Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Protokół ten ma wiele zalet w porównaniu z obecnie stosowaną metabolomiką drożdży, ponieważ ma wysoką specyficzność, wysoką czułość, a także może profilować wiele różnych klas metabolitów, w tym cząsteczki izomeryczne, izobaryczne, hydrofilowe i hydrofobowe. Zastosowana w tym protokole metoda wygaszania zatrzymuje wszelkie reakcje enzymatyczne, jednocześnie znacznie zmniejszając wyciek metabolitów z komórek. Biblioteka MS1 wbudowana w ten protokół pochodzi z różnych przebiegów MS2.

Po całonocnej hodowli w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obrotach na minutę, określić liczbę komórek drożdży na mililitr kultury i dodać pięć mililitrów wysterylizowanego 20% roztworu podstawowego glukozy do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera zawierających 45 mililitrów autoklawizowanej pożywki YP na kolbę. Za pomocą sterylnej pipety transferowej dodać pięć razy po 10 do siódmej komórki drożdży do każdej kolby i hodować komórki drożdży przez co najmniej 24 dodatkowe godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza przy 200 obrotach na minutę. W celu ekstrakcji metabolitów, po hodowli, zebrać komórki drożdży przez odwirowanie i szybko usunąć supernatant.

Umieść probówkę na suchym lodzie i dodaj do komórek dwa mililitry chloroformu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, jeden mililitr metanolu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, jeden mililitr lodowatej nano czystej wody i 200 mikrolitrów szklanych kulek mytych kwasem o grubości od 425 do 600 mikronów. Po dodaniu kulek umieść probówkę pokrytą folią aluminiową w zestawie uchwytów do probówek piankowych z ustalaczem i wiruj próbkę przez 30 minut ze średnią prędkością w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby ułatwić ekstrakcję metabolitu. Następnie inkubować probówkę przez 15 minut na lodzie przed odwirowaniem próbki, aby umożliwić oddzielenie górnej fazy wodnej od środkowych zanieczyszczeń i dolnych faz organicznych.

Za pomocą mikropipety przenieś około 400 mikrolitrów górnej fazy wodnej do umytej i oznakowanej 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 800 mikrolitrów acetonitrylu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie odwirować próbkę i przenieść 800 mikrolitrów górnej części supernatantu do znakowanej fiolki ze spektrometrią mas w celu przechowywania w zerowym stopniu do czasu analizy tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej. Aby oddzielić wyekstrahowane metabolity, należy poddać fiolkę z próbką działaniu ultradźwięków przez 15 minut, a następnie wykonać trzy 10-sekundowe wiry w temperaturze pokojowej.

Po wirowaniu umieścić fiolkę w płytce studzienkowej chromatografa cieczowego i ustawić kolumnę na 45 stopni Celsjusza z natężeniem przepływu 0,25 mililitra na minutę, a płytkę studzienki na zero stopni Celsjusza. Następnie użyj tabeli, aby ustawić gradienty chromatografii cieczowej do analizy. Po rozdzieleniu należy użyć 10 mikrolitrów objętości próbki wtrysku zarówno w dodatnim, jak i ujemnym trybie jonizacji elektrorozpylania w spektrometrze masowym wyposażonym w podgrzewaną jonizację elektrorozpylania w celu identyfikacji i ilościowego określenia metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Pod koniec analizy otwórz surowe dane w odpowiednim oprogramowaniu do analizy związków i wykorzystaj bibliotekę fragmentacji widma mas, aby dopasować widma masowe do adnotacji metabolitów zidentyfikowanych w analizie. Dokładne masy MS1 i wzorce izotopów mogą być również zidentyfikowane, aby umożliwić adnotację metabolitów przy użyciu internetowych baz danych. Następnie użyj biblioteki baz danych i widm, aby wyszukać widma MS2 surowych danych.

Następnego dnia, po schłodzeniu komórek drożdży, dokładnie umyj komórki 15 mililitrami buforu ABC i zbierz komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad w jednym mililitrze świeżego buforu ABC i dodać 500 mikrolitrów roztworu jodku propidyny do komórek. Trzykrotnie zagłuszić próbkę przez 10 sekund na wir i inkubować komórki przez 10 minut na lodzie chronionym przed światłem.

Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i przemyć komórki trzykrotnie jednym mililitrem świeżego buforu ABC na przemycie. Po ostatnim przemyciu ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach świeżego buforu ABC i dodać 10 mikrolitrów powstałej zawiesiny komórek do szkiełka mikroskopowego. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby uchwycić obrazy z mikroskopii interferencyjnej, różnicowej i mikroskopii fluorescencyjnej komórek z filtrami ustawionymi na długość fali wzbudzenia 593 nanometry i długość fali emisji 636 nanometrów.

Następnie użyj odpowiedniego programu do analizy obrazu, aby policzyć całkowitą liczbę komórek w jasnym polu i obrazach fluorescencyjnych oraz określić intensywność fluorescencji barwienia dla poszczególnych komórek. Zmodyfikowana metoda hartowania komórek powoduje znacznie mniejsze uszkodzenia błony plazmatycznej i ściany komórkowej niż metoda hartowania bez buforu 80% metanolu w temperaturze minus 40 stopni Celsjusza. Rzeczywiście, prawie wszystkie komórki poddane hartowaniu metodą zmodyfikowaną wykazują emisję czerwonej fluorescencji, która jest charakterystyczna dla komórek drożdży, w których błona plazmatyczna i ściana komórkowa nie są uszkodzone.

Natomiast prawie wszystkie komórki poddane wygaszaniu metodą niebuforowanego 80% metanolu w temperaturze 40 stopni Celsjusza wykazywały emisję zielonej fluorescencji, która jest charakterystyczna dla komórek drożdży, w których błona plazmatyczna i ściana komórkowa są znacznie uszkodzone. Zmodyfikowana metoda wygaszania komórek powoduje również znacznie mniejszy wyciek rozpuszczalnych w wodzie metabolitów z komórek drożdży niż metoda hartowania bez buforu 80% metanolu w temperaturze minus 40 stopni Celsjusza. Wartości przesunięcia w czasie retencji wzorców metabolitów rozpuszczalnych w wodzie są znacznie niższe, a kształty pików są znacznie ostrzejsze dla kolumny fazy obojowej w porównaniu z kolumną z odwróconą fazą.

Kolejną zaletą metody tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej jest możliwość wykorzystania kolumny fazy jonowej do skutecznego oddzielania różnych rozpuszczalnych w wodzie metabolitów o różnych właściwościach strukturalnych, fizycznych i chemicznych. Upewnij się, że jodek propidyny jest wykonywany w pozycji stojącej w ciemności, a także upewnij się, że zbierasz górną fazę, nie zakłócając środkowej fazy. Jeśli którykolwiek MSP nie może być anotowany z powodu braku biblioteki spektralnej MS2, użyj NMR, aby zilustrować tę strukturę.