Udoskonalone oczyszczanie tkanek oparte na technologii CLARITY w celu trójwymiarowej organizacji fibroblastów w zdrowych i uszkodzonych sercach myszy
May 16th, 2021
Opracowano udoskonaloną metodę oczyszczania tkanek i zastosowano ją do serca dorosłej myszy. Metoda ta została zaprojektowana w celu usunięcia gęstej, autofluorescencyjnej tkanki serca, przy jednoczesnym zachowaniu znakowanej fluorescencji fibroblastów przypisywanej genetycznej strategii reporterowej.
Ten nowatorski protokół oczyszczania tkanek ulepsza istniejącą technologię, aby umożliwić dokładniejsze przyjrzenie się in vivo określonym typom komórek w sercu i ich zachowaniu w warunkach urazu. Ten protokół jest szybki i dość prosty. Pozwala na utrzymanie fluorescencji marca przy minimalnej interferencji z autofluorescencją tkanek tła bez konieczności barwienia komórek lub tkanek.
Zacznij od użycia gazika nasączonego 70% etanolem, aby oczyścić brzuszną powierzchnię eksperymentalnej myszy. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać trzycentymetrowe nacięcie poprzeczne, około trzy metry poniżej wyrostka mieczykowatego i oddeglove myszy od brzucha do wyrostka mieczykowatego, aby oddzielić skórę od leżącej poniżej tkanki ściany brzucha. Wykonaj dwucentymetrowe poprzeczne nacięcie w podskórnej tkance ściany brzucha, trzy centymetry poniżej wyrostka mieczykowatego i wykonaj pionowe cięcie od tego nacięcia w górę linii środkowej przez klatkę piersiową.
Przypnij klatkę piersiową z powrotem, aby odsłonić serce. I użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27, aby wstrzyknąć zimny PBS do żyły głównej górnej i aorty. Kiedy cała krew zostanie wypłukana z serca, podaj 10 mililitrów zimnego 4% PFA do żyły głównej górnej i aorty, aby rozpocząć proces utrwalania.
Kiedy cały utrwalacz zostanie rozbłyskany, wytnij serce i użyj skalpela z prostym ostrzem, aby oddzielić przedsionki, prawą komorę i przegrodę oraz lewą komorę. Umieść serce w 15-mililitrowej stożkowej probówce z zimnym 4% PFA na nocną inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza na nutatorze. Następnego ranka dodaj 0,25% roztwór fotoinicjatora do świeżo przygotowanego roztworu hydrożeli i przenieś serce do hydrożelu.
Zawiń stożkową probówkę w folię na noc inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez zakłóceń fizycznych. Następnego ranka podgrzej probówkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2,5 godziny, a następnie użyj kleszczy, aby ostrożnie przenieść serce do 15-mililitrowej probówki PBS. Umyj serce trzy razy w PBS przez jedną godzinę na pranie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na nutatorze i przenieś serce do kosza aktywnej maszyny do elektroforezy.
Zabezpiecz pokrywę na miejscu i napełnij zbiornik komory aktywnej elektroforezy roztworem czyszczącym do elektroforezy. Gdy komora jest pełna, zanurz kosz w roztworze i dokręć nakrętkę urządzenia do elektroforezy. Następnie uruchom maszynę do elektroforezy przy 1,5 ampera i 37 stopniach Celsjusza na 1,5 godziny.
Po elektroforezie sprawdź wzrokowo serce, aby upewnić się, że nie pozostała żadna nieprzezroczysta tkanka. Umyj oczyszczone serce trzy razy w 15-mililitrowym dwa przez godzinę w świeżym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pranie na nutatorze. Przed zanurzeniem serca w środku odbarwiającym w celu zmniejszenia autofluorescencji hemu.
Po 48 godzinach umyj serce trzykrotnie w PBS, jak pokazano, i wyrównaj serce w świeżo przygotowanym RIMS przez 48 godzin przed obrazowaniem. Aby obrazować 3D oczyszczone serce, najpierw umieść cienką warstwę smaru próżniowego na dnie wydrukowanego w 3D dolnego zbiornika, o tej samej wysokości, co próbka, która jest obrazowana. Napełnij zbiornik RIMS i użyj końcówki pipety, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.
Ostrożnie umieść serce w RIMS lewą ścianą komory skierowaną do góry, uważając, aby do roztworu nie dostały się pęcherzyki. Użyj smaru próżniowego, aby przymocować szklane szkiełko nakrywkowe do dolnej powierzchni wydrukowanego w 3D górnego elementu zbiornika i umieść szkiełko nakrywkowe górnego zbiornika na dolnych zbiornikach, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Następnie napełnij górne zbiorniki glicerolem.
Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować oczyszczone serca. Połączenie wyrafinowanego oczyszczania tkanki serca z obrazowaniem 3D umożliwia zaawansowaną, szczegółową wizualizację fibroblastów serca. Korzystając z tej techniki obrazowania, obserwuje się, że fibroblasty są gęsto upakowane i mają wrzecionowatą morfologię w nieuszkodzonych sercach.
Po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym obserwuje się utratę fibroblastów serca w okolicy niedokrwiennej przez pierwsze trzy dni po urazie. Do siódmego i czternastego dnia fibroblasty migrują lub namnażają się, aby ponownie zasiedlić uszkodzony obszar tkanki. W 28 dniu populacja fibroblastów serca otaczających uszkodzone obszary serca osiąga największą gęstość.
Półtora dnia po uszkodzeniu zawału mięśnia sercowego w uszkodzonej lewej komorze pozostaje niewiele fibroblastów. Jednak w trzecim dniu fibroblasty rozszerzają się i są obecne w większości lewej komory. W przeciwieństwie do chirurgii niedokrwiennej, wlew angiotensyny drugiej i fenolefryny przez kilka tygodni nie powoduje utraty tkanki serca i ścieńczenia ścian.
Zamiast tego fibroblasty wyrównują się wzdłuż osi wzorca skurczu spirali prawoskrętnej, co widać podczas korzystania z protokołu oczyszczania tkanek rafinowanych. Ponadto, po leczeniu angiotensyną drugą i fenolefryną, fibroblasty wydają się małe i zaokrąglone, w przeciwieństwie do kształtu wrzeciona obserwowanego w modelach rozrostu niedokrwiennego i uszkodzenia zawału mięśnia sercowego. Oczyszczanie elektroforetyczne należy wykonywać ostrożnie, zwłaszcza podczas pracy z sercami, które przeszły protokoły urazów.
Protokół ten można wykorzystać do oceny, jak fibroblasty serca reagują na uraz in vivo. Różne markery fluorescencyjne mogą być również wykorzystane do zrozumienia, w jaki sposób serce reaguje na uraz na poziomie komórkowym.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Opracowano doskonałą metodę klarowania tkanek dla serca dorosłego myszy, pozwalającą na wizualizację określonych typów komórek przy jednoczesnym minimalizowaniu autofluorescencji tła. Ten protokół ulepsza istniejące techniki badania tkanki sercowej.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia układu krążenia
- Inżynieria tkankowa
Tło
- Techniki klarowania tkanek są niezbędne do wykonywania obrazów gęstych tkanek biologicznych.
- Autofluorescencja może zasłaniać określone sygnały komórkowe w badaniach obrazowych.
- Utrzymanie fluorescencji oznaczonych komórek jest kluczowe dla dokładnej analizy.
- Istniejące metody mogą wymagać barwienia, co komplikuje proces.
Cel badania
- Opracować szybki i prosty protokół klarowania tkanek.
- Poprawić wizualizację fluorescencji fibroblastów w tkankach sercowych.
- Zmniejszyć interferencję tła wynikającą z autofluorescencji.
Stosowane metody
- Zastosowano 70% etanol do oczyszczenia brzusznej powierzchni myszy.
- Przeprowadzono cięcia chirurgiczne dla dostępu do serca.
- Zastosowano nowatorski protokół klarowania do tkanki sercowej.
- Utrzymano fluorescencję marca bez barwienia.
Główne wyniki
- Nowy protokół skutecznie klarował gęstą tkankę sercową.
- Fluorescencja fibroblastów została zachowana podczas procesu.
- Autofluorescencja tła została znacząco zmniejszona.
- Metoda pozwala na lepsze obrazowanie in vivo komórek sercowych.
Wnioski
- Ta udoskonalona metoda poprawia badania tkanki sercowej.
- Dostawia cenny narzędzie dla badaczy analizujących reakcje na uszkodzenia serca.
- Protokół jest wydajny i minimalizuje potrzebę dodatkowego barwienia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding cardiac fibroblast dynamics in three dimensions provides critical insights into fibrosis mechanisms that drive ventricular stiffness and heart failure progression. This refined CLARITY-based tissue clearing approach enables high-fidelity, whole-organ visualization of fibroblast behavior without antibody penetration limitations or fluorescence loss, supporting mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. The method offers predictive value by revealing spatially resolved fibroblast responses to ischemic and non-ischemic injury models, informing go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fibroblast localization and morphology in intact tissue to clarify pathogenic versus reparative roles in cardiac fibrosis.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genetic fibroblast labeling (Tcf21-MerCreMer; Rosa26-loxP-eGFP) to spatial phenotypes in healthy and injured hearts.
- Predictive Confidence: Reveals injury-specific fibroblast patterns—such as aligned bands post-angiotensin II/phenylephrine or repopulation from border zones post-ischemia—to de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces cleared, fluorescently labeled hearts compatible with confocal imaging for quantitative 3D analysis of fibroblast density, distribution, and morphology.
- Reproducibility: Standardized electrophoresis-based clearing (1.5 amps, 37°C, 1.5 hours) and RIMS equilibration ensure consistent tissue optical properties across experimental groups.
- Scalability: Compatible with multi-sample processing in active electrophoresis chambers, enabling side-by-side comparison of control, ischemic, and hypertensive injury models.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Captures fibroblast responses in models mimicking human ischemic injury (reperfusion) and pressure overload (angiotensin II/phenylephrine), aligning with clinical fibrosis phenotypes.
- Translational Continuity: Tracks fibroblast death, border zone repopulation, and density peaks at day 28 post-ischemia—key temporal windows for antifibrotic intervention testing.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes pro-fibrotic spindle-shaped fibroblasts in ischemia from small, rounded phenotypes in hypertension, informing target-specific pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing spatially resolved phenotypic data that bridges in vitro findings and functional outcomes in preclinical models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of fibroblast activation, migration, and proliferation in 3D tissue context, clarifying pathway-level contributions to fibrosis.
- Screening: Generates quantitative imaging outputs (fibroblast density, alignment, morphology) suitable for high-content analysis in compound screening cascades.
- Analytics: Supports morphometric and spatial statistical analysis of fibroblast networks, enabling comparison across genotypes, injuries, and time points.
- Translational Research: Links fibroblast dynamics to ventricular remodeling timelines, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue clearing and imaging platform applicable to multiple cardiovascular disease models and cell types beyond fibroblasts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in fibroblast function by preserving native tissue architecture and fluorescent signal integrity.
- Operational Value: Eliminates need for sectioning and staining, reducing workflow variability and increasing throughput for 3D phenotyping.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by revealing on-target fibroblast responses that predict functional outcomes in heart failure models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antifibrotic targets based on spatially validated target engagement and phenotypic modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac surgery, perfusion fixation, and hydrogel-based tissue clearing techniques.
- Dependent on access to active electrophoresis equipment, confocal microscopy, and RIMS/glycerol mounting solutions.
- Necessitates standardization of clearing duration and temperature to prevent over-clearing or autofluorescence in injured tissue.
- Adaptation to other disease models may require optimization of decolorization time to reduce heme-derived background without quenching GFP signal.
- Practical limitation: Long-term imaging stability depends on proper RIMS equilibration to prevent refractive index mismatch and signal degradation.
