Zastosowania immobilizacji tkanek Drosophila ze skrzepami fibryny do obrazowania na żywo

W protokole tym opisano unieruchomienie próbki za pomocą skrzepów fibryny. Próbki przenosi się do kropli pożywki hodowlanej zawierającej fibrynogen na powierzchni szkiełka nakrywkowego, po czym indukuje się polimeryzację przez dodanie trombiny. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj pędzla, aby przenieść larwy L3 do dziewięciodołkowego naczynia ze szkła borokrzemianowego zawierającego PBS.

Mieszaj, aby odłączyć większość pokarmu much od larw i przenieś go do innej studni zawierającej pożywkę hodowlaną. Za pomocą kleszczy chwyć larwę na całej jej średnicy w połowie długości ciała i przenieś ją do innego dołka płytki borokrzemianowej zawierającej 200 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej. Nie wypuszczaj larwy.

Aby przeciąć larwę na pół na całej jej średnicy, albo zmiel uchwycony obszar bocznym ruchem końcówek kleszczy, albo wsuń jedną końcówkę innej pary kleszczy między dwie końcówki kleszczy przytrzymujące larwę. Użyj kleszczy, aby przytrzymać larwę za naskórek, a drugą parę kleszczy, aby oderwać naskórek bez ciągnięcia za mózg. Powtarzaj to, aż nerwy wychodzące z mózgu będą widoczne i będzie można uzyskać dostęp do narządów łączących mózg z częściami ustnymi.

Trzymając nerwy wychodzące z mózgu kleszczami, przetnij połączenie między mózgiem a częściami ustnymi drugą parą kleszczy, oddzielając mózg od reszty naskórka. Chwyć mózg za aksony wychodzące z brzusznego rdzenia nerwowego i wyrwij otaczające narządy, delikatnie odciągając je od mózgu. Następnie chwyć połączenie między dyskami wyobrażeniowymi oka a mózgiem za pomocą drugiej pary kleszczy i przetnij to połączenie bez ciągnięcia za mózg.

Upewnij się, że mózg jest odpowiednio oczyszczony z innych tkanek i nie jest uszkodzony. Wyrzuć mózg, jeśli wykazuje oznaki uszkodzenia. Odpipetować roztwór powlekający za pomocą P20 do wewnątrz i na zewnątrz, aby pokryć końcówkę pipety, a następnie odessać mózg pokrytą końcówką wraz z trzema mikrolitrami pożywki i odpipetować ją do innego dołka zawierającego 200 mikrolitrów czystej pożywki hodowlanej.

Powtarzaj ten proces, aż wystarczająca liczba mózgów zostanie wypreparowana, od czasu do czasu zastępując pożywkę hodowlaną w studni, w której przeprowadza się sekcje. Użyj pipety P20 z powlekaną końcówką, aby przenieść wypreparowane mózgi do innego dołka płytki borokrzemianowej zawierającej 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej i fibrynogenu. Odessać jeden mózg wraz z dziewięcioma mikrolitrami pożywki hodowlanej i fibrynogenu.

Tak jak koniec końcówki prawie dotyka szklanego dna pokrywy naczynia do hodowli komórkowych, odpipetować zawartość tak, aby pożywka hodowlana dotknęła szkiełka nakrywkowego natychmiast po wyjęciu końcówki pipety. Użyj jednej końcówki kleszczy lub zamkniętej pary kleszczy, aby delikatnie popchnąć i ustawić mózg w pożywce hodowlanej i kropli fibrynogenu. Jeśli konieczne jest zobrazowanie brzusznej części mózgu, wywołaj krzepnięcie fibrynogenu, aby prawidłowo zorientować mózg w skrzepie.

Popchnij mózg na jedną stronę kropli. Dotknij końcówką pipety krawędzi kropli po przeciwnej stronie mózgu i dodaj jeden mikrolitr trombiny. Poczekaj od jednej do dwóch minut, aż fibrynogen zacznie polimeryzować, co spowoduje powstanie mętnego osadu po jednej stronie kropli, a następnie delikatnie wepchnij i wsuń mózg w skrzep fibryny, upewniając się, że strona brzuszna jest jak najbliżej szkiełka nakrywkowego, nie deformując mózgu.

Odpipetować jeden mikrolitr roztworu trombiny blisko boku mózgu, który nie jest schowany w skrzepie fibryny. Odczekaj dwie do trzech minut, aż drugi skrzep fibryny zastygnie, a następnie naciśnij krawędzie skrzepu, aby mocniej przylegał do szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie zdeformować mózgu. Jeśli mózg wydaje się być zbyt daleko od szkiełka nakrywkowego, zbliż go, dociskając skrzep fibryny bliżej mózgu.

Aby wywołać skrzep fibryny do obrazowania grzbietowej części mózgu, umieść mózg w środku kropli, grzbietową częścią skierowaną w stronę szkiełka nakrywkowego. Za pomocą pipety P2 dotknij końcówką pipety krawędzi kropli po przeciwnej stronie mózgu i odpipetuj jeden mikrolitr trombiny. Odczekaj od dwóch do trzech minut, aż fibrynogen zacznie polimeryzować, co spowoduje powstanie mętnego włóknistego osadu, a następnie naciśnij krawędzie skrzepu, aby mocniej przylegał do szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie zdeformować mózgu.

Trzymając koniec końcówki umieszczonej około 0,5 centymetra nad skrzepem, delikatnie odpipetuj 390 mikrolitrów pożywki hodowlanej bez fibrynogenu, kroplą na wierzch skrzepu. Nie dodawać pożywki hodowlanej po bokach skrzepu, ponieważ może to spowodować oderwanie go od szkiełka nakrywkowego. Aby wypłukać nadmiar trombiny, usuń 300 mikrolitrów z naczynia, a następnie dodaj 300 mikrolitrów czystej pożywki hodowlanej, upewniając się, że skrzepy pozostają całkowicie zanurzone.

Aby uniknąć zmian temperatury powodujących zmiany ostrości, roztwór z odczynnikami należy utrzymywać w tej samej temperaturze, co naczynie hodowlane. Zdejmij pokrywkę naczynia hodowlanego, nie przesuwając samego naczynia. Aby ułatwić wyjmowanie, przed obrazowaniem umieść pokrywkę naczynia o średnicy 35 milimetrów do góry nogami na wierzchu naczynia.

Umieść końcówkę pipety P1000 blisko powierzchni pożywki wewnątrz naczynia hodowlanego i delikatnie wypuść na nią odpowiednią objętość roztworu odczynnika, nie wytwarzając silnych strumieni, które mogłyby oderwać skrzepy. Aby homogenizować roztwór w naczyniu hodowlanym, użyj pipety P200, aby powoli odpipetować niewielką ilość roztworu pięć razy. Załóż pokrywkę bez przesuwania naczynia hodowlanego i wznów obrazowanie.

Kiedy jeden NAPP1 został dodany do unieruchomionych fibryną larw mózgów eksprymujących Bazookę znakowaną GFP, mózgi niosące analogowo wrażliwą mutację aPKC, wykazywały skurcz nabłonka nerwowego, a także jasne skupiska Baz w neuroblastach i ich potomstwie. Neuroblast dzielił się przez cały okres poklatkowy, co wskazuje, że tkanka pozostała zdrowa. A mózgi wykazywały niewielki dryf pomimo zmiany pożywki hodowlanej.

Podobnie, zastosowanie jednego NAPP1 do jajników z ekspresją bazooki znakowanej GFP wywołało skurcz wrażliwych na analogi zmutowanych komórek pęcherzykowych aPKC, ale nie kontrolnych. Hiperstos wyświetlający zarówno dryf boczny, jak i skoncentrowany został najpierw skorygowany o dryf boczny, a następnie dryf ostrości, co spowodowało znaczne zmniejszenie ruchów obserwowanych w oryginalnym hiperstosie. Podczas próbowania tego protokołu ważne jest, aby wsunąć się w mózg w częściowo spolimeryzowany skrzep fibryny, podczas gdy skrzep jest nadal plastyczny, ale wystarczająco solidny, aby stabilnie utrzymać mózg.

Eksperymentuj z manipulacją pustymi skrzepami i delikatnie badaj skrzep podczas polimeryzacji, aby sprawdzić, jak jest wytrzymały.