W jądrze Hi-C w komórkach Drosophila

Protokoły jądra Hi-C umożliwiają eksplorację potwierdzenia chromosomów w różnej rozdzielczości w celu scharakteryzowania pętli, domen i przedziałów organizujących genom chromatyny. Protokół ten zapewnia profilowanie interakcji genomowych w wysokiej rozdzielczości w różnych skalach, zapewniając bardziej spójne pokrycie w pełnym zakresie odległości genomowych i danych przy mniejszym szumie technicznym. Połączenie tego protokołu z edycją genetyczną jest potężną strategią testowania funkcji strukturalnych elementów genetycznych.

Można go również zastosować do charakterystyki zmian strukturalnych, które prowadzą do choroby. Protokół jądra Hi-C może być zastosowany do badania organizacji genomu dowolnego genomu eukariotycznego. Obróbka SDS i Triton powoduje dezagregację wszelkich zagęszczeń jądrowych poprzez pipetowanie, ponieważ agregaty zakłócają wydajność reakcji enzymatycznej i należy upewnić się, że przed sekwencjonowaniem przeprowadzono odpowiednie kontrole jakości.

Zacznij od dodania formaldehydu wolnego od metanolu do jednego razy 10 do siedmiu komórek Schneider's Line 2 Plus Drosophila w 17,5 mililitrach pożywki Schneidera uzupełnionej 10% FBS do końcowego stężenia 2% Inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem co 60 sekund lub na obracającym się kole i dodaj glicynę do końcowego stężenia 0,125 mola z mieszaniem. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej i 15 minutach na lodzie, zebrać komórki przez odwirowanie i ostrożnie ponownie zawiesić osad w 25 mililitrach zimnego PBS i zebrać komórki za pomocą kolejnego wirowania. Pod koniec wirowania ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze lodowatego buforu do lizy w celu zliczenia i dostosuj komórki do stężenia jeden razy 10 do sześciu komórek na mililitr.

Inkubować komórki na lodzie przez 30 minut, odwracając probówkę co dwie minuty, aby wymieszać i zebrać komórki za pomocą kolejnego odwirowania. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżego lodowatego buforu do lizy. Po odwirowaniu przemyć lizat jednym mililitrem buforu restrykcyjnego 1,25X.

Ponownie odwirować, aby zebrać lizat. Zawiesić osad w 360 mikrolitrach świeżego buforu restrykcyjnego i 11 mikrolitrach 10% SDS z ostrożnym pipetowaniem i inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od 7 do 950 obrotów na minutę z okazjonalnym pipetowaniem. Pod koniec inkubacji należy przerwać przenikanie za pomocą 75 mikrolitrów niejonowego środka powierzchniowo czynnego i umieścić probówkę z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 45 minut z wytrząsaniem z prędkością 950 obrotów na minutę z okazjonalnym pipetowaniem.

W celu wytrawienia chromatyny dodaj 200 jednostek Mbo1 do probówki na cztero- do 16-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z rotacją. Pod koniec inkubacji dezaktywuj enzym w 20-minutowej inkubacji w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Aby wypełnić zwisy fragmentów restrykcyjnych i oznaczyć końce DNA biotyną, dodaj po 1,5 mikrolitra z 10 milimolowych dCTP, dGTP, dTTP, 20 mikrolitrów 0,4 milimolowej biotyny dATP, 17,5 mikrolitrów buforu tris o niskiej zawartości EDTA i 10 mikrolitrów po pięć jednostek na mikrolitr polimerazy DNA po jednym dużym fragmencie do probówki z ostrożnym wymieszaniem.

Inkubować reakcję przez 75 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 700 obrotów na minutę co 10 sekund przez 30 sekund. Pod koniec inkubacji dodać mieszaninę ligacyjną do chromatyny i dostosować ją do jednego mililitra końcowej objętości reakcyjnej z dokładnym delikatnym wymieszaniem i inkubować przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza. Aby zdegradować białka próbki, dodaj 50 mikrolitrów 10 miligramów na mililitr proteinazy K do probówki na dwugodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji zwiększ temperaturę do 65 stopni Celsjusza przez noc, aby odwrócić sieciowanie próbki. Następnego ranka należy zdegradować RNA za pomocą 10 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr RNAzy A. Po godzinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodać jedną objętość chloroformu fenolowego do probówki i dokładnie wymieszać przez odwrócenie, aby uzyskać jednorodną fazę białą. Po wytrąceniu DNA zgodnie ze standardowymi protokołami, należy określić ilościowo DNA za pomocą barwnika fluorogenicznego, który wiąże się selektywnie z DNA i fluorometru zgodnie z instrukcjami producenta.

Aby oczyścić DNA z niestrawionych i strawionych podwielokrotności, załaduj 100 nanogramów niestrawionych, strawionych i podligowanych próbek na 1,5% żel agarozowy i poszukaj rozmazu wyśrodkowanego wokół 500 par zasad w strawionej próbce w porównaniu z pasmem o wysokiej masie cząsteczkowej dla ligowanej próbki. Aby zweryfikować znakowanie Hi-C i skuteczność ligacji poprzez amplifikację i trawienie znanej interakcji, po PCR należy roztrawić produkty za pomocą Mbo1, Cla1 lub obu tych elementów, a następnie umieścić próbki na nowym żelu o stężeniu od 1,5 do 2%, aby umożliwić oszacowanie względnej liczby połączeń ligacyjnych 3C i Hi-C. Po sonifikacji próbki w celu uzyskania od 200 do 500 fragmentów DNA par zasad, przenieś 130 mikrolitrów z pięcioma mikrogramami DNA z każdej próbki do nowych probówek wirówkowych zawierających 16 mikrolitrów 10-krotnego buforu ligacyjnego, dwa mikrolitry 10-milimolowego dATP, pięć mikrolitrów polimerazy DNA T4 i siedem mikrolitrów podwójnie destylowanej wody na 30-minutową inkubację w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji dodaj pięć mikrolitrów 10-milimolowych dNTP, cztery mikrolitry 10-krotnego buforu ligacyjnego, pięć mikrolitrów kinazy polinukleotydowej T4, jeden mikrolitr polimerazy DNA jeden duży fragment i 25 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody do probówek na drugą 30-minutową inkubację w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby wybrać fragmenty głównie w zakresie wielkości par zasad od 250 do 550, należy przeprowadzić sekwencyjny wybór wielkości odwracalnej i mobilizacyjnej w fazie stałej z 0,6X, a następnie 0,9X zgodnie z instrukcjami producenta i wymyć DNA za pomocą 100 mikrolitrów tris low EDTA. Aby pobrać biotynę dla każdej biblioteki, umyj 150 mikrolitrów kulek magnetycznych połączonych streptawidyną dwa razy za pomocą 400 mikrolitrów buforu 1X Tween i obracaj próbki przez trzy minuty na obracającym się kole.

Pod koniec inkubacji ponownie zawieś kulki w 300 mikrolitrach buforu 2X no Tween i wymieszaj z 300 mikrolitrami materiału Hi-C na 30-minutowy obrót na obracającym się kole. Pod koniec inkubacji umyj kulki 400 mikrolitrami buforu 0,5X Tween przez trzyminutową inkubację w temperaturze 55 stopni Celsjusza i 750 obrotów na minutę, a następnie dwa płukania w 200 mikrolitrach buforu restrykcyjnego 1X na pranie. Po drugim myciu ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach mieszanki ogonowej dATP na 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji ponownie zawiesić kulki w 50 mikrolitrach bufora do podwiązywania 1X i przenieść zawiesinę do nowej probówki zawierającej cztery mikrolitry wstępnie wyżarzonych sparowanych adapterów końcowych i dwa mikrolitry ligazy T4. Po dwóch godzinach w temperaturze pokojowej usuń supernatant i umyj kulki dwa razy 400 mikrolitrami buforu Tween , a następnie umyj kulki raz 200 mikrolitrami bez buforu Tween i jeden raz 100 mikrolitrami buforu restrykcyjnego przed ponownym zawiesieniem kulek w 40 mikrolitrach buforu restrykcyjnego 1X. Rozmaz od 200 do 1 000 par zasad obserwuje się, gdy ograniczenie za pomocą Mbo1 zakończy się sukcesem.

Jeśli ligacja się powiedzie, w górnej części żelu obserwuje się pasmo o dużej masie cząsteczkowej. Efektywność trawienia można również potwierdzić za pomocą ilościowego PCR. Akceptowalna wydajność trawienia wynosi 80% lub więcej.

Jak pokazano, amplifikację znanej interakcji średniego zasięgu w produktach ligacji Hi-C można oszacować przez trawienie produktu PCR odzyskanego w wyniku amplifikacji. Zaleca się wydajność trawienia powyżej 70%, aby uniknąć dużej ilości nieużytecznych odczytów dla bibliotek po sekwencjonowaniu. Liczba cykli PCR dla końcowej amplifikacji powinna być o jeden cykl mniejsza niż liczba cykli, dla których rozmaz jest widoczny

Poziom trawienia biblioteki wskazuje na obfitość prawidłowych par Hi-C i odzwierciedla proporcję użytecznych odczytów, które zostaną uzyskane z biblioteki. Korzystając z unikalnych prawidłowych par Hi-C, można przeprowadzić podstawową analizę rozkładu par. Jak zaobserwowano w tym reprezentatywnym przykładzie, locus genu NOTCH można zobaczyć wraz z białkami architektonicznymi, domenami pierwszym i drugim oraz modyfikacjami histonów wzdłuż locus.

Po usunięciu regionu zawierającego zarówno miejsca wiązania DNA CTCF, jak i M1BP, można zaobserwować dramatyczną zmianę w kontaktach chromatyny. Po eksperymencie Hi-C można wykonać a, aby dotrzeć do określonego zestawu kontaktów, na przykład z regionów promotora. Jest to szczególnie przydatne przy ocenie dużych genomów.

Jak wykazano, połączenie protokołu Hi-C z addycją genetyczną można wykorzystać do oceny funkcji strukturalnej i regulacyjnej elementów genomu.