Udoskonalone oczyszczanie tkanek oparte na technologii CLARITY w celu trójwymiarowej organizacji fibroblastów w zdrowych i uszkodzonych sercach myszy

Ten nowatorski protokół oczyszczania tkanek ulepsza istniejącą technologię, aby umożliwić dokładniejsze przyjrzenie się in vivo określonym typom komórek w sercu i ich zachowaniu w warunkach urazu. Ten protokół jest szybki i dość prosty. Pozwala na utrzymanie fluorescencji marca przy minimalnej interferencji z autofluorescencją tkanek tła bez konieczności barwienia komórek lub tkanek.

Zacznij od użycia gazika nasączonego 70% etanolem, aby oczyścić brzuszną powierzchnię eksperymentalnej myszy. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać trzycentymetrowe nacięcie poprzeczne, około trzy metry poniżej wyrostka mieczykowatego i oddeglove myszy od brzucha do wyrostka mieczykowatego, aby oddzielić skórę od leżącej poniżej tkanki ściany brzucha. Wykonaj dwucentymetrowe poprzeczne nacięcie w podskórnej tkance ściany brzucha, trzy centymetry poniżej wyrostka mieczykowatego i wykonaj pionowe cięcie od tego nacięcia w górę linii środkowej przez klatkę piersiową.

Przypnij klatkę piersiową z powrotem, aby odsłonić serce. I użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27, aby wstrzyknąć zimny PBS do żyły głównej górnej i aorty. Kiedy cała krew zostanie wypłukana z serca, podaj 10 mililitrów zimnego 4% PFA do żyły głównej górnej i aorty, aby rozpocząć proces utrwalania.

Kiedy cały utrwalacz zostanie rozbłyskany, wytnij serce i użyj skalpela z prostym ostrzem, aby oddzielić przedsionki, prawą komorę i przegrodę oraz lewą komorę. Umieść serce w 15-mililitrowej stożkowej probówce z zimnym 4% PFA na nocną inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza na nutatorze. Następnego ranka dodaj 0,25% roztwór fotoinicjatora do świeżo przygotowanego roztworu hydrożeli i przenieś serce do hydrożelu.

Zawiń stożkową probówkę w folię na noc inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez zakłóceń fizycznych. Następnego ranka podgrzej probówkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2,5 godziny, a następnie użyj kleszczy, aby ostrożnie przenieść serce do 15-mililitrowej probówki PBS. Umyj serce trzy razy w PBS przez jedną godzinę na pranie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na nutatorze i przenieś serce do kosza aktywnej maszyny do elektroforezy.

Zabezpiecz pokrywę na miejscu i napełnij zbiornik komory aktywnej elektroforezy roztworem czyszczącym do elektroforezy. Gdy komora jest pełna, zanurz kosz w roztworze i dokręć nakrętkę urządzenia do elektroforezy. Następnie uruchom maszynę do elektroforezy przy 1,5 ampera i 37 stopniach Celsjusza na 1,5 godziny.

Po elektroforezie sprawdź wzrokowo serce, aby upewnić się, że nie pozostała żadna nieprzezroczysta tkanka. Umyj oczyszczone serce trzy razy w 15-mililitrowym dwa przez godzinę w świeżym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pranie na nutatorze. Przed zanurzeniem serca w środku odbarwiającym w celu zmniejszenia autofluorescencji hemu.

Po 48 godzinach umyj serce trzykrotnie w PBS, jak pokazano, i wyrównaj serce w świeżo przygotowanym RIMS przez 48 godzin przed obrazowaniem. Aby obrazować 3D oczyszczone serce, najpierw umieść cienką warstwę smaru próżniowego na dnie wydrukowanego w 3D dolnego zbiornika, o tej samej wysokości, co próbka, która jest obrazowana. Napełnij zbiornik RIMS i użyj końcówki pipety, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.

Ostrożnie umieść serce w RIMS lewą ścianą komory skierowaną do góry, uważając, aby do roztworu nie dostały się pęcherzyki. Użyj smaru próżniowego, aby przymocować szklane szkiełko nakrywkowe do dolnej powierzchni wydrukowanego w 3D górnego elementu zbiornika i umieść szkiełko nakrywkowe górnego zbiornika na dolnych zbiornikach, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Następnie napełnij górne zbiorniki glicerolem.

Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować oczyszczone serca. Połączenie wyrafinowanego oczyszczania tkanki serca z obrazowaniem 3D umożliwia zaawansowaną, szczegółową wizualizację fibroblastów serca. Korzystając z tej techniki obrazowania, obserwuje się, że fibroblasty są gęsto upakowane i mają wrzecionowatą morfologię w nieuszkodzonych sercach.

Po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym obserwuje się utratę fibroblastów serca w okolicy niedokrwiennej przez pierwsze trzy dni po urazie. Do siódmego i czternastego dnia fibroblasty migrują lub namnażają się, aby ponownie zasiedlić uszkodzony obszar tkanki. W 28 dniu populacja fibroblastów serca otaczających uszkodzone obszary serca osiąga największą gęstość.

Półtora dnia po uszkodzeniu zawału mięśnia sercowego w uszkodzonej lewej komorze pozostaje niewiele fibroblastów. Jednak w trzecim dniu fibroblasty rozszerzają się i są obecne w większości lewej komory. W przeciwieństwie do chirurgii niedokrwiennej, wlew angiotensyny drugiej i fenolefryny przez kilka tygodni nie powoduje utraty tkanki serca i ścieńczenia ścian.

Zamiast tego fibroblasty wyrównują się wzdłuż osi wzorca skurczu spirali prawoskrętnej, co widać podczas korzystania z protokołu oczyszczania tkanek rafinowanych. Ponadto, po leczeniu angiotensyną drugą i fenolefryną, fibroblasty wydają się małe i zaokrąglone, w przeciwieństwie do kształtu wrzeciona obserwowanego w modelach rozrostu niedokrwiennego i uszkodzenia zawału mięśnia sercowego. Oczyszczanie elektroforetyczne należy wykonywać ostrożnie, zwłaszcza podczas pracy z sercami, które przeszły protokoły urazów.

Protokół ten można wykorzystać do oceny, jak fibroblasty serca reagują na uraz in vivo. Różne markery fluorescencyjne mogą być również wykorzystane do zrozumienia, w jaki sposób serce reaguje na uraz na poziomie komórkowym.