Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego
4 kwietnia 2021
Ten protokół opisuje procedurę usuwania brzusznego płata wątroby u dorosłego danio pręgowanego, aby umożliwić badanie regeneracji wątroby.
Protokół ten pozwoli naukowcom wykorzystać dostępne narzędzia chemiczne i genetyczne do zbadania mechanizmów regeneracji wątroby u danio pręgowanego. Częściowa hepatektomia pozwala na precyzyjne usunięcie tkanki w celu pobudzenia regeneracji wątroby bez konieczności stosowania toksycznych skutków toksycznego uszkodzenia wątroby w całym organizmie. Tylko dzięki zrozumieniu molekularnych i komórkowych mechanizmów regeneracji wątroby możemy zaprojektować nowe terapie do leczenia pacjentów z zaawansowaną chorobą wątroby.
Na początek wyjmij rybę ze zbiornika Tricaine za pomocą kleszczy i osadź ją w rowku gąbki nasączonej Tricaine brzuszną stroną do góry. Następnie umieść gąbkę pod mikroskopem preparacyjnym z oświetleniem od góry do dołu. Uszczypnij skórę i łuski tuż za sercem za pomocą cienkich kleszczy i utwórz otwór w jamie ciała, wykonując nacięcie pod kleszczami za pomocą sprężynowych nożyczek.
Obróć gąbkę i wykonaj trzy-czteromilimetrowe nacięcie wzdłuż brzucha, przecinając z tyłu w kierunku płetw brzusznych. Następnie obróć gąbkę z powrotem. Ściśnij boki gąbki jedną ręką, aby wypchnąć narządy trzewne z jamy ciała.
Płat brzuszny wątroby jest obecny na górze jelita, a wątroba jest różową lub pomarańczową strukturą rozłożoną na złotobrązowym jelicie i można ją wyraźnie uwidocznić za pomocą fluorescencji CFP. Ściśnij cienkie kleszcze tak, aby zęby stykały się ze sobą i wsuń zęby między wątrobę a jelito. Następnie powoli oddziel zęby, aby przerwać przyczepy żyły wrotnej między wątrobą a jelitem.
Powtarzaj ten proces, aż wszystkie połączenia wrotne między wątrobą a jelitem zostaną zerwane i wyciągnij płat brzuszny z jelita za pomocą cienkich kleszczy. Odetnij płat brzuszny od reszty wątroby. Badanie zwierzęcia za pomocą fluorescencji CFP wykazuje, że płat brzuszny został usunięty.
Po zakończeniu ostrożnie przenieś rybę z gąbki do zbiornika zawierającego wodę systemową i strumieniuj wodę systemową przez skrzela przez kilka minut, aż ryba wyzdrowieje i zacznie samodzielnie pływać. Po eutanazji ryby usuń ją z lodowatej wody. Umieść go w rowku gąbki brzuszną stroną do góry i wykonaj nacięcie brzusznej ściany ciała w przednim tylnym położeniu serca.
Następnie wykonaj dwa kolejne nacięcia od krawędzi pierwszego nacięcia, które biegną wzdłuż przedniej tylnej osi do płetw brzusznych i oderwij skórę i mięśnie, aby odsłonić narządy trzewne. Narządy trzewne można teraz wizualizować zarówno za pomocą jasnego pola, jak i mikroskopii fluorescencyjnej. Regenerację wątroby po częściowej hepatektomii oszacowano, obliczając stosunek wątroby do masy ciała, który wynosił 1,8% dla mężczyzn i 3,3% dla kobiet.
Stosunek wątroby do masy ciała obu płci określono w dniu zero po operacji i w siódmym dniu w częściowej hepatektomii i pozorowanej kontroli. W dniu zero po operacji zwierzęta pozorowane mają widoczny płat brzuszny, ale u zwierząt po częściowej hepatektomii płat brzuszny był całkowicie nieobecny, co spowodowało 30% zmniejszenie stosunku wątroby do masy ciała u samic o 30% i 20% zmniejszenie stosunku wątroby do masy ciała. W siódmym dniu po operacji u zwierząt po częściowej hepatektomii płat brzuszny nie był zregenerowany, a stosunek wątroby do masy ciała w częściowej hepatektomii i pozorowanej kontroli był porównywalny, co wskazuje na odzyskaną masę wątroby po częściowej hepatektomii.
Wpływ czasu na regenerację płata brzusznego określono poprzez wykonanie pełnej 1/3 częściowej hepatektomii i pomiar stosunku płata brzusznego do długości jelita. Płat brzuszny zajmował od 50 do 100% długości jelita w kontrolach pozorowanych, ale był znacznie zmniejszony u 1/3 zwierząt po częściowej hepatektomii. Zwierzęta po częściowej hepatektomii w 36. dniu po operacji miały zwiększony stosunek płata brzusznego do jelita w porównaniu z pierwszym dniem po operacji.
Statystycznie istotne zwiększenie rozmiaru płata brzusznego zaobserwowano u zwierząt powracających do zdrowia po częściowej hepatektomii w 36. dniu po operacji w porównaniu z pierwszym dniem, ale nie w kontrolach pozorowanych. Niektóre zwierzęta zregenerowały płat brzuszny, ale niektóre nie, co wskazuje na różnice w odpowiedzi na operację. Najważniejszą częścią tego protokołu jest czyste oddzielenie wątroby i jelita, tak aby płat brzuszny mógł zostać całkowicie usunięty.
Częściowa hepatektomia u danio pręgowanego może być wykonana w zmutowanych lub transgenicznych liniach w celu zbadania wymagań genetycznych dotyczących regeneracji wątroby.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy, powtarzalny protokół przeprowadzania częściowej hepatektomii u dorosłych danio pręgowanych, umożliwiający precyzyjne badanie regeneracji wątroby. Metoda ta pozwala badaczom na analizę mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw odrostu wątroby, wykorzystując danio pręgowanego jako organizm modelowy o bezpośrednim znaczeniu klinicznym dla chorób wątroby u ludzi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia regeneracyjna
- Fizjologia wątroby
- Modelowe systemy danio pręgowanego
Wstęp
- Niewydolność wątroby stanowi poważny globalny problem zdrowotny, wiążący się ze wzrostem śmiertelności z powodu przewlekłych chorób wątroby.
- Zdrowe wątroby mogą regenerować się po uszkodzeniu, jednak zdolność ta jest upośledzona w zaawansowanym stadium choroby.
- Danio pręgowany jest potężnym modelem do badania regeneracji organów, w tym odrastania wątroby po częściowej hepatektomii.
- Istniejące protokoły częściowej hepatektomii u danio pręgowanego różnią się od siebie, co prowadzi do niespójnych wyników.
Cel badania
- Opracowanie wydajnego i powtarzalnego protokołu częściowej hepatektomii u dorosłych danio pręgowanych.
- Wykazanie zdolności danio pręgowanych do regeneracji wyresekowanego płata wątroby.
- Stworzenie platformy do dalszych badań nad genetycznymi i molekularnymi mechanizmami regeneracji wątroby.
Zastosowane metody
- Dorosłe danio pręgowane są znieczulane i ułożone brzuchem do góry na gąbce nasączonej trikainą.
- Wykonuje się precyzyjne nacięcie w celu uzyskania dostępu do wątroby, a następnie ostrożnie oddziela się i wycina płat brzuszny od jelita.
- Monitoruje się rekonwalescencję pooperacyjną, a regenerację wątroby ocenia się za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Stosunki masy wątroby do masy ciała oraz długości płata brzusznego do długości jelita są mierzone w różnych punktach czasowych po operacji.
Główne wyniki
- Częściowa hepatektomia skutkuje znaczną początkową redukcją stosunku masy wątroby do masy ciała (30% u samców, 20% u samic).
- Do 7. dnia po operacji masa wątroby zostaje w dużej mierze przywrócona, a uzyskane stosunki są porównywalne z grupami kontrolnymi (sham).
- Regeneracja płata brzusznego jest obserwowana u niektórych, lecz nie u wszystkich zwierząt do 36. dnia po operacji, co wskazuje na zmienność odpowiedzi regeneracyjnej.
- Protokół umożliwia zastosowanie w mutantach lub transgenicznych liniach zebrafish w celu badania wymagań genetycznych dla regeneracji.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia precyzyjne i powtarzalne wykonanie częściowej hepatektomii u dorosłych danio pręgowanych.
- Danio pręgowane potrafią regenerować tkankę wątroby po chirurgicznym usunięciu płata brzusznego.
- Metoda ta ułatwia szczegółowe badanie mechanizmów sterujących regeneracją wątroby, co może mieć znaczenie dla rozwoju nowych terapii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Częściowa hepatektomia u dorosłych rybek zebrafish stanowi odtwarzalny, ilościowy model służący do badania mechanizmów regeneracji wątroby istotnych w kontekście chorób ludzkich. Niniejszy protokół umożliwia precyzyjne usunięcie tkanki oraz ocenę regeneracji, co wspiera walidację celów i minimalizację ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Kompatybilność tej metody z narzędziami genetycznymi i chemicznymi sprawia, że stanowi ona fundamentalny schemat postępowania w przedklinicznych badaniach nad biologią wątroby.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę ścieżek regeneracyjnych opartą na hipotezach po kontrolowanym uszkodzeniu wątroby.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów genetycznych lub farmakologicznych wpływających na odrastanie wątroby.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez oddzielenie odpowiedzi regeneracyjnych od toksyczności systemowej.
- Zapewnia ilościowe punkty końcowe do selekcji projektów z portfolio i priorytetyzacji celów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zestandaryzowany, powtarzalny model uszkodzenia do późniejszego przesiewania związków chemicznych lub genetycznego.
- Dostarcza danych ilościowych, takich jak stosunek masy wątroby do masy ciała oraz stosunek masy płata do masy jelit, niezbędnych do opracowania testów.
- Umożliwia powtarzalną ocenę zdolności regeneracyjnych w różnych kohortach eksperymentalnych.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w transgenicznych lub mutantowych liniach zebrafish.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z istotnymi dla choroby punktami końcowymi regeneracji w celu poszukiwania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po przedkliniczną walidację mechanizmów regeneracyjnych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ilościowe wskaźniki regeneracji.
- Wspiera predykcyjne ograniczanie ryzyka w przypadku strategii terapeutycznych ukierunkowanych na wątrobę.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając kontrolowane wywołanie urazu, ilościową ocenę regeneracji oraz analizę genetyczną lub farmakologiczną w modelu kręgowca.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków regeneracji wątroby.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne modele uszkodzeń z ilościowymi wynikami.
- Analityka: Dostarcza mierzalne punkty końcowe, takie jak stosunek masy wątroby do masy ciała oraz stosunek masy płata do masy jelit, do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną w systemie istotnym dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do badań genetycznych, chemicznych i mechanistycznych w biologii wątroby.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad regeneracją wątroby.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę uszkodzenia i regeneracji w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów medycyny regeneracyjnej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z danio pręgowanym, mikrochirurgii oraz opiece pooperacyjnej.
- Wymaga dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej i infrastruktury do obrazowania ilościowego.
- Wymaga standaryzacji procedur chirurgicznych i analitycznych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych tło genetycznych i linii transgenicznych w badaniach mechanistycznych.
- Zależna od precyzyjnej separacji tkanek w celu zapewnienia powtarzalnych wyników regeneracji.
