Name: Nadmuchiwanie powietrza w płucach myszy z fiksacją perfuzji naczyniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę nadmuchiwania powietrza z fiksacją perfuzji naczyniowej w płucach myszy. Ta technika zachowuje morfologię komórek i ich lokalizację w przestrzeniach pęcherzykowych, zapobiegając zapadaniu się płuc podczas przygotowania do analiz histologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez granty Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi (NHLBI) HL140039 i HL130938. Autorzy chcieliby podziękować Shannon Hott i Jazalle McClendon za ich wiedzę techniczną.

Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Narodowego Zdrowia Żydowskiego.
UWAGA: Protokół składa się z trzech komponentów. Pierwszy komponent szczegółowo opisuje konstrukcję nadmuchiwania powietrza za pomocą sprzętu do perfuzji/utrwalania. Druga sekcja opisuje, jak skonfigurować sprzęt do eksperymentu. Ostatnia sekcja opisuje, jak przygotować zwierzę i przeprowadzić eksperyment.
1. Budowa aparatu do słupa wody (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Wyjąć tłok ze strzykawki z końcówką ślizgową o pojemności 60 ml.</li>
	<li>Przymocować taśmę wokół strzykawki w miejscu oznaczenia 30 ml. Ustawić wysokość strzykawki zgodnie z tym oznaczeniem, aby uzyskać początkowe ciśnienie napompowania 25 cmH2O. Jest to również miejsce, w którym powinien znajdować się poziom wody w kolumnie przez cały czas trwania procedury. Oznacz taśmę jako "25 cm" (jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A) lub "inflacja". 
	UWAGA: Ciśnienie napompowania 25 cmH2O służy do zapewnienia rekrutacji zapadniętych przestrzeni powietrznych. Po rekrutacji pęcherzyków płucnych ciśnienie obniża się do 20cmH2O, aby zapewnić, że przestrzenie powietrzne nie są rozciągnięte.</li>
	<li>Odmierzyć 5 cm od taśmy w kierunku końca tłoka i przymocować kolejny kawałek taśmy do strzykawki. Przesunąć strzykawkę w dół do tego oznaczenia, aby obniżyć ciśnienie napompowania do 20cmH2O podczas fiksacji. Oznacz taśmę jako "20 cm" (jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A) lub "mocowanie".</li>
	<li>Podłącz rurkę z polichlorku winylu (PVC) 180 do końcówki ślizgowej strzykawki. Długość rurki zależy od odległości między strzykawką a komorą nadmuchiwania powietrza (około 25-30 cm).</li>
	<li>Umieść męski trójnik z gwintem Luer (2) (1.219 cala długości, 0.904 cala wysokości, 0.0904 cala średnicy wewnętrznej) na drugim końcu rurki. Ten samiec Luer połączy się z kurkiem komory nadmuchiwania powietrza (krok 2.4).</li>
</ol>
2. Budowa komory do napełniania powietrzem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C)
<ol>
	<li>Wywierć dwa otwory (o średnicy około 4 mm) w plastikowym pojemniku o pojemności 500 ml z zakręcaną nakrętką. Otwory powinny być tego samego rozmiaru co samice Luers (1,224 cala długości, 0,312 cala wysokości, 0,098 cala średnicy wewnętrznej). 
	UWAGA: Puste nośniki lub pojemniki buforowe mogą być wykorzystane do komory nadmuchiwania powietrza.</li>
	<li>Pokryj gwinty żeńskie Luers silikonową uszczelką i umieść mniejszą stronę we wstępnie wywierconych otworach pojemnika.</li>
	<li>Dodaj silikonową uszczelkę wokół żeńskich Luersów w miejscu, w którym wchodzą do pojemnika, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie.</li>
	<li>Przykręcić jednokierunkowy kran na dolnej żeńskiej samicy Luer na komorze nadmuchiwania powietrza.</li>
	<li>Przytnij rurkę na długość około 25 cm i przymocuj męskie luery do wolnych końców rurki. Podłącz męski Luer na jednym końcu rurki do wolnego żeńskiego Luera w komorze nadmuchiwania powietrza. Drugi samiec Luer połączy się z pojemnikiem do przetwarzania zwierząt.</li>
</ol>
3. Budowa kontenera do przetwarzania zwierząt (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D)
<ol>
	<li>Wywierć otwór (o średnicy około 4 mm) z boku dużego plastikowego pojemnika. Otwór powinien mieć średnicę żeńskiego Luera. Plastikowy pojemnik jest potrzebny do złapania nadmiaru roztworu utrwalającego. 
	UWAGA: Użyto plastikowego pojemnika do przechowywania o wymiarach 30 cm x 22 cm, 3,8 L.</li>
	<li>Pokryj gwinty żeńskiego Luera silikonową maszynką do uszczelek i umieść mniejszą stronę we wstępnie wywierconym otworze pojemnika.</li>
	<li>Dodaj silikonową uszczelkę wokół żeńskiego Luera, gdzie wchodzi i wychodzi z pojemnika, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie.</li>
	<li>Przykręć jednokierunkowy kran do żeńskiego Luera. Rurka z komory do pompowania powietrza zostanie przymocowana do tego kranu.</li>
</ol>
4. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Roztwór heparyny
	<ol>
		<li>Napełnij pojemnik bezwapniowym PBS i heparyną (20 U/ml). Przygotuj łącznie 10 ml roztworu heparyny dla każdej myszy. Heparyna jest antykoagulantem, który zapobiega tworzeniu się skrzepów krwi w naczyniach podczas utrwalania perfuzji. Roztwór heparyny zostanie użyty do wypłukania krwi z płuc przed utrwaleniem perfuzji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór utrwalający 
	UWAGA: Utrwalacze mogą stanowić zagrożenie dla zdrowia i powinny być stosowane w dygestoriach chemicznych. Wszystkie aparaty są umieszczone w dygestorium chemicznym, aby zapobiec wdychaniu utrwalaczy.
	<ol>
		<li>Napełnij pojemnik bezwapniowym PBS i paraformaldehydem (4% stężenie końcowe). Przygotować łącznie 50 ml roztworu utrwalającego dla każdej myszy. 
		UWAGA: Rodzaj zastosowanego utrwalacza może się różnić i będzie zależał od dalszych badań histologicznych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie aparatu perfuzyjnego
UWAGA: Do dostarczania płynów do naczyń krwionośnych sugeruje się pompę perystaltyczną, aby zapewnić stałe natężenie przepływu. Poniższe wskazówki dotyczą konfiguracji pompy perystaltycznej i mogą się różnić w zależności od modelu. Alternatywnie, jeżeli pompa perystaltyczna nie jest dostępna, można skonstruować drugi aparat do napełniania płynów z wysokości 35 cm H2O.
<ol>
	<li>Najpierw umieść rurkę wokół zespołu rolki.</li>
	<li>Przymocuj rurkę do ząbkowanych słupków.</li>
	<li>Zatrzaśnij dźwignie na miejscu, umieszczając najpierw lewą dźwignię wokół rurki i zabezpieczając ją górną, a następnie prawą dźwignią.</li>
	<li>Umieścić proksymalny koniec rurki w roztworze heparyny, a dystalny koniec w pojemniku do przetwarzania zwierząt.</li>
	<li>Wstępnie załaduj roztwór heparyny do rurki, uruchamiając pompę w celu usunięcia powietrza z rurki.</li>
	<li>Przymocuj igłę 25G x 5/8" do końca lewej strony rurki.</li>
</ol>
6. Przygotowanie aparatu do napełniania powietrzem
<ol>
	<li>Umieścić strzykawkę do słupa wody w uchwycie pierścieniowym.</li>
	<li>Zmierz wysokość w pionie 25 cm od platformy dla zwierząt do znaku taśmy "25 cm" (krok 1.2) na słupie wody.</li>
	<li>Przymocuj koniec rurki słupa wody do kranu w komorze powietrznej.</li>
	<li>Podłączyć rurkę od żeńskiego Luera komory powietrznej do kranu na pojemniku do przetwarzania zwierząt. 
	UWAGA: Jeśli komora nadmuchiwania powietrza jest skonstruowana tak, jak pokazano na Rysunek 1C, podłączenie rurki w odwrotnej kolejności może spowodować wyciek wody do rurki łączącej się z kaniulą tchawicy.</li>
	<li>Upewnij się, że korek komory powietrznej jest szczelnie zamknięty.</li>
	<li>Upewnij się, że zawór odcinający na zewnątrz pojemnika do przetwarzania zwierząt jest zamknięty, a zawór odcinający na rurce prowadzącej od słupa wody do komory nadmuchiwania powietrza jest otwarty.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę wodą do oznaczenia "25 cm". Woda opuści strzykawkę przez rurkę do komory powietrznej. Po wyrównaniu ciśnienia woda przestanie płynąć.
	<ol>
		<li>Możliwe jest, że woda będzie powoli przeciekać do komory nadmuchiwania powietrza, ponieważ ciśnienie powietrza otoczenia w okapie chemicznym ulega wahaniom. Zwracać uwagę na poziom wody w strzykawce i w razie potrzeby dodać więcej. Utrzymuj poziom wody na poziomie "25 cm" przez cały czas trwania zabiegu. 
		UWAGA: Zwykle poziom wody pozostaje stały przez pierwszą część nadmuchiwania powietrza na poziomie 25 cmH2O; Jednak prawdopodobnie podczas utrwalania do strzykawki będzie trzeba dodać więcej wody. Jeśli woda nie przestaje płynąć, prawdopodobnie w komorze nadmuchiwania powietrza występuje wyciek powietrza. Może być konieczne zastosowanie większej ilości silikonowych uszczelek wokół Luers, aby zapobiec wyciekom powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Przygotowanie zwierząt (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
UWAGA: Ta procedura została zmodyfikowana z Gage et al13. Przeprowadziliśmy tę procedurę na dorosłych samcach i samicach myszy w różnym wieku i nie zauważyliśmy żadnych uprzedzeń związanych z wiekiem lub płcią.
<ol>
	<li>Poddać zwierzę eutanazji pentobarbitalem sodu (150 mg/kg, dootrzewnowo). Upewnij się, że zwierzę jest martwe przed rozpoczęciem sekcji. 
	UWAGA: Chociaż ta procedura jest wykonywana na zwierzętach poddanych eutanazji, procedura ta może być wykonywana na żywych zwierzętach, aby wykorzystać serce do pompowania perfuzatów w całym zwierzęciu.</li>
	<li>Wykonaj dwa boczne nacięcia przez ścianę brzucha. Wykonaj pierwsze nacięcie poniżej klatki piersiowej, a drugie nad biodrami. Przeciąć wzdłuż linii środkowej od dolnego nacięcia w kierunku górnego nacięcia.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek ostrożnie wykonaj nacięcie po bocznej stronie przepony. Płuca powinny się zapadnąć, gdy tylko przepona zostanie przebita. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby uniknąć przebicia płuc. Przebite płuco jest mniej podatne na nadmuchanie podczas późniejszych etapów.</li>
	<li>Przeciąć poprzecznie wzdłuż przepony, aby otworzyć jamę piersiową.</li>
	<li>Przeciąć górnie wzdłuż mostka od wyrostka mieczykowatego do wcięcia szyjnego i bocznie powyżej klatki piersiowej, aby w pełni odsłonić serce i płuca. Przypnij boki klatki piersiowej.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej szyi nad tchawicą. Usuń skórę, mięśnie, tarczycę i tkankę łączną otaczającą tchawicę.</li>
	<li>Za pomocą zakrzywionych kleszczy wsuń dwa kawałki nici lub szwu pod tylną tchawicę. Użyj jednego kawałka szwu, aby przytrzymać adapter Luer-stub do nadmuchiwania na miejscu, a drugiego ostatecznie użyj do zawiązania tchawicy po zakończeniu napompowania powietrzem i utrwalenia perfuzji naczyniowej.</li>
	<li>Zrób mały otwór w tchawicy za pomocą igły 18G x 1" lub nożyczek sprężynowych Vannas.</li>
	<li>Umieść adapter Luer-stub 20G w tym otworze w tchawicy.</li>
	<li>Zawiąż jedną nitkę wokół tchawicy bezpośrednio dystalnie do miejsca, w którym wchodzi adapter Luer-stub, aby utrzymać go na miejscu.</li>
	<li>Przenieść zwierzę do pojemnika do przetwarzania zwierząt.</li>
	<li>Przymocuj adapter Luer-stub do samicy Luer po wewnętrznej stronie pojemnika do przetwarzania zwierząt.</li>
</ol>
8. Napompowanie powietrza, perfuzja i unieruchomienie płuc (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Umieść igłę 25G x 5/8" przymocowaną do rurki aparatu perfuzyjnego do prawej komory serca.</li>
	<li>Przeciąć aortę brzuszną, aby umożliwić odpływ krwi z serca i ułatwić przepływ perfuzatu przez płuca.</li>
	<li>Otwórz kran na zewnątrz pojemnika do przetwarzania zwierzęcego, aby napompować płuca. 
	UWAGA: Pełne napełnienie płuc może zająć trochę czasu. Obserwuj poziom wody w strzykawce, nie powinien on gwałtownie spadać, chyba że występuje wyciek w płucach.</li>
	<li>Napompuj płuca przy 25 cmH2O przez 5 minut. Napompowanie przy 25 cmH2O warunkuje płuca i pomaga w rekrutacji niedodmy płuc. 
	UWAGA: Może być konieczne dodanie niewielkiej ilości wody do strzykawki, aby utrzymać wysokość 25 cm. Stan zapalny i/lub eksperymentalnie wywołane uszkodzenie płuc mogą wpływać na napompowanie płuc. W takim przypadku może być konieczne zwiększenie ciśnienia napompowania do maksymalnie 35 cmH2O, aby pomóc w rekrutacji regionów niedodmądrych.</li>
	<li>W ostatniej minucie napompowania płuc włącz pompę perystaltyczną do natężenia przepływu 10 ml/min. Roztwór heparyny powinien przepływać z butelki przez rurkę do zwierzęcia.
	<ol>
		<li>Celem wlewu heparyny jest zapobieganie tworzeniu się skrzeplin w naczyniach. W związku z tym podawaj heparynę, aż płuca staną się białe i pozbawione krwi. Jeśli płuca nie stają się białe, może być konieczna regulacja igły prawej komory.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po napompowaniu przez 5 minut wyłącz pompę perystaltyczną i zmień rurkę perfuzyjną z roztworu heparyny na utrwalacz.</li>
	<li>Opuścić strzykawkę z kolumną wody do oznaczenia "20 cm" (krok 1.3). To normalne, że pęcherzyki powietrza przemieszczają się w słupie wody, ponieważ ciśnienie zmienia się z 25 do 20 cmH2O.
	<ol>
		<li>Sprawdzić poziom wody w strzykawce. Powinien znajdować się na znaku "25 cm". W tej chwili może być konieczne dodanie więcej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczekaj 1 minutę, aby płuca opróżniły się z 25 do 20 cmH2O.</li>
	<li>Uruchom ponownie pompę perfuzyjną przy natężeniu przepływu 6,5 ml/min.</li>
	<li>Perfuzja naczyniowa - fix przez 10 - 15 minut.</li>
</ol>
9. Ekstrakcja płuc (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Mocno przywiąż drugi kawałek nici wokół dystalnej tchawicy do adaptera Luer-stub. Wyjmij adapter Luer-stub z tchawicy.</li>
	<li>Usunąć igłę z serca.</li>
	<li>Uwolnij płuca i serce z jamy klatki piersiowej, przecinając tkankę łączną za śródpiersiem nożyczkami. Uważaj, aby nie przebić płuc.</li>
	<li>Ostrożnie usuń serce z płuc.</li>
	<li>Umieść płuca w utrwalaczu na noc. 
	UWAGA: Czas trwania utrwalacza różni się w zależności od dalszych badań histologicznych.
	<ol>
		<li>Umieść płuca w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 20-25 ml utrwalacza. Umieść nić mocującą tchawicę przez otwór stożkowej rurki i zabezpiecz gwintami nasadki. Odwróć stożkową rurkę, aby upewnić się, że wyporne, napompowane powietrzem płuca pozostaną całkowicie zanurzone w utrwalaczu, w przeciwnym razie będą unosić się na wierzchu płynu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwórz płuca do badań histologicznych.</li>
</ol>

<ol><li>Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Official+Research+Policy+Statement+of+the+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society%3A+Standards+for+Quantitative+Assessment+of+Lung+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li>
<li>Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+rapidly+frozen+lungs%3A+evaluation+on+the+basis+of+standard+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%3A+Respiratory%2C+Environmental+and+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).</li>
<li>Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+of+lungs+for+structure-function+analysis%3A+credits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%3A+Respiratory%2C+Environmental+and+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).</li>
<li>Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+volume-surface+area+relation+in+air-+and+saline-filled+lungs+fixed+by+vascular+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%3A+Respiratory%2C+Environmental+and+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).</li>
<li>Harris, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-Volume+Curves+of+the+Respiratory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Care%22%5BJournal%5D)">Pressure-Volume Curves of the Respiratory System.</a> Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).</li>
<li>Bachofen, H., Schürch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+surface+forces+and+lung+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alveolar surface forces and lung architecture.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).</li>
<li>Mead, J., Takishima, T., Leith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+distribution+in+lungs%3A+a+model+of+pulmonary+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity.</a> Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).</li>
<li>Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Mechanical+Strain+Characterization+of+Ventilated+ex+vivo+Porcine+and+Murine+Lung+using+Digital+Image+Correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation.</a> Frontiers in Physiology. 11, 600492(2020).</li>
<li>Braber, S., Verheijden, K. aT., Henricks, P. aJ., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li>
<li>Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Airway Macrophages.</a> American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).</li>
<li>Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+Macrophage+Distribution+in+a+Mouse+Model%3A+The+Importance+of+the+Fixation+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method.</a> Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).</li>
<li>Matulionis, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+deformation+and+macrophage+displacement+in+smoke-exposed+and+normal+mice+%28Mus+musculus%29+following+different+fixation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+A%2C+Pathological+Anatomy+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures.</a> Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564(2012).</li>
<li>Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characteristics+of+the+chest+and+lungs+and+the+work+of+breathing+in+different+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species.</a> The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+Methods+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Safety+Evaluation%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Principles and Methods of Immunohistochemistry.</a> Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż powszechnie stosowane, metody zespolenia dotchawiczego wypierają leukocyty z dróg oddechowych i mogą zmieniać normalną architekturę płuc. Metoda nadmuchiwania powietrza z utrwaleniem perfuzji naczyniowej, która jest przewidziana w tym protokole, pokonuje te pułapki i dokładniej zachowuje anatomię płuc. Kluczem do uzyskania wysokiej jakości tkanki metodą perfuzji naczyniowej i utrwalenia jest dokładne monitorowanie ciśnienia napompowania powietrza, unikanie wycieków powietrza i zapewnienie odpowiedniej perfuzji ut...

Histologia płuc stanowi złoty standard oceny architektury płuc w czasie zdrowia i choroby i jest jednym z najczęściej używanych narzędzi przez badaczy chorób płuc1. Jednym z najbardziej krytycznych aspektów tej techniki jest właściwa izolacja i zachowanie tkanki płucnej, ponieważ zmienność na tym etapie może prowadzić do niskiej jakości tkanki i błędnych wyników1,2,3. U żywych zwierząt objętość płuc zależy od równowagi między wewnętrznym elastycznym odrzutem płuc a siłami zewnętrznymi przenoszonymi ze ściany klatki piersiowej i przepony przez napięcie powierzchniowe. W związku z tym, gdy klatka piersiowa jest wprowadzana, siły zewnętrzne są tracone, a płuco zapada się. Skrawki histologiczne przygotowane z zapadniętych płuc mają zatłoczony wygląd, a granice między przedziałami anatomicznymi (tj. przestrzeniami powietrznymi, naczyniami krwionośnymi i śródmiąższem) mogą być trudne do odróżnienia. Aby obejść ten problem, naukowcy często namuchują płuca podczas utrwalania chemicznego, aby zachować rozmiar i architekturę przestrzeni powietrznej.
Płuca mogą być napełnione powietrzem lub płynem. Ciśnienie niezbędne do napompowania płuc do tej samej objętości różni się między napompowaniem powietrza i cieczy z powodu sił międzycząsteczkowych na granicy faz powietrze-ciecz. Podczas napełniania powietrzem wymagane jest wyższe ciśnienie (np. 25 cmH2O) niż napełnianie cieczą (np. 12 cmH2O), aby pokonać napięcie powierzchniowe i otworzyć zapadnięte pęcherzyki płucne4. Po rekrutacji pęcherzyków płucnych niższe ciśnienie może utrzymać pęcherzyki płucne otwarte do tej samej objętości, co krzywa ciśnienie-objętość, a ciśnienie wyrównuje się w całym płucu zgodnie z prawem Pascala4,5,6,7,8.
Istnieją dwie główne metody napompowania i unieruchomienia płuc, które pozwalają zachować płuca myszy do histologii. Najczęściej do przestrzeni powietrznych wkrapla się płyn - często zawierający utrwalacz. Główną zaletą tego podejścia jest to, że jest ono stosunkowo łatwe i wymaga niewielkiego treningu. Podczas gdy dotchawicze wkraplanie utrwalacza może być preferowane w badaniach, które koncentrują się na unaczynieniu, płyn wkraplany przez tchawicę ma tendencję do wypychania bliższych komórek dróg oddechowych i mucyn do bardziej dystalnych obszarów przestrzeni powietrznej, podczas gdy inflacja powietrza nie1,3,4,9,10,11. Co więcej, niezamierzone oderwanie leukocytów od nabłonka podczas napełniania płynu zmienia ich morfologię, sztucznie nadając im prosty, zaokrąglony wygląd4,10,11,12. Wreszcie, napełnienie płuc płynem może nieumyślnie skompresować śródmiąższ4,10,11. Razem czynniki te mogą zniekształcić normalną anatomię i rozmieszczenie komórek w zachowanych płucach, ograniczając w ten sposób technikę.
Alternatywną metodą konserwacji tkanek jest utrwalanie perfuzji naczyniowej. W tej metodzie utrwalacz jest perfundowany do układu naczyniowego płuc przez żyłę główną lub prawą komorę. Metoda ta pozwala zachować lokalizację i morfologię komórek w świetle przestrzeni powietrznej. Jednakże, o ile płuca nie zostaną napompowane podczas perfuzji-utrwalenia, tkanka płucna prawdopodobnie się zapadnie.
Pompowanie powietrzem z perfuzją naczyniową wykorzystuje mocne strony każdej z powyższych technik fiksacji. W tym miejscu przedstawiamy protokół dla tej techniki. Wymagane materiały i sprzęt są stosunkowo niedrogie i można je łatwo zdobyć i zmontować. Kompletna konfiguracja, pokazana na Rysunek 1A, zapewnia stałe ciśnienie w drogach oddechowych do płuc za pomocą regulowanej, wypełnionej płynem kolumny, podczas gdy pompa perystaltyczna dostarcza utrwalacz przez prawą komorę. Płuca z zachowaną morfologią mogą być następnie dalej przetwarzane do analiz strukturalno-funkcjonalnych.

<table><tbody><tr><td>00117XF-Zawór odcinający 1-drogowy 100/PK M Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>Mfr # VPB1000050N &ndash; Artykuł # EW-00117-XF</td> Strzykawka z <td>zaworem odcinającym</td></tr><tr><td>BD 60 ml, końcówka ślizgowa</td><td>BD</td><td>309654</td><td>Strzykawka służąca do budowy kolumny wodnej</td></tr><tr><td>Igła BD PrecisionGlide 25G x 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td>Igła do perfuzji/utrwalania naczyń krwionośnych</td></tr><tr><td>Żeński gwint Luer Montaż panelowy 1/4-28 UNF na męski Luer</td><td>Nordson Medical</td><td>FTLLBMLRL-1</td><td>Żeński Luer</td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td>Roztwór heparyny.</td></tr><tr><td>Adapter Luer-Stub BD Intramedic 20 Gauge</td><td>BD Biosciences</td><td>427564</td><td>Adapter Luer-Stub</td></tr><tr><td>Męski Luer (2) na żeński Trójnik z gwintem Luer</td><td>Nordson Medical</td><td>LT787-9</td><td>Męski Luer</td></tr><tr><td>Nalgene 180 Przezroczysta plastikowa rurka PVC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8000-9020</td><td>Rurka</td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa - 32%</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15714-S</td><td>Roztwór utrwalający. Rozcieńczony do 4% solą fizjologiczną buforowaną fosforanami</td></tr><tr><td>Permatex Ultra Blue Uniwersalna maszyna do uszczelek silikonowych RTV</td><td>Permatex</td><td>81724</td><td>Maszyna do uszczelek silikonowych do hermetycznego uszczelniania komór</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1x bez wapnia i magnezu</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Butelka służąca do budowy komory nadmuchiwania powietrza oraz bufor używany do heparyny i roztworów</td></tr> <tr><td>utrwalającychSterilite Ultra Seal 16.0 kubek prostokątny pojemnik do przechowywania żywności</td><td>Sterilite</td><td>0342</td><td>Pojemnik do przetwarzania zwierząt</td></tr></tbody></table>

nadmuchiwanie powietrza w płucach myszy z fiksacją perfuzji naczyniowej

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Histologia płuc jest często wykorzystywana do badania wkładu komórek przestrzeni powietrznej podczas homeostazy płuc i patogenezy choroby. Jednak powszechnie stosowane metody utrwalania oparte na wkraplaniu mogą przemieszczać komórki przestrzeni powietrznej i śluz do końcowych dróg oddechowych i mogą zmieniać morfologię tkanek. Dla porównania, techniki utrwalania perfuzji naczyniowej są lepsze w zachowaniu lokalizacji i morfologii komórek w przestrzeniach powietrznych i wyściółce błony śluzowej. Jeśli jednak dodatnie ciśnienie w drogach oddechowych nie zostanie jednocześnie zastosowane, obszary płuc mogą się zapadnąć, a naczynia włosowate mogą wybrzuszyć się w przestrzeniach pęcherzykowych, prowadząc do zniekształcenia anatomii płuc. W tym artykule opisujemy niedrogą metodę nadmuchiwania powietrza podczas utrwalania perfuzji naczyniowej w celu zachowania morfologii i lokalizacji komórek dróg oddechowych i pęcherzyków płucnych oraz śródmiąższu w płucach myszy do dalszych badań histologicznych. Stałe ciśnienie powietrza jest dostarczane do płuc przez tchawicę z zamkniętej, wypełnionej powietrzem komory, która utrzymuje ciśnienie za pośrednictwem regulowanej kolumny cieczy, podczas gdy utrwalacz jest perfuzjonowany przez prawą komorę.

W nienaruszonym klatce piersiowej płuca są utrzymywane w rozprężeniu dzięki siłom zewnętrznym wywieranym przez ścianę klatki piersiowej poprzez jamę opłucnową6,14. Po przekłuciu przepony podczas sekcji szczelność jamy opłucnowej zostaje utracona, co prowadzi do zapadnięcia się płuc (Rysunek 2A, 2B). Aby ponownie rozprężyć płuca, przeprowadza się inflację powietrzną. W pierwszym kroku zastosowano ciśnienie 20 cm H₂O, ...

Prezentowana jest metoda napełniania powietrzem z perfuzją naczyniową płuc, która zachowuje lokalizację komórek w drogach oddechowych, pęcherzykach płucnych i śródmiąższu do analiz strukturalno-funkcjonalnych. Stałe ciśnienie w drogach oddechowych jest utrzymywane za pomocą komory do napełniania powietrzem, podczas gdy utrwalacz jest perfuzjonowany przez prawą komorę. Płuca są przetwarzane do badań histologicznych.

Nadmuchiwanie powietrza w płucach myszy z fiksacją perfuzji naczyniowej

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...

Jest to niedroga metoda, która łączy w sobie zalety nadmuchiwania powietrza i fiksacji perfuzji naczyniowej w celu zachowania płuc do analiz strukturalnych i funkcjonalnych. Główną zaletą tej techniki jest zachowanie zarówno morfologii komórki, jak i lokalizacji w przestrzeniach powietrznych płuc. Należy zachować ostrożność podczas umieszczania adaptera króćca przynęty w tchawicy, a igły perfuzyjnej w prawej komorze, aby zapewnić odpowiednie napompowanie i utrwalenie.Aby ustawić urządzenie do napełniania powietrzem, umieść strzykawkę do słupa wody w uchwycie pierścieniowym i zmierz wysokość w pionie od 25 centymetrów od platformy dla zwierząt do 25 centymetrów na słupie wody. Przymocuj do końca rurki słupa wody do kranu w komorze powietrznej i przymocuj rurkę od żeńskiej przynęty komory powietrznej do kranu na pojemniku do przetwórstwa zwierzęcego. Upewnij się, że korek komory powietrznej i kran odcinający na zewnątrz pojemnika do przetwarzania zwierząt są zamknięte oraz że zawór odcinający na rurce prowadzącej od słupa wody do komory nadmuchiwania powietrza jest otwarty.Następnie napełnij strzykawkę wodą do znaku 25 centymetrów. Woda przepłynie przez strzykawkę i rurkę do komory p

air-inflation-of-murine-lungs-with-vascular-perfusion-fixation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie opisujemy procedurę izolacji i chemicznego ustalania wartości płucnej myszy w zamkniętej konformacji poprzez zwiększanie ciśnienia perfuzji.

Utrwalanie ciśnieniowe izolowanej mysiej zastawki płucnej: procedura izolacji i chemicznego mocowania mysiej zastawki płucnej w zamkniętej konformacji

Niedotlenienie naczyń płucnych (HPV) jest ważnym zjawiskiem fizjologicznym, dzięki któremu przy niedotlenieniu pęcherzyków płucnych perfuzja płuc jest dopasowana do wentylacji. Głównym segmentem naczyniowym przyczyniającym się do HPV jest tętnica wewnątrzgroniasta. W tym miejscu opisujemy nasz protokół analizy HPV mysich naczyń płucnych o średnicach 20-100 μm.

Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi umożliwia wizualizację sieci mikronaczyń na powierzchni płuc. W tym miejscu opisujemy podejście do ilościowego określania przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Celem tego artykułu jest opisanie prostych metod, które znacznie pomogą w konfiguracji i analizie płuc myszy z rakiem płuc lub innymi patologiami. Przedstawiamy 3 protokoły do prostego i niezawodnego przeprowadzania wkraplania płuc, stabilizacji i pomiarów objętości płuc.

Metody wkraplania i utrwalania przydatne w badaniach nad rakiem płuc myszy

Wewnętrzna powierzchnia płuc (ISA) jest krytycznym kryterium oceny morfologii i fizjologii płuc w chorobach płuc i regeneracji pęcherzyków płucnych wywołanej urazem. Opisujemy tutaj znormalizowaną metodę, która może zminimalizować błąd systematyczny pomiaru ISA zarówno w modelach myszy do pneumonektomii płuc, jak i implantacji protez.

Ustandaryzowana metoda pomiaru wewnętrznej powierzchni płuc za pomocą pneumonektomii u myszy i implantacji protezy

Prezentowany tutaj jest użyteczny protokół do unieruchomienia płuc, który tworzy stabilne warunki do oceny histologicznej próbek płuc z mysiego modelu rozedmy płuc. Główną zaletą tego modelu jest to, że może naprawić wiele płuc przy tym samym stałym ciśnieniu bez zapadania się płuc lub opróżniania.

Unieruchomienie płuc pod stałym ciśnieniem w celu oceny rozedmy płuc u myszy

Celem tej metody jest przedstawienie prostej i efektywnej metody perfuzji, napełniania i utrwalania płuc myszy w celu zbadania patologii guza płuc i oceny przerzutów do płuc.

Perfuzja i inflacja płuca myszy w celu histologii guza

Celem tej techniki jest wizualizacja ex vivo sieci tętnic płucnych u myszy wcześnie urodzonych i dorosłych poprzez napompowanie płuc i wstrzyknięcie przez tętnicę płucną nieprzezroczystego związku na bazie polimeru radiologicznego. Omówiono również potencjalne zastosowania tkanek odlewanych.

Odlew naczyniowy płuc myszy dorosłych i wczesnych po urodzeniu do obrazowania mikro-CT

Myszy narażone na działanie ozonu i endotoksyn bakteryjnych wykazują rozległą śmierć komórek, w tym neutrofili. Zaobserwowaliśmy adaptacje komórkowe, takie jak zakłócenie blaszek cytoszkieletu, zwiększona ekspresja komórkowa podjednostki syntazy ATP kompleksu V β i angiostatyny w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym, supresja odpowiedzi immunologicznej płuc i opóźniona rekrutacja neutrofili.

Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS

Celem jest opracowanie nowego modelu perfuzji płuc ex vivo (EVLP) u szczurów, który może utrzymać stałą czynność płuc przez 4 godziny przez cały czas trwania EVLP i dostarczyć branży specyfiki implementacji, która zapewni solidną metodę stosowania EVLP na modelach gryzoni.

Opracowanie nowatorskiego systemu perfuzji płuc ex vivo dla płuc szczurów po śmierci krążeniowej

Prezentujemy metodę modelu patogenezy grzybów, która zachowuje naturalne położenie zarodników grzybów w drogach oddechowych płuc do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Skuteczna metoda obrazowania płuc myszy, która zachowuje dynamikę przestrzenną zarodników grzybów w drogach oddechowych

Poznaj metodę nadmuchiwania powietrza z fiksacją perfuzji naczyniowej w płucach myszy. Ta technika zachowuje morfologię komórek i ich lokalizację w przestrzeniach pęcherzykowych, zapobiegając zapadaniu się płuc podczas przygotowania do analiz histologicznych.

Nadmuchiwanie powietrza w płucach myszy z fiksacją perfuzji naczyniowej

Przeglądaj więcej filmów