Name: Badania przesiewowe toksyczności w ludzkich organoidach siatkówki do odkryć farmaceutycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Odkryj metodę przesiewowego badania toksyczności w ludzkich organoidach siatkówki wykorzystującą fenofibrat do ochrony fotoreceptorów przed deoksyceramidami. Platforma umożliwia identyfikację leków przeciwko zwyrodnieniu plamki żółtej typu 2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez Lowy Medical Research Institute. Serdecznie dziękujemy rodzinie Lowy za wsparcie projektu MacTel. Chcielibyśmy podziękować Mari Gantner, Mike'owi Dorrellowi i Lei Scheppke za ich wkład intelektualny i pomoc w przygotowaniu manuskryptu.

<ol><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li>
<li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li>
<li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down%2C+mice+are+not+just+small+humans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 6 Spec No 39-44 (2005).</li>
<li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li>
<li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li>
<li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+pathways+in+neurodegeneration%2C+from+genetics+to+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li>
<li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2%3A+the+Melbourne+collaborative+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li>
<li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li>
<li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li>
<li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Muller%27s+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li>
<li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li>
<li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li>
<li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li>
<li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients%3A+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li>
<li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047(2014).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766(2017).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li>
<li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+Therapy%22%5BJournal%5D)">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Warianty protokołu różnicowania Od czasu wynalezienia samoformujących się miseczek wzrokowych przez grupę20 Yoshiki Sasai, wiele laboratoriów opracowało protokoły generowania organoidów siatkówki, które mogą się zmieniać prawie na każdym kroku 5,18,19,21. Wyczerpująca lista protokołów znajduje się w Capowski et al.22. Przedst...

Modelowanie chorób ludzkich w hodowlach komórkowych i modelach zwierzęcych dostarczyło nieocenionych narzędzi do odkrywania, modyfikowania i walidacji terapii farmakologicznej, umożliwiając im przejście od kandydującego leku do zatwierdzonej terapii. Chociaż połączenie modeli in vitro i in vivo z udziałem innych niż ludzie od dawna stanowi kluczowy element procesu opracowywania leków, często nie są one w stanie przewidzieć skuteczności klinicznej nowych kandydatów na leki1. Istnieje wyraźna potrzeba opracowania technologii, które wypełnią lukę między uproszczonymi monokulturami komórkowymi a badaniami klinicznymi. Ostatnie osiągnięcia technologiczne w zakresie samoorganizujących się trójwymiarowych kultur tkankowych, organoidów, poprawiły ich wierność w stosunku do modelowanych tkanek, co czyni je obiecującymi narzędziami w procesie przedklinicznego opracowywania leków2.
Główną przewagą hodowli komórek ludzkich nad modelami in vivo innymi niż ludzkie jest możliwość odtworzenia specyficznych zawiłości ludzkiego metabolizmu, które mogą się znacznie różnić nawet między kręgowcami wyższego rzędu, takimi jak ludzie i myszy3. Jednak ta specyfika może zostać przyćmiona przez utratę złożoności tkanki; Tak jest w przypadku tkanki siatkówki, w której wiele typów komórek jest misternie splecionych i ma unikalną symbiotyczną interakcję metaboliczną między podtypami komórkowymi, której nie można powielić w monokulturze<klasa SUP="xref">4. Ludzkie organoidy, które zapewniają kopię złożonych tkanek ludzkich z dostępnością i skalowalnością hodowli komórkowej, mają potencjał, aby przezwyciężyć braki tych platform do modelowania chorób.
Organoidy siatkówki pochodzące z komórek macierzystych okazały się szczególnie wierne w modelowaniu złożonej tkanki ludzkiej siatkówki nerwowej5. To sprawiło, że model organoidu siatkówki stał się obiecującą technologią do badania i leczenia chorób siatkówki6,7. Do tej pory większość modelowania chorób w organoidach siatkówki koncentrowała się na monogenowych chorobach siatkówki, w których organoidy siatkówki pochodzą z linii iPSC z chorobotwórczymi wariantami genetycznymi7. Są to na ogół wysoce penetrujące mutacje, które objawiają się jako fenotypy rozwojowe. Mniej skutecznie wykonano w zakresie chorób związanych ze starzeniem się, w których mutacje genetyczne i stresory środowiskowe wpływają na tkanki, które rozwijają się normalnie. Choroby neurodegeneracyjne związane ze starzeniem się mogą mieć złożone dziedziczenie genetyczne i wpływ stresorów środowiskowych, które są z natury trudne do modelowania przy użyciu krótkoterminowych hodowli komórkowych. Jednak w wielu przypadkach te złożone choroby mogą łączyć się ze zwykłymi stresorami komórkowymi lub metabolicznymi, które po przetestowaniu na w pełni rozwiniętej tkance ludzkiej mogą dostarczyć potężnego wglądu w choroby neurodegeneracyjne związane ze starzeniem się8.
Choroba zwyrodnieniowa plamki żółtej o późnym początku, teleangiektazja plamkowa typu II (MacTel), jest doskonałym przykładem genetycznie złożonej choroby neurodegeneracyjnej, która łączy się w powszechny defekt metaboliczny. MacTel to rzadka choroba zwyrodnieniowa siatkówki wynikająca ze starzenia się, która powoduje utratę fotoreceptorów i gleju Müllera w plamce żółtej, co prowadzi do postępującej utraty widzenia centralnego9,10,11,12,13. W MacTel nieokreślone, prawdopodobnie wieloczynnikowe, dziedziczenie genetyczne powoduje powszechne zmniejszenie krążącej seryny u pacjentów, co skutkuje wzrostem neurotoksycznej formy lipidów zwanej deoksysfingolipidami (deoxySL)14,15. Aby udowodnić, że akumulacja deoxySL jest toksyczna dla siatkówki i zwalidować potencjalne terapie farmaceutyczne, opracowaliśmy ten protokół do badania toksyczności fotoreceptorów w organoidach ludzkiej siatkówki14.
Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich organoidów siatkówki, ustalania testu toksyczności i ratowania za pomocą organoidów oraz ilościowego określania wyników. Podajemy udany przykład, w którym określamy specyficzną dla tkanki toksyczność podejrzewanego czynnika chorobotwórczego, deoxySL, i walidujemy stosowanie bezpiecznego leku generycznego, fenofibratu, w potencjalnym leczeniu toksyczności siatkówki wywołanej przez deoksySL. Wcześniejsze prace wykazały, że fenofibrat może zwiększać degradację deoxySL i obniżać krążący deoxySL u pacjentów, jednak jego skuteczność w zmniejszaniu toksyczności siatkówkowej wywołanej przez deoksySL nie została przetestowana16,17. Chociaż przedstawiamy konkretny przykład, protokół ten może być wykorzystany do oceny wpływu dowolnej liczby stresorów metabolicznych/środowiskowych i potencjalnych leków terapeutycznych na tkankę siatkówki.

<table><tbody><tr><td>0,5 mln EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Kolby Erlenmeyera</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>1-deoksysfinganina</td><td></td><td>Avanti</td> 860493 <td></td></tr><tr><td>B27 Suplement, bez witaminy A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Beaver 6900 Mini-Blade</td><td>Beaver-Visitec</td><td>BEAVER6900</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-sacharoza</td><td>VWR</td><td>97061-432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo-fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, proszek</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, pirogronian</td><td>Gibco</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>Oślica przeciw królikom Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td><td>Thermo-fisher</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>osła surowica</td><td>Sigma</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Inaktywowany termicznie</td><td>Corning</td><td>45001-108</td><td></td></tr><tr><td>Fenofibrat</td><td>Sigma</td><td>F6020</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania śmierci komórek in situ, Fluorescin</td><td>Sigma</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, Obniżony czynnik wzrostu</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldehyd</td><td>Thermo-fisher</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-Recoverin</td><td>Millipore</td><td>AB5585</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Sterylne jednorazowe filtry próżniowe</td><td>MilliporeSigma</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Taurine Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Plus- Związek O.C.T.</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>EMS</td><td>62534-10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Niska nasadka 6-dołkowa</td><td>Płytki Corning</td><td>29443-030</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Niska nasadka 75cm2 U-Flask</td><td>Corning</td><td>3814</td><td></td></tr><tr><td>System filtracji próżniowej</td><td>VWR</td><td>10040-436</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik do montażu Vectashield</td><td>wektor Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>długopis woskowy-ImmEdge</td><td>wektor Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dichlorowodorek (inhibitor skały)</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe toksyczności w ludzkich organoidach siatkówki do odkryć farmaceutycznych

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Organoidy stanowią obiecującą platformę do badania mechanizmów chorobowych i metod leczenia, bezpośrednio w kontekście tkanek ludzkich z wszechstronnością i wydajnością hodowli komórkowych. Dojrzałe ludzkie organoidy siatkówki są wykorzystywane do badań przesiewowych potencjalnych metod leczenia farmakologicznego choroby zwyrodnieniowej siatkówki związanej z wiekiem teleangiektazji plamki żółtej typu 2 (MacTel).
Ostatnio wykazaliśmy, że MacTel może być spowodowany podwyższonym poziomem nietypowego gatunku lipidów, deoksysfingolipidów (deoksySLs). Te lipidy są toksyczne dla siatkówki i mogą powodować utratę fotoreceptorów, która występuje u pacjentów z MacTel. Aby przebadać leki pod kątem ich zdolności do zapobiegania toksyczności fotoreceptorów deoksySL, wygenerowaliśmy ludzkie organoidy siatkówki z linii pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) indukowanych przez MacTel i dojrzało je do wieku postmitotycznego, w którym rozwijają wszystkie komórki siatkówki pochodzące z linii neuronalnej, w tym funkcjonalnie dojrzałe fotoreceptory. Organoidy siatkówki potraktowano metabolitem deoxySL, a apoptozę zmierzono w warstwie fotoreceptorów za pomocą immunohistochemii. Korzystając z tego modelu toksyczności, przeprowadzono badania przesiewowe związków farmakologicznych, które zapobiegają śmierci fotoreceptorów wywołanej przez deoxySL. Stosując ukierunkowane podejście kandydujące, ustaliliśmy, że fenofibrat, lek powszechnie przepisywany w leczeniu wysokiego poziomu cholesterolu i trójglicerydów, może również zapobiegać toksyczności deoksySL w komórkach siatkówki.
Badanie toksyczności z powodzeniem zidentyfikowało zatwierdzony przez FDA lek, który może zapobiec śmierci fotoreceptorów. Jest to bezpośrednie możliwe do zastosowania odkrycie ze względu na testowany model o wysokim znaczeniu dla choroby. Platformę tę można łatwo modyfikować w celu testowania dowolnej liczby stresorów metabolicznych i potencjalnych interwencji farmakologicznych w celu odkrycia przyszłych metod leczenia chorób siatkówki.

Organoidy siatkówki wygenerowano z kontrolnej linii iPSC nieobciążonej zespołem MacTel. Po osiągnięciu przez organoidy 26 tygodnia hodowli zostały one wyselekcjonowane i podzielone na grupy eksperymentalne. Organoidy poddano działaniu różnych stężeń deoxySA, aby ustalić, czy deoxySA jest toksyczny dla fotoreceptorów. Przetestowano cztery stężenia deoxySA, od 0 do 1 µM (Rysunek 2), a organoidy traktowano przez 8 dni, wymieniając pożywkę co drugi dzień. Śmierć komórek w odpowiedzi na deoxySA j...

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół generowania dojrzałych ludzkich organoidów siatkówki i wykorzystywania ich w teście toksyczności fotoreceptorów do identyfikacji kandydatów farmaceutycznych na chorobę zwyrodnieniową siatkówki związaną z wiekiem teleangiektazję plamki żółtej typu 2 (MacTel).

Badania przesiewowe toksyczności w ludzkich organoidach siatkówki do odkryć farmaceutycznych

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Protokół ten zapewnia przedkliniczne podejście do odkrywania i walidacji farmaceutycznych metod leczenia metabolicznych chorób siatkówki bezpośrednio w ludzkiej tkance siatkówki. Technika ta łączy złożoność metabolizmu w tkankach ludzkich z wszechstronnością i przepustowością hodowli komórkowej. Wykorzystaliśmy ten test do uzyskania danych przedklinicznych dotyczących leczenia choroby zwyrodnieniowej siatkówki, MacTel, przy użyciu powszechnego i bezpiecznego leku zmieniającego lipidy, fenofibratu, który jest obecnie w klinicznych badaniach bezpieczeństwa.Podejście to można zastosować do dowolnej liczby powszechnych stresorów siatkówki, które prowadzą do choroby, w tym niedoboru składników odżywczych, niedotlenienia, toksyczności światła i innych toksycznych lipidów. W 24 tygodniu hodowli sprawdź organoidy pod kątem tworzenia się szczątkowych segmentów na zewnątrz organoidu. Do 26 do 28 tygodnia zewnętrzne segmenty powinny uformować grubą warstwę.Gdy można zaobserwować zagęszczony segment wątpiący, rozcieńczyć jeden milimolowy roztwór podstawowy deoksySA do 0,51. Stężenia jedno- i dwumikromolowe w trzech mililitrach podłoża różnicującego siatkówkę plus. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i sterylnej sondy wybierz cztery grupy organoidów o mniej więcej tym samym rozmiarze i kształcie, z co najmniej pięcioma organoidami na grupę, a następnie podziel grupy na pojedyncze dołki na 6-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu.Po zebraniu wszystkich organoidów, usunąć jak najwięcej pożywki z każdej studzienki i dodać jedno stężenie roztworu deoksySA do każdej studzienki. Dodać kontrolę nośnika do czwartej grupy organoidów. Po dwóch dniach hodowli zastąpić supernatanty hodowli odpowiednim świeżym deoksySA lub rozcieńczeniem kontrolnym.Po czterech dniach hodowli należy osadzić sekcję kriogeniczną i wybarwić organoidy zgodnie ze standardowymi protokołami, aby umożliwić ocenę śmierci komórki w każdej hodowli. Po barwieniu użyj powiększenia od pięciu do 10 razy, aby zlokalizować obszar pokrojonego przekroju organoidu, który jest nienaruszony, dobrze uformowany i znajduje się w płaszczyźnie, która pobiera próbki reprezentatywnego przekroju poprzecznego organoidu. Przekrój powinien mieć wyraźną zewnętrzną warstwę jądrową fotoreceptorów o grubości co najmniej kilku komórek oraz oddzielną i wyraźną warstwę jąder, które nie mają odzyskania i zabarwienia.Wykadruj obraz i zwiększ powiększenie do 20x. Następnie ponownie wykadruj slajd, aby wypełnić obraz jak największą warstwą fotoreceptorów. Ustaw płaszczyznę Z i ustaw górną granicę dolną granicę zakresu Z, aby zobrazować całą głębokość przekroju.Następnie zobrazuj wszystkie trzy kanały fluoroforu w akwizycji Z-stack i zapisz obraz w formacie pliku, który zachowuje stosunek powierzchni na piksel. Aby określić ilościowo liczbę martwych komórek w każdej próbce, otwórz stosy obrazów na Fidżi. W oknie opcji importu formatu bio upewnij się, że nie są zaznaczone żadne pola w sekcji podziału na osobne okna, a następnie wybierz opcję Obraz, stosy i projekt Z, aby utworzyć nowy obraz do kwantyfikacji.Wybierz kanał obrazu, który pokazuje odzyskiwanie i barwienie, a następnie użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby obrysować ciągły obszar fotoreceptorów na obrazie. Kliknij przycisk Analizuj i ustaw pomiary, a następnie zaznacz pole Obszar. Kliknij przycisk Analizuj i mierz, aby zmierzyć obszar fotoreceptorów, aby policzyć umierające komórki.Pomiar pojawi się w wyskakującym okienku. Aby policzyć jądra dodatnie apoptozy w wybranym regionie fotoreceptora, kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie punktowe, aby wybrać narzędzie wielopunktowe i wybierz barwienie dodatnie apoptozy, które nakłada się na jądra dodatnie DAPI i odzyskuje i barwienie. Przełączaj się między kanałami, aby zweryfikować dodatnie komórki.Następnie podziel liczbę komórek dodatnich w wyniku apoptozy przez obszar, aby uzyskać znormalizowaną wartość śmierci komórki w fotoreceptorach na organoid. Po określeniu stężenia deoksySA, które indukuje śmierć komórki docelowej, należy użyć sterylnej sondy, aby wybrać trzy grupy organoidów o mniej więcej tym samym rozmiarze i kształcie, z co najmniej pięcioma organoidami na grupę. I dodaj grupy do indywidualnych dołków 6-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu.Dodać stężenie deoksySA dla śmierci komórki docelowej, stężenie deoksySA dla docelowej śmierci komórki uzupełnione lekiem będącym przedmiotem zainteresowania lub pożywką kontrolną do odpowiedniego dołka lub organoidów. Po dwóch dniach zastąpić supernatant w każdej studzience odpowiednim stężeniem świeżej pożywki lub pożywki kontrolnej. Po czterech dniach hodowli oceń kultury pod kątem śmierci komórki, jak pokazano.W tej reprezentatywnej analizie organoidy siatkówki wygenerowane z linii pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych teleangiektazją typu 2 indukowaną teleangiektazją typu 2 potraktowano czterema stężeniami deoksySA. Śmierć komórki w odpowiedzi na deoksySA była zależna od stężenia i wykrywalna już w 50 nanomolowych deoksySA. Najwyższe badane stężenie wywołało silną śmierć komórki, przy jednoczesnym zachowaniu integralności organoidu siatkówki.Leczenie fenofibratem 20 mikromolowym zapobiegało indukowanej deoksySA toksyczności w fotoreceptorach organoidów siatkówki, znacznie zmniejszając śmierć komórek o około 80% po czterech dniach leczenia. Pamiętaj, aby wybrać dobrze uformowane i zdrowe organoidy, aby upewnić się, że test jest wykonywany w komórkach siatkówki. Organoidy mogą być przetwarzane w celu pobrania RNA w celu ilościowego określenia ekspresji genów, co pozwala na ocenę sygnałów stresu oraz walidację skutków toksycznych i ratunków.Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie ocenić dalszy metabolizm wielu różnych lipidów w organoidach, otwierając badania nad metabolizmem lipidów w ludzkich siatkówkach.

toxicity-screens-human-retinal-organoids-for-pharmaceutical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe RNA hamującego małą próbę jest ważnym narzędziem, które może pomóc w szybszym wyjaśnieniu molekularnych mechanizmów chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki. W niniejszym artykule przedstawiono rozwój i walidację modeli i metod ekspozycji do wysokoprzepustowych badań przesiewowych uszkodzeń nabłonka rogówki wywołanych fluorowodorem i chloropikryną.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

Korzystając z metody samoorganizacji, opracowujemy protokół z dodatkiem COCO, który może znacznie zwiększyć generowanie fotoreceptorów.

Ukierunkowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół przedstawia i opisuje etapy izolacji, sekcji, hodowli i barwienia eksplantatów siatkówki uzyskanych od dorosłej myszy. Metoda ta jest korzystna jako model ex vivo do badania różnych chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa.

Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Ten protokół opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSC w klastry pola gałkowego i generowania organoidów neuro-siatkówkowych przy użyciu uproszczonych warunków hodowli obejmujących zarówno systemy hodowli adherentnych, jak i zawiesinowych. Inne typy komórek oka, takie jak RPE i nabłonek rogówki, można również wyizolować z dojrzałych pól ocznych w hodowlach siatkówki.

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Obecny protokół opisuje zoptymalizowany system 3D do indukcji siatkówki neuronalnej, który zmniejsza adhezję i fuzję organoidów siatkówki z wysoką powtarzalnością i wydajnością.

Generowanie siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Mikroglej to unikalne komórki odpornościowe rezydentne w siatkówce, odgrywające kluczową rolę w różnych chorobach zwyrodnieniowych siatkówki. Stworzenie modelu kohodowli organoidów siatkówki z mikroglejem może ułatwić lepsze zrozumienie patogenezy i postępów w rozwoju chorób siatkówki.

Składanie organoidów siatkówki z mikroglejem

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Fluorescencyjne nanocząsteczki wytwarzane w naszym laboratorium są wykorzystywane do obrazowania stężeń jonów i strumieni jonowych w systemach biologicznych, takich jak komórki podczas sygnalizacji oraz płyn śródmiąższowy podczas homeostazy fizjologicznej.

Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) to zautomatyzowana platforma służąca do odkrywania i optymalizacji koktajli enzymatycznych do degradacji biomasy. Może ona zostać przystosowana do wielu rodzajów surowców oraz mieszanin enzymów zawierających wiele składników.

GENPLAT: zautomatyzowana platforma do odkrywania enzymów rozkładających biomasę i optymalizacji koktajli enzymatycznych

Odkryj metodę przesiewowego badania toksyczności w ludzkich organoidach siatkówki wykorzystującą fenofibrat do ochrony fotoreceptorów przed deoksyceramidami. Platforma umożliwia identyfikację leków przeciwko zwyrodnieniu plamki żółtej typu 2.

Badania przesiewowe toksyczności w ludzkich organoidach siatkówki do odkryć farmaceutycznych

Przeglądaj więcej filmów