Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Ten test obrazowania in vitro umożliwia ilościowe określenie wpływu różnych zabiegów komórkowych lub różnych genotypów na fagocytozę mikrogleju. Korzystając z dwóch typów komórek, które są istotne dla choroby neurodegeneracyjnej, używamy martwych komórek nerwiaka zarodkowego do ładunku fagocytarnego, które są przygotowywane w sposób, który można łatwo i tanio skalować za pomocą dużych ekranów obrazowania o wysokiej treści. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2 odciąć SH-SY5Ys poprzez zasysanie pożywki.

Dodać 4 ml buforu do dysocjacji komórek i natychmiast usunąć bufor, tak aby mniej niż 1 ml pozostał w postaci cienkiej warstwy pokrywającej komórki. Inkubować przez 2 do 3 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie po 10 ml HBSS do kolby T-75.

Następnie odpipetować SH-SY5Ys do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 400xG przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki buforowej HEPES wolnej od czerwieni fenolowej, upewniając się, że rozbiły się grudki przed utrwaleniem.

Utrwal komórki, dodając 2 ml formaldehydu o mocy 4% do probówki i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym delikatnym mieszaniem. Dodać 10 ml HBSS do probówki. Następnie odwiruj w temperaturze 1200xG przez 7 minut.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki buforowej HEPES wolnej od czerwieni fenolowej. Policz i usuń 1 milion komórek HS-SY5Y do 2 ml probówki o niskim poziomie wiązania białka. Zwiększ całkowitą objętość do 300 do 500 mikrolitrów za pomocą pożywek buforowanych HEPES bez czerwieni fenolu.

Następnie krótko podgrzej rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozpuść wrażliwy na pH ester STP czerwonego barwnika fluorescencyjnego zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie dodaj 12,5 mikrograma barwnika na milion komórek SH-SY5Y.

Delikatnie wymieszaj, przesuwając tubkę. I inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, chroniąc przed światłem. Dodać 1 ml HBSS i wirować w temperaturze 1200xG przez 7 minut i 4 stopnie Celsjusza.

Odrzucić supernatant. I umyć 2 ml HBSS. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce makrofagowej wolnej od czerwieni fenolowej do stężenia od 0,2 do 1,2 miliona komórek na ml, tak aby 50 mikrolitrów zawierało od 10 000 do 60 000 komórek.

W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotuj roztwór ciemnoczerwonego barwnika reaktywnego z estrem sukcynimidylu przepuszczanego przez komórki fluorescencyjne w pożywce makrofagowej. Dodaj Hoechst 33342 i podgrzej roztwór roboczy do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Delikatnie odessać pożywkę makrofagową iPSC, pipetując supernatant komórkowy za pomocą pipety wielokanałowej do sterylnego zbiornika.

Dodaj 70 mikrolitrów roztworu barwnika na studzienkę do makrofagów iPSC za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Naprawa eksperymentalnych zabiegów w pożywkach makrofagowych wolnych od czerwieni fenolowej.

Po inkubacji bardzo delikatnie odessać pożywkę makrofagową iPSC za pomocą pipety wielokanałowej i dodać 100 mikrolitrów HBSS do dołka. Natychmiast usunąć HBSS przez delikatne pipetowanie. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki makrofagowej wolnej od czerwieni fenolowej oraz eksperymentalne zabiegi w oddzielnych studzienkach.

Inkubować przez 10 minut do 1 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 mikrolitrów oznaczonego SH-SY5Ys do dołka po bokach każdej studzienki na krawędzi cieczy. Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 3 do 5 godzin.

Po inkubacji fagocytozy delikatnie odessać supernatanty komórkowe przez pipetowanie pipetą wielokanałową i wyrzucić. Umyj raz 100 mikrolitrami PBS. Następnie utrwal komórki, dodając 100 mikrolitrów 2% formaldehydu i inkubując przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Odessać studzienki i dodać 100 mikrolitrów PBS. Albo przejdź bezpośrednio do obrazowania za pomocą mikroskopu o wysokiej zawartości, albo przykryj płytką i folią, a następnie przechowuj płytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż będzie to wymagane. Włącz mikroskop obrazowania o wysokiej zawartości i otwórz oprogramowanie do przechwytywania obrazu.

Załaduj płytkę testową do mikroskopu, klikając ikonę ZAŁADUJ u góry ekranu. Wybierz zakładkę USTAWIENIA". Z menu rozwijanych w lewym górnym polu wybierz odpowiedni typ blachy.

Opcja autofokusa: dwa szczyty"Obiektyw:40x woda, NA 1.1"Tryb koncentryczny" i Binning 1. Przed użyciem przepłucz obiektyw 40x Water za pomocą menu ustawień. W polu wyboru kanału użyj ikony plusa, aby dodać kanały DAPI, Alexa 647 i Alexa 568.

Ustaw je tak, aby mierzyły w jednej płaszczyźnie jednego mikrometra. Zoptymalizuj ustawienia czasu i mocy, aby uzyskać wydajność barwienia płytki testowej. Upewnij się, że kanały nie są mierzone jednocześnie, klikając sekwencję kanałów, aby oddzielić kanały.

W obszarze nawigacji i definiowania układu wybierz dołki pomiaru, a następnie wybierz od 9 do 12 pól na dołek. Podczas ustawiania należy kliknąć reprezentatywne pole na mapie tablicowej. Sprawdź po kolei każdy kanał pomiarowy, aby upewnić się, że występuje przebarwienie i że obrazy są wyostrzone poprzez regulację przesunięcia kanału.

Aby przesłać dane na serwer w celu zdalnej analizy, kliknij pole "oferty pracy online" i odpowiednią nazwę ekranową. Zapisz protokół testu, klikając przycisk "Zapisz" i kliknij kartę "uruchom eksperyment" u góry. Nazwij płytkę eksperymentalną, a następnie kliknij start"Test fagocytozy na żywo w czasie życia w komórce wykazał, że przy 10 000 SH-SY5Ys na studzienkę, liczba cząstek fagocytozy na komórkę wzrastała liniowo z czasem i została zahamowana o około 50% przez cytochalazynę D. Przy wyższych ilościach SH-SY5Ys na studzienkę, fagocytoza wykazywała słabą liniowość, prawdopodobnie z powodu słabej segmentacji iPSC, makrofagi i SH-SY5Y w bardziej zatłoczonym polu widzenia.

Następujące wyniki uzyskano, wykonując obrazowanie o wysokiej zawartości komórek stałych, w tym ten reprezentatywny obraz fagocytozy. Zwiększenie ilości SH-SY5Ys spowodowało większą liczbę fagocytozowanych cząstek na komórkę. Test fagocytozy został zwalidowany przy użyciu kilku inhibitorów fagocytozy.

Cytochalazyna D i jasplakinolid znacząco hamowały fagocytozę odpowiednio o 91 i 90 procent. A bafilomycyna A1 znacznie zmniejszyła fagocytozę o 31%, gdy była wstępnie inkubowana przez 1 godzinę przed fagocytozą. Dodanie rekombinowanej aneksyny 5 znacznie zmniejszyło fagocytozę o 30% po dodaniu do studzienek bezpośrednio przed dodaniem SH-SY5Y.

Naprawiono SH-SY5Ys, potwierdzono, że wystawiamy fosfatydyloserynę za pomocą fluorescencyjnej sondy Annexin 5. Natomiast żywe SH-SY5Y były ujemne dla barwienia Aneksyną 5. Przetestowano kilka długości czasu trwania fagocytozy, od 1 do 5 godzin, przy użyciu stopniowego dodawania ładunku fagocytarnego.

Całkowitą długość tego protocalla można skrócić, przygotowując ładunek fagocytarny i barwiąc makrofagi iPSC równolegle. Jeśli chcesz to zrobić, ustal wcześniej terminy i wykorzystaj swoje inkubacje do przygotowania rozwiązań na przyszłe kroki.