Name: Stworzenie i utrzymanie żywego biobanku - jak to robimy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Poznaj metody tworzenia i utrzymania żywego biobanku dla raka jelita grubego i trzustki, obejmującego modele pochodzące od pacjentów, takie jak PDX i linie komórkowe. Protokół umożliwia funkcjonalne testowanie przedkliniczne dla medycyny precyzyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Uprzejmie dziękujemy Jenny Burmeister, naszej asystentce graficznej, za nagranie i montaż filmu. Ponadto dziękujemy naszym kolegom z oddziału chirurgiczno-patomorfologicznego za wieloletnią współpracę. Chcielibyśmy również podziękować Marcusowi Müllerowi, kierownikowi produkcji w Centrum Informatyki i Mediów Uniwersytetu w Rostocku, za dostarczenie sprzętu do nagrywania dźwięku i dopracowanie jakości dźwięku.
FINANSOWANIE: Niemiecka Fundacja Pomocy Rakowi (DKH e.V.), grant numer 108446, oraz grant numer TBI-V-1-241-VBW-084 z kraju związkowego Meklemburgia-Pomorze Przednie częściowo sfinansowały te badania.

<ol><li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Mouradov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+cell+lines+are+representative+models+of+the+main+molecular+subtypes+of+primary+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer.</a> Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).</li>
<li>Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bacterial-immunotherapy+with+therapeutic+antibodies%3A+a+novel+therapeutic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept.</a> Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).</li>
<li>DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+approval+success+rates+for+investigational+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+pharmacology+and+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Clinical approval success rates for investigational cancer drugs.</a> Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>Mullins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Biobanking+and+Tumor+Model+Establishment+of+Human+Colorectal+Carcinoma+Provides+Excellent+Tools+for+Preclinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research.</a> Cancers. 11 (10), (2019).</li>
<li>Kuehn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+HROC69+-+a+Crohn%27s+related+colonic+carcinoma+cell+line+and+its+matched+patient-derived+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft.</a> Scientific reports. 6, 24671(2016).</li>
<li>Dangles-Marie, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+colon+cancer+cell+lines+from+fresh+tumors+versus+xenografts%3A+comparison+of+success+rate+and+cell+line+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features.</a> Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).</li>
<li>Gock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Take+Rate+Optimization+for+Colorectal+Carcinoma+Patient-Derived+Xenograft+Models%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+research+international%22%5BJournal%5D)">Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models.</a> BioMed research international. 2016, 11715053(2016).</li>
<li>Collins, A. T., Lang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+the+validity+of+patient+derived+xenograft+%28PDX%29+models%3A+the+implications+for+translational+research+and+personalised+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine.</a> PeerJ. 6, 5981(2018).</li>
<li>Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+of+colorectal+cancer+in+pre-clinical+research%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review.</a> Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extent+of+inflammatory+infiltration+in+primary+cancer+tissues+is+associated+with+lymphomagenesis+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li>
<li>Moyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+murine+tumors+in+the+development+of+patient-derived+xenografts%3A+a+potential+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall.</a> Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).</li>
<li>Prall, F., Maletzki, C., Hühns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+carcinoma+tumour+budding+and+podia+formation+in+the+xenograft+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment.</a> PloS one. 12 (10), 0186271(2017).</li>
<li>Guenot, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+tumour+genetic+alterations+and+intra-tumoral+heterogeneity+are+maintained+in+xenografts+of+human+colon+cancers+showing+chromosome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability.</a> The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).</li>
<li>Mattie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+patient-derived+human+pancreatic+tumor+xenograft+models+for+preclinical+and+translational+development+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics.</a> Neoplasia. 15 (10), New York, N.Y. 1138-1150 (2013).</li>
<li>Cho, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+patient-derived+xenografted+tumors+maintain+characteristic+features+of+the+original+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+surgical+research%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors.</a> The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).</li>
<li>Maletzki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+and+Drug+Response+of+Freshly+Established+Patient-Derived+Tumor+Models+with+CpG+Island+Methylator+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype.</a> PloS one. 10 (11), 0143194(2015).</li>
<li>Katsiampoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+Patient-Derived+Xenografts+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer.</a> Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).</li>
<li>Wege, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+tumor+mice--a+new+model+to+study+and+manipulate+the+immune+response+in+advanced+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy.</a> International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).</li>
<li>Herndler-Brandstetter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mouse+model+supports+development%2C+function%2C+and+tissue+residency+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).</li>
<li>Capasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immune+responses+to+anti-PD-1+mono+and+combination+immunotherapy+in+hematopoietic+humanized+mice+implanted+with+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+immunotherapy+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts.</a> Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37(2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Abe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+phosphoproteomic+analysis+for+phosphosignaling+and+active-kinome+profiling+in+Matrigel-embedded+spheroids+and+patient-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids.</a> Scientific reports. 8 (1), 11401(2018).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
</ol>

Stworzenie żywego biobanku zakłada, oprócz przestrzegania przepisów prawnych dotyczących prywatności, prawa medycznego i dobrostanu zwierząt, dobrą infrastrukturę i zgrany zespół. Korzystne okazało się bezpośrednie zaangażowanie części personelu chirurgicznego w procedury badawcze, ponieważ może on bardzo dobrze ocenić przydatność danego pacjenta do przeszczepienia tkanki. Co więcej, pacjenci mają tendencję do częstszego wyrażania zgody na biobankowanie, gdy ich pisemna zgoda zostanie uzyskana w trakcie dyskusji na temat świadomej zgody chirurgicznej. Aby zaoszczędzić czas i zasoby, przypadki, które przypuszczalnie dostarczą niewystarczającej ilości tkanki nowotworowej, nie powinny być wybierane do biobankowania. Jeśli chodzi o pozyskiwanie próbek, maksyma "komunikacja jest kluczowa" jest prostą, ale często pomijaną prawdą. Wystarczy jedna niedoinformowana pielęgniarka lub kolega chirurg, aby zniszczyć próbkę już na samym początku, postępując jak zwykle i dodając formaldehyd do próbki do resekcji. W związku z tym niezwykle ważne jest, aby każdy członek zaangażowanego personelu zapoznał się ze standardowymi procedurami operacyjnymi dotyczącymi biobankowania. Chirurdzy powinni zostać powiadomieni dzień przed zabiegiem i zaraz po jego rozpoczęciu o planowanym pobraniu tkanek. Ponadto przypadki wybrane do biobankowania powinny być wyróżnione w elektronicznym planie sali operacyjnej. Pobranie tkanki z próbki chirurgicznej powinno być wykonane przez patologa. Po pierwsze, zapewni to, że pobieranie tkanek nie będzie kolidować z końcowym raportem patologicznym. Po drugie, zwiększa to prawdopodobieństwo otrzymania tkanki z odpowiednią ilością żywej tkanki nowotworowej. Szczególnie w rakach trzustki z wyraźną reakcją desmoplastyczną i częstymi obszarami martwiczymi, żywotne części są trudne do zidentyfikowania makroskopowo dla niewprawnego oka. W drodze wyjątku od tej reguły, bloki tkanek z dużych przerzutów do wątroby lub płuc mogą być czasami wycinane przez chirurga "na tylnym stole", jeśli marginesy chirurgiczne można określić makroskopowo. Rak odbytnicy wycięty przez całkowite wycięcie mezorektalne (TME) może nie nadawać się do biobankowania, ponieważ pobranie tkanki z wyciętej próbki przed zatopieniem parafiny może zakłócić ocenę jakości TME. Alternatywnie, tkankę do biobankowania można pozyskać przez przezodbytniczą biopsję raka odbytnicy.
Wskaźniki zakładania pierwotnych kultur komórkowych pochodzących z pierwotnego guza są na ogół niskie. Wtórne hodowle komórkowe pochodzące z PDX mogą być z większym prawdopodobieństwem pomyślnie założone. Zalecamy testowanie różnych pożywek dla każdego przypadku i stosowanie suplementów antybiotykowych przy pierwszych pasażach, aby zmniejszyć zanieczyszczenie do minimum, ponieważ pobrana tkanka rzadko jest sterylna. Po udanej namnażaniu każda pojedyncza linia komórkowa powinna zostać potwierdzona jako linia komórek nowotworowych za pomocą analizy FACS i regularnie badana pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą. Aby wykluczyć zanieczyszczenie krzyżowe, zaleca się regularną analizę STR. Należy zauważyć, że protokół zakładania dla pierwotnych i drugorzędowych linii komórkowych jest stale poddawany optymalizacji. Szczegółowe informacje na temat składu i wskaźników sukcesu poszczególnych mediów wyraźnie wykraczają poza zakres niniejszej pracy i zostaną opublikowane oddzielnie.
W przypadku wszczepienia PDX tkanka nowotworowa może być wszczepiona bezpośrednio po resekcji lub kriokonserwowana w płodowej surowicy cielęcej z 10% DMSO lub podobnym środkiem do zamrażania w celu opóźnionej implantacji. Implantacja bezpośrednio po pobraniu tkanki nowotworowej stanowi obciążenie dla personelu logistycznego i laboratoryjnego, a wyniki ksenoprzeszczepu po kriokonserwacji wcale nie są gorsze 10. Co więcej, inkubacja tkanki w Matrigel przed implantacją guza znacznie zwiększa wskaźniki wszczepienia12. Zalecamy opóźnione wszczepienie po stwierdzeniu jednoznacznego badania patologicznego i natychmiastowe usunięcie błędnie pobranych próbek tkanek. Ponieważ wskaźnik powodzenia pierwotnego wszczepienia wzrasta wraz z niedoborem odporności myszy biorcy, zwykle używamy myszy NSG do pierwszego przejścia PDX. Po pierwszym udanym wszczepieniu PDX, myszy NMRInu/nu mogą i powinny być wykorzystywane do kolejnych pasaży i ekspansji tkanek. Szczep ten jest bardziej wytrzymały, tańszy i łatwiejszy w hodowli w porównaniu z NSG lub podobnymi szczepami z niedoborem odporności, ale nadal wykazuje rozsądne wskaźniki wszczepienia. Co więcej, jego nagość ułatwia implantację i monitorowanie wzrostu guza. Aby zwiększyć szybkość wszczepiania w kolejnych pasażach, zalecamy bezpośredni transfer świeżo pobranych tkanek PDX do myszy gospodarza, gdy tylko jest to możliwe, szczególnie w przypadku wolno rosnących PDX i przypadków o niskim wskaźniku powodzenia pierwotnego wszczepienia. Collins i Lang niedawno dokonali przeglądu 14 badań dotyczących tworzenia PDX jelita grubego i odnotowali wskaźniki wszczepienia wahające się od 14 do 100%, przy medianie wskaźnika tworzenia PDX wynoszącej 68%, przy czym ta ostatnia jest zgodna z naszymi ustaleniami13. Zgodnie z piśmiennictwem zaobserwowaliśmy niższe wskaźniki rozwoju raka trzustki w porównaniu z rakiem jelita grubego PDX14. Niezależnie od szczepu myszy gospodarza i jednostki nowotworowej, wyrostek ludzkich chłoniaków z komórek B związanych z wirusem Epsteina-Barr (EBV) i chłoniaków mysich po stronie implantacji stanowi ważną pułapkę15,16. Jeśli nie zostaną rozpoznane, takie guzy mogą "zanieczyścić" kolejne pasaże, a tym samym zakłócić kolejne wyniki. Niezwykły szybki wzrost PDX i obrzęk węzłów chłonnych szyjnych, pachowych i pachwinowych są silnymi wskaźnikami wzrostu chłoniaka mysiego, ale mimo to wskazane jest regularne badanie histologiczne PDX. Ponadto zgodność genetyczna między PDX a odpowiadającym mu pacjentem-dawcą powinna być regularnie badana za pomocą analizy STR. Idealnie byłoby, gdyby biobank był połączony z kliniczną bazą danych zawierającą charakterystykę pacjenta (informacje ogólne, przeżycie, przeżycie wolne od nawrotu, terapia, nowotwór wtórny itp.). Ze względu na regulacje prawne dotyczące ochrony prywatności oraz brak takiej anonimowej bazy danych, nasz zbiór danych klinicznych jest regularnie administrowany i aktualizowany ręcznie przez współpracujących lekarzy.
Podczas gdy konwencjonalne biobanki ograniczają się do badań obserwacyjnych, żywy biobank daje możliwość interwencji in vitro i in vivo. Linie komórkowe pochodzące od pacjentów są ważnym narzędziem w badaniach podstawowych, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i ocenie nowych środków farmaceutycznych4. Odpowiednie modele PDX mają jednak coraz większe znaczenie, ponieważ ściśle podsumowują histologię pierwotnego guza 17,18 i wykazują wysoką stabilność genetyczną przez kilka pasaży19,20. Nasz biobank PDX sprawdził się jako doskonała platforma do badań przedklinicznych i podstawowych 6,21. Ponadto, ponieważ duże zbiory PDX odpowiednio odzwierciedlają międzyosobniczą heterogeniczność populacji pacjentów, podejście oparte na badaniu klinicznym PDX (PCT) (jedno zwierzę na model na leczenie) zyskało na znaczeniu dla opracowywania leków, ponieważ umożliwia wierne przewidywanie odpowiedzi klinicznej na nowe leki i schemat skojarzony8. Obecnie oceniamy również nowe eksperymentalne leki w małych badaniach klinicznych PCT.
Pomimo tych obiecujących wyników, mediana czasu trwania leczenia wynosząca 12,2 miesiąca utrudnia kliniczne zastosowanie modeli PDX jako "myszy awatarów" do testowania opcji leczenia przeciwnowotworowego, przynajmniej dla tych pacjentów, którzy wymagają natychmiastowego leczenia uzupełniającego lub nawet neoadjuwantowego22. Dodatkową wadą standardowych modeli PDX jest brak przydatności do testowania immunoterapii ze względu na niedobór odporności u myszy gospodarzy. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano kilka "humanizowanych" szczepów myszy. Myszy te mają silnie obniżoną odporność, ale można je odtworzyć za pomocą różnych typów ludzkich komórek pochodzących ze szpiku kostnego lub hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 + po wyrosciu PDX23, co pozwala na ocenę cytotoksyczności za pośrednictwem limfocytów i odpowiedzi na leczenie inhibitorem immunologicznego punktu kontrolnego24,25.
W ostatnich latach organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) stały się ważnymi modelami nowotworów konkurującymi z PDX. Te trójwymiarowe struktury, pochodzące z nienaruszonych fragmentów guza i hodowane w rusztowaniu macierzy zewnątrzkomórkowej, ściśle odzwierciedlają histologiczne i genetyczne właściwości oryginalnego guza. Możliwość długoterminowej rozbudowy i kriokonserwacji sprawia, że ChNP jest idealnym uzupełnieniem żywego biobanku 26,27. Oprócz stosunkowo wysokiego wskaźnika zakładania, odnotowano wiarygodne przewidywanie odpowiedzi na lek dla PDO kilku jednostek nowotworowych28. Co więcej, PDO zostały nawet wygenerowane z krążących komórek nowotworowych, a także możliwe jest jednoczesne tworzenie organoidów z odpowiednich zdrowych tkanek, co pozwala na ocenę toksyczności związanej z terapią na podstawie indywidualnej oceny pacjenta29,30. Jednak w porównaniu z konwencjonalnymi hodowlami komórkowymi 2D, hodowla organoidów jest czasochłonna i zasobochłonna, a sztuczne związki macierzy zewnątrzkomórkowej mogą zakłócać niektóre procedury analityczne31. Co więcej, organoidy nowotworowe są podatne na przerost przez szybciej rosnące, niezłośliwe organoidy pochodzące ze zdrowego nabłonka30. Ze względu na brak zrębu, naczyń krwionośnych i komórek odpornościowych, PDO są w większości nieprzydatne do testowania antyangiogennych leków immunoterapeutycznych. Jednak nowe metody hodowli pozwalają na modelowanie mikrośrodowiska guza in vitro, co sprawia, że PDO są prawdziwym pretendentem do modeli PDX32. Miejmy nadzieję, że w niedalekiej przyszłości indywidualne modele nowotworów u poszczególnych pacjentów, w połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi, takimi jak sekwencjonowanie nowej generacji, utorują drogę do prawdziwej medycyny precyzyjnej i dostosowanych do potrzeb metod leczenia.

W ostatnich latach zgromadzona wiedza na temat właściwości morfologicznych, klinicznych i genetycznych nowotworów doprowadziła do postrzegania raka jako choroby heterogenicznej i zindywidualizowanej. W konsekwencji charakterystyka mutacyjna zmian nowotworowych, obok cech klinicznych i patologicznych, zyskała na znaczeniu w procesie podejmowania decyzji klinicznych, a dla wielu alteracji molekularnych opracowano liczne terapie celowane. Na przykład skuteczność cetuksymabu w leczeniu raka jelita grubego można przewidzieć na podstawie analizy statusu mutacyjnego genów KRAS i PIK3CA1. Medycyna precyzyjna dąży do zastosowania indywidualnego podejścia, aby zapewnić najwyższą odpowiedź na leczenie u każdego pacjenta i uniknąć toksyczności nieskutecznych terapii2. Biobanki zawierają tkanki, krew i inne materiały biologiczne pacjentów onkologicznych, które są powiązane z danymi klinicznymi, stanowiąc tym samym doskonałe narzędzie w translacyjnych badaniach nad rakiem. Ze względu na dużą liczbę próbek klinicznych, biobanki umożliwiają wykrycie rzadkich, ale potencjalnie podatnych na działanie leków mutacji, co stwarza nowe możliwości terapeutyczne dla poszczególnych pacjentów3.
Aby objąć jak najszerszy zakres badań onkologicznych, nie ograniczyliśmy naszej działalności jedynie do pobierania próbek, lecz skupiliśmy się na tworzeniu linii komórkowych nowotworowych oraz ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Tradycyjne linie komórkowe 2D pozostają kamieniem węgielnym badań in vitro i są głównym wyborem w przypadku wielkoskalowych badań przesiewowych leków4,5. Ponadto analiza linii komórkowych jest często łatwiejsza, tańsza i bardziej dostępna. Dodatkowo, dzięki dostępności limfocytów krwi obwodowej (PBL) pochodzących od pacjentów, in vitro można badać również immunologię nowotworów6. Jednak większość nowo opracowanych leków o obiecującej skuteczności przedklinicznej w eksperymentach in vitro na komórkach lub in vivo wykazała rozczarowujące wyniki w badaniach klinicznych7. W przeciwieństwie do nich, badania przedkliniczne oparte na modelach PDX in vivo znacznie wierniej odzwierciedlały aktywność kliniczną środków przeciwnowotworowych8. Ponieważ tkanka PDX ściśle odzwierciedla właściwości histologiczne i molekularne guza dawcy, modele PDX są dobrym sposobem na namnażanie często bardzo ograniczonych ilości żywej tkanki nowotworowej w celu zachowania integralności biobanku oraz umożliwienia wymiany próbek między grupami badawczymi i instytucjami. Co więcej, linie komórkowe nowotworowe pochodzące z tkanki PDX można ustanowić znacznie łatwiej niż pierwotne linie komórkowe nowotworów9. W ostatnich latach nasza grupa badawcza stworzyła kompleksowy, zintegrowany biobank raka jelita grubego i trzustki poprzez stopniową standaryzację i optymalizację przepływu pracy dla wszystkich omawianych próbek biologicznych (Ryc. 1).
<img alt="Schemat przetwarzania próbek tkanek; chirurgia, patologia, wirowanie, hodowla komórkowa, biobank, badanie na zwierzętach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przepływ pracy i organizacja biobanku <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Bacillol&reg; AF; 1L</td><td>Bode, Hartmann</td><td>REF 973380</td><td></td></tr><tr><td>probówka wirówkowa PP do dezynfekcji, 15ml; sterylna</td><td>Greiner Bio One</td><td>GBO Cat. Nr:188271</td><td>probówka wirówkowa</td></tr><tr><td>PP, 50 ml, sterylna</td><td>Sarstedt</td><td>Numer zamówienia: 62.547.254</td><td>probówka wirówkowa</td></tr><tr><td>BD DiscarditTM II Strzykawka 20ml</td><td>BD</td><td>REF 300296</td><td>pobieranie krwi</td></tr><tr><td>Surowica 7,5ml Sarstedt Monovette</td><td>Sarstedt</td><td>Numer artykułu: 01.1601</td><td>Pobieranie krwi</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10ml</td><td>Sarstedt</td><td>REF 86.1254.001</td><td>transfer cieczy</td></tr><tr><td>Pipetboy ratiolab&reg; accupetta</td><td>Ratiolab</td><td>Numer artykułu: RL3200300</td><td>transfer cieczy</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>VWR Cat.No: 613-4438</td> transfer <td>cieczy</td></tr><tr><td>DPBS; bez Ca & Mg</td><td>Pan Biotech</td><td>Kot. Nr: P04-36500</td><td>mycie</td></tr><tr><td>Pancoll człowiek</td><td>Pan Biotech</td><td>Cat. Nr art.: P04-60500</td><td>wirowanie w gradionym gradimencie gęstości</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł Średni)</td><td>PAN Biotech</td><td>Kat. Nr kat.: P04-41500</td><td>hodowla komórek</td></tr><tr><td>FBS Good Forte (filtrowane serum bydlęce)</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. Nr kat.: P40-47500</td><td>hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. Nr kat.: P04-80100</td><td>hodowla komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna / EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>Kot. Nr: P10-023100</td><td>hodowla komórek</td></tr><tr><td>DMSO (dimetylosulfotlenek do hodowli komórkowych)</td> <td>PanReac AppliChem</td><td>VWR Cat.No: A3672.0250</td> zamrażarka <td>do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>(FCS z 10% DMSO)</td> kriotuba do <td>zamrażania</td>komórek <td>własnej roboty</td><td>---</td></tr> - <tr><td>CryoPure 2ml</td><td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>zamrażanie komórek</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórek; sterylna; z pokrywką</td><td>Greiner bio-one</td><td>Nr kat.: 657 160</td><td>hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>szalka Petriego 92 x 16 mm, PS, bez krzywek</td><td>Sarstedt</td><td>Kat. Nr: 82.1472.001</td><td>Przygotowanie tkanek</td></tr><tr><td>sterylne ostrza chirurgiczne</td><td>B.Braun (Aesculap)</td><td>REF BB510</td><td>preparatyka tkanek</td></tr><tr><td>BD DiscarditTM II Strzykawka 10ml</td><td>BD</td><td>REF 309110</td> sitko <td>do przygotowywania tkanek do komórek</td></tr><tr><td>; żółty; 100&mikro; m</td><td>Falcon</td><td>REF 352360</td><td>preparat tkankowy</td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>biocision</td><td>Numer artykułu: 210004</td><td>pojemnik chłodzący z -1&deg; C/min</td></tr><tr><td>Dewar&nbsp; statek transportowy typ 27 B, 2 l, 138 mm</td><td>KGW</td><td>Kat. Nr: System transportowy HT39.1</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet 200&micro; l</td><td>Sarstedt</td><td>REF 70.760.002</td><td>transfer cieczy</td></tr><tr><td>Końcówka filtra 1000&micro; l</td><td>Sarstedt</td><td>REF 70.762.411</td> pipeta <td>do przenoszenia cieczy</td></tr><tr><td>200&micro; l, żółty</td><td>Eppendorf</td><td>Cat. Nr: 3121 000.082</td> pipeta <td>do przenoszenia cieczy</td></tr><tr><td>1000&micro; l, niebieski</td><td>Eppendorf</td><td>Cat. Nr artykułu: 3121 000.120</td> inkubator <td>do przenoszenia cieczy</td></tr><tr><td>&nbsp; BB 6220 CU</td><td>Heraeus</td><td>Nr kat.: płyta</td> grzewcza do <td>hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>51012839 PR&Auml; ZITHERM</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>---</td><td>Mikroskop grzewczy</td></tr><tr><td>Zeiss Primo Vert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>Numer seryjny. 3842000839</td><td>obrazowanie kultur komórkowych</td></tr><tr><td>Sterylna ławka Bezpieczny przepływ 1.8 nunc</td><td>nunc GmbH & Co. KG</td><td></td>---<td>sterylna</td></tr><tr><td>zamrażarka stołowa -80&deg; C</td><td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td><td>---</td><td>przechowywanie próbek</td></tr><tr><td>Waga elektroniczna MP-300</td><td>Chyo</td><td>---</td><td>Scale</td></tr><tr><td>BD Micro-fine, U100 strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>REF 324826</td><td>znieczulenie iniekcyjne</td></tr><tr><td>Rompun 2%; 25ml</td> Numer zgody <td>Bayer</td><td>: 6293841.00.00</td><td>znieczulenie</td></tr><tr><td>Ketamin 100 mg/ml, 25ml</td><td>Numer zatwierdzenia CP-Pharma GmbH</td><td>: 401650.00.00</td><td>anestezjologia</td></tr><tr><td>GES3S Czytnik</td><td>danych</td><td>niedostępny</td><td>Czytnik RFID</td></tr><tr><td>ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)</td><td>Peddymark---</td><td></td><td>Chip RFID</td></tr><tr><td>Cotrim-ratiopharm&reg; &nbsp; Ampullen SF 480&nbsp; mg/5&nbsp; ml</td><td>Ratiopharm</td><td>PZN-03928197</td><td>antybiotykowa woda pitna</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza #FM-20 42x28cm</td><td>Smok</td><td>---</td><td>heating</td></tr><tr><td>Lampa grzewcza</td><td>Elektryczna Petra, Burgau</td><td>---</td><td>heating</td></tr><tr><td>Maść na oczy i nos (5% dekspantenolu) Bepanthen</td><td>Bayer</td><td>PZN-01578675</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta anatomiczna</td> do ochrony oczu <td>B.Braun Aesculap</td><td>BD21 LUB</td><td>Chirurgicznych</td></tr><tr><td>pęseta chirurgiczna</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BD50 1 R</td><td>narzędzia chirurgiczne</td></tr><tr><td>Nożyczki</td> do narzędzi chirurgicznych <td>B.Braun Aesculap</td><td>BC05 6R</td><td>igła do narzędzi chirurgicznych</td></tr><tr><td>&nbsp; uchwyt</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BH1 1 OR</td><td>narzędzia chirurgiczne</td></tr><tr><td>Prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>XN8870. P32</td><td>materiał do szwów chirurgicznych</td></tr><tr><td>Opsite przepuszczalny dla wilgoci i pary opatrunek w sprayu</td><td>Smith& Siostrzeniec</td><td>REF 66004978, PZN- 02063507</td><td>materiał do szwów chirurgicznych</td></tr><tr><td>Zasłona adhezyjna</td><td>Bariera</td><td>REF 904622</td><td>sterylna siatka tkankowa OP</td></tr><tr><td>Gazin&reg;; sterylna; 10x10 cm</td><td>Lohmann& Rauscher</td><td>REF 18506</td><td>sterylne aplikatory z</td></tr><tr><td>bawełnianą końcówką OP Raucotupf</td><td>Lohmann& Rauscher</td><td>REF 11969</td><td>aplikator</td></tr><tr><td>Corning&reg; Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>Nr kat.: 354234</td><td>Membrana podstawna Matrix</td></tr><tr><td>roztwór jodu Braunol (7,5g jodu powidonu)</td><td>B.Braun Melsungen AG</td><td>Numer artykułu: 18839</td><td>dezynfekcja</td></tr><tr><td>MACS&reg; Rozwiązanie do przechowywania tkanek</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>Nr zamówienia: 130-100-008</td><td>rozwiązanie do przechowywania</td></tr><tr><td>Formafix 4%</td><td>Grimm med. Logistik GmbH</td><td>Numer artykułu:</td><td>Rozwiązanie do mocowania</td>F10010G</tr><tr><td>Oprogramowanie FreezerworksBasic</td><td>Dataworks Development, Inc---</td><td></td><td>przykładowa organizacja</td></tr><tr><td>Drukarka Zebra TLP 2844</td><td>Drukarka Zebra</td><td>---</td><td>label</td></tr></tbody></table>

stworzenie i utrzymanie żywego biobanku - jak to robimy

Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

W świetle rosnącej wiedzy na temat międzyosobniczych właściwości i heterogeniczności nowotworów, rozwijająca się dziedzina medycyny spersonalizowanej wymaga platformy do badań przedklinicznych. W ostatnich latach stworzyliśmy biobank nowotworów jelita grubego i trzustki, w skład którego wchodzą pierwotna tkanka nowotworowa, tkanka normalna, surowice, izolowane limfocyty krwi obwodowej (PBL), ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjenta (PDX), a także pierwotne i wtórne linie komórkowe raka. Ponieważ pierwotna tkanka nowotworowa jest ograniczona, a tempo tworzenia się pierwotnych linii komórek nowotworowych jest nadal stosunkowo niskie, PDX pozwala nie tylko na zachowanie i rozbudowę biobanku, ale także na generowanie wtórnych linii komórek rakowych. Co więcej, udowodniono, że modele PDX są idealnym modelem in vivo do przedklinicznych testów leków. Biobankowanie wymaga jednak starannego przygotowania, ścisłych wytycznych i dobrze dostosowanej infrastruktury. Próbki kolektomii, duodenopankreatektomii lub wyciętych przerzutów są pobierane natychmiast po resekcji i przekazywane na oddział patologii. Z poszanowaniem pierwszeństwa bezstronnego raportu histopatologicznego, według uznania patologa prowadzącego, który przeprowadza sekcje, pobierane są małe kawałki guza i tkanki nienowotworowe. 
Martwicze części są odrzucane, a pozostała tkanka nowotworowa jest cięta na małe, identyczne kostki i kriokonserwowana do późniejszego wykorzystania. Dodatkowo niewielka część guza jest mielona i odcedzona w celu pierwotnej hodowli komórek rakowych. Dodatkowo próbki krwi pobrane od pacjenta przed i po operacji są przetwarzane w celu uzyskania surowicy i PBL. W przypadku wszczepienia PDX kriokonserwowane próbki są rozmrażane i wszczepiane podskórnie w boki myszy z niedoborem odporności. Uzyskany PDX dokładnie podsumowuje histologię guzów "dawcy" i może być wykorzystany do późniejszego ksenoprzeszczepu lub kriokonserwowany do późniejszego wykorzystania. W poniższej pracy opisujemy poszczególne etapy tworzenia, utrzymywania i administrowania dużym biobankiem raka jelita grubego i trzustki. Ponadto zwracamy uwagę na kluczowe szczegóły i zastrzeżenia związane z biobankowaniem.

W naszych badaniach wskaźnik ustanowienia pierwotnych kultur komórkowych (Rycina 2A &amp; B) wyniósł 12,9% w dużej serii9. Większość prób izolacji ekspandowalnych komórek nowotworowych ze świeżych preparatów resekcyjnych zakończyła się niepowodzeniem z powodu braku przyrostu lub wczesnej kontaminacji. Ustanowienie linii komórkowej uznano za udane po 3 pasażach przy stałym wzroście w standardowych warunkach hodowli (DMEM, 10% FCS, standardowe naczynie hodowlane) i walidacji różnicowania nabłonkowego za pomocą analizy FACS10. Linie komórkowe pochodzące z guzów PDX (Rycina 2C &amp; D) wykazały wyższy wskaźnik ustanowienia wynoszący 23,6%, co wynika również z możliwości podejmowania wielokrotnych prób, w przeciwieństwie do pierwotnych guzów resekcyjnych9. Jednakże niektóre kultury mieszane (Rycina 2E) nie mogą zostać oczyszczone z przyrostu fibroblastycznego lub zostają całkowicie utracone z powodu przerostu fibroblastów (Rycina 2F).
<img alt="Obrazy mikroskopowe hodowli komórkowych, stadia różnicowania komórek macierzystych, wyniki eksperymentu, skala: 100μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Hodowla komórkowa. Pierwotne linie komórek nowotworowych, pochodzące z przerzutu w przypadku raka jelita grubego HROC313, pasaż 21 (A) oraz raka trzustki HROP88, pasaż 5 (B). Linie komórek nowotworowych pochodzące z modeli PDX raka jelita grubego PDX HROC285 T0 M2 (D) oraz raka trzustki PDX HROP10 T5 M2, pasaż 4 (E). Mieszana hodowla fibroblastów i komórek nowotworowych z raka trzustki HROP75, pasaż 8 (C) oraz przerost fibroblastyczny (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Biorąc pod uwagę zmiany w protokole generowania PDX, wykorzystane szczepy myszy, a także różnych badaczy na przestrzeni kilku lat, jak również znaczne różnice w ilości tkanki nowotworowej dostępnej do przeszczepienia, określenie ogólnego wskaźnika sukcesu generowania PDX nie jest trywialne. W bardzo niedawnej serii eksperymentów z generowania PDX przeprowadzonych przez dwóch badaczy (S.M. i F.B.) zaobserwowano pierwotne wskaźniki wzrostu na poziomie 63% dla PDX jelita grubego (przykładową histologię przedstawiono na Ryc. 3A) i 48% dla PDX trzustki (Ryc. 3B). Wzrost chłoniaków mysich lub ludzkich w miejscu implantacji występuje stosunkowo rzadko, ale może przypominać udany wzrost PDX (Ryc. 3C). Poza badaniem histopatologicznym, zgodność między modelami PDX a pacjentami-dawcami była regularnie potwierdzana za pomocą analizy krótkich powtórzeń tandemowych (STR) (Ryc. 3D). Do chwili obecnej biobank obejmuje &gt;50 pierwotnych i &gt;50 wtórnych linii komórkowych raka jelita grubego, 3 pierwotne i 6 wtórnych linii komórkowych raka trzustki, a także &gt;150 modeli PDX jelita grubego i 19 modeli PDX trzustki.
<img alt="Obrazy histologiczne A-C próbek tkanek z barwieniem H&amp;E; D przedstawia elektroferogram analizy genetycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne porównanie histologiczne PDX jelita grubego (A) oraz trzustki (B). Chłoniak ludzki w miejscu implantacji naśladujący wzrost PDX (C). Test tożsamości genetycznej modelu PDX (HROC430 T1 M2) w stosunku do oryginalnej tkanki guza pacjenta (HROC430Tu) za pomocą analizy krótkich powtórzeń tandemowych (STR). Porównanie dziewięciu loci STR: vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (barwnik FAM) oraz D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (barwnik HEX) z wykorzystaniem wielokrotnej PCR z primerami znakowanymi fluorescencyjnie po elektroforezie kapilarnej potwierdziło zgodność genetyczną PDX i guza dawcy (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

W poniższej pracy opisujemy kolejne kroki niezbędne do stworzenia dużego biobanku raka jelita grubego i trzustki.

Stworzenie i utrzymanie żywego biobanku - jak to robimy

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

Tworzenie i utrzymywanie żywego biobanku, jak to robimy. Wprowadzenie. Tradycyjne biobanki zwykle zawierają niezdolne do życia próbki tkanek i krwi. Pomimo odpowiedniego odzwierciedlenia różnorodności populacji pacjentów z rakiem i umożliwienia analiz genetycznych i histologicznych, nie nadają się one do testów przedklinicznych oceniających strategie terapeutyczne.Biobank integrujący również modele pochodzące od pacjentów przezwycięża te ograniczenia. Umożliwia to testowanie funkcjonalne dla medycyny precyzyjnej. Pobieranie próbek.W przypadku biobankowania raka jelita grubego i trzustki należy wybrać przypadki z udowodnioną diagnozą, a także wystarczającą wielkością guza, obowiązkowe jest poinformowanie pacjenta. Przed rozpoczęciem operacji należy pobrać 20 ml krwi za pomocą strzykawki z heparyną i dodatkowe 7,5 ml z monowetem surowicy. Przetwarzanie surowicy i izolacja PBL.Po odwirowaniu w temperaturze 1,128 RCF przez 15 minut w temperaturze czterech stopni, surowicę umieszcza się we wstępnie znakowanej krioprobówce i bezpośrednio zanurza w ciekłym azocie. Heparynizowaną krew przenosi się do probówki polipropylenowej i rozcieńcza 15 ml PBS. Użyj pipety serologicznej, aby powoli pokryć mieszaninę 15 ml Pancollu.Po odwirowaniu w gradionym gradimencie gęstości, nieprzezroczysta warstwa zawierająca komórki jednojądrzaste jest pobierana za pomocą pipety serologicznej i przenoszona do nowej probówki PP. Po umyciu PBS i granulowaniu komórek jednojądrzastych przez odwirowanie, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce zamrażarki, a następnie dozować do wstępnie oznakowanych krioprobówek. Przenieś probówki do pojemnika chłodzącego odpowiedniego do powolnego zamrażania z prędkością jednego stopnia na minutę i przechowuj tymczasowo w temperaturze 80 stopni.Przetwarzanie tkanek. Jak tylko próbka tkanki zostanie wycięta przez chirurga, umieść ją w odpowiednim pojemniku. W żadnym wypadku nie należy zapominać, że tkanka jest pokryta formaliną.Jak najszybszy transport do patologii w celu wycięcia materiału nowotworowego nieistotnego dla patologicznej oceny marginesów resekcji. Z kawałkiem guza należy obchodzić się tak aseptycznie, jak to możliwe. Ponadto należy pobrać próbkę zdrowej tkanki i umieścić ją w oddzielnych probówkach wypełnionych roztworem do przechowywania tkanek na lodzie.Natychmiast wróć do laboratorium, aby rozpocząć przetwarzanie tkanek w sterylnych warunkach. Kawałek tkanki umieszcza się na sterylnym plastikowym naczyniu wypełnionym roztworem do przechowywania tkanek, aby uniknąć wysuszenia. Przede wszystkim należy wyciąć jeden lub więcej kawałków wielkości główki od szpilki w celu zaszybkiego zamrożenia w zależności od wielkości uzyskanej próbki tkanki.Umieść natywną tkankę we wstępnie oznakowanych krioprobówkach i natychmiast zanurz w ciekłym azocie. Pokrój pozostałą tkankę w kostkę trzy na trzy na trzy milimetry sześcienne. Należy wziąć pod uwagę, że tkanka martwicza musi zostać całkowicie wycięta, ale nie należy jej wyrzucać.Ułóż kostki w czwórkach, aby określić liczbę podwielokrotności do niezbędnego przechowywania. Oznacz odpowiednią liczbę krioprobówek i wstępnie napełnij je 1.5 ml pożywki do zamrażania każda. Ponieważ DMSO w pożywce zamrażarki jest cytotoksyczne, kolejne kroki należy wykonać szybko i bez przerwy.Użyj ostrzy skalpela, aby zebrać cztery kawałki chusteczki w probówce. Upewnij się, że wszystkie kawałki są całkowicie zanurzone w podłożu zamrażarki, najlepiej na dnie probówki i szybko zamroź probówki za pomocą pojemnika do zamrażania. Postępuj w ten sam sposób ze zdrowym okazem.W przypadku długotrwałego przechowywania należy przechowywać wszystkie porcje w zbiorniku z ciekłym azotem. Hodowla komórkowa. Zmiel resztki przetwarzania tkanki nowotworowej, w tym martwicze części, za pomocą ostrzy skalpela tak małych, jak to możliwe.Umieścić sitko do komórek na górze sterylnej probówki z PP i odessać zawiesinę pipetą serologiczną, aby przeszła przez sitko do komórek. Za pomocą tłoka jednorazowej strzykawki przecisnąć resztki tkanki przez sitko do komórek, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Spłucz PBS i powtarzaj te czynności, aż nie pozostanie żaden materiał.Wyjąć sitko do komórek i odwirować zawiesinę przy 180 RCF przez siedem minut. W międzyczasie przygotuj wstępnie pokrytą kolagenem sześciodołkową płytkę z różnymi składami pożywki, aby zwiększyć prawdopodobieństwo wyrostu guza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w PBS i dozować 500 mikrolitrów na studzienkę.Następnie umieść płytkę w standardowym inkubatorze. Wytwarzanie ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta. W celu wytworzenia ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów u myszy z obniżoną odpornością, zwierzęta powinny być trzymane w określonym środowisku wolnym od patogenów.Nosić środki ochrony osobistej składające się z fartuchów, fartucha, maski na twarz, osłony włosów i rękawiczek. Po zaaranżowaniu miejsca pracy weź pożądaną próbkę guza z pojemnika na ciekły azot. Napełnij świeżą probówkę PP 35 ml PBS, a następnie dokładnie umyj proces rozmrażania i przechyl probówkę kriogeniczną w górę iw dół.Gdy tylko zawartość stanie się błotnista, wlej do PBS i spłucz kawałki guza. Wyrzuć większość PBS i opróżnij kostki do pokrywki. Umieść sterylne plastikowe naczynie na opakowaniu z lodem i dodaj kroplę 100 mikrolitrów Matrigel.Użyj kleszczy, aby umieścić kawałki guza w Matrigel i inkubować guz przez 10 minut. W międzyczasie znieczulij dwie myszy. Sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając stopę zwierzęcia.Każdy ruch wskazuje na niewystarczające znieczulenie i wymaga odczekania lub dodatkowego dawkowania. Nałóż maść na oczy, uszczypnij mysz za szyję i wstrzyknij podskórnie mikroczip. Wykonaj następujące kroki równolegle.Zdezynfekuj boki myszy i wykonaj małe nacięcie skóry za pomocą pasiastych nożyczek Metzenbaum i uformuj kieszeń podskórną za pomocą przygotowania. Użyj anatomicznych kleszczy, aby wprowadzić kawałki guza. Upewnij się, że element jest umieszczony na tylnym końcu kieszeni na skórę.Zassać pozostały Matrigel i rozprowadzić równomiernie do wszystkich czterech kieszeni. Poczekaj na utwardzenie żelu i zamknij skórę szwami jednoguzikowymi, nie uszkadzając kawałków guza igłą. Przyciąć nić tak krótko, jak to możliwe nad węzłem i nałożyć opatrunek w sprayu, aby zapobiec zadzieraniu szwów.Zeskanuj mikroczip i dodaj informacje o guzie do bazy danych w celu późniejszej identyfikacji zwierzęcia. Przygotuj klatkę ze świeżą ściółką i materiałem do gniazdowania, umieść myszy przed lampą podczerwieni i monitoruj zwierzę, aż znieczulenie ustąpi. Eksplantacja PDX.Po tym, jak guz PDX osiągnie wymagany rozmiar, mysz jest uśpiona przez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Ostrożnie wypreparuj skórę z guza i całkowicie usuń PDX. Reprezentatywne wyniki.Umieść guz na sterylnym plastikowym naczyniu i użyj sterylnych ostrzy skalpela do dalszej obróbki. Wytnij otwór z plastrami, umieść je w kasecie histologicznej i zanurz w formalinie, aby wytworzyć próbkę zatopioną w parafinie do późniejszej oceny histologicznej. Przenieś resztę guza do roztworu do przechowywania tkanek i stwórz nową, żywotnie zakonserwowaną i zamrożoną próbkę do biobanku.Dodatkowo użyj pozostałości guza PDX analogicznie do hodowli komórek rozdziałowych, aby ustalić wtórne linie komórek nowotworowych. Aby wygenerować kolejne PDX, przenieś dwa lub więcej fragmentów guza za pomocą Matrigel do nowej myszy biorcy, jak pokazano wcześniej. Konkluzja. Za pomocą przedstawionego protokołu udało nam się do tej pory ustalić dziewięć linii komórkowych raka trzustki i ponad 100 linii komórek nowotworowych jelita grubego pochodzących od pacjentów, a także 19 modeli PDX trzustki i ponad 150 modeli jelita grubego.

creation-and-maintenance-of-a-living-biobank-how-we-do-it

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Guzy skórne są często usuwane po operacji mikrograficznej Mohsa. Opisano tutaj protokół, który umożliwia personelowi pomocniczemu klinicznemu skuteczne przetwarzanie i przechowywanie próbek guzów skóry (np. raka płaskonabłonkowego, raka podstawnokomórkowego i czerniaka) do dalszych zastosowań laboratoryjnych bez zakłócania operacji klinicznych.

Utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego

Pokazano praktyczne zastosowanie i wydajność metod generowania reprezentatywnych próbek tkanek modeli zwierzęcych świń dla szerokiego spektrum dalszych analiz w projektach biobanków, w tym wolumetrii, systematycznego losowego pobierania próbek i różnicowego przetwarzania próbek tkanek dla jakościowych i ilościowych analiz morfologicznych i molekularnych.

Strategie pobierania próbek i przetwarzanie próbek tkanek z biobanku z modeli biomedycznych świń

Ta metoda polega na wykorzystaniu klinicznych danych diagnostycznych dla pacjentów z rakiem prostaty w celu kierowania procedurami pobierania próbek podczas biobankowania tkanek po radykalnej prostatektomii. Pozwala to przezwyciężyć problemy z wcześniej opublikowanymi metodami dotyczącymi wydajności i dostępności świeżej tkanki dla szerszego zakresu dalszych zastosowań.

Wykorzystanie danych z obrazowania metodą rezonansu magnetycznego i biopsji do kierowania procedurami pobierania próbek do biobankowania raka prostaty

Ten protokół opisuje metodę śledzenia indywidualnych trajektorii starzenia się mózgu poprzez program dawstwa mózgu i właściwą charakterystykę mózgów. Dawcy mózgu biorą udział w długoterminowym badaniu podłużnym, w tym w seryjnych ocenach wielowymiarowych. Protokół zawiera szczegółowy opis przetwarzania przez mózg i dokładną metodologię diagnostyczną.

Protokół Abbiategrasso Brain Bank do gromadzenia, przetwarzania i charakteryzowania starzejących się mózgów

Biobanki są kluczowymi zasobami dla badań biomedycznych, a Biobank dla Jednostki Medycyny Translacyjnej i Cyfrowej w Europejskim Instytucie Onkologii jest wzorem w tej dziedzinie. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis standardowych procedur operacyjnych biobanków w zakresie zarządzania różnymi rodzajami próbek biologicznych pobranych od ludzi.

Biobank medycyny translacyjnej: Standardowe procedury operacyjne dla optymalnego zarządzania próbkami

Ten protokół opisuje metodę ułatwiającą pobieranie próbek z próbek po radykalnej prostatektomii. Celem jest zmapowanie, scharakteryzowanie i mikro-makro wypreparowanie próbek tkanek z próbek w oparciu o kryteria anatomopatologiczne przed przechowywaniem ich w biobanku.

Zwiększenie wiarygodności biobankowania guzów gruczołu krokowego dzięki ulepszonej technice pobierania próbek i charakterystyce histologicznej

Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę biorepozytorium do standaryzowanego zbierania, opisywania i biobankowania wysokiej jakości ludzkich biopsji cieczy wodnistej i płynu szklistego do dalszych analiz molekularnych, w tym proteomiki, metabolomiki i glikomiki.

Biobankowanie płynnych biopsji ludzkich roztworów wodnych i ciała szklistego do analiz molekularnych

Ten protokół oferuje systematyczne ramy do tworzenia organoidów raka jajnika z różnych stadiów choroby i rozwiązuje wyzwania związane ze zmiennością specyficzną dla pacjenta, aby zwiększyć wydajność i umożliwić solidną, długoterminową ekspansję dla kolejnych zastosowań. Zawiera szczegółowe kroki przetwarzania tkanek, wysiewu, dostosowywania wymagań dotyczących pożywek i barwienia immunofluorescencyjnego.

Strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół pobierania próbek raka piersi, zaprojektowany tak, aby zoptymalizować ich zastosowanie w biobankowaniu, medycynie spersonalizowanej i innych zastosowaniach badawczych. Szczegółowo opisano proces pobierania próbek, w tym biopsję piersi i mastektomii, koncentrując się na minimalizacji uszkodzeń tkanek i maksymalizacji jakości próbki.

Optymalizacja procedur biopsji piersi i pobierania próbek po mastektomii dla biobankowania, medycyny spersonalizowanej i zastosowań badawczych

Tutaj wyjaśniamy protokół modelowania mikrośrodowiska biofizycznego, w którym sieciowanie i zwiększona sztywność błony podstawnej (BM) indukowana przez zaawansowane produkty końcowe glikacji (AGE) ma patologiczne znaczenie.

Jak badać sztywność błony podstawnej jako biofizyczny wyzwalacz w raku prostaty i innych patologiach związanych z wiekiem lub chorobach metabolicznych

Poznaj metody tworzenia i utrzymania żywego biobanku dla raka jelita grubego i trzustki, obejmującego modele pochodzące od pacjentów, takie jak PDX i linie komórkowe. Protokół umożliwia funkcjonalne testowanie przedkliniczne dla medycyny precyzyjnej.

Stworzenie i utrzymanie żywego biobanku - jak to robimy

Przeglądaj więcej filmów