Name: Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj szybką metodę obrazowania in vitro do ilościowej oceny fagocytozy martwych komórek nerwiaka zarodkowego przez makrofagi iPSC. Protokół umożliwia skalowalne badania neuroimmunologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Val Millar i dr Sohaib Nizami za pomoc w mikroskopii o wysokiej zawartości oraz dr Danielowi Ebnerowi za dostęp do mikroskopów o wysokiej zawartości. Ponadto autorzy dziękują dr Emmie Mead za porady dotyczące opracowywania testów oraz pani Cathy Browne za wsparcie w zakresie iPSC. Prace te były wspierane przez Alzheimer's Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, numer grantu ARUK-2020DDI-OX), z dodatkowym wsparciem dla James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) z Oxford Martin School LC0910-004; Nagroda Monument Trust Discovery Award przyznana przez Parkinson's UK (J-1403); nagrody MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 oraz Momentum MC_PC_16034 Awards.

<ol><li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+the+dead%3A+apoptotic+cell+sensing%2C+recognition%2C+engulfment%2C+and+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbour+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748(2013).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).</li>
<li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li>
<li>Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+in+the+brain%3A+Homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease.</a> Frontiers in Immunology. 10, 790(2019).</li>
<li>Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+inflammation+and+phagocytosis+in+Alzheimer%27s+disease%3A+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).</li>
<li>Brown, G. C., Neher, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of live neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).</li>
<li>Scott-Hewitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+externalization+of+phosphatidylserine+mediates+developmental+synaptic+pruning+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 105380(2020).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+splicing+isoform+of+GPR56+mediates+microglial+synaptic+refinement+via+phosphatidylserine+binding%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 104136(2020).</li>
<li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+externalization+results+from+and+causes+neurite+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li>
<li>Skjesol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TLR4+adaptor+TRAM+controls+the+phagocytosis+of+Gram-negative+bacteria+by+interacting+with+the+Rab11-family+interacting+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2.</a> PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684(2019).</li>
<li>Wong, K., Li, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+induces+elevation+of+intracellular+calcium+and+phosphatidylserine+externalization+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets.</a> Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).</li>
<li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), (2013).</li>
<li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li>
<li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li>
<li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+Alzheimer%27s+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout%2C+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research & Therapy. 12, 151(2020).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer%27s+disease+not+evident+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li>
<li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+robust+Z%27+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699(2020).</li>
<li>Fernandes, H. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+Stress+and+Autophagic+Perturbations+Lead+to+Elevated+Extracellular+%CE%B1-Synuclein+in+GBA-N370S+Parkinson%27s+iPSC-Derived+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular α-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).</li>
<li>Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+neurons+without+inflammation+by+microglial+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).</li>
<li>Kober, D. L., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2-ligand+interactions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">TREM2-ligand interactions in health and disease.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Witting, A., Müller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+clearance+of+apoptotic+neurons+by+microglia%2Fbrain+macrophages+in+vitro%3A+Involvement+of+lectin-%2C+integrin-%2C+and+phosphatidylserine-mediated+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).</li>
<li>Hsieh, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+TREM2+ligands+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+neuronal+cells+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).</li>
<li>Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+microglial+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+the+brain+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease.</a> Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49(2018).</li>
<li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li>
<li>Shirotani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminophospholipids+are+signal-transducing+TREM2+ligands+on+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikroglej pełni ważne funkcje, które wpływają na inicjację i progresję chorób neurodegeneracyjnych, w tym fagocytozę neuronów apoptotycznych. Upośledzona fagocytoza mikrogleju i niewłaściwa fagocytoza synaps są związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, chociaż mechanizmy leżące u podstaw i przyczynowość nie są dobrze poznane 4,23. W tym artykule przedstawiono test fagocytozy do pomiaru fagocytozy komórek apoptotycznych za pomocą makrofagów iPSC, z odczytem obrazowania poklatkowego żywych komórek lub mikroskopią o wysokiej zawartości komórek stałych, lub kombinacją obu w jednym teście. Ta wszechstronność oznacza, że test może być używany do badania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych w czasie w kilku studzienkach lub wykorzystywany do badań przesiewowych o wysokiej zawartości z wieloma schorzeniami lub zabiegami. Ponieważ test o wysokiej zawartości jest ustalany w jednym punkcie czasowym, można jednocześnie przygotować wiele płytek testowych. Test o wysokiej zawartości ma potencjalną przydatność w charakteryzowaniu makrofagów/mikrogleju z wariantami genetycznymi związanymi z chorobą lub w badaniach przesiewowych inhibitorów małych cząsteczek pod kątem zmian w fagocytozie. Test można również łatwo dostosować do badania fagocytozy innych modeli mikrogleju lub potencjalnie astrocytów. Test fagocytozy można potencjalnie multipleksować za pomocą barwienia żywych komórek, np. mitochondriów, wapnia lub wskaźników ROS, a także można przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne po utrwaleniu dla białek będących przedmiotem zainteresowania. W porównaniu z istniejącymi testami fagocytozy, które wykorzystują apoptotyczne komórki neuronalne, głównymi zaletami tego protokołu jest to, że przygotowanie ładunku fagocytarnego jest stosunkowo proste i szybkie, a w efekcie uzyskuje się jednolity produkt. Inne testy indukują apoptozę neuronów lub SH-SY5Y z S-nitrozo-L-cysteiną przez 2 godziny25, kwasem okadaikowym przez 3 godziny22, staurosporyną przez 4-16 godzin 26,27,28,29 lub promieniowaniem UV przez 24 godziny30 i mogą prowadzić do powstania komórek na różnych etapach apoptozy. Co więcej, o ile autorzy wiedzą, obrazowanie żywych komórek i odczyty obrazowania o wysokiej zawartości nie zostały wcześniej opisane. Głównym ograniczeniem stosowania utrwalania paraformaldehydu do przygotowania ładunku fagocytarnego jest to, że nie podsumowuje on w pełni procesu apoptozy, ponieważ utrwalenie zapobiega rozpadowi komórek na ciała apoptotyczne, które prawdopodobnie zostaną szybciej fagocytozowane ze względu na ich mniejszy rozmiar. Nie wiadomo, jaki wpływ ma fiksacja na wydzielanie nukleotydowych sygnałów "znajdź mnie" (np. ATP, UDP) z komórki docelowej, które przyciągają fagocyty. Podobnie jak komórki apoptotyczne, utrwalone SH-SY5Y wykazują pewną przepuszczalność błony dla jodku propidyny. Przepuszczalność błony jest związana z uwalnianiem sygnałów "znajdź mnie"; jednak nie zostało to zbadane w utrwalonych SH-SY5Y, a jeśli nukleotydy zostaną uwolnione zbyt szybko, zostaną zmyte przed dodaniem SH-SY5Ys do makrofagów iPSC.
Pierwszym krytycznym krokiem w protokole jest barwienie martwych SH-SY5Y estrem STP wrażliwego na pH czerwonego barwnika fluorescencyjnego. Barwnik ten szybko i kowalencyjnie reaguje z wolnymi aminami pierwszorzędowymi na powierzchni martwych SH-SY5Ys. Czas barwienia nie musi być optymalizowany; Należy jednak zachować ostrożność przy obchodzeniu się z barwnikiem przed etykietowaniem. Reakcji znakowania nie wolno przeprowadzać w zawierających wolne aminy. Ponadto istnieje ryzyko wytrącania się, jeśli wsad DMSO zostanie rozcieńczony w zimnym buforze wodnym lub w wysokim stężeniu końcowym. Osady pojawią się pod mikroskopem jako gęste ciemne obiekty. Dodatkowo wrażliwy na pH roztwór barwnika przykleja się do zwykłych plastikowych probówek wirówkowych i powoli się zmywa; Dlatego na etapie etykietowania zalecane są tuby o niskim stopniu wiązania. Zastosowanie barwnika wrażliwego na pH, zamiast barwnika trwale fluorescencyjnego, pomaga w identyfikacji pochłoniętych cząstek w porównaniu z cząstkami sąsiadującymi z błoną plazmatyczną. Ponieważ występuje pewna fluorescencja przy neutralnym pH, gęstość ładunku fagocytarnego i makrofagów iPSC musi być utrzymywana na tyle niska, aby można było ją dokładnie segmentować, chociaż na tyle wysoka, aby wychwycone zostały liczne zdarzenia fagocytarne. Mikroskopia o wysokiej zawartości była w stanie dokładnie zidentyfikować fagocytozę ze średnią gęstością ładunku w odwiercie (ponad 2 SH-SY5Ys na makrofag iPSC). I odwrotnie, ze względu na słabszą czułość mikroskopu w widmie głębokiej czerwieni, segmentacja makrofagów iPSC w danych obrazowania poklatkowego żywych komórek była mniej pewna i konieczne było użycie bardzo niskiej gęstości ładunku, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wyników fałszywie dodatnich (1 SH-SY5Y na każde dwa makrofagi iPSC). Walidację prawidłowej segmentacji i gęstości ładunku należy przeprowadzić na podstawie porównań między odwiertami niepoddanymi działaniu cytochalazyny D i odwiertów poddanych działaniu cytochalazyny D. W dobrze zoptymalizowanym teście cytochalazyna D powinna zmniejszyć średnią liczbę plamek na komórkę o 90% w porównaniu z próbkami nietraktowanymi.
Kolejnym krytycznym krokiem w protokole jest barwienie makrofagami iPSC, które pozwala na identyfikację komórki i segmentację w analizie obrazu, tak aby wszelkie zewnętrzne SH-SY5Y były wykluczone ze zliczania. Zalecany barwnik przenika komórki, przekształca się w nierozpuszczalny produkt fluorescencyjny w cytoplazmie, utrwala się i jest nietoksyczny (patrz tabela materiałów). Etap barwienia został zoptymalizowany pod kątem użycia makrofagów iPSC z testem fagocytozy obrazowania o wysokiej zawartości i sugerujemy, że należy go ponownie zoptymalizować, jeśli stosowane są inne typy komórek. Czas barwienia komórek można wydłużyć, aby poprawić osadzanie się nierozpuszczalnego produktu fluorescencyjnego w komórkach. Jeśli stężenie barwnika jest zoptymalizowane, należy zachować ostrożność, aby uniknąć toksycznych poziomów nośnika rozpuszczalnika organicznego.
Trzecim czynnikiem decydującym o powodzeniu testu jest analiza danych. Dostarczone potoki analizy mają charakter orientacyjny, a nie nakazowy, ponieważ różnice w intensywności barwienia lub morfologii komórek mogą zmniejszyć skuteczność segmentacji potoków zgodnie z zapisem. W związku z tym wymagane będą pewne optymalizacje, z testowaniem rurociągu na odpowiednich kontrolach dodatnich i ujemnych, a parametry, które powinny być optymalizowane, są wskazane w tekście protokołu. Kontrole ujemne powinny obejmować stan, w którym makrofagi iPSC są wstępnie traktowane silnym inhibitorem fagocytozy, takim jak cytochalazyna D, przed dodaniem SH-SY5Ys. Inną możliwą kontrolą ujemną jest dodanie SH-SY5Ys do wcześniej nieleczonych studzienek makrofagów iPSC na końcu testu, 10 minut przed utrwaleniem, co pozwala na pewne osiadanie ładunku, ale jest zbyt krótkie, aby wystąpiła znaczna ilość fagocytozy. Zdarzenie fagocytozy definiuje się jako obiekt o czerwonej fluorescencji w granicach makrofaga iPSC, zdefiniowany przez algorytm oprogramowania przy użyciu kanału głębokiej czerwonej fluorescencji. Jeśli segmentacja komórek jest słaba (ryc. 2), wiele niefagocytozowanych SH-SY5Y w bliskim sąsiedztwie makrofagów iPSC może zostać błędnie włączonych do analizy, tj. wyniki fałszywie dodatnie. Najważniejszym czynnikiem w osiągnięciu dobrej segmentacji jest ścisłe rozgraniczenie makrofagów iPSC. Segmentacja dla obu analiz jest zautomatyzowana, więc nie jest możliwe uzyskanie idealnej segmentacji dla każdej komórki; Jednak kilka parametrów można dostosować, aby segmentacja była bardziej optymalna, używając kilku obrazów testowych jako odniesienia. Kontrola cytochalazyny D jest ważna dla oceny optymalnej segmentacji, ponieważ duża liczba zdarzeń fagocytarnych wykrytych w tym stanie wskazuje, że segmentacja jest nieoptymalna. Optymalizacja potoku analizy danych powinna być w idealnym przypadku powtarzana do momentu, gdy liczba zdarzeń fagocytarnych na komórkę będzie o 80%-90% niższa w stanie cytochalazyny D w porównaniu z brakiem inhibitora.
Problemy z testem fagocytozy, które są najbardziej prawdopodobne, to: (1) słaba fluorescencja wrażliwa na pH w kontrolach pozytywnych, (2) rzadki lub nierównomierny rozkład makrofagów pod koniec testu lub (3) wysoka liczba wyników fałszywie dodatnich w analizie z niefagocytozowanych SH-SY5Y. Rozwiązywanie problemów ze słabą fluorescencją wrażliwą na pH powinno najpierw sprawdzić, czy barwienie SH-SY5Ys spowodowało powstanie osadu komórkowego o silnym purpurowym kolorze. Jeśli kolor jest słaby, upewnij się, że użyto świeżego barwnika, upewnij się, że bufor do etykietowania jest wolny od amin, dodaj dodatkowe płukanie do SH-SY5Ys przed barwieniem, sprawdź, czy zabarwiono prawidłową liczbę SH-SY5Y, upewnij się, że nie ma widocznych osadów barwnika i zoptymalizuj stężenie barwnika na etykiecie. Jeśli SH-SY5Y są silnie wybarwione, sprawdź, czy stężenie dodane do płytki testowej jest prawidłowe i upewnij się, że makrofagi iPSC są zdrowe i nie są zbyt stare. Drugi rodzaj problemu, nierównomierne rozmieszczenie makrofagów, może wynikać z utraty komórek podczas pipetowania i należy podjąć kroki w celu zmniejszenia sił pipetowania odczuwanych przez komórki, unikając końcówek o wąskich otworach. Jeśli problem będzie się powtarzał, skróć czas inkubacji ładowania makrofagów iPSC barwnikiem przepuszczalnym dla komórek. Trzeci problem, dotyczący błędnego włączenia do analizy cząstek niefagocytozowanych, wskazuje, że konieczna jest dalsza optymalizacja potoku analizy. Rozwiązywanie problemów powinno w pierwszej kolejności koncentrować się na segmentacji komórek i na tym, czy oprogramowanie obejmuje sąsiednie obiekty. Konkretne parametry, które można dostosować, są sugerowane w uwagach poniżej odpowiednich kroków (kroki 6.1.11-6.1.15 dla analizy poklatkowej na żywo i kroki 6.2.4-6.2.8 dla analizy o wysokiej zawartości). Jeśli segmentacja komórek nie może być dalej ulepszona, analiza o wysokiej zawartości obejmuje dodatkowy etap (krok 6.2.8), który wyklucza nieprawidłowo segmentowane makrofagi iPSC. Co więcej, moduł, który filtruje akceptowane miejsca fluorescencji wrażliwej na pH w makrofagach iPSC, może być zoptymalizowany, zwiększając intensywność progową akceptowanych obiektów, co powinno pomóc w wykluczeniu niefagocytozowanych SH-SY5Y (krok 6.1.17 dla analizy poklatkowej żywych komórek i krok 6.2.11 dla analizy o wysokiej zawartości).
Opracowaliśmy dwa rodzaje odczytu mikroskopowego dla testu fagocytozy, z których każdy ma zalety i ograniczenia. Obrazowanie poklatkowe żywych komórek ma tę zaletę, że dostarcza dodatkowych informacji na temat kinetyki fagocytozy i jest szerzej dostępne niż platformy obrazowania o wysokiej zawartości. Zalecane oprogramowanie typu open source jest niezależne od źródła mikroskopu i może być używane z dowolnym dobrej jakości mikroskopem fluorescencyjnym, z funkcją poklatkową żywych komórek lub bez niej. Głównym ograniczeniem obrazowania żywych komórek jest ograniczona czułość i optyka, co utrudnia wykrycie i przeprowadzenie dobrej segmentacji makrofagów iPSC. Ograniczenie to można złagodzić, wydłużając czas barwienia makrofagów iPSC lub przełączając się na bardziej czuły mikroskop, jeśli jest dostępny. Test fagocytozy obrazowania o wysokiej zawartości jest zalecanym odczytem, jeśli dostępny jest system obrazowania o wysokiej zawartości. Systemy obrazowania o wysokiej zawartości zapewniają większą przepustowość i bardziej wiarygodne dane, co umożliwia wykorzystanie tego testu do badań przesiewowych, w których oczekuje się solidnego Z' wynoszącego ≥0,7 dla "liczby plamek na komórkę" wyjściowej20. W porównaniu z metodą poklatkową żywych komórek, odczyt mikroskopii o wysokiej zawartości ma wyższą czułość, wyższy stopień automatyzacji i szybkości, można przetwarzać więcej studzienek i pól obrazowania oraz tworzyć obrazy konfokalne o wysokiej rozdzielczości. Segmentacja komórek jest bardziej efektywna przy dobrych obrazach, a segmentacja jest dodatkowo wspomagana przez oprogramowanie do analizy obrazowania o wysokiej zawartości, które zapewnia więcej metod segmentacji komórek odpowiednich dla komórek o bardzo nieregularnych kształtach. Oprogramowanie do analizy obrazowania o wysokiej zawartości obliczyło również więcej parametrów fagocytozy w porównaniu z oprogramowaniem typu open source, takich jak procent komórek fagocytarnych. Głównym ograniczeniem testu fagocytozy o wysokiej zawartości jest koszt i dostępność systemu obrazowania i oprogramowania analitycznego.
Podsumowując, ilościowy test fagocytozy przedstawiony w tym artykule jest użytecznym narzędziem do modelowania fagocytozy mikrogleju martwych neuronów in vitro. Mikroglej jest modelowany przez makrofagi iPSC, a martwe neurony są modelowane przez SH-SY5Ys utrwalone paraformaldehydem. Chociaż nie są to najbardziej autentyczne modele mikrogleju i martwych/apoptotycznych neuronów, są one łatwe do przygotowania i skalowalne. Sam test jest bardzo wszechstronny, ze szczegółowymi dwoma rodzajami odczytu obrazowania i ma potencjał do dostosowania do stosowania z różnymi modelami monokultur mikrogleju/makrofagów lub innym typem komórek, aby działać jako ładunek fagocytarny. Odczyt obrazowania o wysokiej zawartości jest korzystny dla uzyskania danych ilościowych i może być skalowany w celu oznaczenia małocząsteczkowych modulatorów fagocytozy lub badań przesiewowych wariantów genetycznych w makrofagach iPSC. Ponieważ jednak systemy obrazowania o wysokiej zawartości są drogie i wymagają dużej ilości danych, w protokole uwzględniono alternatywny odczyt obrazowania przy użyciu mikroskopu poklatkowego z żywymi komórkami, który w razie potrzeby można zastąpić dowolnym dobrej jakości konwencjonalnym mikroskopem fluorescencyjnym.

Mikrogleje są makrofagami rezydującymi w tkance mózgowej, a do ich funkcji należą nadzór odpornościowy, koordynowanie odpowiedzi zapalnych na urazy/infekcje, przebudowa synaptyczna oraz fagocytoza martwych komórek, mieliny, agregatów białkowych i patogenów. Fagocytoza to proces, w którym mikrogleje rozpoznają ładunek za pomocą receptorów powierzchniowych i reorganizują swój cytoszkielet, aby pochłonąć obiekt do fagosomu, który następnie łączy się z lizosomami w celu degradacji ładunku. Zdrowe mikrogleje fagocytują apoptotyczne komórki mózgu, aby usunąć je, zanim ulegną one nekrozie1. Fagocytoza apoptotycznych komórek jest również znana jako efersocytoza i wymaga ekspozycji sygnału „zjedz mnie” w postaci fosfatydyloseryny przez obumierającą komórkę2. Liczne receptory mikroglejów wiążą się bezpośrednio z fosfatydyloseryną, w tym TIM-4, BAI1, Stabilin-2 i TREM2. Receptory TAM mikroglejów (np. MERTK) i integryny wiążą się z fosfatydyloseryną pośrednio, wykorzystując odpowiednio białka pomocnicze GAS6 lub MFG-E8. Do rozpoznania obumierających komórek niezbędne mogą być inne sygnały „zjedz mnie”, do których należą zmiany w glikozylacji lub ładunku białek powierzchniowych; ekspresja wewnątrzkomórkowych białek ICAM3, kalretikuliny i aneksyny-I na powierzchni komórki; utlenione LDL lub powlekanie apoptotycznej komórki produkowanym przez mikrogleje kompleментом C1q1,2.
Choroby neurodegeneracyjne, w tym choroba Parkinsona, choroba Alzheimera, otępienie czołowo-skroniowe oraz stwardnienie zanikowe boczne, wiązane są z upośledzeniem funkcji mikrogleju, w tym z gromadzeniem się produktów przemiany materii w mózgu, takich jak martwe komórki, fragmenty mieliny i agregaty białkowe, a także z nadmiernymi odpowiedziami zapalnymi na te bodźce3. Fagocytoza może być upośledzona w chorobach neurodegeneracyjnych i przyczyniać się do patologii w wyniku połączenia starzenia się organizmu, stanu zapalnego lub specyficznych genetycznych wariantów ryzyka4,5. Z drugiej strony, dowody z modeli zwierzęcych chorób neurodegeneracyjnych wskazują, że mikroglej może niewłaściwie fagocytować żywe neurony lub synapsy6,7,8. Mechanizm ten jest prawdopodobnie inicjowany przez ekspozycję fosfatydyloseryny na uszkodzonych neurytach, która jest bezpośrednio wykrywana przez receptory fagocytozy mikrogleju TREM2 lub GPR56, albo pośrednio przez rozpuszczalne białko dopełniacza C1q pokrywające membranę wzbogaconą w fosfatydyloserynę, co prowadzi do fagocytozy zapośredniczonej przez CR39,10,11.
Testy fagocytozy in vitro, stosowane np. do oceny wpływu fenotypowego wariantu genetycznego ryzyka w mikrogleju, są często przeprowadzane z użyciem niefizjologicznych ładunków, takich jak kulki lateksowe4. Stosuje się również bakterie znakowane fluorescencyjnie oraz zymosan, które są fizjologiczne, lecz nie mają związku z chorobami neurodegeneracyjnymi. Niefizjologiczne ładunki fagocytarne mogą służyć do wykrywania defektów w podstawowym mechanizmie pochłaniania fagocytarnego, jednak nie pozwalają na dokładne modelowanie pierwszego etapu „rozpoznawania” w fagocytozie apoptotycznych neuronów. Wielkość, kształt, sztywność i rodzaj ładunku determinują również aktywowane wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne, co prowadzi do różnych stanów aktywacji mikrogleju. Na przykład bakterie E.coli są małe i sztywne, w przeciwieństwie do ludzkich komórek, a lipopolisacharydy na ich powierzchni są rozpoznawane przez receptor Toll-podobny 4 (TLR4), który aktywuje fagocytozę oraz prozapalne szlaki sygnalizacyjne2,12.
W kontekście badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi bardziej odpowiednim ładunkiem fagocytarnym byłoby taki, który wykazuje obecność fosfatydyloseryny na błonach komórkowych ssaków, a najlepiej pochodzenia ludzkiego i neuronalnego, aby uwzględnić sygnały, z którymi prawdopodobnie spotkają się mikrogleje. W tym protokole fagocytozy jako model neuronów wybrano linię komórkową neuroblastoma człowieka SH-SY5Y, która jest łatwa w hodowli. Trwała ekspozycja fosfatydyloseryny na powierzchni została sztucznie wywołana za pomocą paraformaldehydu, o którym wcześniej wykazano, że powoduje ekspozycję fosfatydyloseryny w płytkach krwi13. Jako model komórkowy mikrogleju wykorzystano ludzkie makrofagi iPSC, które naśladują ontogenezę i profil transkrypcyjny ludzkiego mikrogleju i wykazują zdolność do fagocytozy14,15,16,17. Makrofagi iPSC nie są najbardziej autentycznym dostępnym modelem mikrogleju, np. nie naśladują morfologii mikrogleju; można jednak zastąpić je bardziej autentycznym modelem monokultury mikrogleju iPSC, jeśli jest to pożądane, na przykład zgodnie z Haenseler et al.15. Ludzkie modele iPSC są preferowane w badaniach nad neurodegeneracją w porównaniu z pierwotnym mikroglejem gryzoni ze względu na obawy dotyczące ograniczonego nakładania się modułów transkrypcyjnych mikrogleju obserwowanych w tkankach dotkniętych chorobami neurodegeneracyjnymi u ludzi i myszy18. Martwe komórki SH-SY5Y barwi się barwnikiem wrażliwym na kwasy, który fluorescuje słabo przy pH obojętnym i silniej wewnątrz fagolizosomów makrofagów iPSC po fagocytozie. Zastosowanie barwnika wrażliwego na kwasy poprawia dokładność wykrywania zdarzeń fagocytarnych, zapewniając wszechstronność w odczytach z makrofagów żywych i utrwalonych19. Niniejszy protokół opisuje zarówno obrazowanie fagocytozy w czasie rzeczywistym (time-lapse) na żywych komórkach, jak i utrwalony test obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging) dla fagocytozy, przy zastosowaniu tych samych etapów przygotowania komórek przed odczytem (Rysunek 1).
<img alt="Schemat procesu przekształcenia komórek SH-SY5Y w makrofagi iPSC; barwienie komórek, obrazowanie, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1Schemat metodologii. Schemat testu fagocytozy, w którym przygotowanie komórek SH-SY5Y oraz barwienie makrofagów pochodzących z iPSC przeprowadzane są równolegle, a następnie komórki SH-SY5Y są naddawane pipetą na makrofagi iPSC. Następnie przeprowadza się natychmiastowe obrazowanie poklatkowe żywych komórek lub komórki są inkubowane w 37 °C/5% CO2 przez wymagany czas i utrwalone przed przeprowadzeniem wysokotreściowej mikroskopii (high-content microscopy). PFA: paraformaldehyd, HBM: buforowane HEPES medium bez czerwieni fenolowej, pHr: roztwór pH-czułego czerwonego barwnika fluorescencyjnego STP Ester, PRFMM: medium dla makrofagów bez czerwieni fenolowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>15 ml stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>Do wirowania komórek</td></tr><tr><td>2-20 &mikro; L, 20-200 i mikro; L, 100-1000 i mikro; L Mikropipety</td><td></td><td></td><td></td>jednokanałowe</tr><tr><td>2-merkaptoetanol 50 mM</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>Składnik pożywki fabrycznej</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd w PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>Do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa, poddawana</td><td></td><td></td><td></td>działaniu kultur tkankowych</tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa AggreWell-800</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34815</td><td>24-dołkowa płytka Microwell o niskiej przyczepności do tworzenia ciał zarodkowych</td></tr><tr><td>Annexin V-FITC Zestaw do barwienia / wykrywania apoptozy</td><td>Abcam</td><td>ab14085</td><td>Zestaw do barwienia aneksyny V-FITC, jako test do kontroli jakości utrwalonych SH-SY5Ys. Zestaw zawiera bufor wiążący aneksynę, aneksynę V-FITC i jodek propidyny.</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik</td><td></td><td></td><td></td>komórek</tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td>stołowa</tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td>stołowa</tr><tr><td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, poddana działaniu kultur tkankowych,, 96-dołkowa z pokrywką</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td>96-dołkowa mikropłytka do hodowli tkankowej (TC) z czarnymi ściankami i optycznie przezroczystym dnem, do oznaczania</td></tr> <tr><td>fagocytozyOprogramowanie</td><td></td><td></td> CellProfiler <td>Oprogramowanie typu open source do analizy obrazów fagocytozy uzyskanych za pomocą mikroskopu poklatkowego żywych komórek. Pobierz za darmo ze strony internetowej (http://cellprofiler.org/), protokół ten korzystał z wersji 2.2.0.</td></tr><tr><td>Barwnik CellTracker Deep Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34565</td><td>Ciemnoczerwony fluorescencyjny, przepuszczalny dla komórek, reaktywny barwnik sukcynimidylowo-reaktywny z estrem sukcynimidylu do barwienia cytoplazmy makrofagów iPS. Rozpuść barwnik CellTracker Deep Red w DMSO do 2 mM (1,4 mg/ml). Stosować przy 1 &mu; M, przez rozcieńczenie materiału wyjściowego DMSO pożywką makrofagową.</td></tr><tr>Komora <td></td><td></td><td></td><td>bezpieczeństwa laminarnego przepływu powietrza klasy 2</td></tr><tr><td>Butla</td><td></td><td></td> gazowa CO2 <td>Akcesorium do</td></tr><tr><td>inkubatora EVOS FL Auto CO2, ustawione na 37&deg; C i 5 % CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>System przechowywania i analizy danych obrazowych Columbus</td><td>Perkin Elmer</td><td>Columbus</td><td>Platforma przechowywania i analizy danych dla Opera Phenix. Obsługuje wszystkie główne instrumenty przesiewowe o wysokiej zawartości.</td></tr><tr><td>Cytochalazyna D</td><td>Cayman</td><td>11330</td><td>Leczenie kontrolą ujemną w teście fagocytozy. Rozpuścić w DMSO do 10 mM i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20&deg; C, unikaj dalszych cykli zamrażania i rozmrażania. Stosować przy końcowym stężeniu 10 &mikro;M.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>Składnik nośnika SH-SY5Y</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Rozpuszczalnik do barwników CellTracker i pHrodo</td></tr><tr><td>EVOS FL System automatycznego obrazowania</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMF4300</td><td>Mikroskop do obrazowania poklatkowego z żywymi komórkami</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube CY5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4656</td><td>Akcesorium do EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube DAPI</td><td>Thermo Akcesorium Fisher</td><td>AMEP4650</td><td>do EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube RFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4652</td><td>Akcesorium do</td></tr><tr><td>inkubatora scenicznego</td> EVOS FL Auto EVOS <td>Thermo Fisher</td><td>AMC1000</td><td>Akcesorium do automatycznej</td></tr><tr><td>płodowej surowicy bydlęcej</td><td>EVOS FL Sigma</td><td>F4135</td><td>Składnik podłoża SH-SY5Y</td></tr><tr><td>Cytometr</td><td></td><td></td><td></td>przepływowy</tr><tr><td>Cytometria przepływowa oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td>analityczne</tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free, z kwalifikacją hESC, matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu</td><td>Invitrogen</td><td>A1413302</td><td>matryca błony podstawnej z kwalifikacją hESC do hodowli iPSC</td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>Składnik pożywki zarówno fabrycznej, jak i makrofagowej</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>BE 10-547F</td><td>Hank' s zbilansowany roztwór soli do etapów mycia</td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany BMP4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td>Składnik pożywki dla ciała embrionalnego</td></tr><tr><td>Ludzka rekombinowana IL-3</td><td>Gibco</td><td>PHC0033</td><td>Składnik pożywek fabrycznych i makrofagowych Ludzki</td></tr><tr><td>rekombinowany SCF</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-695</td><td>Składnik pożywki dla ciała embrionoidalnego</td></tr><tr><td>Ludzka rekombinowana pożywka VEGF</td><td>Gibco</td><td>PHC9394</td><td>Składnik pożywki dla ciała embrionalnego</td></tr><tr><td>Roztwór do obrazowania żywych komórek</td><td>Thermo Fisher</td><td>A14291DJ</td><td>Bezczerwone pożywki buforowane przez HEPES bez fenolu do znakowania martwych SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>Probówki 2 ml o niskim poziomie wiązania z białkami</td><td>Eppendorf</td><td>30108.132</td><td>Do barwienia SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHC9501</td><td>Składnik pożywek fabrycznych i makrofagowych</td></tr><tr><td>mTeSR1 Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Pożywka iPSC</td></tr><tr>Wielokanałowa pipeta <td></td><td></td><td>20-200 uL</td><td>Do pracy z płynami na 96-dołkowej płytce</td></tr><tr><td>Odczynnik NucBlue Live ReadyProbes</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37605</td><td>Hoechst 33342 w butelce z zakraplaczem do barwienia jąder makrofagów iPS, należy użyć 0,5 kropli/ml w pożywce makrofagowej.</td></tr><tr><td>System badań przesiewowych o wysokiej zawartości</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14000000</td><td>mikroskop do obrazowania o wysokiej zawartości, używany z oprogramowaniem Harmony w wersji 4.9.</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Składnik pożywki fabrycznej, makrofagowej i SH-SY5Y</td></tr><tr><td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36011</td><td>wrażliwy na pH czerwony barwnik fluorescencyjny do oznaczania martwych SH-SY5Ys. Rozpuść proszek estru pHrodo iFL Red STP w DMSO do stężenia 5 mg/ml. Na każdy 1 milion SH-SY5Ys dodaj 2,5 &mu; L (12,5 &mu; g) z zapasu pHrodo iFL Red STP Ester do wstępnie ogrzanych komórek zawieszonych w roztworze do obrazowania żywych komórek.&nbsp;</td></tr><tr><td>Serologiczny napełniacz do pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolba T175, poddana działaniu</td><td></td><td></td> kultur tkankowych <td>Naczynie do różnicowania prekursorów makrofagów iPSC, znane jako "Fabryki"</td></tr> <tr><td>Kolba</td><td></td><td></td> T75 <td>Naczynie do hodowli SH-SY5Y</td></tr><tr><td>Przezroczyste zgrzewarki do płytek</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676001</td><td>Do przechowywania i transportu płytek testowych</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1X), bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>Bufor dysocjacji komórek zawierający rekombinowane enzymy podobne do trypsyny i 1,1 mM EDTA, użyj schludnego.</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna, ustawiona na 37& C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Pożywka z L-glutaminą, gentamycyną i czerwienią fenolową</td><td>Lonza</td><td>BE04-418F</td><td>Składnik pożywki fabrycznej i makrofagowej</td></tr><tr><td>Pożywka X-VIVO 15 z L-glutaminą; bez gentamycyny i czerwieni fenolowej</td><td>Lonza</td><td>04-744Q</td><td>Pożywka makrofagowa wolna od czerwieni fenolowej, do stosowania w fagocytozie bez dodatków i czynników wzrostu</td></tr></tbody></table>

test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów ipsc

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Mikroglej koordynuje reakcje neuroimmunologiczne w kilku chorobach neurodegeneracyjnych, w tym w chorobie Parkinsona i chorobie Alzheimera. Mikroglej usuwa martwe i umierające neurony w procesie efferocytozy, wyspecjalizowanej formy fagocytozy. Funkcja fagocytozy może zostać zakłócona przez środowiskowe lub genetyczne czynniki ryzyka, które wpływają na mikroglej. W artykule przedstawiono szybki i prosty protokół mikroskopii in vitro do badania efferocytozy mikrogleju w modelu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) mikrogleju, przy użyciu ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego (SH-SY5Y) znakowanej barwnikiem wrażliwym na pH dla ładunku fagocytarnego. Procedura skutkuje wysoką wydajnością martwych komórek nerwiaka zarodkowego, które wykazują powierzchniową fosfatydyloserynę, rozpoznawaną przez fagocyty jako sygnał "zjedz mnie". Test na 96-dołkowej płytce nadaje się do obrazowania poklatkowego żywych komórek lub płytkę można z powodzeniem utrwalić przed dalszym przetwarzaniem i określić ilościowo za pomocą mikroskopii o wysokiej zawartości. Mikroskopia o wysokiej zawartości komórek stałych umożliwia zwiększenie skali testu w celu badań przesiewowych inhibitorów małych cząsteczek lub oceny funkcji fagocytarnej linii iPSC wariantu genetycznego. Chociaż test ten został opracowany do badania fagocytozy całych martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC, test można łatwo dostosować do innych ładunków istotnych dla chorób neurodegeneracyjnych, takich jak synaptosomy i mielina oraz inne typy komórek fagocytarnych.

Obrazowanie typu time-lapse żywych komórek przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanym protokołem, wysiewając makrofagi pochodzące z iPSC typu dzikiego w zagęszczeniu 20 000 komórek na studzienkę. Zastosowano różne ilości komórek SH-SY5Y (od 10 000 do 30 000 na studzienkę, zgodnie z szacunkiem z liczenia komórek w kroku 3.1), a w niektórych studzienkach przeprowadzono preinkubację (1 h) z cytochalazyną D, inhibitorem fagocytozy, która służyła jako kontrola hamująca fagocytozę dla każdej ilości komórek SH-SY5Y. Obrazowanie rozpoczęto 40 min po dodaniu komórek SH-SY5Y, a obrazy rejestrowano w odstępach 5-minutowych przez kolejne 3 h (dane obejmują początkową 40-minutową przerwę). Reprezentatywny film time-lapse znajduje się w Dane uzupełniająceoraz przeanalizowano dane ilościowe przedstawione w Rycina 3Przy gęstości 10 000 komórek SH-SY5Y na studzienkę liczba fagocytowanych cząsteczek (punktów) na komórkę wzrastała liniowo w czasie i została zahamowana o około 50% przez cytochalazynę D. Hamowanie przez cytochalazynę D było słabsze od oczekiwanego, co najprawdopodobniej wynikało z niewystarczającej liczby powtórzeń technicznych lub biologicznych, ponieważ w każdej warunkach obrazowano tylko jedną studzienkę w trzech polach widzenia. Przy większych ilościach komórek SH-SY5Y na studzienieczkę (20 000 i 30 000) fagocytoza wykazywała słabą liniowość, co prawdopodobnie było spowodowane błędną segmentacją makrofagów i komórek SH-SY5Y pochodzących z iPSC w bardziej zagęszczonym polu widzenia.
Obrazowanie wysokotreściowe (high-content imaging) utrwalonych komórek przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanym protokołem, wykorzystując makrofagi iPSC typu dzikiego w zagęszczeniu 20 000 komórek na studzienkę oraz kilka różnych ilości komórek SH-SY5Y (od 10 000 do 80 000 na studzienkę); płytkę testową utrwalono i obrazowano po 5 h. Reprezentatywny obraz fagocytozy przedstawiono na Rysunku 4A, a przeanalizowane dane na Rysunku 4B17. Zwiększenie liczby komórek SH-SY5Y doprowadziło do wzrostu liczby fagocytowanych cząsteczek (punktów) na komórkę; jednak dwukrotny wzrost ilości SH-SY5Y spowodował jedynie 1,5-krotny wzrost liczby punktów na komórkę. Wskazuje to, że badane ilości nie są czynnikiem limitującym tempo fagocytozy. Następnie test fagocytozy z obrazowaniem wysokotreściowym zwalidowano przy użyciu kilku inhibitorów fagocytozy (Rysunek 4C)17. Inhibitory polimeryzacji aktyny, cytochalazyna D i jasplakinolid, znacząco zahamowały fagocytozę odpowiednio o 91% i 90%, gdy inkubowano je wstępnie przez 1 h przed fagocytozą. Solidny wskaźnik Z' testu przy zastosowaniu cytochalazyny D lub jasplakinolidu jako kontroli negatywnych obliczono odpowiednio na 0,7 i 0,820. Inhibitor zakwaszania lizosomów, bafilomycyna A1, znacząco zredukowała fagocytozę o 31% przy inkubacji przez 1 h przed fagocytozą. Słabszy efekt inhibitora zakwaszania lizosomów w porównaniu z inhibitorami aktyny sugeruje, że detekcja zinternalizowanego ładunku może nie wymagać pełnego zakwaszenia fagosomu. Rekombinowaną anneksynę V zastosowano jako kontrolę w celu specyficznego zablokowania fosfatydyloseryny eksponowanej na powierzchni komórek SH-SY5Y, co uniemożliwia receptorom fagocytarnym dostęp do liganda, który jest ważnym sygnałem „zjedz mnie”. Dodatek rekombinowanej anneksyny V znacząco zredukował fagocytozę o 30%, gdy została ona dodana do studzienek bezpośrednio przed dodaniem komórek SH-SY5Y. Potwierdzono, że utrwalone komórki SH-SY5Y eksponują fosfatydyloserynę, stosując fluorescencyjną sondę anneksyny V, podczas gdy żywe komórki SH-SY5Y były negatywne w barwieniu anneksyną V (Rysunek 4D).
Wcześniej wykazano, że receptor fagocytozy mikroglialnej TREM2 jest istotny dla fagocytozy apoptotycznych neuronów21. Mutacja R47H w genie TREM2 jest genem ryzyka późnej postaci choroby Alzheimera i przypuszcza się, że zmniejsza ona wiązanie ligandów przez TREM223. W celu oceny funkcji fagocytycznej TREM2 R47H oraz TREM2 KO przeprowadzono wysokoprzepustowy test fagocytozy na utrwalonych komórkach z wykorzystaniem izogenicznych linii makrofagów iPSC z wariantami WT/R47H/KO TREM217. Przetestowano kilka przedziałów czasu trwania fagocytozy od 1 do 5 h, stosując kaskadowe dodawanie ładunku fagocytowanego (40 000 komórek SH-SY5Y). Uzyskany sygnał wzrasta liniowo do 4 h, a następnie lekko stabilizuje się w 5 h (Rysunek 5)17. Obniżone tempo i wydajność fagocytozy (procent komórek z dodatnimi punktami) były widoczne w przypadku TREM2 KO w porównaniu z WT, podczas gdy mutant TREM2 R47H nie wykazał zaburzeń fagocytozy. Defekt fagocytyczny w komórkach TREM2 KO nie jest fenokopiowany przez mutację TREM2 R47H, co prawdopodobnie wynika z faktu, że funkcja TREM2 jest wystarczająca do wspierania prawidłowej fagocytozy.
<img alt="Wykres z mikroskopii fluorescencyjnej, plamki phrodo w czasie, komórki SH-SY5Y; wpływ cytochalazyny D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykładowe dane z analizy fagocytozy w czasie w żywych komórkach. Pobieranie martwych komórek SH-SY5Y przez makrofagi iPSC typu dzikiego BIONi010-C (ECACC ID: 66540023), obrazowane w odstępach 5 min przez 3 h. Czasy przedstawione na wykresie liczone są od rozpoczęcia fagocytozy, wliczając pierwsze 40 min bez pomiaru. Wykreślono średnią liczbę plamek na komórkę z trzech powtórznych studzienek. Fagocytoza 10 000 komórek SH-SY5Y jest hamowana przez 10 µM cytochalazyny D przy 1 h wstępnej inkubacji, podczas gdy przy większej liczbie komórek SH-SY5Y (20 000 i 30 000) uzyskano nieoptymalną ilościową ocenę fagocytozy. Średnia ± odchylenie standardowe (SD), N = 1 eksperyment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie komórkowe i wykres liczby zarodników: obrazy mikroskopowe i analiza danych komórek SH-SY5Y." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Optymalizacja i walidacja wysokoprzepustowego testu fagocytozy w utrwalonych komórkach. (A) Reprezentatywny obraz mikroskopii wysokoprzepustowej komórek SH-SY5Y fagocytowanych przez makrofagi iPSC typu dzikiego BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Przedstawiono punkt czasowy 3 h z użyciem 40 000 komórek SH-SY5Y. Kanały fluorescencji są nałożone; barwienie makrofagów iPSC zaznaczono na czerwono, jądra na niebiesko, a komórki SH-SY5Y na żółto. Panel wstawkowy stanowi fragment obrazu powiększony 3x. (B) Liczba punktów na komórkę fagocytowanych martwych komórek SH-SY5Y po 5 h, przy zastosowaniu różnych ilości dodanego materiału do makrofagów iPSC typu dzikiego. Średnia ± błąd standardowy średniej (SEM), dla N = 3 zbiorów. (C) Fagocytoza (3 h) jest hamowana przez 10 µM cytochalasyny D (Cyt), 1 µM bafilomycyny A1 (Baf), 1 µM jasplakinolidu (przy 1 h wstępnej inkubacji; Jas) oraz 13 µg/mL rekombinowanej anneksyny V (dodanej jednocześnie z martwymi komórkami SH-SY5Y; Ann). Jako kontrolę negatywną (-ve) wykorzystano makrofagi iPSC bez dodanych komórek SH-SY5Y, a kontrolą dodatnią (+ve) były nieleczone makrofagi iPSC z dodatkiem komórek SH-SY5Y. Dane znormalizowano do średniej dla powtórzenia eksperymentu. Średnie ± SEM, dla N = 3-6 zbiorów i dwóch linii komórkowych typu dzikiego (SFC840-03-03, charakterystyka tej linii opisana w (Fernandes et al.21) oraz BIONi010-C). Jednoczynnikowa analiza ANOVA z testem post-hoc Dunnetta, porównania do komórek nieleczonych. *p &lt; 0.05, ***p &lt; 0.001. (D) Świeżo utrwalone komórki SH-SY5Y barwią się jednorodnie pod kątem ekspozycji fosfatydyloseryny (anneksyna V-FITC) i mają ograniczoną przepuszczalność błony komórkowej (jodek propidyny). Żywe komórki SH-SY5Y nie barwią się na anneksynę V-FITC ani jodek propidyny, z wyjątkiem ogniskowego barwienia obecnego w nielicznych martwych komórkach w hodowli. Rysunki powielono za zgodą czasopisma Alzheimer's Research &amp; Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy analizy fagocytozy; dane eksperymentalne dotyczące wariantów TREM2; metryki plamek komórkowych w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Fagocytoza jest zredukowana w makrofagach z iPSC TREM2 KO, ale nie w makrofagach z iPSC R47H TREM2. Wysokoprzepustowy test fagocytozy przeprowadzony z użyciem 40 000 komórek SH-SY5Y na studnię z sekwencyjnym dodawaniem. Ilościowo określono średnie dla parametrów: liczba plamek na komórkę, suma powierzchni plamek (µm2) na komórkę oraz procent komórek zawierających fagocytowane cząstki na pole widzenia. Dane znormalizowano do średniej dla każdego genotypu w każdym eksperymencie. Średnia ± SEM, dla N = 3 serii zbiorów. Dwuway ANOVA z pomiarem powtórzonym, post-hoc test Dunnetta, porównania parzyste z WT dla każdego punktu czasowego: *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001. Rysunki powielone za zgodą Alzheimer's Research &amp; Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina dodatkowa S1: Przykładowa kontrola jakości (QC) przygotowania linii SH-SY5Y.Rozdzielone komórki SH-SY5Y utrwalono przez 10 min przy użyciu 0% (żywe komórki), 1% i 2% paraformaldehydu (PFA), a następnie przemyto. Komórki barwiono anneksyną V-FITC oraz jodkiem propidium (PI), po czym niezwłocznie poddano analizie cytometrycznej. Wykresy kropkowe gęstości kolorów utworzono w oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej, wykorzystując kontrole pojedynczo barwione i niebarwione do wyznaczenia bramki kwadrantowej. Kwadranty są opisane procentową liczbą zdarzeń w obrębie każdego z nich. Żywe komórki znajdują się głównie w Q4, a komórki utrwalone głównie w Q2. Q1 = anneksyna V-/PI-, Q2 = anneksyna V+/PI+, Q3 = anneksyna V+/PI-, Q4 = anneksyna V-/PI- (żywe komórki). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Wideo uzupełniające: Time-lapse fagocytozy żywych komórek.Reprezentatywne nagranie time-lapse przedstawiające fagocytowane komórki SH-SY5Y przez makrofagi iPSC-macrophages BIONi010-C typu dzikiego (ECACC ID: 66540023). Obrazy były rejestrowane co 5 min przez 3 h. Nagranie zostało przycięte i odtwarzane jest z prędkością 3 klatek na sekundę, pokazując ostatnie 1,5 h testu. Komórki SH-SY5Y barwione barwnikiem wrażliwym na kwasy są widoczne na czerwono; intensywność sygnału wzrasta wraz z zakwaszaniem fagosomu. Jądra komórkowe barwione Hoechst 33342 są widoczne na niebiesko. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Ten test obrazowania in vitro umożliwia ilościowe określenie wpływu różnych zabiegów komórkowych lub różnych genotypów na fagocytozę mikrogleju. Korzystając z dwóch typów komórek, które są istotne dla choroby neurodegeneracyjnej, używamy martwych komórek nerwiaka zarodkowego do ładunku fagocytarnego, które są przygotowywane w sposób, który można łatwo i tanio skalować za pomocą dużych ekranów obrazowania o wysokiej treści. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2 odciąć SH-SY5Ys poprzez zasysanie pożywki.Dodać 4 ml buforu do dysocjacji komórek i natychmiast usunąć bufor, tak aby mniej niż 1 ml pozostał w postaci cienkiej warstwy pokrywającej komórki. Inkubować przez 2 do 3 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie po 10 ml HBSS do kolby T-75.Następnie odpipetować SH-SY5Ys do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 400xG przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki buforowej HEPES wolnej od czerwieni fenolowej, upewniając się, że rozbiły się grudki przed utrwaleniem.Utrwal komórki, dodając 2 ml formaldehydu o mocy 4% do probówki i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym delikatnym mieszaniem. Dodać 10 ml HBSS do probówki. Następnie odwiruj w temperaturze 1200xG przez 7 minut.Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki buforowej HEPES wolnej od czerwieni fenolowej. Policz i usuń 1 milion komórek HS-SY5Y do 2 ml probówki o niskim poziomie wiązania białka. Zwiększ całkowitą objętość do 300 do 500 mikrolitrów za pomocą pożywek buforowanych HEPES bez czerwieni fenolu.Następnie krótko podgrzej rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozpuść wrażliwy na pH ester STP czerwonego barwnika fluorescencyjnego zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie dodaj 12,5 mikrograma barwnika na milion komórek SH-SY5Y.Delikatnie wymieszaj, przesuwając tubkę. I inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, chroniąc przed światłem. Dodać 1 ml HBSS i wirować w temperaturze 1200xG przez 7 minut i 4 stopnie Celsjusza.Odrzucić supernatant. I umyć 2 ml HBSS. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce makrofagowej wolnej od czerwieni fenolowej do stężenia od 0,2 do 1,2 miliona komórek na ml, tak aby 50 mikrolitrów zawierało od 10 000 do 60 000 komórek.W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotuj roztwór ciemnoczerwonego barwnika reaktywnego z estrem sukcynimidylu przepuszczanego przez komórki fluorescencyjne w pożywce makrofagowej. Dodaj Hoechst 33342 i podgrzej roztwór roboczy do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Delikatnie odessać pożywkę makrofagową iPSC, pipetując supernatant komórkowy za pomocą pipety wielokanałowej do sterylnego zbiornika.Dodaj 70 mikrolitrów roztworu barwnika na studzienkę do makrofagów iPSC za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Naprawa eksperymentalnych zabiegów w pożywkach makrofagowych wolnych od czerwieni fenolowej.Po inkubacji bardzo delikatnie odessać pożywkę makrofagową iPSC za pomocą pipety wielokanałowej i dodać 100 mikrolitrów HBSS do dołka. Natychmiast usunąć HBSS przez delikatne pipetowanie. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki makrofagowej wolnej od czerwieni fenolowej oraz eksperymentalne zabiegi w oddzielnych studzienkach.Inkubować przez 10 minut do 1 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 mikrolitrów oznaczonego SH-SY5Ys do dołka po bokach każdej studzienki na krawędzi cieczy. Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 3 do 5 godzin.Po inkubacji fagocytozy delikatnie odessać supernatanty komórkowe przez pipetowanie pipetą wielokanałową i wyrzucić. Umyj raz 100 mikrolitrami PBS. Następnie utrwal komórki, dodając 100 mikrolitrów 2% formaldehydu i inkubując przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Odessać studzienki i dodać 100 mikrolitrów PBS. Albo przejdź bezpośrednio do obrazowania za pomocą mikroskopu o wysokiej zawartości, albo przykryj płytką i folią, a następnie przechowuj płytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż będzie to wymagane. Włącz mikroskop obrazowania o wysokiej zawartości i otwórz oprogramowanie do przechwytywania obrazu.Załaduj płytkę testową do mikroskopu, klikając ikonę ZAŁADUJ u góry ekranu. Wybierz zakładkę USTAWIENIA". Z menu rozwijanych w lewym górnym polu wybierz odpowiedni typ blachy.Opcja autofokusa: dwa szczyty"Obiektyw:40x woda, NA 1.1"Tryb koncentryczny" i Binning 1. Przed użyciem przepłucz obiektyw 40x Water za pomocą menu ustawień. W polu wyboru kanału użyj ikony plusa, aby dodać kanały DAPI, Alexa 647 i Alexa 568.Ustaw je tak, aby mierzyły w jednej płaszczyźnie jednego mikrometra. Zoptymalizuj ustawienia czasu i mocy, aby uzyskać wydajność barwienia płytki testowej. Upewnij się, że kanały nie są mierzone jednocześnie, klikając sekwencję kanałów, aby oddzielić kanały.W obszarze nawigacji i definiowania układu wybierz dołki pomiaru, a następnie wybierz od 9 do 12 pól na dołek. Podczas ustawiania należy kliknąć reprezentatywne pole na mapie tablicowej. Sprawdź po kolei każdy kanał pomiarowy, aby upewnić się, że występuje przebarwienie i że obrazy są wyostrzone poprzez regulację przesunięcia kanału.Aby przesłać dane na serwer w celu zdalnej analizy, kliknij pole "oferty pracy online" i odpowiednią nazwę ekranową. Zapisz protokół testu, klikając przycisk "Zapisz" i kliknij kartę "uruchom eksperyment" u góry. Nazwij płytkę eksperymentalną, a następnie kliknij start"Test fagocytozy na żywo w czasie życia w komórce wykazał, że przy 10 000 SH-SY5Ys na studzienkę, liczba cząstek fagocytozy na komórkę wzrastała liniowo z czasem i została zahamowana o około 50% przez cytochalazynę D. Przy wyższych ilościach SH-SY5Ys na studzienkę, fagocytoza wykazywała słabą liniowość, prawdopodobnie z powodu słabej segmentacji iPSC, makrofagi i SH-SY5Y w bardziej zatłoczonym polu widzenia.Następujące wyniki uzyskano, wykonując obrazowanie o wysokiej zawartości komórek stałych, w tym ten reprezentatywny obraz fagocytozy. Zwiększenie ilości SH-SY5Ys spowodowało większą liczbę fagocytozowanych cząstek na komórkę. Test fagocytozy został zwalidowany przy użyciu kilku inhibitorów fagocytozy.Cytochalazyna D i jasplakinolid znacząco hamowały fagocytozę odpowiednio o 91 i 90 procent. A bafilomycyna A1 znacznie zmniejszyła fagocytozę o 31%, gdy była wstępnie inkubowana przez 1 godzinę przed fagocytozą. Dodanie rekombinowanej aneksyny 5 znacznie zmniejszyło fagocytozę o 30% po dodaniu do studzienek bezpośrednio przed dodaniem SH-SY5Y.Naprawiono SH-SY5Ys, potwierdzono, że wystawiamy fosfatydyloserynę za pomocą fluorescencyjnej sondy Annexin 5. Natomiast żywe SH-SY5Y były ujemne dla barwienia Aneksyną 5. Przetestowano kilka długości czasu trwania fagocytozy, od 1 do 5 godzin, przy użyciu stopniowego dodawania ładunku fagocytarnego.Całkowitą długość tego protocalla można skrócić, przygotowując ładunek fagocytarny i barwiąc makrofagi iPSC równolegle. Jeśli chcesz to zrobić, ustal wcześniej terminy i wykorzystaj swoje inkubacje do przygotowania rozwiązań na przyszłe kroki.

in-vitro-quantitative-imaging-assay-for-phagocytosis-dead

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie przeprowadzamy test fagocytozy mikrogleju na nerwiaka zarodkowego przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Test pomaga ocenić upośledzenie funkcji mikrogleju w chorobach neurodegeneracyjnych.

Test fagocytozy mikrogleju: test in vitro w celu ustalenia modelu fagocytozy mikrogleju dla komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu makrofagów iPSC

W tym filmie oceniamy zdolność fagocytarną oczyszczonych astrocytów in vitro za pomocą testu obrazowania na żywo. Test służy jako skuteczna platforma przesiewowa do identyfikacji związków chemicznych, które mogą zwiększać lub hamować zdolność fagocytarną astrocytów.

Test fagocytozy in vitro: metoda oparta na obrazowaniu na żywo do badania fagocytozy synaptosomy w czasie rzeczywistym za pośrednictwem astrocytów

Źródło: Funes, S., et. al., Ludzkie komórki podobne do mikrogleju: różnicowanie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych i test fagocytozy żywych komórek in vitro przy użyciu ludzkich synaptosomów. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia test do badania zdolności fagocytarnej komórek podobnych do mikrogleju przy użyciu wrażliwych na pH synaptosomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym.

Test fagocytozy żywych komórek komórek podobnych do mikrogleju przy użyciu ludzkich synaptosomów

Mikroglej to komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) o dużej zdolności do fagocytozy lub pochłaniania materiału w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu opisano szeroko stosowany, wiarygodny i wysoce ilościowy test do wizualizacji i pomiaru pochłaniania składników synaptycznych za pośrednictwem mikrogleju.

Test pochłaniania: protokół oceny interakcji między fagocytami OUN a neuronami

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Prezentujemy metody oceny zdolności fagocytarnej pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny i wewnątrzkomórkowego barwienia kropelkami lipidów.

In vitro Fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

Ten protokół przedstawia test fagocytozy in vitro do pomiaru zdolności fagocytarnej astrocytów. Oczyszczone astrocyty i mikroglej szczurów są używane wraz z synaptosomami sprzężonymi ze wskaźnikiem pH. Metoda ta może wykrywać kinetykę pochłaniania i degradacji w czasie rzeczywistym oraz zapewnia odpowiednią platformę przesiewową do identyfikacji czynników modulujących fagocytozę astrocytów.

Nowatorski test obrazowania na żywo in vitro fagocytozy za pośrednictwem astrocytów przy użyciu synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH

Ten artykuł przedstawia użyteczny test in vitro do oceny zdolności kondycjonowanej pożywki z komórek nowotworowych do przyciągania makrofagów.

Test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami

Ten protokół opisuje solidne generowanie makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz metody ich późniejszej charakterystyki. Ekspresja markerów powierzchniowych komórek, ekspresja genów i testy funkcjonalne są wykorzystywane do oceny fenotypu i funkcji tych makrofagów pochodzących z iPSC.

Produkcja i charakterystyka ludzkich makrofagów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje proces różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w komórki podobne do mikrogleju do eksperymentów in vitro. Dołączamy również szczegółową procedurę generowania ludzkich synaptosomów z dolnych neuronów ruchowych pochodzących z iPSC, które można wykorzystać jako substrat do testów fagocytozy in vitro przy użyciu systemów obrazowania żywych komórek.

Ludzkie komórki podobne do mikrogleju: różnicowanie z indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi i test fagocytozy żywych komórek in vitro przy użyciu ludzkich synaptosomów

Ten protokół opisuje nieenzymatyczną i prostą metodę izolowania 7-9-dniowych komórek szpiku kostnego myszy noworodków i generowania zróżnicowanych makrofagów przy użyciu supernatantu komórek L929 jako źródła czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (M-CSF). Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego poddano dalszej analizie pod kątem antygenów powierzchniowych F4/80, CD206, CD11b i kompetencji funkcjonalnych.

Izolacja szpiku kostnego noworodków myszy i przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Poznaj szybką metodę obrazowania in vitro do ilościowej oceny fagocytozy martwych komórek nerwiaka zarodkowego przez makrofagi iPSC. Protokół umożliwia skalowalne badania neuroimmunologiczne.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Przeglądaj więcej filmów