wywiercenie 2,5 cm otworów w dnie i wypełnionych 1 cm gipsu paryskiego. Prawnik, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton i Petr Volf. &ldquo; Kolonizacja laboratoryjna i masowa hodowla muchówek piaskowych flebotominowych (Diptera, Psychodidae)." Pasożyt 24. Dostęp 6 sierpnia 2020 r. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Pędzel 6-0</td><td>Dowolna firma zajmująca się zaopatrzeniem sztuki</td><td>n/a</td><td>Służy do wyrównywania zarodków</td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td>środek przeciwgrzybiczy</td></tr><tr><td>Standardowe szklane kapilary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td>Służy do wytwarzania igieł do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Kontroler Trio-MPC100 i manipulator MP845</td><td>Sutter Instruments Kontroler</td><td></td><td>mikroiniekcji i Mikromanipulator</td></tr></tbody></table>

mucha piaskowa (phlebotomus papatasi) mikroiniekcja zarodka do mutagenezy crispr/cas9

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Muchy piaskowe są naturalnymi wektorami dla gatunków Leishmania, pasożytniczych pierwotniaków wywołujących szerokie spektrum objawów, od zmian skórnych po patologię trzewną. Rozszyfrowanie natury interakcji wektor/pasożyt ma zasadnicze znaczenie dla lepszego zrozumienia przenoszenia Leishmania na ich gospodarzy. Wśród parametrów kontrolujących kompetencję wektorów muchy piaskowej (tj. ich zdolność do przenoszenia i przenoszenia patogenów) wykazano, że kluczową rolę odgrywają parametry właściwe tym owadom. Na przykład odpowiedź immunologiczna owadów wpływa na kompetencję wektora muchy piaskowej do Leishmania. Badania nad tymi parametrami były ograniczone ze względu na brak metod modyfikacji ekspresji genów przystosowanych do stosowania w tych organizmach niemodelowych. Regulacja w dół genów przez małe interferujące RNA (siRNA) jest możliwa, ale oprócz tego, że jest to wyzwanie techniczne, prowadzi tylko do częściowej utraty funkcji, która nie może być przekazywana z pokolenia na pokolenie. Ukierunkowana mutageneza za pomocą technologii CRISPR/Cas9 została niedawno zaadaptowana do muchy piaskowej Phlebotomus papatasi. Technika ta prowadzi do wygenerowania zakaźnych mutacji w specjalnie wybranym locus, co pozwala na badanie genów będących przedmiotem zainteresowania. System CRISPR/Cas9 opiera się na indukcji ukierunkowanych pęknięć dwuniciowego DNA, które są następnie naprawiane przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub naprawę sterowaną homologią (HDR). NHEJ składa się z prostego zamknięcia przerwy i często prowadzi do małych zdarzeń wstawiania/usuwania. W przeciwieństwie do tego, HDR wykorzystuje obecność cząsteczki DNA dawcy dzielącej homologię z docelowym DNA jako matrycę do naprawy. W tym miejscu przedstawiamy metodę mikroiniekcji zarodków muchy piaskowej do celowanej mutagenezy za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu NHEJ, która jest jedyną jak dotąd techniką modyfikacji genomu dostosowaną do wektorów muchy piaskowej.

Protokół mikroiniekcji CRISPR/Cas9 opisany tutaj w celu generowania mutantów muszki piaskowej został opracowany w poprzedniej publikacji4. Podejście to zapewniło wysoką wydajność mutagenezy, gdyż 11 z 540 osobników przeżyło procedurę, z czego 9 było mutantami. Podczas projektowania przewodników do mutacji CRISPR/Cas9 krytycznym pierwszym krokiem jest sekwencjonowanie regionu wokół obszaru docelowego. Matryca do sekwencjonowania powinna pochodzić z linii, która zostanie wykorzystana jako źródło emb...

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Ukierunkowana mutageneza została dostosowana do muchówek piaskowych dopiero niedawno i jest kluczową techniką dla zrozumienia roli i funkcji genów będących przedmiotem zainteresowania u tych owadów wektorów. Mikroiniekcja zarodka jest bardzo ważnym krokiem w edycji genomu owadów, ale musi być dostosowana do gatunków, z którymi pracujesz, w naszym przypadku muszek piaskowych. W porównaniu z innymi gatunkami owadów zarodki muchy piaskowej są bardzo małe.Potrzebują dużo czasu na rozwój i są szczególnie wrażliwe na poziom wilgotności. Pięć dni przed wstrzyknięciem samice muszek piaskowych karmią krwią w celu rutynowego utrzymania kolonii. Pewnego dnia po karmieniu złap karmione krwią samice w gipsowych strąkach z bocznym portem w grupach od 100 do 150 i nakarm muchy 30% roztworem sacharozy.Piątego dnia po karmieniu krwią umieść biały kawałek wilgotnej bibuły filtracyjnej w komorze do składania jaj. I użyj aspiratora do ust, aby zebrać i przenieść około 10 samic z kapsuły gipsowej do komory składania jaj. Po 30 do 60 minutach wyjmij szalkę Petriego i bibułę filtracyjną z komory jajowania.Dbając o to, aby bibuła filtracyjna pozostała wilgotna i przez cały ten okres zbierała nowe grupy samic i zarodków. Po zebraniu wszystkich zarodków użyj mikroskopu stereoskopowego i bardzo cienkiego pędzla, aby ostrożnie przenieść około 50 zarodków na pojedyncze kawałki wilgotnej czarnej bibuły filtracyjnej, umieścić na szkiełkach mikroskopowych, zwieńczonych pojedynczym szkiełkiem nakrywkowym na szkiełko. Dodaj tyle wody do każdej bibuły filtracyjnej, aby zarodki były wilgotne bez unoszenia się lub zasysania pod szkiełkami nakrywkowymi i wyrównaj zarodki do szkiełek nakrywkowych.Dwie do trzech godzin po rozpoczęciu zbierania jaj umieść szkiełko pod mikroskopem preparacyjnym i za pomocą pędzla ostrożnie dodaj wodę do tylnej części bibuły filtracyjnej. Załaduj z powrotem 0,5 do jednego mikrolitra obciążenia wtrysku wymieszaj do igły do mikroiniekcji i zamontuj igłę w pneumatycznym sterowniku wtrysku, ustawionym na 30 funtów na cal kwadratowy ciśnienia pod mikroskopem. Nacisnąć spust, aby usunąć powietrze z końcówki igły.Po uwolnieniu powietrza powoli zwiększaj ciśnienie trzymania. Gdy materiał do iniekcji zacznie płynąć, należy zmniejszyć ciśnienie trzymania, aż znajdzie się ono tuż poniżej punktu mieszanki iniekcyjnej wypływającej z igły i wprowadzić igłę w bok pierwszego zarodka. Używając szkiełka nakrywkowego za zarodkiem jako ogranicznika wstecznego, należy wprowadzić niewielką ilość mieszanki do wstrzykiwań do zarodka przed delikatnym wyjęciem igły.Natychmiast po wyjęciu igły należy nacisnąć wstrzykiwacz, aby usunąć z końcówki igły wstrzyknięty materiał i przejść do następnego zarodka. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków policz liczbę wstrzykniętych zarodków, aby zachować bieżącą liczbę i dodaj wodę do bibuły filtracyjnej, aby szkiełko nakrywkowe unosiło się na wodzie. Następnie użyj sondy, aby przytrzymać bibułę filtracyjną na miejscu, jednocześnie odciągając szkiełko nakrywkowe od zarodków.I był bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar wody ze zjeżdżalni. Przenieś bibułę filtracyjną na stos wilgotnej bibuły filtracyjnej na nowej szalce Petriego i ręcznie przenieś każdy zarodek na zwilżone, małe strąki gipsowe bez stłoczenia. Następnie przykryj strąki sitkiem i przechowuj strąki w inkubatorze o temperaturze 26 stopni przy wilgotności 70%.Podobnie jak w przypadku większości skutecznych protokołów mikroiniekcji, ważna jest dobra igła do mikroiniekcji dostosowana do wstrzykiwanych zarodków. Dobre ostre igły mogą z łatwością wbić się w zarodek, nie pozwalając na ucieczkę materiału po wstrzyknięciu. Wyciągnięte igły nie powinny mieć zbyt długiego stożka.W przeciwnym razie światło igły staje się bardzo wąskie w większej części stożka, co utrudnia uzyskanie wystarczająco wysokiego ciśnienia wtrysku, aby przepchnąć materiał przez igłę. Zarodki wyhodowane po wstrzyknięciu, które są zdrowe, powinny zostać zachowane, natomiast uszkodzone zarodki skażone, zanieczyszczone grzybem powinny zostać odrzucone. Potencjalne zmutowane allele można zidentyfikować u osobników hodowanych po wstrzyknięciu poprzez analizę PCR regionu otaczającego oczekiwane miejsca cięcia.Po ustaleniu linii mutantów przy użyciu wstrzykniętych zarodków, genotypowanie PCR pozwala na identyfikację homozygotycznych krzyżówek zmutowanego rodzeństwa. Ważne jest, aby mieć dobrą igłę, aby być delikatnym i manipulować oraz wstrzykiwać zarodki. I upewnić się, że zarodki są nawodnione przez cały czas trwania zabiegu.Edycja genomu u niektórych much dopiero się zaczyna. Ta technika jest tak naprawdę pierwszym krokiem, po którym powinny nastąpić bardziej złożone strategie modyfikacji genomu.

sand-fly-phlebotomus-papatasi-embryo-microinjection-for-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Tutaj opisujemy metody efektywnych iniekcji poczwarek i dorosłych osobników w Nasonia vitripennis jako dostępne alternatywy dla mikroiniekcji zarodków, umożliwiając funkcjonalną analizę interesujących genów za pomocą wyciszania RNA poprzez interferencję RNA (RNAi) lub nokautowania genów za pomocą edycji genomu CRISPR/Cas9.

Zastrzyki z poczwarek i dorosłych osobników do edycji genów RNAi i CRISPR w nosonia vitripennis

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

To są protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków skoczka kukurydzianego w celu modyfikacji ich genomu poprzez edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 lub dodawanie oznaczonych elementów transpozycyjnych poprzez transformację linii zarodkowej.

Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9

Ten artykuł przedstawia krok po kroku protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 orientalnej muszki owocowej Bactrocera dorsalis. Szczegółowe kroki przewidziane w tym ustandaryzowanym protokole posłużą jako przydatny przewodnik do generowania zmutowanych much do funkcjonalnych badań genów u B. dorsalis.

Protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 muszki owocowej Bactrocera dorsalis

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Poznaj mikroiniekcję zarodków muchy piaskowej Phlebotomus papatasi do mutagenezy CRISPR/Cas9. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów w wektorach chorób i rozwój strategii kontroli wektorów.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Przeglądaj więcej filmów