Name: Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Poznaj protokół częściowej hepatektomii u dorosłych Danio rerio, umożliwiający badanie mechanizmów regeneracji wątroby. Metoda ta pozwala na precyzyjne badania molekularne i komórkowe z zastosowaniem w terapii chorób wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

I.M.O. jest wspierany przez NIAAA (F32AA027135). W.G. jest wspierany przez R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 oraz Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. jest stypendystą Pew w dziedzinie nauk biomedycznych.

Danio pręgowany był hodowany i hodowany zgodnie ze standardowymi procedurami. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Brigham and Women's Hospital (2016N000405). Dorosłe rybki danio pręgowanego były poszczone przez 24 godziny przed rozpoczęciem protokołu. Woda systemowa odnosi się do wody w zbiornikach z rybami pręgowanymi w obiekcie wodnym.
1. Przygotowanie i znieczulenie
<ol>
	<li>Przygotować 0,016% roztwór trikainy w wodzie systemowej. 
	UWAGA: Trikaina działa drażniąco, jeśli wejdzie w kontakt z oczami, skórą lub drogami oddechowymi.</li>
	<li>Przygotuj gąbkę do trzymania znieczulonego danio pręgowanego podczas protokołu sekcji. Pokrój pełną gąbkę na ćwiartki. Za pomocą żyletki usuń cienki klin gąbki, który biegnie równolegle do długiej osi ćwiartki gąbki.
	<ol>
		<li>Szczelina powinna być wystarczająco długa, aby pomieścić dorosłą rybę (będzie się to różnić w zależności od różnych rozmiarów ryb). Na przykład w przypadku dorosłej ryby o długości 35 mm długość szczeliny powinna wynosić 20 mm. Głowa i tułów są dobrze trzymane w gąbce, ale ogon biegnie poza krawędź gąbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Namocz gąbkę w 0,016% roztworze trikainy.</li>
	<li>Umieścić dorosłego danio pręgowanego (samca lub samicę) w 625 ml 0,016% roztworu trikainy.</li>
	<li>Inkubować przez 6 minut lub do momentu, gdy ryba przestanie reagować na dotyk.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij rybę ze zbiornika Tricaine i umieść rybę brzuszną stroną do góry w rowku gąbki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A - B).</li>
	<li>Umieść gąbkę pod mikroskopem preparacyjnym z oświetleniem od góry do dołu.</li>
</ol>
2. Chirurgia
<ol>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy uszczypnij skórę i łuski przyśrodkowo, tuż za sercem (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B).</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie pod kleszczami, aby utworzyć otwór w jamie ciała (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C - D). Należy uważać, aby nie uszkodzić serca ani głównego naczynia krwionośnego, ponieważ spowoduje to zwiększoną śmiertelność.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie o średnicy 3-4 mm wzdłuż brzucha, przetwarzając z tyłu, aż nacięcie dotrze do płetw brzusznych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D - E). W tym momencie płat brzuszny wątroby może być widoczny przez nacięcie.</li>
	<li>Ściśnij boki gąbki jedną ręką, aby wypchnąć narządy trzewne z jamy ciała. Płat brzuszny wątroby będzie widoczny na górze jelita (<silna klasa="xfig">Rysunki 1F,2A-B). Wątroba pojawi się jako różowa lub pomarańczowa struktura rozłożona na złotobrązowym jelicie. Zwierzęta wyznaczone do kontroli pozorowanej są na tym etapie odzyskiwane.</li>
	<li>Ściśnij cienkie kleszcze tak, aby dwa zęby się stykały. Wywierając nacisk na gąbkę, wsuń zęby cienkich kleszczyków między wątrobę a jelito (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G). Uważaj, aby nie przebić jelita, ponieważ spowoduje to zwiększoną śmiertelność.</li>
	<li>Powoli rozluźnij nacisk na kleszcze, tak aby zęby odsunęły się od siebie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H). To działanie ślizgowe przecina liczne przyczepy żyły wrotnej między płatem brzusznym a jelitem (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2B) i jest konieczne do czystego usunięcia płata brzusznego. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie połączenia wrotne między wątrobą a jelitem zostaną zerwane.</li>
	<li>Oderwij płat brzuszny od jelita za pomocą cienkich kleszczy i odetnij płat brzuszny od reszty wątroby (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1I).</li>
	<li>Procedura ta prowadzi do częściowej hepatektomii w jednej trzeciej (<silna klasa="xfig">Ryc. 1J).</li>
</ol>
3. Odzyskiwanie
<ol>
	<li>Ostrożnie wyjmij rybę z gąbki i umieść ją w zbiorniku z wodą systemową.</li>
	<li>Pipetą podlewaj skrzela pipetami przez kilka minut, aż ryba zacznie samodzielnie pływać (<silna klasa="xfig">Rysunek 1K).</li>
	<li>Monitoruj ryby przez 2-4 godziny przed umieszczeniem ich z powrotem w systemie. Nie należy karmić ryb przez pełne 24 godziny po zabiegu.</li>
	<li>Monitoruj ryby codziennie przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Z czasem nacięcie w ścianie ciała zagoi się naturalnie, bez konieczności zakładania szwów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1L,2C).</li>
</ol>
4. Analiza długości płata brzusznego do jelita
<ol>
	<li>Poddać eutanazji wszystkie zwierzęta przeznaczone do analizy w lodowatej wodzie przez 10 minut, aż ustaną wszystkie ruchy operkularne.</li>
	<li>Wyjmij rybę z lodowatej wody i umieść ją brzuszną stroną do góry w rowku gąbki.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie w brzusznej ścianie ciała w przednim i tylnym położeniu serca. Następnie wykonaj dwa kolejne nacięcia, które biegną wzdłuż osi przednio-tylnej od pierwszego nacięcia aż do płetw brzusznych. (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Zdejmij skórę i mięśnie, aby odsłonić narządy trzewne (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Uzyskaj jasne pole i fluorescencyjne obrazy narządów trzewnych za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. To pole widzenia będzie obejmowało obszar, w którym płat brzuszny został wycięty. Ponieważ zwierzęta są poddawane eutanazji przed analizą, ten rodzaj analizy wyklucza długoterminowe obrazowanie tych samych ryb.</li>
</ol>
5. Analiza stosunku wątroby do masy ciała
<ol>
	<li>Poddać eutanazji wszystkie zwierzęta przeznaczone do analizy w lodowatej wodzie przez 10 minut, aż ustaną wszystkie ruchy operkularne.</li>
	<li>Umieść rybę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodaj 25 ml 4% paraformaldehydu w 1x PBS i 0,3% Tween do probówki. 
	UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny, a roztwory zawierające formaldehyd należy zawsze przetwarzać w okapie chemicznym.</li>
	<li>Nutować przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wykonaj cztery 10-minutowe prania w 1x PBS i 0,3% Tween.</li>
	<li>Wyciągnij ryby kleszczami i osusz na ręczniku papierowym.</li>
	<li>Zapisz wagę całej ryby.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie w brzusznej ścianie ciała w przednim i tylnym położeniu serca. Następnie wykonaj dwa kolejne nacięcia, które biegną wzdłuż osi przednio-tylnej od pierwszego nacięcia aż do płetw brzusznych. (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Zdejmij skórę i mięśnie, aby odsłonić narządy trzewne (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Uzyskaj obrazy wątroby w jasnym polu za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.</li>
	<li>Wypreparuj wątrobę, umieszczając kawałki wątroby na łodzi do ważenia.</li>
	<li>Zapisz wagę wątroby.</li>
</ol>

<ol><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li>
<li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+it+new+again%3A+insight+into+liver+development%2C+regeneration%2C+and+disease+from+zebrafish+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li>
<li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li>
<li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li>
<li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li>
<li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li>
<li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF%CE%B2+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li>
<li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979(2015).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizational+principles+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22The+Liver%3A+Biology+and+Pathobiology%3A+Fifth+Edition%22%5BJournal%5D)">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Różnice anatomiczne między modelami danio pręgowanego i ssaków do regeneracji wątroby stanowią wyjątkowe wyzwanie dla resekcji wątroby. Wątroba danio pręgowanego znajduje się w bliskiej odległości od serca i jelita; Nieumyślne uszkodzenie któregokolwiek z narządów powoduje zwiększoną śmiertelność. Wątroba danio pręgowanego nie jest otoczona, co utrudnia oddzielenie jej od jelita. Wątroba otrzymuje bogatą w składniki odżywcze krew z jelita przez żyły wrotne. U ssaków żyły opuszczające jelito zbiegają się w pierwotnej żyle...

Wśród organów stałych u ludzi, wątroba jest jedynym organem zdolnym do regeneracji1. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ wątroba jest niezbędnym organem, odpowiedzialnym za kluczowe funkcje metaboliczne, magazynowanie energii, detoksykację krwi, wydzielanie białek osocza i produkcję żółci2. Hepatocyty utracone w wyniku uszkodzeń toksycznych lub zapalnych są zastępowane głównie przez podział pozostałych hepatocytów1. Jednym z klasycznych eksperymentalnych modeli badania regeneracji wątroby jest częściowa hepatektomia, w której usuwa się pojedyncze płaty wątroby, pozostawiając pozostałe płaty nienaruszone3. Procedura ta została początkowo opracowana u szczurów, u których usuwa się około dwóch trzecich masy wątroby. Po częściowej hepatektomii u ssaków następuje regeneracja kompensacyjna w pozostałych płatach, aż wątroba odzyska swoją początkową masę. Warto zauważyć, że wątroba ssaków nie zastępuje brakujących płatów.
Danio pręgowany (Danio rerio) stanowi praktyczny model do badania regeneracji dorosłych organów4. Wątroba danio pręgowanego, choć strukturalnie różni się od wątroby ssaków, składa się z tych samych typów komórek i pełni tę samą funkcję, co u ssaków2. Składa się z trzech płatów, z dwoma płatami grzbietowymi i pojedynczym płatem brzusznym, które są spłaszczone wzdłuż jelita. Częściowa hepatektomia była wcześniej wykonywana u danio pręgowanego, ze sprzecznymi relacjami co do dokładnego sposobu regeneracji. Zazwyczaj jedną trzecią częściowej hepatektomii wykonuje się poprzez usunięcie całego płata brzusznego. Wstępne doniesienia wskazywały, że po usunięciu płata brzusznego został on w pełni zregenerowany w ciągu tygodnia5,6,7, co sugeruje, że w przeciwieństwie do wątroby ssaków, wątroba danio pręgowanego jest zdolna do regeneracji epimorficznej. Późniejsze badania wykazały, że usunięcie płata brzusznego skutkowało regeneracją kompensacyjną w płatach grzbietowych, a nie regeneracją brakującego płata brzusznego, a ostatecznie odzyskaniem masy wątroby w ciągu tygodnia8,9. Profilowanie transkryptomiczne płatów grzbietowych po resekcji płata brzusznego ujawniło istotne zmiany związane z regeneracją kompensacyjną10. Biorąc pod uwagę, że sposób regeneracji wątroby może się różnić w zależności od stopnia urazu8, spekulowaliśmy, że rozbieżności w wynikach mogą wynikać z technicznych różnic w protokole częściowej hepatektomii między grupami badawczymi.
Ten protokół opisuje procedurę wykonywania jednej trzeciej częściowej hepatektomii u dorosłego danio pręgowanego poprzez usunięcie płata brzusznego. Technika ta będzie cenna dla oceny mechanizmów regeneracji wątroby.

<table><tbody><tr><td>16% wodny roztwór paraformaldehydu,</td><td>mikroskopia elektronowa klasy EM Sciences</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki wirówkowe Falcon, polipropylen, sterylne</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>AS 82/220.R2 PLUS Waga analityczna</td><td>Bay State Scale & Systems, INC.</td><td>WL-104-1051</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>EMS Kuehne Kleszcze do szkła nakrywkowego/próbek</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72997-07</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td><td></td></tr><tr><td>Mastertop Gąbka do czyszczenia celulozy</td><td>Amazon</td><td>B07CBSM53Z</td><td></td></tr><tr><td>PBS10X Płynny Conc 4L</td><td>EMD Millipore</td><td>6505-4L</td><td></td></tr><tr><td>Super cienkie mikronożyczki, 3 1/4 "proste</td><td>Biomedyczne instrumenty badawcze</td><td>11-1020</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy</td><td>Syndel</td><td>TRIC-M-GR-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, Fisher BioReagents</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Niewydolność wątroby jest jedną z głównych przyczyn zgonów na całym świecie, a śmiertelność z powodu przewlekłej choroby wątroby gwałtownie rośnie w Stanach Zjednoczonych. Zdrowe wątroby są zdolne do regeneracji po uszkodzeniach toksycznych, ale w zaawansowanej chorobie wątroby naturalna zdolność wątroby do regeneracji jest upośledzona. Danio pręgowany stał się potężnym systemem eksperymentalnym do badania regeneracji. Są idealnym modelem do badania regeneracji wątroby po częściowej hepatektomii, procedurze o bezpośrednim znaczeniu klinicznym, w której część wątroby jest usuwana chirurgicznie, pozostawiając resztę nienaruszoną. Nie ma standardowego protokołu częściowej hepatektomii; Poprzednie badania wykorzystujące ten model wykorzystywały nieco inne protokoły i przedstawiały rozbieżne wyniki. Opisano tutaj skuteczny, powtarzalny protokół wykonywania częściowej hepatektomii u dorosłych danio pręgowanego. Używamy tej techniki, aby wykazać, że danio pręgowany jest zdolny do epimorficznej regeneracji wyciętego płata. Protokół ten może być wykorzystany do dalszego badania mechanizmów wymaganych do regeneracji wątroby u danio pręgowanego.

W celu zbadania potencjału regeneracyjnego wątroby dorosłego danio pręgowanego przeprowadzono częściową hepatektomię (PHX) u dorosłych osobników tego gatunku. Do badań wybrano duże, dorosłe ryby (o długości 30-40 mm) w wieku od 1,5 do 2,5 roku. W ramach poszczególnych eksperymentów zwierzęta pobierano z tego samego zbiornika, dobierając je pod kątem wieku i rozmiaru. Jako odpowiednią kontrolę zastosowano operacje pozorowane (sham), podczas których zwierzęta zostały znieczulone i poddane dużemu nacięciu brzusznej ściany c...

Ten protokół opisuje procedurę usuwania brzusznego płata wątroby u dorosłego danio pręgowanego, aby umożliwić badanie regeneracji wątroby.

Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Protokół ten pozwoli naukowcom wykorzystać dostępne narzędzia chemiczne i genetyczne do zbadania mechanizmów regeneracji wątroby u danio pręgowanego. Częściowa hepatektomia pozwala na precyzyjne usunięcie tkanki w celu pobudzenia regeneracji wątroby bez konieczności stosowania toksycznych skutków toksycznego uszkodzenia wątroby w całym organizmie. Tylko dzięki zrozumieniu molekularnych i komórkowych mechanizmów regeneracji wątroby możemy zaprojektować nowe terapie do leczenia pacjentów z zaawansowaną chorobą wątroby.Na początek wyjmij rybę ze zbiornika Tricaine za pomocą kleszczy i osadź ją w rowku gąbki nasączonej Tricaine brzuszną stroną do góry. Następnie umieść gąbkę pod mikroskopem preparacyjnym z oświetleniem od góry do dołu. Uszczypnij skórę i łuski tuż za sercem za pomocą cienkich kleszczy i utwórz otwór w jamie ciała, wykonując nacięcie pod kleszczami za pomocą sprężynowych nożyczek.Obróć gąbkę i wykonaj trzy-czteromilimetrowe nacięcie wzdłuż brzucha, przecinając z tyłu w kierunku płetw brzusznych. Następnie obróć gąbkę z powrotem. Ściśnij boki gąbki jedną ręką, aby wypchnąć narządy trzewne z jamy ciała.Płat brzuszny wątroby jest obecny na górze jelita, a wątroba jest różową lub pomarańczową strukturą rozłożoną na złotobrązowym jelicie i można ją wyraźnie uwidocznić za pomocą fluorescencji CFP. Ściśnij cienkie kleszcze tak, aby zęby stykały się ze sobą i wsuń zęby między wątrobę a jelito. Następnie powoli oddziel zęby, aby przerwać przyczepy żyły wrotnej między wątrobą a jelitem.Powtarzaj ten proces, aż wszystkie połączenia wrotne między wątrobą a jelitem zostaną zerwane i wyciągnij płat brzuszny z jelita za pomocą cienkich kleszczy. Odetnij płat brzuszny od reszty wątroby. Badanie zwierzęcia za pomocą fluorescencji CFP wykazuje, że płat brzuszny został usunięty.Po zakończeniu ostrożnie przenieś rybę z gąbki do zbiornika zawierającego wodę systemową i strumieniuj wodę systemową przez skrzela przez kilka minut, aż ryba wyzdrowieje i zacznie samodzielnie pływać. Po eutanazji ryby usuń ją z lodowatej wody. Umieść go w rowku gąbki brzuszną stroną do góry i wykonaj nacięcie brzusznej ściany ciała w przednim tylnym położeniu serca.Następnie wykonaj dwa kolejne nacięcia od krawędzi pierwszego nacięcia, które biegną wzdłuż przedniej tylnej osi do płetw brzusznych i oderwij skórę i mięśnie, aby odsłonić narządy trzewne. Narządy trzewne można teraz wizualizować zarówno za pomocą jasnego pola, jak i mikroskopii fluorescencyjnej. Regenerację wątroby po częściowej hepatektomii oszacowano, obliczając stosunek wątroby do masy ciała, który wynosił 1,8% dla mężczyzn i 3,3% dla kobiet.Stosunek wątroby do masy ciała obu płci określono w dniu zero po operacji i w siódmym dniu w częściowej hepatektomii i pozorowanej kontroli. W dniu zero po operacji zwierzęta pozorowane mają widoczny płat brzuszny, ale u zwierząt po częściowej hepatektomii płat brzuszny był całkowicie nieobecny, co spowodowało 30% zmniejszenie stosunku wątroby do masy ciała u samic o 30% i 20% zmniejszenie stosunku wątroby do masy ciała. W siódmym dniu po operacji u zwierząt po częściowej hepatektomii płat brzuszny nie był zregenerowany, a stosunek wątroby do masy ciała w częściowej hepatektomii i pozorowanej kontroli był porównywalny, co wskazuje na odzyskaną masę wątroby po częściowej hepatektomii.Wpływ czasu na regenerację płata brzusznego określono poprzez wykonanie pełnej 1/3 częściowej hepatektomii i pomiar stosunku płata brzusznego do długości jelita. Płat brzuszny zajmował od 50 do 100% długości jelita w kontrolach pozorowanych, ale był znacznie zmniejszony u 1/3 zwierząt po częściowej hepatektomii. Zwierzęta po częściowej hepatektomii w 36. dniu po operacji miały zwiększony stosunek płata brzusznego do jelita w porównaniu z pierwszym dniem po operacji.Statystycznie istotne zwiększenie rozmiaru płata brzusznego zaobserwowano u zwierząt powracających do zdrowia po częściowej hepatektomii w 36. dniu po operacji w porównaniu z pierwszym dniem, ale nie w kontrolach pozorowanych. Niektóre zwierzęta zregenerowały płat brzuszny, ale niektóre nie, co wskazuje na różnice w odpowiedzi na operację. Najważniejszą częścią tego protokołu jest czyste oddzielenie wątroby i jelita, tak aby płat brzuszny mógł zostać całkowicie usunięty.Częściowa hepatektomia u danio pręgowanego może być wykonana w zmutowanych lub transgenicznych liniach w celu zbadania wymagań genetycznych dotyczących regeneracji wątroby.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule prezentujemy metodę przeprowadzania HCT u dorosłych danio pręgowanych.

Przeszczepianie całego szpiku nerkowego u dorosłych danio pręgowanych

Nerka danio pręgowanego jest siedliskiem zarówno nerkowych, jak i krwiotwórczych dorosłych komórek macierzystych i progenitorowych, co stanowi wyjątkową okazję do badania tych typów komórek oraz ich potomstwa w kręgowym organizmie modelowym. W niniejszej pracy prezentujemy szczegółową procedurę sekcji, która umożliwia badaczowi identyfikację i chirurgiczne usunięcie nerki dorosłego danio pręgowanego, co może być wykorzystane w takich zastosowaniach jak izolacja komórek, transplantacja oraz...

Sekcja nerek dorosłego danio pręgowanego

Artykuł opisuje celowaną ablację wątroby, metodę wywoływania śmierci hepatocytów za pomocą metronidazolu u transgenicznych larw danio pręgowanego. Przykładowy protokół opisuje proces generowania, manipulowania i oceny celowanej ablacji wątroby u danio pręgowanego.

Celowana ablacja wątroby: indukowanie śmierci hepatocytów za pomocą metronidazolu u transgenicznych larw danio pręgowanego

Wykorzystanie danio pręgowanego do badań sercowo-naczyniowych rozszerza się w kierunku badań nad dorosłymi sercami. W przypadku tych zastosowań szybka i prosta izolacja tkanek serca ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zmian pośmiertnych i uzyskania odpowiedniej liczby próbek. Tutaj opisujemy szybką i powtarzalną metodę preparowania serc dorosłych danio pręgowanego.

Odzyskiwanie serc dorosłych ryb danio pręgowanego do zastosowań o wysokiej przepustowości

Aby pomóc ocenić mechanizmy molekularne leżące u podstaw regeneracji wątroby u danio pręgowanego za pomocą dróg żółciowych, stworzyliśmy model uszkodzenia wątroby, w którym hepatocyty wykazujące ekspresję nitroreduktazy są genetycznie ablowane po leczeniu metronidazolem.  W tym protokole opisujemy, jak umiejętnie manipulować, monitorować i analizować ablację hepatocytów i regenerację wątroby napędzaną przez żółć.

Ablacja specyficzna dla hepatocytów u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe

Trwałe zwłóknienie z odkładaniem się nadmiernej ilości białek macierzy zewnątrzkomórkowej prowadzi do marskości wątroby. Nadużywanie alkoholu jest jedną z głównych przyczyn ciężkich chorób wątroby. Stworzyliśmy model zwłóknienia wątroby danio pręgowanego indukowanego etanolem, aby zbadać mechanizmy i strategie promowania regeneracji hepatocytów po uszkodzeniu wywołanym alkoholem.

Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

Ten protokół opisuje analizy histologiczne wątroby larw danio pręgowanego, które były leczone 2% etanolem przez 24 godziny. Takie ostre leczenie etanolem powoduje stłuszczenie wątroby i obrzęk naczyń krwionośnych wątroby.

Analizy histologiczne ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby u danio pręgowanego

Pozostaje głównym wyzwaniem opracowanie warunkowego nokautu genów lub skutecznego nokautu genów w narządach dorosłego danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy protokół przeprowadzania wyciszania genu siRNA za pośrednictwem nanocząstek w sercu dorosłego danio pręgowanego, zapewniając w ten sposób nową metodę utraty funkcji do badania dorosłych narządów u danio pręgowanego i innych organizmów modelowych.

Wyciszanie genów siRNA za pośrednictwem nanocząstek w sercu dorosłego danio pręgowanego

Tutaj demonstrujemy metodę ilościowego określania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego, umożliwiając ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby.

Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

Tutaj prezentujemy, jak wygenerować model danio pręgowanego związanego z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD) w celu zbadania wpływu nadwyżki cholesterolu na mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych.

Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

Opisano nową metodę iniekcji dootrzewnowej (IP) u dorosłych ryb pręgowanych. W przypadku stosowania związków toksycznych, takich jak doksorubicyna, procedura ta jest bardziej skuteczna niż dwie wcześniej opisane metody IP. Technika ta została zaprojektowana tak, aby mogła być łatwo zaadoptowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w modelowaniu danio pręgowanego.

Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność

Poznaj protokół częściowej hepatektomii u dorosłych Danio rerio, umożliwiający badanie mechanizmów regeneracji wątroby. Metoda ta pozwala na precyzyjne badania molekularne i komórkowe z zastosowaniem w terapii chorób wątroby.

Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów