Name: Sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę oceny skracania sarkomerów w kardiomiocytach pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych białek sarkomerowych. Technika ta umożliwia wizualizację funkcji sarkomerów in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium z Wydziału Medycyny Regeneracyjnej Uniwersytetu Medycznego Jichi za pomocną dyskusję i pomoc techniczną. Badanie to było wspierane przez granty Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (AMED; JP18bm0704012 i JP20bm0804018), Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS; JP19KK0219) oraz Japońskie Towarzystwo Obiegowe (grant na badania podstawowe) dla H.U.

<ol><li>Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Global+Burden+of+Cardiovascular+Diseases+and+Risk+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors.</a> Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).</li>
<li>Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyopathy%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Cardiomyopathy: an overview.</a> American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).</li>
<li>Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Cardiac+Disease+Mechanisms+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%3A+Progress%2C+Promises+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. , 30(2020).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li>
<li>Gramlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense-mediated+exon+skipping%3A+a+therapeutic+strategy+for+titin-based+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunctions+Contribute+to+Hypertrophic+Cardiomyopathy+in+Patient+iPSC-Derived+Cardiomyocytes+with+MT-RNR2+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).</li>
<li>Cho, G. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Transplantation+Confers+Maturation+of+PSC-Derived+Cardiomyocytes+Conducive+to+Modeling+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy.</a> Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li>
<li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li>
<li>Kopljar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+drug-induced+effects+on+contractile+motion+properties+and+cardiac+biomarkers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li>
<li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Gene+Tagging+of+Transcriptionally+Silent+Genes+in+hiPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).</li>
<li>Chanthra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Fluorescent+Reporter+System+Identifies+Laminin-511%2F521+as+Potent+Regulators+of+Cardiomyocyte+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4249(2020).</li>
<li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cardiomyocyte+show+of+force%3A+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li>
<li>Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Proliferation+of+Monolayer+Cultures+of+Embryonic+Stem+%28ES%29+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Following+Acute+Loss+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma.</a> PLoS ONE. 3 (12), 3896(2008).</li>
<li>Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41165(2017).</li>
<li>Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte-specific+gene+expression+following+systemic+injection+of+AAV%3A+in+vivo+gene+delivery+follows+a+Poisson+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.</a> Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1(2007).</li>
<li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914(2020).</li>
<li>Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnzai%2C+T+%22Methods+of+Molecular+Biology%22">Methods of Molecular Biology</a>. Yoshida, Y., et al. , (2020).</li>
<li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brief+Review+of+Current+Maturation+Methods+for+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact-GFP+alters+F-actin+organization%2C+cellular+morphology+and+biophysical+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3241(2019).</li>
<li>Sparrow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Myofilament-Localized+Calcium+Dynamics+in+Adult+Cardiomyocytes+and+the+Effect+of+Hypertrophic+Cardiomyopathy+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations.</a> Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).</li>
</ol>

H.U. złożył wniosek patentowy związany z tym rękopisem.

PSC-CM mają ogromny potencjał do wykorzystania jako platforma in vitro do modelowania chorób serca i testowania działania leków. Niemniej jednak najpierw należy opracować dokładną, ujednoliconą metodę oceny funkcji PSC-CMs. Większość testów funkcjonalnych dotyczy PSC-CM, np. elektrofizjologia, przemijające wapń i metabolizm26, a jedno z pierwszych badań PSC-CM pochodzących od pacjentów dotyczyło zespołu wydłużonego odstępu QT27. Jednak kurczliwość, jedna z najważni...

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na całym świecie1, a kardiomiopatia stanowi trzecią przyczynę zgonów związanych z sercem2. Kardiomiopatia to zbiorowa grupa chorób, które wpływają na mięsień sercowy. Ostatnie odkrycia w zakresie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) i ukierunkowanego różnicowania komórek iPS w kierunku kardiomiocytów (PSC-CM) otworzyły drzwi do badania kardiomiocytów z genomem pacjenta jako modelu kardiomiopatii in vitro. Komórki te mogą być wykorzystane do zrozumienia patofizjologii chorób serca, wyjaśnienia ich mechanizmów molekularnych oraz do testowania różnych kandydatów terapeutycznych3. Zainteresowanie jest ogromne, dlatego wygenerowano komórki iPS pochodzące od pacjentów (np. kardiomiopatia przerostowa [HCM]4,5, arytmogenna kardiomiopatia prawej komory [ARVC]6, kardiomiopatia rozstrzeniowa [DCM]7, oraz kardiomiopatie związane z mitochondriami8,9). Ponieważ jedną z cech kardiomiopatii jest dysfunkcja i zaburzenie sarkomerów, potrzebne jest ważne narzędzie, które jednolicie mierzy funkcję sarkomerów.
Skracanie sarkomeru jest najczęściej używaną techniką do oceny funkcji sarkomeru i kurczliwości dorosłych kardiomiocytów pochodzących z modeli zwierzęcych i ludzkich. Do wykonania skrócenia sarkomerów potrzebne są dobrze rozwinięte sarkomery, które są widoczne w kontraście fazowym. Jednak PSC-CM hodowane in vitro wykazują słabo rozwinięte i zdezorganizowane sarkomery, a zatem nie mogą być używane do prawidłowego pomiaru skracania sarkomerów10. Ta trudność w prawidłowej ocenie kurczliwości PSC-CM utrudnia ich wykorzystanie jako platformy do oceny funkcji serca in vitro. Aby pośrednio ocenić kurczliwość PSC-CMs, wykorzystano mikroskopię sił atomowych, matryce mikrosłupków, mikroskopię sił trakcyjnych i pomiary impedancji w celu zmierzenia wpływu ruchu wywieranego przez te komórki na ich otoczenie11,12,13. Bardziej wyrafinowane i mniej inwazyjne zapisy z wideomikroskopii rzeczywistego ruchu komórkowego (np. SI8000 firmy SONY) mogą być alternatywnie wykorzystane do oceny ich kurczliwości, jednak ta metoda nie mierzy bezpośrednio ruchu sarkomeru ani kinetyki generowania siły14.
Aby bezpośrednio mierzyć ruch sarkomeru w PSC-CMs, pojawiają się nowe podejścia, takie jak fluorescencyjne znakowanie białka sarkomerowego. Na przykład Lifeact jest używany do oznaczania aktyny nitkowatej (F-aktyny) do pomiaru ruchu sarkomeru15,16. Genetycznie zmodyfikowane komórki iPS są inną opcją znakowania białek sarkomerowych (np. α-aktyniny [ACTN2] i miomezyny-2 [MYOM2]) za pomocą białka fluorescencyjnego17,18,19.
W tym artykule opisujemy, jak wykonać obrazowanie poklatkowe do pomiaru skrócenia sarkomeru za pomocą Myom2-TagRFP (mysie embrionalne komórki macierzyste [ES]) i ACTN2-mCherry (ludzkie komórki iPS). Pokazujemy również, że wzorzysta kultura ułatwia wyrównanie sarkomerów. Ponadto opisujemy alternatywną metodę znakowania sarkomerem, przy użyciu wirusów związanych z adenowirusami (AAV), które mogą być szeroko stosowane do komórek iPS pochodzących od pacjenta.

<table><tbody><tr><td>1-Tioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145-25</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (55mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>polimer 2-metakryloyloksyetylofosforylcholiny (MPC),</td> <td>NOF Corp.</td><td>LIPIDURE-CM5206</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fujifilm wako</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>35-milimetrowa miska obrazowa z polimerowym szkiełkiem nakrywkowym (&micro;-Dish 35 mm, wysoka)</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>AAVproR Helper Free System (AAV6) (wektory; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)</td><td>Takara</td><td>6651</td><td></td></tr><tr><td>ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSC</td><td>N.A.</td><td></td><td>Umieściliśmy kasetę oporną na IRES-puromycynę do 3' UTR locus TNNT2 i mCherry wokół kodonu stop ACTN2 w linii hiPSC 610B1, postępując zgodnie z metodą opisaną gdzie indziej (Anzai, Methods Mol Biol, w druku)</td></tr> <tr><td>Suplement B-27 (50X), bez surowicy</td><td>Suplement Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B-27, bez insuliny</td><td>Suplement Thermo Fisher Scientific</td><td>A18956-01</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50X), bez witaminy A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaza (25 U/&mikro; L)</td> <td>Merck Millipore</td><td>70746</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek blasticidyny S</td><td>Fujifilm wako</td><td>029-18701</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4, ludzki, rekombinowany,</td> <td>R& D Systems, Inc.</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-100g</td><td></td></tr><tr><td>C59, Wnt Antagonist (WntC59)</td> <td>abcam</td><td>ab142216</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do rysowania CAD,</td> <td>Robert McNeel and Associates, WA, USA</td> Ultrafiltracja odśrodkowa <td>Rhinoceros 6.0</td><td></td></tr><tr><td>(100k MWCO), Vivaspin-20</td><td>Sartorius</td><td>VS2042</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Wytrawiacz chromu</td><td>Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japonia</td> Maska chromowa <td>N14B</td><td></td></tr><tr><td>pokryta AZP1350</td><td>Clean Surface Technology Co., Japonia</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Nośnik strącania (20 mg / ml glikogenu, 3 M octan sodu (pH 5,2))</td><td>Takara</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM) - wysoki poziom glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM) - wysoka glukoza, bez pirogronianu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99,5)</td><td>Fujifilm wako</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Moregate</td><td>59301104</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10, ludzka, rekombinowana,</td> <td>R& D Systems, Inc.</td><td>345-FG-025</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów (podstawowy), ludzki, rekombinowany</td><td>Fujifilm wako</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świń w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100g</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154-500</td><td></td></tr><tr><td>SZKLANE DNO płytki hodowlane</td><td>MatTek</td><td>P24G-1.5-13-F/H</td><td></td></tr><tr><td>Szynka& rsquo; s F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-062</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-061</td><td></td></tr><tr><td>L-alanino-L-glutamina (suplement GlutaMAX, 200mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-sól sodowa kwasu askorbinowego</td><td>Fujifilm wako</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>fragment Laminin-511 E8 ( LN511-E8, iMatrix-511)</td><td>Nippi</td><td>892012</td><td></td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>Union Optical Co., Ltd., Japonia</td><td>PEM-800</td><td></td></tr><tr><td>Bezmaskowe narzędzie litograficzne</td><td>NanoSystem Solutions, Inc., Japonia</td><td>D-Light DL-1000</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Millex-HV, 0,45 i mikro; m, PVDF (0,45-&mikro; m filtr)</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Myom2-RFP (SMM18)</td><td>N.A.</td><td></td><td>Opracowany w naszym poprzednim artykule (Chanthra, Sci Rep, 2020)</td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera CMOS ORCA-Flash4.0 V3</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006-10</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Sansei medical co. Ltd</td><td>01-004</td><td></td></tr><tr><td>Fenol / Chloroform / Alkohol izoamylowy (25:24:1)</td> <td>Gen nippon</td><td>311-90151</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer polidimetylosiloksanu (PDMS)</td><td>Dow Corning Corp., MI, USA</td><td>SILPOT 184</td><td></td></tr><tr><td>polietyleniminy MAX (MW. 40 000)</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>Pozytywny twórca fotorezystu</td><td>Tokyo Ohka Kogyo Co. , Ltd., Japonia</td><td>NMD-3</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Takara</td><td>9034</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>Fujifilm wako</td><td>166-23153</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko aktywiny A dla ludzi / myszy / szczurów</td><td>R& D Systems, Inc.</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana proteaza trypsyna podobna (rTrypsin; Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japonia</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka</td><td>Mikasa Co., Ltd., Japonia</td><td>MS-A100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia konfokalna Spininng</td><td>Oxford Instruments</td><td>Andor Dragonfly Spinning Disk System</td><td></td></tr><tr><td>StemSure LIF, Mysz, rekombinant, roztwór (10^6U)</td><td>Fujifilm wako</td><td>195-16053</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3010</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td><td>SU-8 3010</td><td></td></tr><tr><td>SU-8</td><td>deweloper Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td><td>Twórca</td><td></td>SU-8</tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Nippon Gen</td><td>314-90021</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego-A165 (VEGF), ludzki, rekombinowany</td><td>Fujifilm wako</td><td>226-01781</td><td></td></tr></tbody></table>

sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych.

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Kardiomiocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC-CMs) mogą być wytwarzane zarówno z embrionalnych, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ES/iPS). Komórki te stanowią obiecujące źródła do modelowania chorób serca. W przypadku kardiomiopatii skrócenie sarkomeru jest jedną ze standardowych ocen fizjologicznych, które stosuje się w przypadku dorosłych kardiomiocytów w celu zbadania ich fenotypów chorobowych. Dostępne metody nie są jednak odpowiednie do oceny kurczliwości PSC-CM, ponieważ komórki te mają słabo rozwinięte sarkomery, które są niewidoczne w mikroskopii z kontrastem fazowym. Aby rozwiązać ten problem i przeprowadzić skracanie sarkomeru za pomocą PSC-CM, zastosowano znakowane fluorescencyjnie białka sarkomerowe i fluorescencyjne obrazowanie na żywo. Cienkie linie Z i linia M znajdują się odpowiednio na obu końcach i w środku sarkomeru. Białka linii Z — α-aktynina (ACTN2), teletonina (TCAP) i białko LIM związane z aktyną (PDLIM3) — i jedno białko M-line — Myomesin-2 (Myom2) — zostały oznaczone białkami fluorescencyjnymi. Te znakowane białka mogą ulegać ekspresji z endogennych alleli jako knock-iny lub z wirusów związanych z adenowirusami (AAV). W tym miejscu przedstawiamy metody różnicowania mysich i ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów, wytwarzania AAV oraz wykonywania i analizowania obrazowania na żywo. Opisano również metody wytwarzania stempli polidimetylosiloksanu (PDMS) do wzorzystej kultury PSC-CM, co ułatwia analizę skracania sarkomeru za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie. Aby ocenić skrócenie sarkomeru, zarejestrowano poklatkowe obrazy bijących komórek z dużą liczbą klatek na sekundę (50-100 klatek na sekundę) pod wpływem stymulacji elektrycznej (0,5-1 Hz). Aby przeanalizować długość sarkomeru w trakcie kurczenia się komórek, zarejestrowane obrazy poklatkowe poddano działaniu SarcOptiM, wtyczki do ImageJ/Fiji. Nasza strategia zapewnia prostą platformę do badania fenotypów chorób serca w PSC-CM.

Pomiar skracania się sarkomerów z wykorzystaniem linii reporterowych PSC-CMs z knock-in. Do pomiaru skracania się sarkomerów wykorzystano PSC-CMs z oznakowanymi sarkomerami. Linie te wykazują ekspresję Myom2-RFP oraz ACTN2-mCherry z locus endogennego. TagRFP wprowadzono do Myom2, kodującego białka M lokalizujące się w linii M, natomiast mCherry wprowadzono metodą knock-in do ACTN2, kodującego α-aktyninę, która lokalizuje się w linii Z18...

Ta metoda może być użyta do zbadania skrócenia sarkomeru za pomocą kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych z fluorescencyjnie znakowanymi białkami sarkomerowymi.

Sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Trudno jest ocenić funkcję sarkomeru w kardiomiocytach pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych ze względu na ich słabo rozwinięty i zdezorganizowany sarkomer. Korzystając z białek sarkomerowych znakowanych fluorescencyjnie, możemy teraz uzyskać dostęp do skracania sarkomerów. Możemy wizualizować sarkomery i oceniać ich funkcję in vitro za pomocą kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych i fluorescencyjnie znakowanych białek sarkomerowych.Korzystając z transdukcji opartej na AAV, możemy rozszerzyć metodę na dowolne indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta. Metoda ta może być rozszerzona o rozwój terapii kardiomiopatii, ponieważ może być stosowana do bezpośredniej oceny dysfunkcji sarkomerów związanych z chorobą in vitro. Metoda ta jest przydatna w dziedzinie kardiologii, w tym w badaniach kardiologii dziecięcej.Można go jednak również zastosować do badania dysfunkcji mięśni szkieletowych, takich jak miopatia. W dniu minus czwartym indukcji różnicowania pokryj sześciodołkową płytkę 0,5 mikrograma na centymetr kwadratowy lamininy-511 E8 rozcieńczonej w PBS przez 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zbliżając się do końca inkubacji, należy traktować indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste rekombinowaną trypsyną przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Gdy komórki się odłączą, zbierz komórki na pożywkę uzupełnioną 10% FBS do liczenia i ponownie zawieś komórki w 1,25 razy 10 do piątych komórek na dwa mililitry pożywki AK02N uzupełnionej lamininą-511 E8 i inhibitorem ROCK po odwirowaniu. Następnie odessać roztwór powlekający z każdej studzienki sześciodołkowej płytki i zasiać dwa mililitry komórek w każdym dołku. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.Po czterech dniach komórki osiągają 80% konfluencję. Zastąp supernatant w każdym dołku dwoma mililitrami RPMI plus B27 bez pożywki insulinowej uzupełnionej inhibitorem GSK-3 na studzienkę w celu wywołania różnicowania. Po dwóch dniach różnicowania delikatnie zastąp pożywkę dwoma mililitrami RPMI plus B27 bez pożywki insulinowej uzupełnionej inhibitorem jeżozwierza na studzienkę.Komórki powinny osiągnąć 100% zbieżności. W czwartym dniu różnicowania delikatnie zastąp supernatanty dwoma mililitrami RPMI plus B27 bez insuliny na studzienkę. Komórki powinny pozostać w dużej gęstości, a niektóre mogły zacząć unosić się na wodzie.W siódmym i dziewiątym dniu różnicowania zastąp supernatant w każdym dołku dwoma mililitrami RPMI plus B27 z insuliną uzupełnioną puromycyną w celu selektywnej hodowli kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. W tym momencie w kulturach należy zaobserwować bicie komórek. Aby skonfigurować wzorzystą pluripotencjalną hodowlę kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, najpierw użyj taśmy naprawiającej, aby usunąć kurz z powierzchni wykonanego na zamówienie stempla PDMS i na krótko zanurz stempel w 70% etanolu.Użyj miotełki do kurzu, aby usunąć etanol z powierzchni stempla i potraktuj powierzchnię pięcioma do 10 mikrolitrami 0,5% polimeru MPC i etanolu. Gdy polimer całkowicie wyschnie, umieść stempel na polimerowym szkiełku nakrywkowym w 35-milimetrowym naczyniu do obrazowania i umieść ciężarek na stemplu. Po 10 minutach użyj mikroskopu świetlnego, aby potwierdzić, że wzór został przeniesiony na szkiełko nakrywkowe, a następnie umyj naczynie i szkiełko nakrywkowe dwa razy PBS.Po drugim praniu pokryj szkiełko nakrywkowe 0,5 do jednego mikrograma na centymetr kwadratowy lamininy-511 E8 rozcieńczonej w 0,1% żelatynie przez dwie do czterech godzin inkubacji w temperaturze pokojowej. W 10 dniu różnicowania przemyj komórki dwa razy PBS, a następnie potraktuj jednym mililitrem rekombinowanej trypsyny na dołek przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zliczeniu ponownie zawieś komórki w ilości od 2,5 do pięciu razy od 10 do piątej komórki na mililitr RPMI plus B27 z insuliną uzupełnioną o stężenie puromycyny i wysiewaj jeden mililitr komórek na płytkę w celu nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego ranka zastąp supernatant świeżym RPMI i witaminą B27 z insuliną uzupełnioną puromycyną i zwróć komórki do inkubatora hodowli komórkowych, odświeżając pożywkę dwa do trzech razy w tygodniu do 21 do 28 dni w celu obrazowania. W celu obrazowania poklatkowego skrócenia sarkomeru w kulturach PCCSM należy nałożyć olej na 100-krotnie większą soczewkę obiektywową fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego i wybrać warunki obrazowania na żywo w odpowiednim oprogramowaniu. Aby uzyskać dobrze reprezentatywne dane, wybierz najwyższą liczbę klatek na sekundę, ustaw migawkę tak, aby była otwarta, a następnie zastosuj kategoryzację cztery na cztery w kadrowaniu obszaru akwizycji, aby uzyskać jak najkrótsze odstępy czasu między obrazami podczas obrazowania poklatkowego.Jeśli tempo dudnienia komórek jest niskie, wywołaj komórki poprzez stymulację polem elektrycznym i rozpocznij nagrywanie poklatkowe, uważając, aby obrazowane pole pozostało ostre podczas obrazowania. Pod koniec okresu obrazowania zapisz zdjęcia poklatkowe w odpowiednim folderze. Aby przeanalizować zdjęcia poklatkowe, otwórz serię zdjęć poklatkowych w ImageJ i dostosuj jasność i kontrast obrazów, aż będzie można wyraźnie zaobserwować wzór sarkomeru.W menu Więcej narzędzi wybierz SarcOptiM, a następnie naciśnij Control Shift P i przycisk jednego mikrona na pasku narzędzi, aby skorzystać z instrukcji w celu kalibracji programu. Następnie narysuj linię w poprzek obszaru sarkomeru, który ma być użyty do zmierzenia skrócenia sarkomeru, i kliknij Jednokomórkowy AVI, aby rozpocząć analizę skracania sarkomeru. Obrazowanie poklatkowe kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych znakowanych sarkomerem, wzorzystych może być wykorzystane do pomiaru skrócenia sarkomeru w różnych punktach czasowych.Aby przezwyciężyć dezorganizację sarkomeru zwykle obserwowaną w wzorcowych hodowlach kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych, specyficzne znaczniki PDMS można zastosować do hodowli wzorzystych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych w prążkowany wzór, który promuje wydłużony kształt komórki i bardziej zorganizowany wzór sarkomeru w porównaniu z komórkami hodowanymi w obszarze bez wzorca. Hodowle wzorzyste sprzyjają również lepszemu skurczowi komórek i zapewniają gładki profil długości sarkomeru w porównaniu z komórkami hodowanymi bez wzorca. Kardiomiocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych transdukowane przez AAV wyrażają sarkomeryczne sygnały GFP wzdłuż wzorzystych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych już trzy dni po transdukcji i mogą być również wykorzystywane do pomiaru profili skurczu sarkomeru.Co więcej, dodanie genu oporności na blasticydynę podczas transdukcji może być również wykorzystane do ułatwienia wzorzystej selekcji kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych do czystości ponad 90%Aby ułatwić łatwiejszą i wyższą jakość analizy obrazu, konieczne jest zidentyfikowanie obszaru z sarkomerami, które poruszają się liniowo i uzyskanie obrazów z najwyższą liczbą klatek na sekundę. Za pomocą tej metody możemy ocenić rolę dojrzewania białek mięsaka w celu zbadania dysfunkcji sarkomeru w laboratoryjnych kardiomiocytach pochodzących ze specyficznych dla choroby, pochodzących od pacjenta komórek iPS.

sarcomere-shortening-pluripotent-stem-cell-derived-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.

Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

Wewnątrzkomórkowy recykling wapnia odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji skurczowej i rozkurczowej w kardiomiocytach. W tym miejscu opisujemy protokół oceny rezerwy Ca2 + retikulum sarkoplazmatycznego i rozkurczowej funkcji usuwania wapnia w kardiomiocytach za pomocą systemu obrazowania wapnia.

Ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych

Tutaj prezentujemy metodę optycznego obrazowania potencjałów czynnościowych, szczególnie w indukowanych komorowo indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych. Metoda opiera się na sterowanej przez promotor ekspresji wrażliwego na napięcie białka fluorescencyjnego.

Specyficzne dla podtypu zapisy optycznego potencjału czynnościowego w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach komorowych pochodzących z komórek macierzystych

Tworzenie właściwej sieci sarkomerowej jest ważne dla dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przedstawiamy podejście oparte na super rozdzielczości, które pozwala na ilościową ocenę strukturalnego dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, w celu poprawy warunków hodowli sprzyjających rozwojowi serca.

Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj metodę oceny skracania sarkomerów w kardiomiocytach pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych białek sarkomerowych. Technika ta umożliwia wizualizację funkcji sarkomerów in vitro.

Sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych. (Wideo) | JoVE Journal

Sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych.

Przeglądaj więcej filmów