Name: Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych przez CRISPR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj protokół produkcji ludzkich komórek CAR-T modyfikowanych przez CRISPR-Cas9 z wysoką wydajnością edycji wielu genów. Ta metoda umożliwia translację do zastosowań klinicznych w terapii przeciwnowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy Human Immunology Core za dostarczanie normalnych limfocytów T dawcy oraz Flow Cytometry Core na University of Pennsylvania.

Ludzkie limfocyty T zostały pozyskane przez University of Pennsylvania Human Immunology Core, który działa zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej, z ustalonymi standardowymi procedurami operacyjnymi i/lub protokołami odbioru, przetwarzania, zamrażania i analizy próbek zgodnych z wytycznymi etycznymi MIATA i University of Pennsylvania.
1. Produkcja wektorów lentiwirusowych
UWAGA: Produkty wirusowe zostały uszkodzone pod względem replikacji poprzez rozdzielenie konstruktów pakujących (Rev, gag/pol/RRE, VSVg i plazmid transferowy) na cztery oddzielne plazmidy, co znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzeń rekombinacji, które mogą skutkować wirusem kompetentnym do replikacji.
<ol>
	<li>Przygotuj HEK293T komórek na dzień przed transfekcją. Umieść około 6 x 106 komórek w naczyniach hodowlanych T150 w 30 ml standardowej pożywki hodowlanej (określanej jako R10: RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 10 mM HEPES, 1% Pen/Strep, 1% L-glutaminy) i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. 18-24 godziny później komórki powinny być w 60-70% zlewające się i wyglądać zdrowo (wypustki dendrytyczne i równomierne rozmieszczenie w kolbie). Jeśli komórki wyglądają zdrowo, przejdź do kroku 1.2.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę do transfekcji zawierającą odczynnik do lipofekcji (96 μl), pTRP gag/pol (Lot# RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (Lot# RR13SEP19B-3) (18 μg), pTRP VSVG (Lot# RR13SEP19C) (7 μg) plazmidy pakujące i 15 μg plazmidu ekspresyjnego (CD19bbz scFv sklonowany w pTRPE).
	<ol>
		<li>Dla każdej reakcji transfekcji przygotować jedną probówkę zawierającą 1 ml minimalnej pożywki niezbędnej o zredukowanej surowicy oraz cztery plazmidy opisane w kroku 1.2, jak również jedną probówkę zawierającą 2 ml pożywki o obniżonej surowicy oraz 90 μl odczynnika do lipofekcji. Połączyć te dwa roztwory przez kroplowe dodawanie 1 ml mieszaniny plazmidu do 2 ml mieszaniny odczynników do lipofekcji. Pamiętaj, aby energicznie wymieszać roztwór, pipetując kilka razy w górę i w dół. Inkubować roztwór przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W międzyczasie odessać pożywkę z kolby HEK293T komórkowej i delikatnie przemyć komórki 10 ml minimalnej ilości niezbędnej pożywki o obniżonej surowicy i ponownie odessać.</li>
		<li>Delikatnie dodać mieszaninę do transfekcji (3 ml) z kroku 1.2.1 do dolnego rogu kolby do hodowli komórkowych za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Delikatnie przechylić kolbę, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę transfekcyjną w kolbie do hodowli komórkowej i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że nie przeszkadzasz monowarstwie komórek. Po 10 minutowej inkubacji dodać 35 ml pożywki R10 i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze na 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 24 godzinach zebrać supernatant z kolb do hodowli komórkowych HEK293T i przenieść do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Dodać świeży R10 do komórek HEK29T i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na kolejne 24 godziny. Odwiruj supernatant (300 x g), aby usunąć resztki komórek i przefiltruj supernatant przez filtr 0,45 μm.</li>
	<li>Zagęścić filtrat od etapu 1.3 przez ultrawirowanie z dużą prędkością (25 000 x g przez 2,5 godziny lub 8000 x g przez noc (O/N)). Przechowywać 24-godzinny osad wirusa w temperaturze 4 °C podczas gromadzenia 48-godzinnego wirusa.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.3-1.4 dla kolekcji 48 godzin i połącz 24-godzinne i 48-godzinne kolekcje wirusów. Granulki z kolekcji 48 h będą zawierały łączny zbiór lentiwirusa.</li>
	<li>Zawiesić osad wirusa w około 1 ml zimnego R10 i podwielokrotność do fiolek o pojemności 100 μl. Natychmiast zamrozić porcje za pomocą suchego lodu i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Obliczyć funkcjonalne miano wirusa w jednostkach transdukcyjnych/ml, transdukując stałą ilość pierwotnych ludzkich komórek T aktywowanych kulkami CD3/CD28 z seryjnymi rozcieńczeniami supernatantu lentiwirusa. Zmierzyć transdukcję CAR po 72 godzinach za pomocą cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Barwienie CAR skierowanego na CD19 przeciwciałem anty-FCM63 scFv. W przypadku innych chimerycznych receptorów antygenowych barwienie za pomocą rekombinowanego białka znakowanego fluoroforem, które jest specyficzne dla CAR scFv. Rozcieńczenie wirusa, które generuje poniżej 20% komórek CAR dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej, jest najdokładniejszym rozcieńczeniem, na podstawie którego można obliczyć miano wirusa. Powyżej 20% komórek CAR-dodatnich zwiększa się szansa na dwukrotną transdukcję każdej dodatniej komórki, co skutkuje niedoszacowaniem liczby transdukujących cząstek. Obliczyć jednostki transdukcyjne na ml (TU / ml ) = (liczba transdukowanych komórek x procent komórek dodatnich CAR x współczynnik rozcieńczenia)/(objętość transdukcji w ml).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Projektowanie sgRNA i rozerwanie genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T
<ol>
	<li>Projektowanie CRISPR sgRNA 
	UWAGA: Kilka serwerów i programów ułatwia projektowanie sgRNA specyficznych dla celu. W tym protokole sgRNA CRISPR zostały zaprojektowane przy użyciu CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) i portalu projektowego gRNA z Broad institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
	<ol>
		<li>Dla każdego genu docelowego zaprojektuj od sześciu do dziesięciu sekwencji sgRNA, aby celować we wczesne kodujące sekwencje egzonów. 
		UWAGA: sgRNA powinno mieć wysoką skuteczność na miejscu i niską skuteczność poza celem. Każdy algorytm uczenia maszynowego do określania skuteczności sgRNA działa nieco inaczej. Dlatego zaleca się porównanie wielu narzędzi do projektowania sgRNA i sporządzenie listy od sześciu do dziesięciu sgRNA do badań przesiewowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakłócenie genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T
	<ol>
		<li>Pozyskanie autologicznych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od zdrowych dawców-ochotników. Schematyczna oś czasu protokołu jest opisana w Rysunek 2A i opisana poniżej.</li>
		<li>Wyizoluj limfocyty T CD4+ i CD8+ za pomocą dostępnych na rynku zestawów selekcyjnych CD4 i CD8.</li>
		<li>Połącz limfocyty T CD4 + i CD8 + w stosunku 1:1 i inkubuj przez noc w 3x106 komórek/ml w R10 uzupełnionym 5 ng / ml huIL-7 i huIL-15 każdy. Dodanie IL-7 i IL-15 jest zalecane, ponieważ wiadomo, że promują one fenotyp pamięci centralnej, a komórki CAR-T rozszerzone IL-7 i IL-15 mają lepszą skuteczność przeciwnowotworową w porównaniu z ekspandowanymi komórkami CAR-T IL-222,23,24.</li>
		<li>Następnego dnia należy policzyć limfocyty T i odwirować 5-10 x 106 komórek przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić cały supernatant i przemyć osad komórkowy w zminimalizowanej ilości niezbędnych pożywek o zredukowanej surowicy. Zawiesić osad w 100 μl roztworu nukleofekcji zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).</li>
		<li>Podczas mycia komórek przygotuj kompleks rybonukleoproteinowy (RNP) z Cas9 i gRNA, inkubując 10 μg nukleazy Cas9 z 5 μg sgRNA przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Stosunek molowy Cas9 do sgRNA wynosi 1:2,4. Zalecana jest fałszywa kontrola, która zawiera Cas9 i wzmacniacz elektroporacji, ale nie sgRNA. 
		UWAGA: Na tym etapie można przeprowadzić multipleksową edycję genów, tworząc kompleksy RNP dla każdego celu osobno i łącząc je z komórkami w czasie nukleofekcji, jak opisano w następnym kroku. Wybór odczynników do złożenia kompleksu RNP jest kluczem do uzyskania wysokiej wydajności KO. Na przykład nukleazy Cas9 od różnych dostawców mają różne efekty poza celem, a chemicznie zmodyfikowane gRNA zmniejszają toksyczność dla limfocytów T, zwiększając w ten sposób wydajność KO.</li>
		<li>Połączyć zawieszone komórki z kroku 2.2.4 z kompleksem RNP z kroku 2.2.5 i dodać 4,2 μl wzmacniacza elektroporacji 4 μM (oligonukleotyd ssDNA, który nie jest homologiczny do ludzkiego genomu). Dobrze wymieszaj i przenieś do kuwet do elektroporacji. Unikaj pęcherzyków powietrza, ponieważ pogarszają one wydajność elektroporacji.</li>
		<li>Elektroporacja ogniw za pomocą kodu impulsowego EH111. Po elektroporacji inkubować komórki w R10 uzupełnionym 5 ng/ml huIL-7 i huIL-15 w 5x106 komórek/ml w temperaturze 30 °C przez 48 godzin na płytkach 12-dołkowych. Po 48 godzinach przystąp do aktywacji i ekspansji limfocytów T.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Aktywacja limfocytów T, transdukcja i ekspansja lentiwirusa
UWAGA: Do badania przesiewowego sgRNA, transdukcja lentiwirusowa (Krok 3.2) konstruktu CAR nie jest konieczna.
<ol>
	<li>Policz elektroporowane limfocyty T i rozcieńcz do stężenia 1 x 106 komórek/ml za pomocą ciepłego R10 uzupełnionego 5 ng / ml huIL-7 i huIL-15. Aktywuj komórki, dodając kulki magnetyczne pokryte przeciwciałem monoklonalnym anty-CD3 / anty-CD28 w stosunku 3 kulek na żywą komórkę T. 
	UWAGA: Elektroporacja powoduje znaczną śmierć ogniwa, w wyniku czego powstaje około 60% ± 15% żywotnych ogniw w porównaniu z ogniwami nieelektroporowanymi. Użyj liczby żywych/martwych komórek, aby określić odpowiednią ilość koralików. Przenieść komórki do temperatury 37 °C i inkubować przez noc.</li>
	<li>Po całonocnej stymulacji transdukuj komórki T zmodyfikowane przez CRISPR supernatantem lentiwirusowym z kroku 1. Dodać odpowiednią objętość na podstawie miana wirusa obliczonego w kroku 1.7, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 3 i inkubować komórki przez 72 godziny w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Osad wirusa zawieszony w R10 jest po prostu dodawany na komórki zgodnie ze stężeniem komórek, mianem wirusa i pożądanym MOI.</li>
	<li>Po 72 godzinach nakarmić komórki z 50% obecnej objętości hodowli R10 zawierającej 10 ng/ml huIL-7 i huIL-15 i wstawić je z powrotem do inkubatora na kolejne 48 godzin. Nie przeszkadzaj skupiskom, które utworzyły się między limfocytami T a koralikami.</li>
	<li>Po 48 godzinach usuń kulki z komórek, delikatnie ponownie zawieszając mieszaninę komórkowo-kulkową, a następnie rozdzielając magnetycznie. Policz komórki po usunięciu kulek i doprowadź do stężenia 0,8 x 106 komórek/ml za pomocą R10 uzupełnionego 5 ng/ml huIL-7 i huIL-15. Po usunięciu koralików liczba komórek powinna być podobna do liczby komórek w dniu 1 przed elektroporacją (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Po 24 godzinach należy policzyć komórki i podawać do stężenia 1 x 106 komórek/ml z R10 + 5 ng/ml huIL-7 i huIL-15. Powtarzaj to co 24 godziny, aż kinetyka wzrostu i wielkość komórki wykażą, że komórki odpoczęły od stymulacji. 
	UWAGA: Od tego momentu limfocyty T podwajają się mniej więcej co 24 godziny. Limfocyty T zwykle przechodzą 5-7 podwojeń populacji i mają objętość komórek około 300 ± 50 fL, gdy są wypoczęte.</li>
	<li>Po odpoczynku odwiruj komórki CAR-T zaprojektowane przez CRISPR i ponownie zawieś w pożywkach do zamrażania (1:1 X-Vivo i FBS plus 10% DMSO) w celu kriokonserwacji. Użyte komórki CAR-T powinny być rozmrożone i odpoczęte w temperaturze 37 °C przez 16 godzin przed eksperymentem. 
	UWAGA: Zachowaj około 10x106 komórek zarezerwowanych do pomiaru skuteczności wybijania i integracji CAR. Oczekiwane podwojenie populacji i zmiany objętości podczas ekspansji zostały pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2B,2C. Dodatkowo, Rysunek 2D pokazuje poziomy ekspresji CAR zarówno na makietach, jak i genetycznie edytowanych komórkach CAR-T.</li>
</ol>
4. Wydajność CRISPR
<ol>
	<li>Ekstrakcja genomowego DNA i amplifikacja genów docelowych
	<ol>
		<li>Z każdej hodowli przesiewowej odwiruj 3-5 x 106 limfocytów T. Komórki można zamrozić w postaci suchej granulki lub przeprowadzić ekstrakcję genomowego DNA. W czasie ekstrakcji DNA ponownie zawiesić granulki w 200 μl soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) i wyekstrahować genomowe DNA z komórek poddanych elektroporacji za pomocą standardowego zestawu do ekstrakcji DNA zgodnie z instrukcją producenta.
		<ol>
			<li>Krótko mówiąc, zjonizuj komórki proteinazą K i załaduj lizat na kolumnę wiążącą DNA. Podczas wirowania DNA wiąże się z błoną, podczas gdy zanieczyszczenia przechodzą przez nią. Po dwóch etapach mycia w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń i inhibitorów enzymów, wymyj DNA w wodzie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Amplifikuj 200-300 ng genomowego DNA za pomocą standardowej mieszanki PCR zawierającej polimerazę DNA, białka pomocnicze, sole i dNTP oraz 10 μM starterów do przodu i do tyłu flankujących obszar zamierzonego pęknięcia podwójnej nici. 
		UWAGA: W przypadku projektowania startera PCR, referencyjna sekwencja genomowa (którą można znaleźć za pomocą http://www.ensemble.org) flankująca miejsce cięcia gRNA jest wprowadzana do narzędzia NCBI starter blast tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Startery PCR powinny być zaprojektowane w taki sposób, aby amplikon miał docelową wielkość 600-700 pz. Długość ta pozwala na zaprojektowanie starterów sekwencjonowania, które wiążą się w amplikonie w wystarczającej odległości od miejsca cięcia gRNA (co najmniej 150 pz), aby zapewnić dobrą jakość sekwencjonowania wokół indeli indukowanych Cas9 (patrz 4.2.1). Każda gRNA wymaga unikalnej pary starterów, chyba że miejsca cięcia gRNA znajdują się w bliskiej odległości. </li>
		<li>Uruchom cały produkt PCR na 1% żelu agarozowym i oczyść amplikon za pomocą standardowego zestawu do oczyszczania w żelu agarozowym. 
		UWAGA: Proces określania optymalnej Tm dla PCR może obejmować wiele rund rozwiązywania problemów. Dzieje się tak, ponieważ sekwencja KO ma indele, a gen docelowy powinien być przygotowany do sekwencjonowania, w którym nie byłoby indeli, zwykle 100 pz przed lub za miejscem cięcia. Może się to znacznie różnić ze względu na indele wynikające z niehomologicznego łączenia końców. Zaprojektowanie zagnieżdżonych starterów sekwencjonowania do starterów PCR i zwiększenie stężenia sekwencjonowanych produktów może wyeliminować problemy z sekwencjonowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekwencjonowanie i wykrywanie indel
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery sekwencjonowania, które wiążą się z oczyszczonym żelem amplikonem i wysyłają makiety i nokautujące amplikony do sekwencjonowania Sangera. Po zakończeniu sekwencjonowania prześlij pliki śledzenia do oprogramowania Desktop Genetics (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) w celu analizy TIDE.
		<ol>
			<li>W celu sekwencjonowania projektu startera wprowadź sekwencję amplikonu PCR do standardowego oprogramowania do projektowania starterów (NCBI, Eurofins lub inne publicznie dostępne narzędzia). Oprogramowanie do projektowania zasugeruje wiele sekwencji starterów, które są odpowiednie do sekwencjonowania Sangera.</li>
			<li>Wybierz startery do przodu i do tyłu, które wiążą się w amplikonie co najmniej 150 pz przed lub za miejscem cięcia gRNA, aby zapewnić dobrą jakość sekwencjonowania wokół indeli. Chromatogram sekwencjonowania zostanie użyty w ppkt 4.2 do analizy TIDE, dlatego ważne jest, aby jakość sekwencjonowania była dobra dla dokładnego rozkładu indelu (patrz Hultquist i wsp.)25.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj analizy TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition), aby wykryć skuteczność nokautu (KO) na poziomie genomu26. Algorytm dokładnie rekonstruuje widmo indeli na podstawie śladów sekwencji i oblicza wartości R2, odzwierciedlając dobroć dopasowania po nieujemnym modelowaniu liniowym przez oprogramowanie TIDE.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja białka docelowego
	<ol>
		<li>W przypadku genów docelowych, których produkt genowy ulega ekspresji na powierzchni limfocytów T, należy wybarwić około 1 x 105 komórek z każdej hodowli przesiewowej przeciwciałem znakowanym fluorochromem specyficznym dla białka docelowego. Porównaj poziomy ekspresji białka docelowego między grupą kontrolną a grupą nokautową za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A,3B.</li>
		<li>W przypadku genów docelowych, których produkt genu ulega ekspresji wewnątrzkomórkowej, należy lizować około 3 x 106 milionów komórek na grupę przesiewową w buforze do lizy i postępować zgodnie ze standardowymi protokołami dla SDS-PAGE i western blotting. Alternatywnie, powierzchniowa lub wewnątrzkomórkowa cytometria przepływowa może być użyta do sondowania docelowego białka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Monitorowanie efektów niezamierzonych za pomocą iGUIDE - Przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie i analiza DNA
UWAGA: Technika iGUIDE pozwala na wykrywanie lokalizacji rozszczepienia kierowanego Cas9 i ilościowe określenie rozkładu tych dwuniciowych pęknięć DNA.
<ol>
	<li>Wykonaj iGUIDE zgodnie z opisem Nobles et al.21. Niecelowe efekty locus TRAC ukierunkowane na sgRNA przy użyciu techniki iGUIDE zostały pokazane w Stadtmauer i in., 202013.</li>
</ol>

<ol><li>Kowolik, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).</li>
<li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-dependent+CD28+signaling+selectively+enhances+survival+and+proliferation+in+genetically+modified+activated+human+primary+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).</li>
<li>Kuwana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+chimeric+receptor+composed+of+immunoglobulin-derived+V+resions+and+T-cell+receptor-derived+C+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+Communications%22%5BJournal%5D)">Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions.</a> Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).</li>
<li>Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-lymphocyte+cytotoxicity+and+proliferation+directed+by+a+single+chimeric+TCR%CE%B6%2FCD28+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).</li>
<li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+manufacturing+of+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Global manufacturing of CAR-T cell therapy.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+ciloleucel+CAR-T-cell+therapy+in+refractory+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 139(2015).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+and+NK-cell+infiltration+into+solid+tumors%3A+a+key+limiting+factor+for+efficacious+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy.</a> Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).</li>
<li>Mohammed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cell+function+by+reversing+the+immunosuppressive+tumor+microenvironment+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer.</a> Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).</li>
<li>Moon, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifactorial+T-cell+hypofunction+that+is+reversible+can+limit+the+efficacy+of+chimeric+antigen+receptor-transduced+human+T+cells+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).</li>
<li>Beatty, G. L., O'Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+the+treatment+of+solid+tumors%3A+defining+the+challenges+and+next+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps.</a> Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).</li>
<li>Stadtmauer, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-engineered+T+cells+in+patients+with+refractory+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer.</a> Science. 367 (6481), (2020).</li>
<li>MacLeod, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+a+CD19+CAR+into+the+TCR+alpha+chain+locus+streamlines+production+of+allogeneic+gene-edited+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells.</a> Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+editing+to+generate+universal+CAR-T+cells+resistant+to+PD1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).</li>
<li>Ureña-Bailén, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+technology%3A+towards+a+new+generation+of+improved+CAR-T+cells+for+anticancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies.</a> Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).</li>
<li>Li, C., Mei, H., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+explorations+of+CRISPR%2FCas9+in+CAR-T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy.</a> Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, 00471(2013).</li>
<li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).</li>
<li>Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+choices%3A+regulation+of+memory+CD8+T+cell+generation+and+homeostasis+by+interleukin+%28IL%29-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Hultquist, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+engineering+of+primary+CD4%2B+T+cells+for+the+interrogation+of+HIV-host+factor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions.</a> Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

W tym miejscu opisujemy podejścia do edycji genów komórek CAR-T przy użyciu technologii CRISPR Cas9 i wytwarzania produktów w celu dalszego testowania funkcji i skuteczności. Powyższy protokół został zoptymalizowany pod kątem przeprowadzania edycji genu CRIPSR w pierwotnych ludzkich limfocytach T w połączeniu z inżynierią limfocytów T z chimerycznymi receptorami antygenowymi. Protokół ten pozwala na wysoką skuteczność nokautu przy minimalnej zmienności między dawcami. Modyfikacja za pomocą CRISPR może poprawić zarówno sk...

Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T zrewolucjonizowała dziedzinę adoptywnych terapii komórkowych i immunoterapii nowotworów. Limfocyty CAR-T to zmodyfikowane limfocyty T wyrażające syntetyczny receptor immunologiczny, który łączy specyficzny dla antygenu fragment przeciwciała jednołańcuchowego z domenami sygnałowymi pochodzącymi z łańcucha TCRzeta i domenami kostymulującymi, niezbędnymi i wystarczającymi do aktywacji komórek T i kostymulacji1,2,3,4. Produkcja komórek CAR-T rozpoczyna się od ekstrakcji własnych limfocytów T pacjenta, a następnie transdukcji wirusa ex vivo modułu CAR i ekspansji produktu komórkowego CAR-T za pomocą kulek magnetycznych, które działają jak sztuczne komórki prezentujące antygen5. Rozszerzone komórki CAR-T są ponownie podawane pacjentowi, gdzie mogą się wszczepić, wyeliminować docelowe komórki nowotworowe, a nawet utrzymywać się przez wiele lat po infuzji6,7,8. Chociaż terapia komórkami CAR-T doprowadziła do znacznych wskaźników odpowiedzi w nowotworach złośliwych komórek B, sukces kliniczny w przypadku guzów litych został zakwestionowany przez wiele czynników, w tym słabą infiltrację komórek T9, immunosupresyjne mikrośrodowisko nowotworu10, pokrycie i swoistość antygenu oraz dysfunkcja komórek CAR-T11,12. Innym ograniczeniem obecnej terapii komórkami CAR-T jest stosowanie autologicznych limfocytów T. Po wielu rundach chemioterapii i wysokim obciążeniu nowotworem, komórki CAR-T mogą być niskiej jakości w porównaniu z allogenicznymi produktami CAR-T od zdrowych dawców, a także czas i koszty związane z produkcją autologicznych komórek CAR-T. Edycja genów produktu komórkowego CAR-T za pomocą CRISPR/Cas9 stanowi nową strategię przezwyciężania obecnych ograniczeń komórek CAR-T13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 to dwuskładnikowy system, który może być używany do celowej edycji genomu w komórkach ssaków18,19. Endonukleaza Cas9 związana z CRISPR może indukować specyficzne dla miejsca pęknięcia podwójnej nici prowadzone przez małe RNA poprzez parowanie zasad z docelową sekwencją DNA20. W przypadku braku szablonu naprawczego, pęknięcia dwuniciowe są naprawiane przez podatny na błędy szlak łączenia niehomologicznych końców (NHEJ), co skutkuje mutacjami przesunięcia ramki lub przedwczesnymi kodonami stop poprzez mutacje insercji i delecji (INDELs)19,20,21. Wydajność, łatwość użycia, opłacalność i możliwość multipleksowej edycji genomu sprawiają, że CRISPR/Cas9 jest potężnym narzędziem zwiększającym skuteczność i bezpieczeństwo autologicznych i allogenicznych komórek CAR-T. To podejście można również wykorzystać do edycji komórek T skierowanych przez TCR, zastępując konstrukcję CAR TCR. Ponadto allogeniczne komórki CAR-T, które mają ograniczony potencjał do wywoływania choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, mogą być również generowane przez edycję genów locus TCR, b2m i HLA.
W tym protokole pokazujemy, jak inżynieria CRISPR limfocytów T może być połączona z dostarczaniem CAR-Transgene za pośrednictwem wektora wirusowego, aby generować produkty komórkowe CAR-T z edytowanym genomem o zwiększonej skuteczności i bezpieczeństwie. Schemat ideowy całego procesu jest pokazany w Rysunek 1. Stosując to podejście, wykazaliśmy wysoką skuteczność nokautu genów w pierwotnych ludzkich komórkach CAR-T. Rysunek 2A szczegółowo opisuje harmonogram każdego kroku edycji i produkcji komórek T. Omówiono również strategie projektowania przewodnikowego RNA i walidacji nokautu w celu zastosowania tego podejścia do różnych genów docelowych.

<table><tbody><tr><td>Jednostka podstawowa 4D-Nucleofactor</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofactor X-Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Accuprime Pfx Supermix</td><td>ThermoFisher</td><td>12344040</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Beckman Optima XPN Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anty-ludzkie przeciwciało CD3</td><td>Biolegend</td><td>317322</td><td>Klon OKT3</td></tr><tr><td>BV711 Anty-ludzki klon PD1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>EH12.2H7</td></tr><tr><td>Cas9-Wzmacniacze elektroporacji</td><td>IDT</td><td>1075915</td><td></td></tr><tr><td>CD3 / CD28 Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CD4 + Zestaw do izolacji limfocytów T</td><td>Technologie stemCell</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>CD8 + Zestaw do izolacji limfocytów T</td><td>Technologie StemCell</td><td>15063</td><td></td></tr><tr><td>Filtr/butelka próżniowa Corning 0,45 mikrona</td><td>Corning</td><td>430768</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych Corning T150</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td> Zestaw do krwi i tkanek <td>Millipore Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNAeasy</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Magnes DynaMag</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Suplement</td> <td>GlutamaxTermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T ogniwa</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>huIL-15</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>huIL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel i czyszczenie PCR</td><td>Takara</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>P3 Komórka pierwotna 4D-nukleofactor X Kit L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>ekspresja pTRPE Plazmid</td><td>w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Królik Anti-Mouse FMC63 scFv Przeciwciało monoklonalne, (R19M), PE</td><td>CytoArt</td><td>200105</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>ThermoFisher</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spy Fi Cas9</td><td>Aldevron</td><td>9214</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Wirusowa mieszanka opakowaniowa</td><td>we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo-15 Media</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja ludzkich komórek car-t zmodyfikowanych przez crispr

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptywne terapie komórkowe wykorzystujące limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym (komórki CAR-T) wykazały niezwykłą skuteczność kliniczną u pacjentów z nowotworami hematologicznymi i są obecnie badane pod kątem różnych guzów litych. Limfocyty CAR-T są generowane przez usunięcie limfocytów T z krwi pacjenta i zmodyfikowanie ich w celu ekspresji syntetycznego receptora immunologicznego, który przekierowuje limfocyty T w celu rozpoznania i wyeliminowania docelowych komórek nowotworowych. Edycja genów w komórkach CAR-T może potencjalnie poprawić bezpieczeństwo obecnych terapii komórkowych CAR-T i jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność komórek CAR-T. W tym miejscu opisujemy metody aktywacji, ekspansji i charakterystyki ludzkich komórek CAR-T skierowanych na CD19 za pomocą CRISPR. Obejmuje to transdukcję wektora lentiwirusowego CAR i wykorzystanie pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA) i endonukleazy Cas9 do celowania w geny będące przedmiotem zainteresowania w limfocytach T. Metody opisane w tym protokole mogą być uniwersalnie stosowane do innych konstruktów CAR i genów docelowych poza tymi, które zostały użyte w tym badaniu. Ponadto w protokole tym omówiono strategie projektowania gRNA, selekcji gRNA i walidacji nokautu genu docelowego w celu uzyskania wysoce wydajnej, multipleksowej inżynierii CRISPR-Cas9 ludzkich limfocytów T klasy klinicznej.

Opisujemy tutaj protokół inżynierii genetycznej limfocytów T, który może być wykorzystany do generowania zarówno autologicznych, jak i allogenicznych komórek CAR-T, a także limfocytów T z przekierowanym receptorem TCR.
Rysunek 1 przedstawia szczegółowy opis etapów zaangażowanych w proces wytwarzania limfocytów T edytowanych za pomocą CRISPR. Proces rozpoczyna się od zaprojektowania sgRNA dla genu docelowego. Po zaprojektowaniu i syntezie sgRNA są one wykorzystywan...

Tutaj prezentujemy protokół edycji genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą technologii CRISPR Cas do modyfikacji komórek CAR-T.

Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych przez CRISPR

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Nasz protokół laboratoryjny umożliwia połączenie edycji ludzkiego genomu z terapią komórkami CAR T. Procedura laboratoryjna polega na tym, że CRISPR-Cas9 celuje w maksymalnie trzy geny z wysoką skutecznością. I wreszcie, nasze podejście można przełożyć na badania kliniczne na ludziach.Opisane metody można zastosować do innych konstruktów CAR i genów docelowych. Podstawy tych technik są na tyle solidne, że można je przełożyć na większą skalę oraz do współpracy akademickiej i przemysłowej w celu dalszego rozwoju. Próbując użyć tego protokołu po raz pierwszy, ogranicz liczbę grup w przewodnikowym ekranie RNA, aby umożliwić dokładne czasy inkubacji.Z naszego doświadczenia wynika, że przestrzeganie opisanych warunków uprawy i gęstości wysiewu ma kluczowe znaczenie. Na początek należy uzyskać autologiczne komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC od zdrowych dawców ochotników i wyizolować limfocyty T CD4 i CD8 dodatnie za pomocą dostępnych na rynku zestawów selekcyjnych CD4 i CD8. Połącz limfocyty T CD4-dodatnie i CD8-dodatnie w stosunku jeden do jednego i inkubuj 3 miliony komórek na mililitr w R10, uzupełnione 5 nanogramami na mililitr każdego ludzkiego IL7 i ludzkiego IL15 przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia policz limfocyty T i odwiruj od 5 do 10 milionów komórek w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Odrzucić cały supernatant i przemyć osad komórkowy w zredukowanej surowicy o minimalnej ilości niezbędnych pożywek. Ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach roztworu jądrowego zgodnie z instrukcjami producenta.Podczas mycia komórek przygotuj rybonukleoproteinę lub kompleks RNP, inkubując 10 mikrogramów nukleazy Cas9 z 5 mikrogramami pojedynczego przewodnika RNA przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dołącz symulowaną kontrolę bez pojedynczego prowadzącego RNA. Połącz ponownie zawieszone komórki z kompleksem RNP i dodaj 4,2 mikrolitra czteromikromolowego wzmacniacza elektroporacji.Dobrze wymieszaj i przenieś do kuwet do elektroporacji. Elektroporuj komórki za pomocą kodu impulsu EH111, a następnie inkubuj 5 milionów komórek na mililitr w R10, uzupełnionych 5 nanogramami na mililitr ludzkiego IL7 i ludzkiego IL15 w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin w 12-dołkowych płytkach. Po inkubacji przystąp do aktywacji i ekspansji limfocytów T.Zaprojektuj startery sekwencjonowania, wprowadzając sekwencję amplikonu PCR do standardowego oprogramowania do projektowania starterów. Oprogramowanie do projektowania zasugeruje wiele sekwencji starterów, które są odpowiednie do sekwencjonowania Sangera. Wybierz startery do przodu i do tyłu, które wiążą się z amplikonem co najmniej 150 par zasad przed lub za miejscem cięcia gRNA, aby zapewnić dobrą jakość sekwencjonowania wokół indeli.Użyj analizy TIDE, aby wykryć skuteczność nokautu na poziomie genomu. Algorytm dokładnie rekonstruuje widmo indeli ze śladów sekwencji i oblicza wartości R kwadrat. Po aktywacji limfocyty T są namnażane w hodowli i kriokonserwowane do przyszłych badań.Podczas ekspansji podwojenie populacji i zmiany objętości są śledzone w całym protokole zarówno dla pozorowanych, jak i edytowanych komórek CAR T. Nie wykryto żadnych istotnych zmian w proliferacji i aktywacji podczas ekspansji. Po krioprezerwacji komórek określono poziomy ekspresji CAR do dalszych badań funkcjonalnych zarówno dla pozorowanych komórek T CAR, jak i nokautowanych.Nie zaobserwowano istotnych zmian. Skuteczność nokautu można określić za pomocą wielu technik. Na tych reprezentatywnych wykresach cytometrii przepływowej loci PDCD1 i TRAC były celowane przy użyciu pojedynczego przewodnika RNA, wykazując skuteczność 90% dla pojedynczego przewodnika RNA PDCD1 i 98% dla pojedynczego przewodnika RNA TRAC u wielu zdrowych dawców.Ważne jest, aby upewnić się, że proporcje molowe Cas9 i przewodnikowych RNA są dokładne. Podczas zabiegu komórki powinny być zawsze utrzymywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza i nie powinny być pozostawiane w roztworze do elektroporacji przez dłuższy czas. Po zakonserwowaniu CAR, zmodyfikowane przez CRISPR limfocyty CAR T mogą być wykorzystywane do testów funkcjonalnych in vitro i in vivo, takich jak testy cytotoksyczności, produkcja cytokin i syngenetyczne lub ksenograficzne modele myszy nowotworowych.Nasze podejście wykorzystujące technologię CRISPR Cas9 jest obecnie stosowane w badaniach klinicznych. Podejście to może być stosowane zarówno w przypadku raka, jak i niezłośliwych chorób genetycznych, takich jak hemoglobinofaty, które dotykają miliony dzieci i dorosłych na całym świecie.

production-of-human-crispr-engineered-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Film przedstawia proces tworzenia genetycznie modyfikowanych komórek CAR T za pomocą systemu CRISPR-Cas9. Zakażenie limfocytów T lentiwirusami CRISPR i CAR powoduje modyfikacje genu docelowego i syntezę chimerycznego receptora antygenowego lub CAR, co ostatecznie prowadzi do powstania genetycznie zmodyfikowanych limfocytów CAR T.

Genetyczna modyfikacja limfocytów CAR T przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Ten film demonstruje test do edycji genów w ludzkich limfocytach T przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Mieszanina pierwotnych limfocytów T CD4 + i CD8 + jest połączona z kompleksem rybonukleoproteinowym CRISPR-Cas9, ukierunkowanym na określone geny w celu nokautu. Po elektroporacji sgRNA kieruje Cas9 do docelowej sekwencji DNA, tworząc precyzyjne cięcia. Cięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczny mechanizm łączenia końców komórki, co prowadzi do nokautu genu.

Technika CRISPR-Cas9 do edycji genów w limfocytach T

Ten film demonstruje technikę generowania limfocytów T z chemerycznym receptorem antygenu (CAR) specyficznym dla antygenu poprzez transdukcję retrowirusową. Aktywowane mysie limfocyty T CD8 + dodaje się do płytki mikrodołkowej pokrytej rekombinowanymi fragmentami fibronektyny. Następnie wprowadza się wektory retrowirusowe zawierające transgeniczne RNA kodujące specyficzny dla antygenu chimeryczny receptor antygenowy (CAR), a płytkę odwirowuje się w celu ułatwienia transdukcji. Po inkubacji...

Technika wytwarzania limfocytów CAR T specyficznych dla antygenu

wyrażające specyficzny dla CD19 receptor antygenu chimerycznego (CAR) są podawane jako eksperymentalne leczenie nowotworów złośliwych komórek B w naszych pierwszych badaniach klinicznych terapii genowej u ludzi. Opisujemy modyfikację genetyczną limfocytów T przy użyciu systemu Śpiącej Królewny (SB) w celu wprowadzenia specyficznego dla CD19 CAR i selektywnej propagacji na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen CD19 +.

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Limfodepletywne i immunomodulacyjne efekty standardu leczenia chemioterapią i radioterapią mogą być wykorzystane do zwiększenia skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii limfocytami T. Przedstawiamy metodę generowania limfocytów T receptora antygenu chimerycznego (CAR) specyficznych dla EGFRvIII i podawania ich w kontekście standardowej opieki nad glejakiem.

Wytwarzanie limfocytów CAR T do terapii adoptywnej w kontekście standardu opieki nad glejakiem

Tutaj prezentujemy protokół do genetycznej edycji komórek CAR-T za pomocą systemu CRISPR/Cas9.

Wykorzystanie CRISPR/Cas9 do wyeliminowania GM-CSF w komórkach CAR-T

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Szczegółowy protokół jest dostępny dla użycia technologii CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wysoce efektywnego docelowego wkręcania dużych, multicistronicznych konstruktów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pośrednictwem homologii (HMEJ) szlaku naprawy DNA. Limfocyty T zmodyfikowane za pomocą tego protokołu adaptowalnego do cGMP utrzymują doskonałą ekspansję komórek, cytotoksyczność i produkcję cytokin.

Inżynieria niewirusowa pierwotnych ludzkich limfocytów T poprzez ukierunkowaną integrację dużych matryc DNA za pośrednictwem homologii

Ten protokół opisuje kluczowe kroki uprawy pierwotnych komórek T, w tym ich izolację, aktywację, ekspansję oraz przejściową transfekcję przez elektroporację mRNA. Dodatkowo proponowany jest przepływ pracy i panel przeciwciał do analizy cytometrycznej fenotypu, markerów aktywacji, żywotności oraz ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR).

Izolacja, hodowla i przejściowa transfekcja pierwotnych ludzkich komórek T w celu wygenerowania komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)

Poznaj protokół produkcji ludzkich komórek CAR-T modyfikowanych przez CRISPR-Cas9 z wysoką wydajnością edycji wielu genów. Ta metoda umożliwia translację do zastosowań klinicznych w terapii przeciwnowotworowej.

Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych przez CRISPR

Przeglądaj więcej filmów