Name: Zastosowania immobilizacji tkanek Drosophila ze skrzepami fibryny do obrazowania na żywo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę immobilizacji tkanek Drosophila za pomocą skrzepów fibryny do obrazowania na żywo. Technika ta minimalizuje dryf próbki i umożliwia dynamiczną obserwację procesów nerwowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium Januschke jest wspierana przez granty Wellcome trust 100031/Z/12/A i 1000032/Z/12/A. Pracownia obrazowania tkanek jest wspierana przez WT101468 grantowy od Wellcome.

<ol><li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744(2016).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical%2Fbasal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li>
<li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li>
<li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li>
<li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li>
<li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168(2017).</li>
<li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division%2C+differentiation+and+loss%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li>
<li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li>
<li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li>
<li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
<li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588(2013).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%3A+An+iIternational+Journal+On+the+Molecular%2C+Supramolecular+and+Evolutionary+Aspects+of+Chromosome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li>
<li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li>
<li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li>
<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li>
<li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166(2018).</li>
<li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745(2018).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Busse, B. MultiStackRef [software]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html">http://bradbusse.net/sciencedownloads.html</a> (2011).</li>
<li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li>
<li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879(2012).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Loyer, N. ImageJ macros [software]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obrazowanie na żywo całych mózgów larwalnych D. melanogaster daje możliwość obserwacji asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych w warunkach zbliżonych do kontekstu fizjologicznego. Pierwsza część naszego protokołu przedstawia nasze podejście do sekcji mózgów larwalnych. Jak już wspomniano13, krytycznym aspektem preparatu jest unikanie uszkodzenia mózgu. Najtrudniejszym aspektem tego jest oddzielenie mózgu od sąsiednich dysków wyobrażeniowych bez nadmiernego ciągnięcia mózgu. Nasze podejście do "cięcia bez ciągnięcia" polega na wykonaniu ruchu szlifierskiego za pomocą końcówek jednej pary kleszczy lub na przesunięciu końcówek kleszczy wzdłuż dwóch innych końcówek kleszczy przytrzymujących połączenie między tkankami (ryc. 1A), podczas gdy Lerit i in. opisują ruchy przypominające piłę za pomocą szpilki preparucyjnej. Radzimy eksperymentatorowi, aby wypróbował wszystkie podejścia i przyjął to najlepiej dopasowane dla siebie. Sugerujemy również używanie końcówek do pipet z powłoką BSA lub FCS zamiast narzędzi do preparowania do przenoszenia izolowanych mózgów. Powłoka zapobiega przywieraniu tkanek do tworzywa sztucznego i umożliwia bezpieczny transfer tkanek, zawsze utrzymując je całkowicie zanurzone, bez narażania ich na możliwe przejściowe odkształcenia, gdy przyklejają się do narzędzia preparacyjnego podczas przenoszenia. Powlekane końcówki mają inne zalety, które umożliwiają przenoszenie kilku mózgów jednocześnie, co jest szczególnie przydatne, gdy krytyczne jest kontrolowanie czasu przebywania próbek w określonym podłożu; nadają się do przenoszenia innych tkanek, nawet delikatnych, jak na przykład ciała tłuszczowe; Mogą pomieścić szeroki zakres różnych rozmiarów próbek, używając większych końcówek lub przycinając koniec końcówki.
Następnie protokół ten opisuje zastosowanie krzepnięcia fibrynogenu do unieruchomienia mózgów larw na szkiełku nakrywkowym szalki hodowlanej. Mózg jest zorientowany w kropli pożywki hodowlanej + fibrynogenu, po czym krzepnięcie jest indukowane przez dodanie trombiny. Tworzenie fibryny jest stopniowe, co zapewnia okno czasowe, w którym w razie potrzeby można precyzyjnie dostroić orientację próbki (ryc. 2C). Jeśli wymagane jest lekkie ściśnięcie próbki - co jest odradzane w przypadku mózgów larwalnych - można ją również precyzyjnie wyregulować, dociskając skrzep mniej więcej blisko próbki w krokach 3.4.4 i 3.5.2. Główną zaletą tego krzepnięcia fibrynogenu w porównaniu z protokołem opisanym w Lerit i wsp., w którym mózgi są zamontowane między membraną przepuszczalną dla gazów a szkiełkiem nakrywkowym, jest zdolność do zastąpienia pożywki hodowlanej podczas obrazowania na żywo. Możliwą zaletą stosowania membrany przepuszczającej gaz w porównaniu z naszym protokołem może być to, że zapewnia ona optymalne natlenienie próbek, które może być bardziej ograniczone przy naszym podejściu, ponieważ mózgi są oddzielone od powietrza przez skrzep i pewne podłoże. Z tego powodu, chociaż nie oceniliśmy wpływu ilości pożywki hodowlanej w naczyniu hodowlanym, sugerujemy ograniczenie ilości pożywki hodowlanej na wierzchu skrzepów, przy jednoczesnym utrzymywaniu skrzepów całkowicie zanurzonych.
Ponieważ manipulowanie skrzepami może być eksperymentalnie trudne i czasochłonne, zalecamy, aby eksperymentator najpierw przećwiczył manipulowanie skrzepami bez próbek. Modulowanie objętości kropli pożywki hodowlanej + fibrynogenu na szkiełku nakrywkowym, stężenia fibrynogenu lub objętości i stężenia trombiny może ułatwić przygotowanie i może być ważne przy dostosowywaniu protokołu do innych rodzajów tkanek. Mając wystarczające doświadczenie w manipulowaniu skrzepami, kilka mózgów może zostać unieruchomionych w jednym skrzepie, jeśli to konieczne, chociaż komplikuje to precyzyjne dostrojenie orientacji. Na szkiełku nakrywkowym może powstać kilka skrzepów, co pozwala na przykład na obrazowanie próbek o różnych genotypach. Możliwe jest również wystawienie różnych skrzepów na tym samym szkiełku nakrywkowym na działanie różnych pożywek hodowlanych, chociaż należy uważać, aby nigdy nie mieszać kropli pożywki hodowlanej pokrywających różne skrzepy. Gdy mózgi larw są już unieruchomione i gotowe do obrazowania na żywo, zalecamy przestrzeganie zaleceń Lerit i wsp.13 , aby uniknąć nadmiernego fotouszkodzenia. Do tych zaleceń dodajemy tylko to, aby nie tylko utrzymać mózg w temperaturze 25 °C podczas obrazowania na żywo za pomocą inkubatora etapowego, ale także podgrzać ten etap przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem obrazowania. W naszych rękach brak systematycznego działania skutkuje silnym dryfem koncentracji.
W niektórych kontekstach korzystna może być możliwość wykonania skorelowanej mikroskopii oraz utrwalenia i barwienia immunologicznego próbki po obrazowaniu na żywo. Jednak ograniczeniem stosowania skrzepów fibrynowych jest to, że prawie niemożliwe jest mechaniczne odizolowanie mózgu od skrzepu bez jego uszkodzenia. Możliwym sposobem na przezwyciężenie tego ograniczenia może być opracowanie metod degradacji skrzepów fibryny za pomocą plazminy lub wywołania demontażu skrzepu poprzez dodanie peptydu naśladującego guzki umożliwiające polimeryzację fibryny28. Zazwyczaj używamy skrzepów fibrynowych na próbkach od pojedynczych komórek do tkanek o długości 200 μM, ale możemy również z powodzeniem unieruchomić w skrzepach i zobrazować mózgi dorosłych trzmieli o szerokości ponad 3 mm. Górna granica wielkości próbki, która może być unieruchomiona w skrzepach, pozostaje do ustalenia. Podobnie, chociaż zwykle obrazujemy unieruchomione próbki przez 4 do 5 godzin, z powodzeniem zobrazowaliśmy neuroblasty w hodowli pierwotnej przez okres do 3 dni, co wskazuje, że skrzep przynajmniej nie przeszkadza w długoterminowej żywotności. Wręcz przeciwnie, skrzepy mogą ułatwiać regularną wymianę podłoża, co jest wymogiem w przypadku długotrwałego obrazowania, bez potrzeby stosowania w tym celu urządzeń, takich jak pompy perystaltyczne. Chociaż nie zmierzyliśmy parametrów przepuszczalności skrzepów fibryny, wydaje się, że włóknisty, żelowy charakter skrzepów jest przepuszczalny dla komórek. Odkryliśmy, że latrunkulina A, Colcemid lub 1-NAPP1, ligandy HALO-tag i inne standardowe barwniki stosowane w biologii komórki docierają do komórek w skrzepie fibryny bez żadnych problemów i do tej pory nie napotkaliśmy cząsteczek, które zostałyby zatrzymane przez skrzep, co jednak jest możliwością, którą należy empirycznie przetestować.
Podsumowując, stosowanie skrzepów fibrynowych zapewnia niezawodny i stosunkowo łatwy do wdrożenia sposób unieruchamiania żywych tkanek do obrazowania na żywo. Poza przydatnością w ograniczaniu dryfu bocznego, możliwość zmiany pożywki hodowlanej podczas obrazowania na żywo okazała się nieoceniona dla naszego podejścia genetyki chemicznej do badania asymetrycznego podziału komórek neuroblastów D. melanogaster 21. Przewidujemy, że technika ta będzie korzystna dla badań w szerokim zakresie różnych tkanek, szczególnie jeśli obejmują one genetykę chemiczną lub, na przykład, samoznakowanie białek29.
Nasze makro MultiHyperStackReg opiera się na wtyczce TurboReg ImageJ, która wyrównuje kolejne klatki lub wycinki stosu, oraz wtyczce MultiStackReg ImageJ, która pozwala na zastosowanie przekształceń do innych stosów. MultiHyperStackReg pozwala po prostu zastosować te transformacje do hyperstacków (stosów z co najmniej czterema wymiarami). Ponieważ korzystanie z MultiHyperStackReg, jak go opisujemy, wymaga wielu czynności i może być dość czasochłonne, napisaliśmy również makro AutoHyperStackReg, które automatycznie wykonuje wszystkie kroki opisane w krokach 6.2 i 6.3. Jednak w przeciwieństwie do MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg nie ma obecnie możliwości obliczenia wyrównania stosu na podstawie podregionu tego stosu, co jest czasami kluczową opcją dla satysfakcjonującego wyrównania. Innym ograniczeniem AutoHyperStackReg jest to, że jego użycie jest ograniczone do tłumaczeń, a nie do innych transformacji proponowanych przez TurboReg i MultiStackReg, podczas gdy MultiHyperStackReg może zastosować do hyperstack dowolny typ transformacji, jeśli użytkownik tego potrzebuje. Przyszłe wersje będą implementować te funkcje i będą dostępne w usłudze GitHub30. Wreszcie, nasze makro z obrotowym skanowaniem linii zapewnia łatwy sposób szybkiego pomiaru sygnałów korowych w upływach czasu, nawet jeśli kora zmienia swoje położenie lub orientację w czasie. To, czy do analizy najlepiej nadaje się tryb śledzenia, czy tryb nieśledzenia, zależy od jakości i spójności sygnału korowego. Tryb śledzenia jest łatwiejszy w użyciu, ponieważ użytkownik nie musi zastanawiać się, gdzie będzie kora mózgowa dla każdego punktu czasowego i może dostosować się do dużych zmian pozycji i orientacji w czasie. Jest to jednak odpowiednie tylko wtedy, gdy sygnał korowy pozostaje wystarczająco silny do wykrycia przez cały film: niepowodzenie w wykryciu czegokolwiek innego niż kora (np. jasny przedział cytoplazmatyczny blisko kory) może zagrozić wykrywaniu dla każdego następnego punktu czasowego (np. przedział cytoplazmatyczny oddala się od kory, a linie korowe podążają za nim przez resztę upływu czasu). Tryb bez śledzenia nie ma tej pułapki, ponieważ wykrywanie jest ograniczone do linii pierwotnie narysowanej przez użytkownika (np. jasny przedział cytoplazmatyczny może spowodować niepowodzenie wykrywania przez kilka punktów czasowych, ale gdy przedział cytoplazmatyczny oddala się od strefy wykrywania, wznawia się prawidłowe wykrywanie kory), ale nie zachowuje się dobrze, jeśli pozycja lub orientacja kory zmienia się bardzo w czasie. Kolejną funkcją (która będzie dostępna na GitHub30), która zostanie opracowana dla trybu śledzenia, będzie opcja analizowania tylko określonych punktów czasowych i zdefiniowania referencyjnego punktu czasowego (a nie pierwszego punktu czasowego), przed którym i po którym zostanie wykonane wykrywanie, co pozwoli użytkownikowi przynajmniej uniknąć problematycznych punktów czasowych.

Drosophila nadal jest ważnym modelowym systemem do badania szerokiego zakresu zagadnień biologicznych i od dziesięcioleci przoduje w poszerzaniu wiedzy w wielu dyscyplinach. Jedną z cech, która szczególnie go wyróżnia, jest to, że szczególnie dobrze nadaje się do obrazowania na żywo. Możliwość monitorowania procesów subkomórkowych lub zachowania komórek i tkanek w czasie rzeczywistym nadal przyczynia się do generowania kluczowych pojęć związanych z biologią komórki i rozwoju. Wiele udanych protokołów zostało opracowanych przez różne grupy, aby utrzymać takie próbki Drosophila przy życiu i w zdrowiu, aby zbadać zachowanie próbki i żywych cząsteczek fluorescencyjnych. Narządy i tkanki muchy, takie jak dyski wyobrażeniowe1,2, mózg larwy3,4,5,6, lub komory jajowe dorosłych samic7,8,9, lub dorosłe jelito10 Na przykład można je wyekstrahować i przechowywać w kulturze w celu obrazowania za pomocą mikroskopii poklatkowej. Kluczowym wyzwaniem dla obrazowania na żywo jest zapewnienie, że próbka jest utrzymywana blisko powierzchni obrazowania w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości i nieruchomego bez naruszania integralności próbki, która może być wrażliwa na uderzenia mechaniczne. Na przykład, aby badać nerwowe komórki macierzyste, zwane neuroblastami lub neuronami w mózgu larw Drosophila, można utrzymać próbki blisko powierzchni obrazowania, pokrywając je pożywką hodowlaną w szczelnych komorach obrazowania11,12,13. Podejście to nie pozwala jednak na łatwą wymianę mediów, co ogranicza eksperymentalne pole manewru. Alternatywnie, próbki można przygotować i umieścić na szkiełkach nakrywkowych poddanych obróbce w celu zwiększenia adhezji komórek i umożliwienia wielopunktowej mikroskopii wizytującej oraz rozszerzonego obrazowania żywych komórek w otwartych szalkach hodowlanych, które potencjalnie umożliwiają wymianę pożywki, ale nie zapewniają łatwych środków zapobiegających dryfowaniu lub utracie próbki podczas wymiany pożywki14,15.
Metoda skrzepów fibrynowych, pierwotnie opracowana do badania mejozy u żywych spermatocytów muchy żurawia16 jest specjalnie przystosowana do przezwyciężenia tych problemów. Fibrynogen rozpuszcza się w odpowiedniej pożywce hodowlanej, próbki umieszcza się i orientuje w kropli tego roztworu w odpowiedniej komorze obrazowania o szklanej powierzchni przed dodaniem trombiny, co powoduje szybkie tworzenie się nierozpuszczalnego skrzepu fibryny, lepkiej włóknistej siatki, która przylega do powierzchni szkła i próbek, zapewniając jednocześnie dostęp próbki do pożywki hodowlanej. Pożywka może być następnie wymieniona bez zakłócania pozycji skrzepu lub próbki. Wymiana pożywki hodowlanej podczas obrazowania jest na przykład pożądana, gdy inhibitory mają być dodawane jak w oryginalnej metodzie lub do eksperymentów z wymłukiwaniem lub pościgiem impulsowym, lub gdy barwniki fluorescencyjne mają być dodawane podczas obrazowania żywych komórek, przy jednoczesnym utrzymywaniu komórek i tkanek na miejscu. Skrzepy fibrynowe nadają się do obrazowania tkanek Drosophila, a także pojedynczych komórek13,17. Skrzepy fibrynowe mogą być ponadto wykorzystywane do orientacji próbek, które ze względu na swój kształt lub inne właściwości normalnie nie byłyby zorientowane w pożądany sposób poprzez modulację pozycji próbki w skrzepie fibryny i kształtu samego skrzepu.
Tutaj przedstawiamy aktualne informacje na temat naszych obecnych metod obrazowania opartych na skrzepach fibryny i udostępniamy narzędzia do analizy obrazu opartej na segmentacji oraz skupiamy się na wykorzystaniu tej metody do badania podziałów neuroblastów w rozwijającym się mózgu muchy. Rutynowo stosujemy metodę skrzepu fibrynowego, aby śledzić wiele próbek w różnych skrzepach w tym samym naczyniu hodowlanym. Pozwala to i) na obrazowanie zdarzeń subkomórkowych, takich jak zachowanie centrosomów lub lokalizacja mRNA na żywo18,19, ii) monitorowanie zachowania próbek podczas leczenia farmakologicznego różnych genotypów przy użyciu tych samych ustawień obrazowania przy użyciu wielopunktowej mikroskopii wizytującej20, iii) badanie skutków ostrego hamowania enzymów21 oraz iv) minimalizacja dryfowania w celu zbadania zmian w orientacji podziału komórek w ich środowisku fizjologicznym po ukierunkowanej ablacji laserowej22. Podczas gdy niepożądane działanie trombiny i fibrynogenu oraz skrzepu fibryny musi być empirycznie przetestowane dla każdej próbki, metoda ta jest w zasadzie odpowiednia do unieruchomienia każdego rodzaju próbki, która ma być analizowana za pomocą obrazowania żywych komórek, a u Drosophila została z powodzeniem wykorzystana do badania wielu aspektów biologii neuroblastów5,19, 20, ale także dynamika projekcji cytosensorów żeńskich komórek macierzystych linii zarodkowej23 oraz zmiany polaryzacji po ostrym zahamowaniu aPKC komórek pęcherzykowych komór jajowych samic Drosophila21.
Poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne powoduje generowanie złożonych zestawów danych 3D z rozdzielczością czasową, które wymagają metod ekstrakcji tych ilościowych informacji. Poniżej opisujemy nasz dalszy rozwój makr opartych na ImageJ24, które mogą być używane do korygowania dryfowania w hiperstosach oraz niestandardowych makr ImageJ, które umożliwiają półautomatyczną kwantyfikację wielokanałowej fluorescencji w korze komórkowej, opracowanej do ilościowego oznaczania białek korowych w neuroblastach mózgów larw Drosophila lub pojedynczych neuroblastów w pierwotnej hodowli komórkowej.

<table><tbody><tr><td>Albumina surowica bydlęca, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Surowica płodowa, odpowiednia do hodowli komórkowych</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen z ludzkiego osocza</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych FluoroDish - 35 mm, studnia 23 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analogowa (1NA-PP1)</td><td>Płytka punktowa Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex z dziewięcioma wgłębieniami</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka dla owadów</td><td>Schneidera Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Trombina z osocza bydlęcego</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

zastosowania immobilizacji tkanek drosophila ze skrzepami fibryny do obrazowania na żywo

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila to ważny system modelowy do badania szerokiego zakresu zagadnień biologicznych. Różne narządy i tkanki z różnych etapów rozwoju muchy, takie jak dyski wyobrażeniowe, mózg larwy lub komory jajowe dorosłych samic lub jelito dorosłego osobnika, można pobrać i przechowywać w kulturze w celu obrazowania za pomocą mikroskopii poklatkowej, dostarczając cennych informacji na temat biologii komórki i rozwoju. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nasz obecny protokół preparacji mózgów larw Drosophila, a następnie przedstawiamy nasze obecne podejście do unieruchamiania i orientowania mózgów larw i innych tkanek na szklanym szkiełku nakrywkowym za pomocą skrzepów fibryny. Ta metoda immobilizacji wymaga jedynie dodania fibrynogenu i trombiny do pożywki hodowlanej. Nadaje się do obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości na odwróconych mikroskopach wielu próbek w tej samej naczyniu hodowlanym, minimalizuje boczne dryfowanie często spowodowane ruchami stolika mikroskopu w wielopunktowej mikroskopii wizytującej i pozwala na dodawanie i usuwanie odczynników w trakcie obrazowania. Prezentujemy również makra na zamówienie, których rutynowo używamy do korygowania dryfu oraz do wyodrębniania i przetwarzania określonych informacji ilościowych z analizy poklatkowej.

Unieruchomienie tkanek Drosophila za pomocą skrzepów fibryny oraz wymiana pożywki hodowlanej podczas obrazowania na żywo. 
Po przeprowadzeniu sekcji zgodnie z procedurą przedstawioną w kroku 2 (Rysunek 1) i unieruchomieniu w skrzepach fibryny na tej samej lamCompetitionce zgodnie z procedurą przedstawioną w kroku 3 (Rysunek 2), mózgi larwalne wykazujące ekspresję Bazooka znakowanego GFP (Baz::GFP), ortologa białka polaryzacyjnego Par-3 u muchy, były obrazowane przez 30 min za pomocą konfokalnego obrazowania wielopozycyjnego w trybie time-lapse. Baz::GFP połączono z apkcas4, allelem umożliwiającym ostre hamowanie atypowej kinazy białkowej C (aPKC) poprzez dodanie małego analogu ATP 1-NAPP120. W związku z tym do pożywki hodowlanej dodano 1-NAPP1 zgodnie z procedurą przedstawioną w kroku 4 i wznowiono obrazowanie na żywo na 2,5 h. Mózgi kontrolne zawierające wersję typu dzikiego kinazy aPKC nie reagowały na analog ATP, podczas gdy mózgi posiadające dodatkowo mutację aPKC wrażliwą na analog (apkcas4) wykazały skurcz neuroepitelium oraz jasne skupiska Baz w neuroblastach i ich potomstwie (Rysunek 6, Wideo 1). Neuroblasty nadal dzielą się w trakcie rejestracji time-lapse, co wskazuje, że tkanka pozostaje zdrowa, a mózgi wykazują niewielki dryft mimo zmiany pożywki hodowlanej, co świadczy o ich dobrym unieruchomieniu. Analogicznie, po przeprowadzeniu sekcji zgodnie z procedurą przedstawioną w27, owariolach wykazujących ekspresję Baz::GFP zostały unieruchomione w skrzepach fibryny na tej samej lamce i obrazowane przez 8 min, po czym zastosowanie 1-NAPP1 wywołało skurcz komórek pęcherzykowych mutantów apkcas4, ale nie w grupach kontrolnych (Rysunek 7, Wideo 2).
Korekcja dryftu bocznego i ostrości przy użyciu MultiHyperstackReg. 
Hyperstack wykazujący zarówno dryft boczny, jak i dryft ostrości (Wideo 3, panel lewy) został najpierw skorygowany pod kątem dryftu bocznego (krok 6.2, Rysunek 3, Wideo 3, panel środkowy), a następnie pod kątem dryftu ostrości (krok 6.3, Rysunek 4, Wideo 3, panel prawy) przy użyciu wtyczki MultiStackReg oraz makra MultiHyperstackReg, co doprowadziło do znacznej redukcji ruchów zaobserwowanych w oryginalnym hyperstacku.
Pomiar sygnału korowego przy użyciu obracających się skanów liniowych 
Neuroblast wyrażający Baz::GFP (zielony) oraz białko transbłonowe CD4 znakowane podczerwienią fluorescencyjną (CD4::mIFP, czerwony) został poddany obrazowaniu podczas jednej mitozy. Sygnał CD4::mIFP posłużył jako punkt odniesienia do detekcji kory w różnych częściach neuroblasta za pomocą skanów liniowych (krok 7, Rycina 5, Rycina 8A–C), a sygnał Baz::GFP mierzono w wykrytych pozycjach (Rycina 8D). Podczas podziału neuroblasty ulegają przejściowej polaryzacji poprzez utworzenie odrębnych i przeciwstawnych domen korowych: bieguna apikalnego i bieguna bazalnego. Baz definiuje biegun apikalny i konsekwentnie sygnał Baz::GFP wzrastał w biegunie apikalnym neuroblasta i malał w biegunie bazalnym podczas podziału (Rycina 8C,D). Pozycja kory była skutecznie śledzona przez cały czas trwania rejestracji time-lapse (Rycina 8C, Wideo 4). Linie i genotypy Drosophila są wymienione w Tabeli uzupełniającej 1–2.
<img alt="Obróbka NAPP1 wpływająca na strukturę komórek; mikroskopia fluorescencyjna; kontrola vs aPKCΔ54 w czasie; eksperyment." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Zastosowanie analogu ATP na unieruchomionych mózgach larwalnych podczas obrazowania na żywo. (A) Obrazowanie na żywo dwóch mózgów larwalnych wykazujących ekspresję Baz::GFP, unieruchomionych na tej samej lamellce. W 0 min medium hodowlane zostaje zmienione na stężenie 10 µM analogu ATP 1-NAPP1. Mózgi kontrolne nie reagują widocznie na analog ATP, podczas gdy mózgi z mutacją aPKC wrażliwą na analog (aPKCAS4) wykazują skurcz neuroepithelium (groty strzałek) oraz jasne skupiska Baz w neuroblastach i ich potomstwie. Maksymalna projekcja intensywności z 33 warstw dla głębokości 23 µM. Pasek skali: 20 µM. (B) Powiększenie neuroepithelium. Pasek skali: 10 µM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa odpowiedzi komórek na 10 µM NAPP1 w czasie; porównanie kontroli z mutantem aPKC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Aplikacja analogu ATP na unieruchomione komory jajowe podczas obrazowania na żywo. Obrazowanie na żywo dwóch owarioli wykazujących ekspresję Baz::GFP, unieruchomionych na tej samej lamince. W 0 min medium hodowlane zostaje zmienione na stężenie 10 µM analogu ATP 1-NAPP1. Kontrolne komory jajowe nie reagują widocznie na analog ATP, podczas gdy komory jajowe z mutacją aPKC wrażliwą na analog (aPKCAS4) wykazują skurcz nabłonka (groty strzałek), co ostatecznie prowadzi do pozornego rozpadu złączy przylegających. Maksymalna projekcja intensywności z 33 warstw dla głębokości 27 µM. Pasek skali: 20 µM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia poklatkowa dynamiki błony komórkowej; wykresy przedstawiają intensywność sygnału w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Pomiar sygnału korowego przy użyciu obrotowych skanów liniowych. (ANa żywo D. melanogaster neuroblast wykazujący ekspresję Baz::GFP (zielony) i CD4::mIFP (czerwony). Linie cyjanowe: początkowe linie skanowania wyznaczone prostopadle do poszczególnych stref kory w celu pomiaru. Pasek skali: 5 µM. (B) Identyfikacja kory (ciemnoniebieska linia) przy użyciu skanów liniowych kory oraz kanału referencyjnego CD4::mIFP (czerwony). Linia cyjanowa: obszar zdefiniowany przez parametr „Measure around” (tutaj 2 piksele), w którym mierzony jest sygnał po wykryciu kory. Pasek skali: 2 µm. (C) Cyjan: obszary korowe zidentyfikowane podczas podziału neuroblasta za pomocą metody rotujących skanów liniowych z początkowych linii skanowania pokazanych na (A), z wykorzystaniem CD4::mIFP (czerwony) jako kanału referencyjnego. Pasek skali: 5 µMStrzałka: biegun apikalny. Grot strzałki: biegun bazalny. (D) Pomiar intensywności sygnału Baz::GFP w czasie w dwóch odpowiadających im strefach wyznaczonych przez rotacyjne skany liniowe przedstawione w (C). Podczas mitozy białko Baz::GFP ulega przejściowemu wzbogaceniu w biegunie apikalnym neuroblasta i zanika w przeciwległym biegunie bazalnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wideo 1: Zastosowanie wymiany medium w unieruchomionych mózgach larw podczas obrazowania na żywo w celu dodania inhibitora, przedstawione na Rysunku 6, pasek skali: 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo 2: Zastosowanie wymiany pożywki w unieruchomionych komorach jajowych podczas obrazowania na żywo w celu dodania inhibitora, przedstawione na Ryc. 7, pasek skali: 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo 3: Korekcja dryftu bocznego i ostrości przy użyciu MultiHyperStackReg. Obrazowanie na żywo neuroblasta wykazującego ekspresję sondy błonowej PH::GFP. Xy: pojedyncza płaszczyzna ogniskowa. Xz: przekrój ortogonalny. Po lewej: przed korekcją dryftu. W środku: po korekcji dryftu bocznego. Po prawej: po korekcji dryftu bocznego i ostrości, pasek skali: 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo 4: Detekcja kory za pomocą obrotowych skanów liniowych, przedstawiona na Rysunku 8, pasek skali: 5 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Genotypy obrazowanych tkanek Drosophila. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Pochodzenie użytych transgenów. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Dodatkowy plik z kodem 1: Pochodzenie użytych transgenów. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowy plik z kodem 2: Pochodzenie użytych transgenów. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowy plik kodowania 3: Pochodzenie użytych transgenów. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje zastosowania immobilizacji próbki za pomocą skrzepów fibryny, ograniczając dryf i umożliwiając dodawanie i wymywanie odczynników podczas obrazowania na żywo. Próbki przenosi się do kropli pożywki zawierającej fibrynogen na powierzchni szkiełka nakrywkowego, po czym indukuje się polimeryzację przez dodanie trombiny.

Zastosowania immobilizacji tkanek Drosophila ze skrzepami fibryny do obrazowania na żywo

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

W protokole tym opisano unieruchomienie próbki za pomocą skrzepów fibryny. Próbki przenosi się do kropli pożywki hodowlanej zawierającej fibrynogen na powierzchni szkiełka nakrywkowego, po czym indukuje się polimeryzację przez dodanie trombiny. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj pędzla, aby przenieść larwy L3 do dziewięciodołkowego naczynia ze szkła borokrzemianowego zawierającego PBS.Mieszaj, aby odłączyć większość pokarmu much od larw i przenieś go do innej studni zawierającej pożywkę hodowlaną. Za pomocą kleszczy chwyć larwę na całej jej średnicy w połowie długości ciała i przenieś ją do innego dołka płytki borokrzemianowej zawierającej 200 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej. Nie wypuszczaj larwy.Aby przeciąć larwę na pół na całej jej średnicy, albo zmiel uchwycony obszar bocznym ruchem końcówek kleszczy, albo wsuń jedną końcówkę innej pary kleszczy między dwie końcówki kleszczy przytrzymujące larwę. Użyj kleszczy, aby przytrzymać larwę za naskórek, a drugą parę kleszczy, aby oderwać naskórek bez ciągnięcia za mózg. Powtarzaj to, aż nerwy wychodzące z mózgu będą widoczne i będzie można uzyskać dostęp do narządów łączących mózg z częściami ustnymi.Trzymając nerwy wychodzące z mózgu kleszczami, przetnij połączenie między mózgiem a częściami ustnymi drugą parą kleszczy, oddzielając mózg od reszty naskórka. Chwyć mózg za aksony wychodzące z brzusznego rdzenia nerwowego i wyrwij otaczające narządy, delikatnie odciągając je od mózgu. Następnie chwyć połączenie między dyskami wyobrażeniowymi oka a mózgiem za pomocą drugiej pary kleszczy i przetnij to połączenie bez ciągnięcia za mózg.Upewnij się, że mózg jest odpowiednio oczyszczony z innych tkanek i nie jest uszkodzony. Wyrzuć mózg, jeśli wykazuje oznaki uszkodzenia. Odpipetować roztwór powlekający za pomocą P20 do wewnątrz i na zewnątrz, aby pokryć końcówkę pipety, a następnie odessać mózg pokrytą końcówką wraz z trzema mikrolitrami pożywki i odpipetować ją do innego dołka zawierającego 200 mikrolitrów czystej pożywki hodowlanej.Powtarzaj ten proces, aż wystarczająca liczba mózgów zostanie wypreparowana, od czasu do czasu zastępując pożywkę hodowlaną w studni, w której przeprowadza się sekcje. Użyj pipety P20 z powlekaną końcówką, aby przenieść wypreparowane mózgi do innego dołka płytki borokrzemianowej zawierającej 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej i fibrynogenu. Odessać jeden mózg wraz z dziewięcioma mikrolitrami pożywki hodowlanej i fibrynogenu.Tak jak koniec końcówki prawie dotyka szklanego dna pokrywy naczynia do hodowli komórkowych, odpipetować zawartość tak, aby pożywka hodowlana dotknęła szkiełka nakrywkowego natychmiast po wyjęciu końcówki pipety. Użyj jednej końcówki kleszczy lub zamkniętej pary kleszczy, aby delikatnie popchnąć i ustawić mózg w pożywce hodowlanej i kropli fibrynogenu. Jeśli konieczne jest zobrazowanie brzusznej części mózgu, wywołaj krzepnięcie fibrynogenu, aby prawidłowo zorientować mózg w skrzepie.Popchnij mózg na jedną stronę kropli. Dotknij końcówką pipety krawędzi kropli po przeciwnej stronie mózgu i dodaj jeden mikrolitr trombiny. Poczekaj od jednej do dwóch minut, aż fibrynogen zacznie polimeryzować, co spowoduje powstanie mętnego osadu po jednej stronie kropli, a następnie delikatnie wepchnij i wsuń mózg w skrzep fibryny, upewniając się, że strona brzuszna jest jak najbliżej szkiełka nakrywkowego, nie deformując mózgu.Odpipetować jeden mikrolitr roztworu trombiny blisko boku mózgu, który nie jest schowany w skrzepie fibryny. Odczekaj dwie do trzech minut, aż drugi skrzep fibryny zastygnie, a następnie naciśnij krawędzie skrzepu, aby mocniej przylegał do szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie zdeformować mózgu. Jeśli mózg wydaje się być zbyt daleko od szkiełka nakrywkowego, zbliż go, dociskając skrzep fibryny bliżej mózgu.Aby wywołać skrzep fibryny do obrazowania grzbietowej części mózgu, umieść mózg w środku kropli, grzbietową częścią skierowaną w stronę szkiełka nakrywkowego. Za pomocą pipety P2 dotknij końcówką pipety krawędzi kropli po przeciwnej stronie mózgu i odpipetuj jeden mikrolitr trombiny. Odczekaj od dwóch do trzech minut, aż fibrynogen zacznie polimeryzować, co spowoduje powstanie mętnego włóknistego osadu, a następnie naciśnij krawędzie skrzepu, aby mocniej przylegał do szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie zdeformować mózgu.Trzymając koniec końcówki umieszczonej około 0,5 centymetra nad skrzepem, delikatnie odpipetuj 390 mikrolitrów pożywki hodowlanej bez fibrynogenu, kroplą na wierzch skrzepu. Nie dodawać pożywki hodowlanej po bokach skrzepu, ponieważ może to spowodować oderwanie go od szkiełka nakrywkowego. Aby wypłukać nadmiar trombiny, usuń 300 mikrolitrów z naczynia, a następnie dodaj 300 mikrolitrów czystej pożywki hodowlanej, upewniając się, że skrzepy pozostają całkowicie zanurzone.Aby uniknąć zmian temperatury powodujących zmiany ostrości, roztwór z odczynnikami należy utrzymywać w tej samej temperaturze, co naczynie hodowlane. Zdejmij pokrywkę naczynia hodowlanego, nie przesuwając samego naczynia. Aby ułatwić wyjmowanie, przed obrazowaniem umieść pokrywkę naczynia o średnicy 35 milimetrów do góry nogami na wierzchu naczynia.Umieść końcówkę pipety P1000 blisko powierzchni pożywki wewnątrz naczynia hodowlanego i delikatnie wypuść na nią odpowiednią objętość roztworu odczynnika, nie wytwarzając silnych strumieni, które mogłyby oderwać skrzepy. Aby homogenizować roztwór w naczyniu hodowlanym, użyj pipety P200, aby powoli odpipetować niewielką ilość roztworu pięć razy. Załóż pokrywkę bez przesuwania naczynia hodowlanego i wznów obrazowanie.Kiedy jeden NAPP1 został dodany do unieruchomionych fibryną larw mózgów eksprymujących Bazookę znakowaną GFP, mózgi niosące analogowo wrażliwą mutację aPKC, wykazywały skurcz nabłonka nerwowego, a także jasne skupiska Baz w neuroblastach i ich potomstwie. Neuroblast dzielił się przez cały okres poklatkowy, co wskazuje, że tkanka pozostała zdrowa. A mózgi wykazywały niewielki dryf pomimo zmiany pożywki hodowlanej.Podobnie, zastosowanie jednego NAPP1 do jajników z ekspresją bazooki znakowanej GFP wywołało skurcz wrażliwych na analogi zmutowanych komórek pęcherzykowych aPKC, ale nie kontrolnych. Hiperstos wyświetlający zarówno dryf boczny, jak i skoncentrowany został najpierw skorygowany o dryf boczny, a następnie dryf ostrości, co spowodowało znaczne zmniejszenie ruchów obserwowanych w oryginalnym hiperstosie. Podczas próbowania tego protokołu ważne jest, aby wsunąć się w mózg w częściowo spolimeryzowany skrzep fibryny, podczas gdy skrzep jest nadal plastyczny, ale wystarczająco solidny, aby stabilnie utrzymać mózg.Eksperymentuj z manipulacją pustymi skrzepami i delikatnie badaj skrzep podczas polimeryzacji, aby sprawdzić, jak jest wytrzymały.

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisaliśmy cechy strukturalne synaps glejowo-neuromuscularnych w nowatorskiej preparacji tkankowej żywych larw muchy typu „Inside-out”, wykorzystując barwniki fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Oznaczyliśmy zakończenia żywych neuronów za pomocą fluorescencyjnych przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko HRP, a także zwizualizowaliśmy przestrzeń perisynaptyczną przy użyciu fluorescencyjnych dekstranów.

Wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Przedstawiono prostą, niedrogą i skuteczną metodę przygotowania embrionów Drosophila do analizy za pomocą obrazowania na żywo. Nasz protokół zapewnia wilgotność i wymianę gazową oraz nie powoduje kompresji embrionu Drosophila. Metoda ta jest odpowiednia do obrazowania na żywo embrionów Drosophila w oparciu o GFP z wykorzystaniem stereomikroskopu lub pionowego mikroskopu złożonego.

Przygotowanie zarodków Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Opracowano proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez użycia środków znieczulających dla C. elegans, nienaruszonych larw Drosophila oraz larw rybek danio. Urządzenie wykorzystuje odkształcalną membranę z PDMS do unieruchomienia tych organizmów modelowych w celu wykonania obrazowania poklatkowego licznych procesów, takich jak bicie serca, podział komórkowy i podkomórkowy transport neuronalny. Prezentujemy zastosowanie tego urządzenia i pokazujemy przykłady różnych typów danych...

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Opisano protokół obrazowania na żywo białek lub struktur autofluorescencyjnych oznaczonych GFP w pojedynczych oocytach Drosophila.

Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila

Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym.

Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Ten protokół opisuje metodę montowania larw Drosophila w celu osiągnięcia dłuższego niż 10 godzin nieprzerwanego obrazowania poklatkowego u nienaruszonych żywych zwierząt. Metoda ta może być stosowana do obrazowania wielu procesów biologicznych w pobliżu ściany ciała larwy.

LarvaSPA, czyli metoda montowania larw Drosophila do długotrwałego obrazowania poklatkowego

Poznaj metodę immobilizacji tkanek Drosophila za pomocą skrzepów fibryny do obrazowania na żywo. Technika ta minimalizuje dryf próbki i umożliwia dynamiczną obserwację procesów nerwowych w czasie rzeczywistym.

Zastosowania immobilizacji tkanek Drosophila ze skrzepami fibryny do obrazowania na żywo

Przeglądaj więcej filmów