Name: Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj ilościową metabolomikę Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. Ta metoda umożliwia identyfikację i ilościowe oznaczenie ponad 370 metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni obecnym i byłym członkom laboratorium Titorenko za dyskusje. Wyrażamy uznanie dla Centrum Biologicznych Zastosowań Spektrometrii Mas, Centrum Genomiki Strukturalnej i Funkcjonalnej oraz Centrum Mikroskopii i Obrazowania Komórkowego (wszystkie na Uniwersytecie Concordia) za wybitne usługi. Badanie to było wspierane przez granty z Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) z Kanady (RGPIN 2014-04482 i CRDPJ 515900 - 17). K.M. był wspierany przez Concordia University, Armand C. Archambault Fellowship oraz Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.

1. Przygotowanie i sterylizacja podłoża do uprawy drożdży
<ol>
	<li>Przygotuj 180 ml kompletnego ekstraktu drożdżowego z pożywką baktopeptonową (YP). Kompletna pożywka YP zawiera 1% (w/v) ekstraktu drożdżowego i 2% (w/v) baktopeptonu.</li>
	<li>Rozprowadzić 180 ml pożywki YP równomiernie do czterech kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Każda z tych kolb zawiera 45 ml pożywki YP.</li>
	<li>Wysterylizować kolby pożywką YP w autoklawie w temperaturze 15 psi/121 °C przez 45 minut.</li>
</ol>
2. Szczep drożdży typu dzikiego
<ol>
	<li>Użyj szczepu BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).</li>
</ol>
3. Uprawa drożdży na pożywce YP zawierającej 2% glukozy
<ol>
	<li>Wysterylizować 20% (w/v) roztwór podstawowy glukozy przez autoklawowanie w temperaturze 15 psi/121 °C przez 45 minut.</li>
	<li>Dodać 5 ml autoklawowanego 20% (m/v) roztworu podstawowego glukozy do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera z 45 ml wysterylizowanej pożywki YP. Końcowe stężenie glukozy w pożywce YP wynosi 2% (w/v).</li>
	<li>Za pomocą pętli mikrobiologicznej zaszczepić komórki drożdży w każdej z dwóch kolb Erlenmeyera pożywką YP zawierającą 2% glukozy.</li>
	<li>Hodować komórki drożdży przez noc w temperaturze 30 °C w wytrząsarce rotacyjnej ustawionej na 200 obr./min.</li>
	<li>Weź porcję kultury drożdży. Określ całkowitą liczbę komórek drożdży na ml hodowli. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
</ol>
4. Transfer komórek do pożywki YP i wzrost komórki z 2% glukozą
<ol>
	<li>Dodać 5 ml wysterylizowanego 20% (w/v) roztworu podstawowego glukozy do każdej z pozostałych dwóch kolb Erlenmeyera z autoklawowaną pożywką YP. Końcowe stężenie glukozy wynosi 2% (w/v).</li>
	<li>Przenieść objętość nocnej kultury drożdży w pożywce YP z 2% glukozą, która zawiera całkowitą liczbę komórek 5,0 x 107, do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera z pożywką YP zawierającą 2% glukozy. Do transferu komórek należy użyć sterylnej pipety.</li>
	<li>Hodować komórki drożdży przez co najmniej 24 godziny (lub dłużej, jeśli wymaga tego doświadczenie) w temperaturze 30 °C w wytrząsarce rotacyjnej ustawionej na 200 obr./min.</li>
</ol>
5. Wytwarzanie odczynników, przygotowywanie sprzętu laboratoryjnego i ustawianie sprzętu do hartowania komórek
<ol>
	<li>Przygotować następujące elementy: 1) roztwór hartowniczy (60% wysokojakościowego (>99,9%) metanolu w 155 mM buforze wodorowęglanu amonu (ABC), pH = 8,0); 2) lodowaty roztwór ABC (pH = 8,0); 3) termometr cyfrowy zdolny do pomiaru temperatury do -20 °C; 4) Duże butelki wirówkowe o pojemności 500 ml; 5) wstępnie schłodzona wirówka szybkoobrotowa z wstępnie schłodzonym wirnikiem i wstępnie schłodzonymi butelkami wirówkowymi o pojemności 500 ml do tego wirnika, wszystkie w temperaturze -5 °C; 6) probówki do ekstrakcji metabolitów (15 ml szybkoobrotowe szklane probówki wirówkowe z nakrętkami wyłożonymi politetrafluoroetylenem); oraz 7) suchy lód.</li>
</ol>
6. Wygaszanie komórek
<ol>
	<li>Użyj hemocytometru, aby określić liczbę komórek drożdży na ml YP z 2% hodowlą glukozy.</li>
	<li>Przenieść objętość kultury w pożywce YP z 2% glukozą, która zawiera całkowitą liczbę komórek 5,0 x 108, do wstępnie schłodzonych butelek wirówkowych o pojemności 500 ml.</li>
	<li>Szybko napełnić butelkę wirówkową zawierającą komórki do objętości 200 ml roztworem hartowniczym przechowywanym w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odwirować butelki w wirówce wysokoobrotowej o stężeniu 11,325 x g przez 3 minuty w temperaturze -5 °C.</li>
	<li>Szybko i delikatnie wyjąć butelkę z wirówki; delikatnie odkręcić pokrywkę i usunąć supernatant, nie naruszając osadu.</li>
	<li>Szybko zawieś ponownie osad komórkowy w 10 ml lodowatego buforu ABC i przenieś zawiesinę do 15 ml szybkoobrotowej szklanej probówki wirówkowej z nasadką wyłożoną politetrafluoroetylenem w celu ekstrakcji metabolitów.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w wirówce klinicznej o sile 3 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 0 °C.</li>
	<li>Szybko usunąć szwadron i umieścić probówkę na suchym lodzie, aby rozpocząć ekstrakcję metabolitów lub przechowywać probówkę w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji.</li>
</ol>
7. Przygotowanie odczynników, sprzętu laboratoryjnego i sprzętu do ekstrakcji metabolitów
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: 1) chloroform klasy LC-MS; 2) Metanol klasy LC-MS; 3) Nano-czysta woda klasy LC; 4) Klasa LC-MS (ACN); 5) kulki szklane (myte kwasem, 425-600 μm); 6) wir z zestawem uchwytów na rurkę piankową z ustalaczem; 7) Probówki wirówkowe ze szkła szybkoobrotowego o pojemności 15 ml z nakrętkami wyłożonymi politetrafluoroetylenem; 8) fiolki ze stwardnieniem rozsianym; 9) suchy lód; oraz 10) probówki o pojemności 1,5 ml przemyte raz etanolem, raz ACN i raz wodą nano-czystą. 
	UWAGA: Używaj wyłącznie końcówek i probówek do mikropipet wykonanych z polipropylenu, który jest odporny na rozpuszczalniki organiczne.</li>
</ol>
8. Ekstrakcja metabolitów
<ol>
	<li>Do metabolitów przechowywanych w suchym lodzie lub przechowywanych w temperaturze -80 °C w probówce z kroku 6.7 dodać następujące elementy: 1) 2 ml chloroformu przechowywanego w temperaturze -20 °C; 2) 1 ml metanolu przechowywanego w temperaturze -20 °C; 3) 1 ml lodowatej nano-czystej wody; oraz 4) 200 μL kulek szklanych płukanych kwasem o pojemności 425-600 μm.</li>
	<li>Przykryj i zamknij ujście probówki folią aluminiową. Umieścić probówki w zestawie uchwytów do rurek piankowych z ustalaczem i wirować je przez 30 minut ze średnią prędkością (tj. z prędkością ustawioną na 6, gdzie 12 to maksymalna prędkość wiru) w temperaturze 4 °C, aby ułatwić ekstrakcję metabolitów.</li>
	<li>Inkubuj probówkę przez 15 minut na lodzie (NIE na suchym lodzie!), aby przyspieszyć wytrącanie się białka i oddzielenie górnej fazy wodnej od dolnej fazy organicznej.</li>
	<li>Odwirować probówkę w wirówce klinicznej przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ten etap wirowania umożliwia oddzielenie górnej fazy wodnej (która zawiera metabolity rozpuszczalne w wodzie) od warstwy środkowej (która zawiera szczątki komórkowe i białka) oraz od dolnej fazy organicznej (która zawiera głównie lipidy).</li>
	<li>Za pomocą mikropipety przenieś górną fazę wodną (400 μl) do umytej i oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 800 μl ACN, która była przechowywana w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Po dodaniu górnej fazy wodnej do ACN utrzymywanej w temperaturze -20 °C wystąpią opady białej chmury.</li>
	<li>Odwirować probówkę z próbką w wirówce stołowej o sile 13 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Opady białej chmury znikną po odwirowaniu.</li>
	<li>Przenieść 800 μl z górnej części płynu w probówce do oznakowanej fiolki ze stwardnieniem rozsianym. Przechowywać próbkę w temperaturze 0 °C do czasu jej analizy za pomocą LC-MS/MS.</li>
</ol>
9. Przygotowanie odczynników, sprzętu laboratoryjnego i sprzętu do LC
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: 1) wir; 2) ultradźwiękowy sonikator 3) Fiolki ze szkła MS; 4) system LC wyposażony w pompę dwustopniową, odgazowywacz i autosampler; 5) kolumna do chromatografii fazy jonowej (polimer 5 μm, 150 x 2,1 mm) wymieniona w Tabeli Materiałów; 6) grzejnik kolumnowy; oraz 7) fazy ruchome, w tym faza A (5:95 ACN:woda (v/v) z 20 mM octanem amonu, pH = 8,0) i faza B (100% ACN).</li>
</ol>
10. Separacja wyekstrahowanych metabolitów przez LC
<ol>
	<li>Zawartość fiolki ze stwardnieniem rozsianym należy poddać działaniu ultradźwięków przez 15 minut.</li>
	<li>Wirować fiolkę MS 3x przez 10 sekund w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Umieścić fiolkę ze stwardnieniem rozsianym w płytce studzienki.</li>
	<li>Podczas chromatografu utrzymywać temperaturę kolumny 45 °C i natężenie przepływu 0,250 ml/min. Przechowywać próbkę w płytce studzienkowej w temperaturze 0 °C. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z gradientami LC, które należy stosować podczas chromatografii. 
	UWAGA: Reprezentatywny chromatogram jonów całkowitych rozpuszczalnych w wodzie metabolitów, które zostały wyekstrahowane z komórek szczepu typu dzikiego BY4742, pokazano na rysunku Rysunek 1. Metabolity oddzielone przez LC zidentyfikowano i oznaczono ilościowo za pomocą analizy spektrometrii mas, którą przeprowadzono w trybie jonizacji dodatniej [ESI (+)], jak opisano w kroku 11.</li>
</ol>
11. Analiza spektrometryczna mas metabolitów oddzielonych LC
<ol>
	<li>Użyć spektrometru mas wyposażonego w podgrzewaną jonizację elektronatryskową (HESI) do identyfikacji i ilościowego oznaczania metabolitów rozpuszczalnych w wodzie, które zostały oddzielone przez LC. Użyj analizatora spektrometru mas dla jonów MS1 i detektora spektrometru mas dla jonów MS2. Użyj ustawień podanych w Tabeli 2 i Tabeli 3 do zależnego od danych pozyskiwania jonów MS1 i MS2.</li>
	<li>Do wstrzykiwania należy użyć próbki o objętości 10 μl zarówno w trybie ESI (+), jak i ESI (-).</li>
</ol>
12. Identyfikacja i kwantyfikacja różnych metabolitów poprzez przetwarzanie surowych danych z LC-MS/MS
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania wymienionego w Tabeli materiałów, aby przeprowadzić identyfikację i ilościowe określenie różnych metabolitów rozpuszczalnych w wodzie z surowych plików LC-MS/MS. To oprogramowanie wykorzystuje MS1 do oznaczania ilościowego metabolitów i MS2 do identyfikacji metabolitów. Oprogramowanie wykorzystuje najobszerniej wyselekcjonowaną bibliotekę fragmentacji widma mas do opisywania metabolitów przy użyciu surowych danych LC-MS/MS poprzez dopasowanie widm MS. To oprogramowanie wykorzystuje również dokładną masę MS1 i dopasowanie wzorca izotopowego do opisywania metabolitów za pomocą internetowych baz danych. Zobacz Rysunek 2, aby uzyskać szczegółowe informacje.</li>
	<li>Skorzystaj z biblioteki baz danych i widm, która jest dostępna bezpłatnie online (https://www.mzcloud.org), aby wyszukać widma MS2 surowych danych.</li>
</ol>
13. Test integralności błony za pomocą barwienia jodkiem propidyny (PI) i mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Po schładzaniu komórek przeprowadzonym zgodnie z opisem w kroku 6, dokładnie umyj schładzone komórki 15 ml buforu ABC w celu usunięcia roztworu hartującego. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze 0 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu ABC i dodać 0,5 ml roztworu PI (0,5 mg/ml).</li>
	<li>Wirować probówkę z próbką 3x przez 10 s i inkubować ją przez 10 minut w ciemności i na lodzie.</li>
	<li>Odwirować probówkę z próbką w wirówce stołowej o stężeniu 13 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu ABC.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 13 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz ten krok jeszcze 2 razy, aby usunąć PI związany z powierzchnią komórki.</li>
	<li>Zawiesić osad w 300 μl buforu ABC. Umieścić 10 μl zawiesiny na powierzchni szkiełka mikroskopowego.</li>
	<li>Rejestruj obrazy z kontrastu różnicowego interferencyjnego (DIC) i mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj filtra ustawionego na długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 593 nm i 636 nm.</li>
	<li>Użyj oprogramowania, aby policzyć całkowitą liczbę komórek (w trybie DIC) oraz liczbę komórek barwionych fluorescencyjnie. Użyj również tego oprogramowania, aby określić intensywność barwienia dla poszczególnych komórek.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Aby skutecznie korzystać z opisanego tutaj protokołu, postępuj zgodnie ze środkami zapobiegawczymi opisanymi poniżej. Chloroform i metanol ekstrahują różne substancje z laboratoryjnych wyrobów z tworzyw sztucznych. Dlatego należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Unikaj stosowania tworzyw sztucznych w etapach, które wiążą się z kontaktem z którymkolwiek z tych dwóch rozpuszczalników organicznych. Do wykonania tych czynności należy użyć pipet ze szkła borokrzemianowego. Przed użyciem należy napełnić pipety chloroformem i me...

Rozpuszczalne w wodzie metabolity to półprodukty o niskiej masie cząsteczkowej i produkty metabolizmu, które przyczyniają się do istotnych procesów komórkowych. Te ewolucyjnie zachowane procesy obejmują przekształcanie składników odżywczych w energię użytkową, syntezę makrocząsteczek, wzrost i sygnalizację komórkową, kontrolę cyklu komórkowego, regulację ekspresji genów, reakcję na stres, potranslacyjną regulację metabolizmu, utrzymanie funkcjonalności mitochondriów, pęcherzykowy transport komórkowy, autofagię, starzenie się komórek i regulowaną śmierć komórki1,2,3.
Wiele z tych istotnych ról metabolitów rozpuszczalnych w wodzie zostało odkrytych w badaniach na pączkujących drożdżach S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Ten jednokomórkowy eukariont jest użytecznym organizmem modelowym do analizowania mechanizmów, za pomocą których rozpuszczalne w wodzie metabolity przyczyniają się do procesów komórkowych ze względu na jego podatność na zaawansowane analizy biochemiczne, genetyczne i molekularne23,24,25,26. Chociaż metody LC-MS/MS nieukierunkowanej metabolomiki zostały wykorzystane do badania roli metabolitów rozpuszczalnych w wodzie w pączkujących drożdżach3,18,22,27, ten rodzaj analizy wymaga poprawy jego wszechstronności, solidności, czułości i zdolności do rozróżniania różnych izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form tych metabolitów.
Ostatnie lata są naznaczone znaczącymi postępami w stosowaniu metod LC-MS/MS nieukierunkowanej metabolomiki do profilowania rozpuszczalnych w wodzie metabolitów in vivo. Pozostaje jednak wiele wyzwań związanych z korzystaniem z tej metodologii2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Wyzwania te obejmują następujące elementy. Po pierwsze, wewnątrzkomórkowe stężenia wielu metabolitów rozpuszczalnych w wodzie są poniżej progu czułości dla obecnie stosowanych metod. Po drugie, skuteczność wygaszania aktywności metabolicznej jest zbyt niska, a zakres związanego z wygaszaniem wycieku wewnątrzkomórkowych metabolitów komórkowych jest zbyt wysoki dla obecnych metod; W związku z tym obecnie stosowane metody nie doszacowają wewnątrzkomórkowych stężeń metabolitów rozpuszczalnych w wodzie. Po trzecie, istniejące metody nie są w stanie rozróżnić izomerów strukturalnych (tj. cząsteczek o tym samym wzorze chemicznym, ale różnych połączeniach atomowych) lub stereoizomerów (tj. cząsteczek o tym samym wzorze chemicznym i łączności atomowej, ale o różnym układzie atomowym w przestrzeni) określonych metabolitów; Uniemożliwia to prawidłowe opisywanie niektórych metabolitów obecnie stosowanymi metodami. Po czwarte, istniejące internetowe bazy danych spektralnych mas jonów macierzystych (MS1) i jonów wtórnych (MS2) są niekompletne; wpływa to na prawidłową identyfikację i kwantyfikację określonych metabolitów przy użyciu surowych danych LC-MS/MS uzyskanych przy pomocy obecnych metod. Po piąte, istniejące metody nie mogą wykorzystywać jednego rodzaju ekstrakcji metabolitów w celu odzyskania wszystkich lub większości klas metabolitów rozpuszczalnych w wodzie. Po szóste, istniejące metody nie mogą wykorzystywać jednego typu kolumny LC do oddzielenia od siebie wszystkich lub większości klas metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.
Tutaj zoptymalizowaliśmy warunki do wygaszania aktywności metabolicznej w komórkach S. cerevisiae, zachowując większość rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w tych komórkach przed ekstrakcją i ekstrahując większość klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów z komórek drożdży. Opracowaliśmy wszechstronną, solidną i czułą metodę identyfikacji i kwantyfikacji ponad 370 rozpuszczalnych w wodzie metabolitów wyekstrahowanych z komórek S. cerevisiae w oparciu o LC-MS/MS. Ta metoda metabolomiki niecelowanej umożliwia ocenę stężeń wewnątrzkomórkowych różnych cząsteczek nośników energii, nukleotydów, aminokwasów, cukrów prostych, produktów pośrednich glikolizy i produktów pośrednich cyklu trikarboksylowego. Opracowana metoda LC-MS/MS pozwala na identyfikację i kwantyfikację różnych izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form rozpuszczalnych w wodzie metabolitów o zróżnicowanych właściwościach strukturalnych, fizycznych i chemicznych.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A9554</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11450</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Bactopepton</td><td>Fisher</td><td>Scientific BP1420-2</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C297-4</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna</td><td>Sigma</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>L-leucyna</td><td>Sigma</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4564</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4564</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Thermo Scientific</td><td>R37108</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Hardware equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml butelki wirówkowe</td><td>Beckman</td><td>355664</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1100 series LC</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1312A</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do redlic Beckman</td><td></td><td>6254249</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Wirnik do redlic Beckman Wirnik do redlic</td><td>Beckman</td><td>JA-10</td><td></td></tr><tr><td>Centra CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Termometr cyfrowy</td><td>Omega</td><td>HH509</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw uchwytów do rurek piankowych z ustalaczem</td><td>Thermo Scientific</td><td>02-215-388</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC kolumna fazy obojenia (5&mikro; m polimer 150 x 2,1 mm)</td><td>Sigma Milipore</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Orbitrap Velos MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>ETD-10600</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator ultradźwiękowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337416</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX Bonus-RP, 80&Aring;, 2,1 x 150 mm, 5 &mikro; m</td><td>Agilent Technologies</td><td>883725-901</td><td></td></tr><tr><td>Materiały laboratoryjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mL Szklane fiolki na próbki z nakrętkami wyłożonymi teflonem</td><td>Fisher Scientific</td><td>60180A-SV9-1P</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane (myte kwasem, 425-600 &mu; m)</td> Hemacytometr <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>15-mililitrowe szybkie szklane probówki wirówkowe z nasadkami wyłożonymi teflonem</td><td>PYREX</td><td>05-550</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compound Discoverer 3.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>V3.1</td><td></td></tr><tr><td>Szczep drożdży</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczep drożdży BY4742</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1049</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa metabolomika saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomika to metodologia używana do identyfikacji i kwantyfikacji wielu produktów pośrednich o niskiej masie cząsteczkowej i produktów przemiany materii w komórce, tkance, organie, płynie biologicznym lub organizmie. Metabolomika tradycyjnie koncentruje się na metabolitach rozpuszczalnych w wodzie. Metabolom rozpuszczalny w wodzie jest produktem końcowym złożonej sieci komórkowej, która integruje różne czynniki genomiczne, epigenomiczne, transkryptomiczne, proteomiczne i środowiskowe. W związku z tym analiza metabolomiczna bezpośrednio ocenia wynik działania wszystkich tych czynników w wielu procesach biologicznych w różnych organizmach. Jednym z tych organizmów są pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae, jednokomórkowy eukariont z w pełni zsekwencjonowanym genomem. Ponieważ S. cerevisiae jest podatny na kompleksowe analizy molekularne, jest używany jako model do analizowania mechanizmów leżących u podstaw wielu procesów biologicznych w komórce eukariotycznej. Wszechstronna metoda analityczna do solidnej, czułej i dokładnej oceny ilościowej metabolomu rozpuszczalnego w wodzie zapewniłaby niezbędną metodologię do analizy tych mechanizmów. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji warunków wygaszania aktywności metabolicznej i ekstrakcji rozpuszczalnych w wodzie metabolitów z komórek S. cerevisiae. W protokole opisano również zastosowanie chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) do analizy ilościowej ekstrahowanych metabolitów rozpuszczalnych w wodzie. Opisana tutaj metoda LC-MS/MS metabolomiki nieukierunkowanej jest wszechstronna i solidna. Umożliwia identyfikację i kwantyfikację ponad 370 rozpuszczalnych w wodzie metabolitów o różnych właściwościach strukturalnych, fizycznych i chemicznych, w tym różnych izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form tych metabolitów. Metabolity te obejmują różne cząsteczki nośników energii, nukleotydy, aminokwasy, monosacharydy, produkty pośrednie glikolizy i produkty pośrednie cyklu trikarboksylowego. Metoda LC-MS/MS metabolomiki nieukierunkowanej jest czuła i umożliwia identyfikację i ilościowe określenie niektórych metabolitów rozpuszczalnych w wodzie w stężeniach tak niskich, jak 0,05 pmol/μl. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do oceny rozpuszczalnych w wodzie metabolomów dzikich i zmutowanych komórek drożdży hodowanych w różnych warunkach.

Aby usprawnić ilościową ocenę metabolitów rozpuszczalnych w wodzie w komórce drożdży, zoptymalizowano warunki quenchingu (gwałtownego zatrzymania metabolizmu) komórek na potrzeby detekcji metabolitów. Quenching komórek w tym celu polega na szybkim zatrzymaniu wszystkich reakcji enzymatycznych wewnątrz komórki31,3,37,38. Takie zatrzymanie aktywności metabolicznej...

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Protokół ten ma wiele zalet w porównaniu z obecnie stosowaną metabolomiką drożdży, ponieważ ma wysoką specyficzność, wysoką czułość, a także może profilować wiele różnych klas metabolitów, w tym cząsteczki izomeryczne, izobaryczne, hydrofilowe i hydrofobowe. Zastosowana w tym protokole metoda wygaszania zatrzymuje wszelkie reakcje enzymatyczne, jednocześnie znacznie zmniejszając wyciek metabolitów z komórek. Biblioteka MS1 wbudowana w ten protokół pochodzi z różnych przebiegów MS2.Po całonocnej hodowli w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obrotach na minutę, określić liczbę komórek drożdży na mililitr kultury i dodać pięć mililitrów wysterylizowanego 20% roztworu podstawowego glukozy do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera zawierających 45 mililitrów autoklawizowanej pożywki YP na kolbę. Za pomocą sterylnej pipety transferowej dodać pięć razy po 10 do siódmej komórki drożdży do każdej kolby i hodować komórki drożdży przez co najmniej 24 dodatkowe godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza przy 200 obrotach na minutę. W celu ekstrakcji metabolitów, po hodowli, zebrać komórki drożdży przez odwirowanie i szybko usunąć supernatant.Umieść probówkę na suchym lodzie i dodaj do komórek dwa mililitry chloroformu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, jeden mililitr metanolu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, jeden mililitr lodowatej nano czystej wody i 200 mikrolitrów szklanych kulek mytych kwasem o grubości od 425 do 600 mikronów. Po dodaniu kulek umieść probówkę pokrytą folią aluminiową w zestawie uchwytów do probówek piankowych z ustalaczem i wiruj próbkę przez 30 minut ze średnią prędkością w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby ułatwić ekstrakcję metabolitu. Następnie inkubować probówkę przez 15 minut na lodzie przed odwirowaniem próbki, aby umożliwić oddzielenie górnej fazy wodnej od środkowych zanieczyszczeń i dolnych faz organicznych.Za pomocą mikropipety przenieś około 400 mikrolitrów górnej fazy wodnej do umytej i oznakowanej 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 800 mikrolitrów acetonitrylu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie odwirować próbkę i przenieść 800 mikrolitrów górnej części supernatantu do znakowanej fiolki ze spektrometrią mas w celu przechowywania w zerowym stopniu do czasu analizy tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej. Aby oddzielić wyekstrahowane metabolity, należy poddać fiolkę z próbką działaniu ultradźwięków przez 15 minut, a następnie wykonać trzy 10-sekundowe wiry w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu umieścić fiolkę w płytce studzienkowej chromatografa cieczowego i ustawić kolumnę na 45 stopni Celsjusza z natężeniem przepływu 0,25 mililitra na minutę, a płytkę studzienki na zero stopni Celsjusza. Następnie użyj tabeli, aby ustawić gradienty chromatografii cieczowej do analizy. Po rozdzieleniu należy użyć 10 mikrolitrów objętości próbki wtrysku zarówno w dodatnim, jak i ujemnym trybie jonizacji elektrorozpylania w spektrometrze masowym wyposażonym w podgrzewaną jonizację elektrorozpylania w celu identyfikacji i ilościowego określenia metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.Pod koniec analizy otwórz surowe dane w odpowiednim oprogramowaniu do analizy związków i wykorzystaj bibliotekę fragmentacji widma mas, aby dopasować widma masowe do adnotacji metabolitów zidentyfikowanych w analizie. Dokładne masy MS1 i wzorce izotopów mogą być również zidentyfikowane, aby umożliwić adnotację metabolitów przy użyciu internetowych baz danych. Następnie użyj biblioteki baz danych i widm, aby wyszukać widma MS2 surowych danych.Następnego dnia, po schłodzeniu komórek drożdży, dokładnie umyj komórki 15 mililitrami buforu ABC i zbierz komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad w jednym mililitrze świeżego buforu ABC i dodać 500 mikrolitrów roztworu jodku propidyny do komórek. Trzykrotnie zagłuszić próbkę przez 10 sekund na wir i inkubować komórki przez 10 minut na lodzie chronionym przed światłem.Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i przemyć komórki trzykrotnie jednym mililitrem świeżego buforu ABC na przemycie. Po ostatnim przemyciu ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach świeżego buforu ABC i dodać 10 mikrolitrów powstałej zawiesiny komórek do szkiełka mikroskopowego. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby uchwycić obrazy z mikroskopii interferencyjnej, różnicowej i mikroskopii fluorescencyjnej komórek z filtrami ustawionymi na długość fali wzbudzenia 593 nanometry i długość fali emisji 636 nanometrów.Następnie użyj odpowiedniego programu do analizy obrazu, aby policzyć całkowitą liczbę komórek w jasnym polu i obrazach fluorescencyjnych oraz określić intensywność fluorescencji barwienia dla poszczególnych komórek. Zmodyfikowana metoda hartowania komórek powoduje znacznie mniejsze uszkodzenia błony plazmatycznej i ściany komórkowej niż metoda hartowania bez buforu 80% metanolu w temperaturze minus 40 stopni Celsjusza. Rzeczywiście, prawie wszystkie komórki poddane hartowaniu metodą zmodyfikowaną wykazują emisję czerwonej fluorescencji, która jest charakterystyczna dla komórek drożdży, w których błona plazmatyczna i ściana komórkowa nie są uszkodzone.Natomiast prawie wszystkie komórki poddane wygaszaniu metodą niebuforowanego 80% metanolu w temperaturze 40 stopni Celsjusza wykazywały emisję zielonej fluorescencji, która jest charakterystyczna dla komórek drożdży, w których błona plazmatyczna i ściana komórkowa są znacznie uszkodzone. Zmodyfikowana metoda wygaszania komórek powoduje również znacznie mniejszy wyciek rozpuszczalnych w wodzie metabolitów z komórek drożdży niż metoda hartowania bez buforu 80% metanolu w temperaturze minus 40 stopni Celsjusza. Wartości przesunięcia w czasie retencji wzorców metabolitów rozpuszczalnych w wodzie są znacznie niższe, a kształty pików są znacznie ostrzejsze dla kolumny fazy obojowej w porównaniu z kolumną z odwróconą fazą.Kolejną zaletą metody tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej jest możliwość wykorzystania kolumny fazy jonowej do skutecznego oddzielania różnych rozpuszczalnych w wodzie metabolitów o różnych właściwościach strukturalnych, fizycznych i chemicznych. Upewnij się, że jodek propidyny jest wykonywany w pozycji stojącej w ciemności, a także upewnij się, że zbierasz górną fazę, nie zakłócając środkowej fazy. Jeśli którykolwiek MSP nie może być anotowany z powodu braku biblioteki spektralnej MS2, użyj NMR, aby zilustrować tę strukturę.

quantitative-metabolomics-saccharomyces-cerevisiae-using-liquid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Opis ilościowej procedury fosforylacji z wykorzystaniem kriolizy, solubilizacji mocznikiem, frakcjonowania HILIC oraz wzbogacania peptydów fosforylowanych metodą IMAC.

Ilościowa fosfoproteomika w Saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi

Opisujemy nową ilościową metodę lipidomiki służącą do identyfikacji licznych gatunków lipidów w drożdżach z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją przez elektroryś spray w trybie skanowania przeglądowego (ESI/MS). Metoda ta przewyższa obecnie dostępne metody identyfikacji i oznaczania ilościowego lipidów pod względem zdolności do rozdzielania różnych form cząsteczkowych lipidów, czułości oraz szybkości analizy.

Ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

Źródło: Samuels, D. J. i in. Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej – spektrometrii mas do analizy metabolitów gronkowca aureus. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje zastosowanie chromatografii cieczowej – spektrometrii mas do identyfikacji i ilościowej identyfikacji metabolitów wewnątrzkomórkowych S. aureus. Przedstawia etapy związane z ekstracją metabolitów, normalizacją peptydów, chromatografią cieczową oraz analizą spektrometriczną mas.

Podejście oparte na chromatografii cieczowej – spektrometrii mas do analizy metabolitów S. aureus

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Prezentujemy protokół wykorzystujący chromatografię cieczową w połączeniu z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych lipidów komórkowych u Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda ilościowej oceny głównych klas lipidów w komórce drożdży jest wszechstronna, solidna i czuła.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Przedstawiono metodę nieukierunkowanej analizy metabolitów i lipidów w ziarnie pszenicy. Protokół obejmuje metodę ekstrakcji metabolitu acetonitrylu oraz metodologię chromatografii cieczowej z odwróconą fazą i spektrometrią mas, z akwizycją w dodatnich i ujemnych trybach jonizacji elektrorozpylanej.

Nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji metabolitów ze Staphylococcus aureus i ich późniejszej analizy za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas.

Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy metabolitów Staphylococcus aureus

Poznaj ilościową metabolomikę Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. Ta metoda umożliwia identyfikację i ilościowe oznaczenie ponad 370 metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Przeglądaj więcej filmów