Name: Udoskonalone oczyszczanie tkanek oparte na technologii CLARITY w celu trójwymiarowej organizacji fibroblastów w zdrowych i uszkodzonych sercach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj udoskonaloną metodę oczyszczania tkanek CLARITY do wizualizacji fibroblastów w sercu myszy. Protokół redukuje autofluorescencję tła i umożliwia trójwymiarowe obrazowanie komórek sercowych bez dodatkowego barwienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować CCHMC Confocal Imaging Core za pomoc i wskazówki w rozwoju tego modelu, a także Mattowi Batie z Inżynierii Klinicznej za zaprojektowanie wszystkich części drukowanych w 3D. Demetria Fischesser otrzymała stypendium szkoleniowe z National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204), a Jeffery D. Molkentin był wspierany przez Howard Hughes Medical Institute.

<ol><li>Nagaraju, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+phenotype+and+reversibility+of+fibrosis+in+patients+With+end-stage+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).</li>
<li>Yoon, S., Eom, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%3A+present+status+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions.</a> Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).</li>
<li>Borlaug, B. A., Redfield, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diastolic+and+systolic+heart+failure+are+distinct+phenotypes+within+the+heart+failure+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum.</a> Circulation. 123, 2006-2014 (2011).</li>
<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the cardiac fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Sadeghi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+3D+cardiac+fibrotic+tissue+to+study+fibrotic+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434(2017).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li>
<li>Bruns, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricular+fibroblast+secretome+drives+cardiomyocyte+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation.</a> PLoS One. 14 (8), 0220573(2019).</li>
<li>Skiöldebrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+activation+of+human+cardiac+fibroblasts+leads+to+altered+calcium+signaling%2C+decreased+connexin+43+expression+and+increased+glutamate+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion.</a> Heliyon. 3 (10), 00406(2017).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+pegasos+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method.</a> Cell Research. 28, 803-818 (2018).</li>
<li>Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+cardiac+injury+response+of+targeted+cell+populations+via+cleared+heart+three-dimensional+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transparent+intact+cardiac+tissue+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution.</a> Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Yokoyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sympathetic+hyperinnervation+and+denervation+after+myocardial+infarction+by+three-dimensional+assessment+of+the+cardiac+sympathetic+network+in+cleared+transparent+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts.</a> PLoS One. 12 (7), 0182072(2017).</li>
<li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-of-Acrylamide+SDS-based+Tissue+Clearing+%28FASTClear%29+for+three+dimensional+visualization+of+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue.</a> Scientific Reports. 7, 5188(2017).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Nehrhoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+in+CUBIC-cleared+mouse+heart+tissue%3A+going+deeper%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper.</a> Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).</li>
<li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+reporter+mouse+line+for+Cre-+and+FLP-dependent+lineage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis.</a> Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+Routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li>Means, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+S1P2+and+S1P3+receptor-mediated+Akt+activation+protects+against+in+vivo+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circuatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).</li>
<li>Michael, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+ischemia+and+reperfusion%3A+A+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circuatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).</li>
<li>Ahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myocardial+infarcts+of+a+predictable+size+and+location+by+branch+pattern+probability-assisted+coronary+ligation+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Joural+of+Physiology%3A+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice.</a> American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).</li>
<li>Patten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+remodeling+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circuatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).</li>
<li>Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+echocardiographic+assessment+of+left+ventricular+dimensions+and+function+after+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).</li>
<li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577, 405-409 (2020).</li>
<li>Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist+mechanics+of+the+left+ventricle.+Principles+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%3A+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).</li>
<li>Arts, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+three-dimensional+motion+patterns+of+the+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).</li>
<li>Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+muscle+actin-positive+cells+in+healing+human+myocardial+scars%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars.</a> American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).</li>
<li>Hashmi, S., Al-Salam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%3A+A+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison.</a> International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie posiadają żadnych informacji związanych z treścią tego manuskryptu.

W artykule przedstawiono udoskonaloną metodę oczyszczania tkanek, która pozwala na wizualizację fibroblastów serca in vivo, zarówno na początku badania, jak i po urazie, w celu scharakteryzowania i lepszego zrozumienia fibroblastów w sercu myszy. Ten ulepszony protokół rozwiązuje ograniczenia w istniejących protokołach oczyszczania tkanek, które próbowały zidentyfikować określone typy komórek w sercu dorosłego lub noworodka 12,13,14,16,17,20.<sup class...

Chociaż kardiomiocyty stanowią największą frakcję objętościową w sercu, fibroblasty serca są liczniejsze i są krytycznie zaangażowane w regulację podstawowych cech strukturalnych i naprawczych tego narządu. Fibroblasty serca są wysoce mobilne, reagują mechanicznie i fenotypowo różnią się w zależności od stopnia ich aktywacji. Fibroblasty serca są niezbędne do utrzymania prawidłowego poziomu macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), a zbyt mała lub zbyt duża produkcja ECM przez te komórki może prowadzić do choroby1,2,3. Biorąc pod uwagę ich znaczenie w chorobie, fibroblasty serca stają się coraz ważniejszym tematem badań w celu zidentyfikowania nowych strategii leczenia, zwłaszcza w próbach ograniczenia nadmiernego zwłóknienia4,5,6,7. Po urazie fibroblasty aktywują się i różnicują w bardziej syntetyczny typ komórek znany jako miofibroblast, który może być proliferacyjny i wydzielać obfite ECM, a także mieć aktywność skurczową, która pomaga w przebudowie komór.
Podczas gdy fibroblasty serca były szeroko oceniane pod kątem ich właściwości w hodowlach 2D6,8,9,10, znacznie mniej wiadomo o ich właściwościach i dynamice w żywym sercu 3D, zarówno na początku badania, jak i po stymulacji choroby. W tym miejscu opisano udoskonaloną metodę oczyszczania tkanek serca dorosłej myszy przy jednoczesnym utrzymaniu fluorescencji fibroblastów znakowanych genetycznym systemem reporterowym Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. W sercu Tcf21 jest stosunkowo specyficznym markerem uśpionych fibroblastów4. Po podaniu tamoksyfenu w celu aktywacji indukowalnego białka MerCreMer, zasadniczo wszystkie uśpione fibroblasty będą trwale eksprymować wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP) z locus Rosa26, co pozwala na ich śledzenie in vivo.
Istnieje wiele dobrze ugruntowanych protokołów oczyszczania tkanek, z których niektóre zostały zastosowane do serca11,12,13,14,15,16,17. Stwierdzono jednak, że wiele odczynników stosowanych w różnych protokołach oczyszczania tkanek tłumi endogenne sygnały fluorescencyjne18. Dodatkowo, dorosłe serce jest trudne do oczyszczenia ze względu na obfite białka zawierające grupę hemową, które generują autofluorescencję19. Dlatego celem tego protokołu było zachowanie fluorescencji markera fibroblastów przy jednoczesnym hamowaniu autofluorescencji hemu w uszkodzonym sercu dorosłego człowieka w celu optymalnej wizualizacji 3D in vivo12,13,14,16,17,20.
Poprzednie badania próbujące zbadać fibroblasty serca in vivo wykorzystywały perfundowane przeciwciała do oznaczania tych komórek, chociaż takie badania były ograniczone przez penetrację przeciwciał i strukturę naczyń krwionośnych serca14,16,17,20. Chociaż Salamon i wsp. wykazali oczyszczanie tkanek z utrzymaniem miejscowej fluorescencji neuronalnej w sercu noworodka, a Nehrhoff i wsp. wykazali utrzymanie fluorescencji znakującej komórki szpikowe, utrzymanie endogennej fluorescencji przez całą ścianę komory nie zostało jeszcze wykazane, w tym wizualizacja dorosłych fibroblastów serca na początku badania lub po urazie13, 20. Ten protokół oczyszczania tkanek udoskonala mieszaninę poprzednich protokołów opartych na metodzie CLARITY (przezroczysty hydrożel tkankowy kompatybilny z polimerylamidem i hybrydyzacją z akrylamidem (przezroczysty hydrożel tkankowy z wymianą lipidową/barwieniem immunologicznym/hybrydyzacją in situ) i PEGASOS (system rozpuszczalników związanych z glikolem polietylenowym (PEG)). Ten udoskonalony protokół pozwolił na dokładniejsze zbadanie fibroblastów serca w sercu myszy na początku badania oraz tego, jak reagują one na różne rodzaje urazów. Protokół jest prosty i powtarzalny i pomoże scharakteryzować zachowanie fibroblastów serca in vivo.

<table><tbody><tr><td>4-0 pleciony jedwab</td><td>Ethicon</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>8-0 prolene</td><td>Ethicon</td><td>8730H</td><td></td></tr><tr><td>40% roztwór akryloamidu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>Angiotensyna II</td><td>Sigma</td><td>A9525-50G</td><td></td></tr><tr><td>Maść na sztuczne łzy</td><td>Covetrus</td><td>048272</td><td></td></tr><tr><td>DABCO (1,4-diazabicyklo[2.2. 2]oktan)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D27802-25G</td><td></td></tr><tr><td>GLUture miejscowy klej tkankowy</td><td>World Precision Instruments</td><td>503763</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H0777</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Start Analysis</td><td>Software Oxford Instruments</td><td>N/A Pompy</td><td></td></tr><tr><td>mikroosmotyczne</td><td>Alzet</td><td>Model 1002</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Oprogramowanie do analizy elementów</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy Nikon A1R HD</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Normalny autoklawizowany karm</td><td>Labdiet</td><td>5010</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroksypropyloacetamido)-2, 4, 6-tri-jodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroksypropylo)izoftalamid</td><td>CosmoBio</td><td>AXS-1002424</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek fenylefryny</td><td>Sigma</td><td>P6126-10G</td><td></td></tr><tr><td>Fotoinicjator</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td></td></tr><tr><td>Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]</td><td>Jackson Laboratories</td><td>Jax Nr magazynowy:012429</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>roztwór chlorku sodu</td><td>Hospira, Inc.</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksyfen spożywczy</td><td>Envigo</td><td>TD.130860</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Quadrol, N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrakis(2-Hydroksypropylo)etylenodiamina, środek odbarwiający</td><td>Millipore Sigma</td><td>122262-1L</td><td></td></tr><tr><td>X-Clarity elektroforetyczna komora czyszcząca</td><td>Logos Biosystems</td><td>C30001</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforetyczne rozwiązanie czyszczące X-Clarity</td><td>Logos Biosystems</td><td>C13001</td><td></td></tr><tr><td>Kosz na chusteczki do elektroforezy X-Clarity</td><td>Logos Biosystems</td><td>C12001</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na chusteczki do elektroforezy X-Clarity</td><td>Logos Biosystems</td><td>C12002</td><td></td></tr></tbody></table>

udoskonalone oczyszczanie tkanek oparte na technologii clarity w celu trójwymiarowej organizacji fibroblastów w zdrowych i uszkodzonych sercach myszy

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Choroby sercowo-naczyniowe są najczęstszą przyczyną śmiertelności na całym świecie i często charakteryzują się zwiększonym zwłóknieniem serca, które może prowadzić do zwiększonej sztywności komór z zaburzeniami czynności serca. Ten wzrost zwłóknienia komór serca jest spowodowany aktywacją rezydujących fibroblastów, chociaż sposób działania tych komórek w trójwymiarowym (3-D) sercu, na początku lub po aktywacji, nie jest dobrze poznany. Aby zbadać, w jaki sposób fibroblasty przyczyniają się do chorób serca i ich dynamiki w sercu 3D, opracowano udoskonaloną metodę oczyszczania i obrazowania tkanek opartą na projekcie CLARITY, która pokazuje fluorescencyjnie znakowane fibroblasty serca w całym sercu myszy. Fibroblasty rezydujące w tkankach znakowano genetycznie za pomocą fluorescencyjnych myszy reporterowych Rosa26-loxP-eGFP skrzyżowanych z fibroblastem serca wykazującym ekspresję linii knock-in Tcf21-MerCreMer. Technikę tę wykorzystano do obserwacji dynamiki lokalizacji fibroblastów w całej dorosłej lewej komorze u zdrowych myszy oraz w zwłókniałych mysich modelach choroby serca. Co ciekawe, w jednym z modeli urazów zaobserwowano unikalne wzorce fibroblastów serca w uszkodzonym sercu myszy, które podążały za pasmami owiniętych włókien w kierunku kurczliwym. W modelach uszkodzeń niedokrwiennych nastąpił zgon fibroblastów, a następnie ponowne zasiedlenie ze strefy granicznej zawału. Podsumowując, ta udoskonalona technika oczyszczania tkanki serca i cyfrowy system obrazowania pozwalają na wizualizację 3D fibroblastów serca w sercu bez ograniczeń związanych z niepowodzeniem penetracji przeciwciał lub wcześniejszymi problemami związanymi z utratą fluorescencji w wyniku przetwarzania tkanek.

Fibroblasty serca są niezbędne dla podstawowego funkcjonowania serca, a także dla odpowiedzi na uszkodzenia mięśnia sercowego. Poprzednie próby zrozumienia rozmieszczenia i morfologii tych komórek były prowadzone głównie w warunkach 2-D. Opublikowano jednak udoskonaloną technikę przejaśniania tkanki serca (Rysunek 2) i obrazowania 3-D, która umożliwia zaawansowaną, bardziej szczegółową wizualizację fibroblastów serca. Dzięki tej technice obrazowania stwierdzono, że w nieuszkodzonych sercach ...

Opracowano udoskonaloną metodę oczyszczania tkanek i zastosowano ją do serca dorosłej myszy. Metoda ta została zaprojektowana w celu usunięcia gęstej, autofluorescencyjnej tkanki serca, przy jednoczesnym zachowaniu znakowanej fluorescencji fibroblastów przypisywanej genetycznej strategii reporterowej.

Udoskonalone oczyszczanie tkanek oparte na technologii CLARITY w celu trójwymiarowej organizacji fibroblastów w zdrowych i uszkodzonych sercach myszy

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Ten nowatorski protokół oczyszczania tkanek ulepsza istniejącą technologię, aby umożliwić dokładniejsze przyjrzenie się in vivo określonym typom komórek w sercu i ich zachowaniu w warunkach urazu. Ten protokół jest szybki i dość prosty. Pozwala na utrzymanie fluorescencji marca przy minimalnej interferencji z autofluorescencją tkanek tła bez konieczności barwienia komórek lub tkanek.Zacznij od użycia gazika nasączonego 70% etanolem, aby oczyścić brzuszną powierzchnię eksperymentalnej myszy. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać trzycentymetrowe nacięcie poprzeczne, około trzy metry poniżej wyrostka mieczykowatego i oddeglove myszy od brzucha do wyrostka mieczykowatego, aby oddzielić skórę od leżącej poniżej tkanki ściany brzucha. Wykonaj dwucentymetrowe poprzeczne nacięcie w podskórnej tkance ściany brzucha, trzy centymetry poniżej wyrostka mieczykowatego i wykonaj pionowe cięcie od tego nacięcia w górę linii środkowej przez klatkę piersiową.Przypnij klatkę piersiową z powrotem, aby odsłonić serce. I użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27, aby wstrzyknąć zimny PBS do żyły głównej górnej i aorty. Kiedy cała krew zostanie wypłukana z serca, podaj 10 mililitrów zimnego 4% PFA do żyły głównej górnej i aorty, aby rozpocząć proces utrwalania.Kiedy cały utrwalacz zostanie rozbłyskany, wytnij serce i użyj skalpela z prostym ostrzem, aby oddzielić przedsionki, prawą komorę i przegrodę oraz lewą komorę. Umieść serce w 15-mililitrowej stożkowej probówce z zimnym 4% PFA na nocną inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza na nutatorze. Następnego ranka dodaj 0,25% roztwór fotoinicjatora do świeżo przygotowanego roztworu hydrożeli i przenieś serce do hydrożelu.Zawiń stożkową probówkę w folię na noc inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez zakłóceń fizycznych. Następnego ranka podgrzej probówkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2,5 godziny, a następnie użyj kleszczy, aby ostrożnie przenieść serce do 15-mililitrowej probówki PBS. Umyj serce trzy razy w PBS przez jedną godzinę na pranie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na nutatorze i przenieś serce do kosza aktywnej maszyny do elektroforezy.Zabezpiecz pokrywę na miejscu i napełnij zbiornik komory aktywnej elektroforezy roztworem czyszczącym do elektroforezy. Gdy komora jest pełna, zanurz kosz w roztworze i dokręć nakrętkę urządzenia do elektroforezy. Następnie uruchom maszynę do elektroforezy przy 1,5 ampera i 37 stopniach Celsjusza na 1,5 godziny.Po elektroforezie sprawdź wzrokowo serce, aby upewnić się, że nie pozostała żadna nieprzezroczysta tkanka. Umyj oczyszczone serce trzy razy w 15-mililitrowym dwa przez godzinę w świeżym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pranie na nutatorze. Przed zanurzeniem serca w środku odbarwiającym w celu zmniejszenia autofluorescencji hemu.Po 48 godzinach umyj serce trzykrotnie w PBS, jak pokazano, i wyrównaj serce w świeżo przygotowanym RIMS przez 48 godzin przed obrazowaniem. Aby obrazować 3D oczyszczone serce, najpierw umieść cienką warstwę smaru próżniowego na dnie wydrukowanego w 3D dolnego zbiornika, o tej samej wysokości, co próbka, która jest obrazowana. Napełnij zbiornik RIMS i użyj końcówki pipety, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.Ostrożnie umieść serce w RIMS lewą ścianą komory skierowaną do góry, uważając, aby do roztworu nie dostały się pęcherzyki. Użyj smaru próżniowego, aby przymocować szklane szkiełko nakrywkowe do dolnej powierzchni wydrukowanego w 3D górnego elementu zbiornika i umieść szkiełko nakrywkowe górnego zbiornika na dolnych zbiornikach, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Następnie napełnij górne zbiorniki glicerolem.Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować oczyszczone serca. Połączenie wyrafinowanego oczyszczania tkanki serca z obrazowaniem 3D umożliwia zaawansowaną, szczegółową wizualizację fibroblastów serca. Korzystając z tej techniki obrazowania, obserwuje się, że fibroblasty są gęsto upakowane i mają wrzecionowatą morfologię w nieuszkodzonych sercach.Po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym obserwuje się utratę fibroblastów serca w okolicy niedokrwiennej przez pierwsze trzy dni po urazie. Do siódmego i czternastego dnia fibroblasty migrują lub namnażają się, aby ponownie zasiedlić uszkodzony obszar tkanki. W 28 dniu populacja fibroblastów serca otaczających uszkodzone obszary serca osiąga największą gęstość.Półtora dnia po uszkodzeniu zawału mięśnia sercowego w uszkodzonej lewej komorze pozostaje niewiele fibroblastów. Jednak w trzecim dniu fibroblasty rozszerzają się i są obecne w większości lewej komory. W przeciwieństwie do chirurgii niedokrwiennej, wlew angiotensyny drugiej i fenolefryny przez kilka tygodni nie powoduje utraty tkanki serca i ścieńczenia ścian.Zamiast tego fibroblasty wyrównują się wzdłuż osi wzorca skurczu spirali prawoskrętnej, co widać podczas korzystania z protokołu oczyszczania tkanek rafinowanych. Ponadto, po leczeniu angiotensyną drugą i fenolefryną, fibroblasty wydają się małe i zaokrąglone, w przeciwieństwie do kształtu wrzeciona obserwowanego w modelach rozrostu niedokrwiennego i uszkodzenia zawału mięśnia sercowego. Oczyszczanie elektroforetyczne należy wykonywać ostrożnie, zwłaszcza podczas pracy z sercami, które przeszły protokoły urazów.Protokół ten można wykorzystać do oceny, jak fibroblasty serca reagują na uraz in vivo. Różne markery fluorescencyjne mogą być również wykorzystane do zrozumienia, w jaki sposób serce reaguje na uraz na poziomie komórkowym.

refined-clarity-based-tissue-clearing-for-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano wysoce powtarzalny model zawału mięśnia sercowego u myszy z minimalnymi inwazyjnymi manipulacjami. Model można łatwo wykonać, co skutkuje wysoką odtwarzalnością i wskaźnikiem przeżycia. W związku z tym opisany model zmniejszy liczbę wymaganych zwierząt, zgodnie z zasadą 3R (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

W tym badaniu pokazano protokół wideo krok po kroku resekcji wierzchołkowej. Resekcja wierzchołkowa jest ostatnio wyróżnionym podejściem chirurgicznym w badaniach nad regeneracją serca u ssaków. Badanie to może promować zastosowanie resekcji wierzchołkowej jako standardowej metodologii w badaniach nad mechanizmem leżącym u podstaw regeneracji serca.

Mysi model resekcji wierzchołkowej do badania wczesnej regeneracji serca ssaków

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Proliferacja kardiomiocytów po urazie jest dynamicznym procesem, który wymaga symfonii sygnałów zewnątrzkomórkowych z populacji komórek niebędących miocytami. Wykorzystując śledzenie linii, pasywną CLARITY i techniki trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej z pełnym mocowaniem, możemy analizować wpływ różnych typów komórek na naprawę i regenerację serca.

Uchwycenie reakcji docelowych populacji komórek na uraz serca za pomocą trójwymiarowego obrazowania serca

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię świetlną wraz z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek do badania skomplikowanych struktur serca w sercach gryzoni, co ma ogromny potencjał dla zrozumienia morfogenezy i przebudowy serca.

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Poznaj udoskonaloną metodę oczyszczania tkanek CLARITY do wizualizacji fibroblastów w sercu myszy. Protokół redukuje autofluorescencję tła i umożliwia trójwymiarowe obrazowanie komórek sercowych bez dodatkowego barwienia.

Udoskonalone oczyszczanie tkanek oparte na technologii CLARITY w celu trójwymiarowej organizacji fibroblastów w zdrowych i uszkodzonych sercach myszy (Wideo) | JoVE Journal

Udoskonalone oczyszczanie tkanek oparte na technologii CLARITY w celu trójwymiarowej organizacji fibroblastów w zdrowych i uszkodzonych sercach myszy

Przeglądaj więcej filmów