Name: Zbiór i dezagregacja: pomijany krok w badaniach nad metodami biofilmu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Poznaj trzy techniki zbierania i dezagregacji biofilmu z różnych powierzchni: poliwęglanu, szkła borokrzemowego oraz silikonowej rurki. Metody te zwiększają powtarzalność badań mikrobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers i Fei San Lee za ich wkład w ten artykuł.

1. Wirowanie i sonikacja
<ol>
	<li>Wyhoduj dojrzały biofilm P. aeruginosa ATCC 15442 uprawiany zgodnie z normą ASTM E25622.</li>
	<li>Pod koniec 48-godzinnego okresu wzrostu należy przygotować się do obróbki biofilmu i próbek zgodnie z normą ASTM E28718</li>
	<li>Aseptyczne osłony przeciwbryzgowe należy włożyć do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem. Powtórz tę czynność dla wszystkich probówek, które zostaną poddane leczeniu. Rurki do kuponów kontrolnych nie wymagają osłony przeciwbryzgowej.</li>
	<li>W asepcie wyjmij losowo wybrany pręt z reaktora CDC Biofilm. Opłucz kupony, aby usunąć luźno przyczepione komórki, delikatnie zanurzając pręt w 30 ml sterylnej buforowanej wody.</li>
	<li>Trzymaj pręt równolegle do blatu stołu, nad pustą, sterylną stożkową probówką o pojemności 50 ml i za pomocą wysterylizowanego płomieniem klucza imbusowego poluzuj dociskową, aby wrzucić kupon pokryty biofilmem do probówki. Powtórz dla żądanej liczby kuponów. Usuń osłony przeciwbryzgowe i umieść w osobnym pojemniku do sterylizacji.</li>
	<li>Używając pipety serologicznej o pojemności 5 ml, powoli odpipetuj 4 ml produktu leczniczego lub kontrolnego do probówek, tak aby płyn spłynął po wewnętrznej stronie ścianki probówki.</li>
	<li>Delikatnie postukaj w spód tuby, aby wszelkie pęcherzyki powietrza znajdujące się pod kuponem zostały przemieszczone. Odczekaj 30 - 60 s między każdym dodawaniem.</li>
	<li>Pod koniec określonego czasu kontaktu należy odpipetować 36 ml neutralizatora do probówek w tej samej kolejności, w jakiej zastosowano zabieg (lub kontrolę). 
	UWAGA: Końcowa objętość połączonego traktowania i neutralizatora jest ważna dla dokładnego określenia gęstości logarytmu biofilmu.</li>
	<li>Wiruj każdą rurkę na najwyższym ustawieniu przez 30 ± 5 s. Upewnij się, że osiągnięto pełny wir. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas wirowania ciężkich kuponów, takich jak stal nierdzewna, w szklanych fiolkach, gdzie może dojść do pęknięcia.</li>
	<li>Określ optymalną liczbę probówek na kąpiel i umieszczenie w stojaku na probówki przed przetworzeniem rzeczywistych próbek. W przypadku przetwarzania wielu próbek należy upewnić się, że temperatura wody w łaźni sonizacyjnej wynosi 21 ± 2 oC.</li>
	<li>Umieść probówki w stojaku na probówki zawieszonym w odgazowanym sonikatorze tak, aby poziom wody w kąpieli był równy poziomowi cieczy w probówkach. Sonikacja przy 45 kHz, 100% mocy i funkcji Normal przez 30 ± 5 s. Powtórz cykle wirowania i sonikacji, a następnie zakończ ostatnim wirem (łącznie 5 cykli). 
	UWAGA: Te probówki z zebranym i zdezagregowanym biofilmem mają rozcieńczenie 10:0 lub 0.</li>
	<li>Próbkę należy rozcieńczyć seryjnie w wodzie buforowej. Płytkę na agarze R2A przy użyciu odpowiedniej metody powlekania. Inkubować w temperaturze 36 ± 2 oC przez 24 godziny. Należy policzyć kolonie odpowiednio do zastosowanej metody posiewu i zapisać dane.</li>
</ol>
2. Skrobanie i homogenizacja
<ol>
	<li>Wyhoduj dojrzały biofilm P. aeruginosa ATCC 15442 zgodnie z normą ASTM E264713.</li>
	<li>Ustawić stację pobierania próbek tak, aby zawierała płytkę do pobierania próbek, 95% etanol w zlewce, palnik alkoholowy, hemostatyki, narzędzie do usuwania kuponów, zlewki ze sterylną wodą rozcieńczającą i probówki do rozcieńczania kuponów.</li>
	<li>Wyłącz pompę. Zdejmij osłonę kanału i użyj sterylnego narzędzia do usuwania kuponu i hemostatów, aby usunąć kupon, uważając, aby nie naruszyć biofilmu.</li>
	<li>Przepłukać kupon, delikatnie zanurzając, ruchem płynu, w 45 ml sterylnej wody do rozcieńczania (znajdującej się w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml). Natychmiast cofnij ruch, aby usunąć kupon.</li>
	<li>Umieścić kupon w zlewce zawierającej 45 ml sterylnej wody do rozcieńczania. Powierzchnię kuponu pokrytą biofilmem zeskrobywać w dół przez około 15 sekund za pomocą sterylnej szpatułki lub skrobaka. Opłucz szpatułkę lub skrobak, mieszając je w zlewce. Powtórz proces skrobania i płukania 3-4 razy, zapewniając pełne pokrycie powierzchni kuponu.</li>
	<li>Przepłukać kupon, trzymając go pod kątem 60° nad sterylną zlewką i pipetując 1 ml sterylnej wody rozcieńczającej na powierzchnię kuponu. Powtórz w sumie 5 płukań. Końcowa objętość w zlewce wynosi 50 ml. 
	UWAGA: Końcowa objętość połączonego traktowania i neutralizatora jest ważna dla dokładnego określenia gęstości logarytmu biofilmu.</li>
	<li>Załóż każdą osłonę kanału po usunięciu kuponów.</li>
	<li>Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, homogenizuj zeskrobaną próbkę biofilmu. Podłącz sterylną sondę homogenizatora do homogenizatora, umieść końcówkę sondy w płynie, włącz homogenizator i zwiększ prędkość do 20 500 obr./min.</li>
	<li>Homogenizuj próbkę przez 30 sekund. Zmniejsz prędkość obrotową i wyłącz homogenizator.</li>
	<li>Odkaż sondę między próbkami biofilmu, homogenizując 9 ml sterylnej próby ślepej do rozcieńczania przy 20 500 obr./min przez 30 sekund, jak opisano powyżej. Homogenizować probówkę o pojemności 9 ml z 70% etanolem przez 30 s, odłączyć sondę i odstawić w probówce z etanolem na 1 minutę. Homogenizować dwie dodatkowe ślepe próby rozcieńczenia. 
	UWAGA: Do każdej próbki można użyć jednorazowej sondy homogenizatora.</li>
	<li>Próbki należy stopniowo rozcieńczać w wodzie buforowej. Płytkę na agarze R2A przy użyciu odpowiedniej metody powlekania. Inkubować płytki w temperaturze 36 ± 2oC przez 24 godziny, policzyć kolonie odpowiednio do zastosowanej metody posiewu i zapisać dane.</li>
</ol>
3. Skrobanie, wirowanie i sonikacja
<ol>
	<li>Wyhoduj dojrzały biofilm Escherichia coli ATCC 53498 w silikonowym wężyku cewnika10.</li>
	<li>Przygotuj materiały do pobierania próbek: probówki do płukania, sterylną probówkę wirówkową, pustą sterylną szalkę Petriego, sterylizowany płomieniowo hemostat i nożyczki ze stali nierdzewnej, minutnik i linijkę.</li>
	<li>Przy zatrzymanej pompie użyj 70% etanolu do oczyszczenia zewnętrznej części rurki. Zmierz 2 cm od końca, omijając obszar przymocowany do złącza, i zaznacz rurkę, aby określić miejsca cięcia.</li>
	<li>Za pomocą wysterylizowanych płomieniowo nożyczek odetnij rurkę na znaku 2 cm i umieść segment na pustej sterylnej szalce Petriego. Przetrzyj rurkę 70% etanolem i ponownie podłącz dystalny koniec do rurki odpływowej.</li>
	<li>Wypłucz segment rurki, aby usunąć komórki planktonu. Za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem delikatnie zanurz segment rurki w 20 ml sterylnej wody rozcieńczającej, a następnie natychmiast wyjmij. Umieść segment w 10 ml neutralizatora.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem przytrzymaj segment rurki i zeskrob sterylnym drewnianym aplikatorem w sztyfcie, aż wszystkie wewnętrzne obszary rurki zostaną zeskrobane. Od czasu do czasu przepłukać patyczek w 10 ml neutralizatora i umieścić segment z powrotem w probówce z próbką. Zeskrobany segment rurki ma rozcieńczenie 100 lub 0. 
	UWAGA: Końcowa objętość połączonego traktowania i neutralizatora jest ważna dla dokładnego określenia gęstości logarytmu biofilmu.</li>
	<li>Wiruj każdą probówkę na najwyższym ustawieniu przez 30 ± 5 s. Umieść probówkę w stojaku na probówki zawieszonym w sonikatorze tak, aby poziom wody w kąpieli był równy poziomowi cieczy w probówkach. Sonikuj przy 45 kHz, 100% mocy i funkcji Normal przez 30 ± 5 sekund. Powtórz cykle wiru i sonikacji, a następnie zakończ się ostatnim wirem. 
	UWAGA: Ta probówka z zebranym i zdezagregowanym biofilmem jest rozcieńczona 10:0.</li>
	<li>Próbki należy stopniowo rozcieńczać w wodzie buforowej. Płytka na tryptycznym agarze sojowym przy użyciu odpowiedniej metody powlekania.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 36 ± 2 o Cprzez 24 godziny. Policzyć kolonie odpowiednio do zastosowanej metody posiewu, zapisać dane i obliczyć średnią arytmetyczną.</li>
</ol>

<ol><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASTM+Standard+E2562%2C+2017%2C+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+with+High+Shear+and+Continuous+Flow+using+CDC+Biofilm+Reactor%5BTitle%5D)+AND+%22ASTM+International%22%5BJournal%5D)">ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.</a> ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2017).</li>
<li>Environmental Protection Agency (USEPA). Efficacy Test Methods, Test Criteria, and Labeling Guidance for Antimicrobial Products with Claims Against Biofilm on Hard, Non-Porous Surfaces. Environmental Protection Agency (USEPA). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epa.gov/perticide-analytical-methods/efficacy-test-methods-test-criteria-and-labeling-guidance-antimicrobial">http://www.epa.gov/perticide-analytical-methods/efficacy-test-methods-test-criteria-and-labeling-guidance-antimicrobial</a> (2021).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Gomes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+reactors+for+the+study+of+medical+biofilms%3A+a+review+of+the+principles+and+latest+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).</li>
<li>Goeres, D. M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoeres%2C+DM+%22Recent+Trends+in+Biofilm+Sciences+and+Technology%22">Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology</a>. Simoes, M., et al. , Elsevier Science and Technology. 71-88 (2020).</li>
<li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).</li>
<li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASTM+Standard+E2871%2C+Standard+Test+Method+for+Determining+Disinfectant+Efficacy+Against+Biofilm+Grown+in+the+CDC+Biofilm+Reactor+Using+the+Single+Tube+Method%5BTitle%5D)+AND+%22ASTM+International%22%5BJournal%5D)">ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method.</a> ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2019).</li>
<li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Biofilm+Efficacy+Test%3A+The+Single+Tube+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method.</a> Journal of Microbiological Methods. , (2019).</li>
<li>Summers, J. G. The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149">https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149</a> (2019).</li>
<li>Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checking+the+Validity+of+the+harvesting+and+Disaggregating+Steps+in+Laboratory+Tests+of+Surface+Disinfectants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants.</a> Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).</li>
<li>Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConlon%2C+BP+%22Biofilm-based+Healthcare-associated+Infections%22">Biofilm-based Healthcare-associated Infections</a>. Donelli, G. , (2015).</li>
<li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASTM+Standard+E2647%2C+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+Using+Drip+Flow+Biofilm+Reactor+with+Low+Shear+and+Continuous+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22ASTM+International%22%5BJournal%5D)">ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow.</a> ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2020).</li>
<li>Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propidium+iodide+staining+underestimates+viability+of+adherent+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells.</a> Scientific Reports. , (2019).</li>
<li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li>
<li>Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Ultrasonication+Improves+Detection+of+Biofilm-formative+Bacteria+Around+a+Metal+Implant%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).</li>
<li>Lourenco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+information+about+a+biofilm+experiment+%28MIABiE%29%2C+standards+for+reporting+experiments+and+data+on+sessile+microbial+communities+living+at+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces.</a> Pathogens and Disease. 0, 1-7 (2014).</li>
<li>Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Ultrasonic+Baths+for+Analytical+Applications%3A+A+New+Approach+for+Optimisation+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Brazilian+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions.</a> Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).</li>
<li>Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Elma+GmbH+%26+Co%22">Elma GmbH & Co</a>. , Singen, Germany. (2009).</li>
<li>Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+times+and+energy+densities+for+ultrasonic+disinfection+of+Escherichia+coli%2C+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Enterococcus+avium+and+sewage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Engineering+and+Science%22%5BJournal%5D)">Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage.</a> Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).</li>
<li>Suslick, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sonochemistry.</a> Science. 247 (4949), (1990).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Minimum informacji na temat metod zbioru i dezagregacji Aby stworzyć powtarzalne dane dotyczące biofilmu w całej społeczności naukowej, konieczne jest, aby autorzy uwzględnili jak najwięcej szczegółów dotyczących każdego z etapów wzrostu, obróbki, pobierania próbek i analizy metody biofilmu. Standaryzacja metod biofilmu pomogła w tym przedsięwzięciu, ponieważ pozwala badaczowi odnieść się do konkretnej metody i wszelkich istotnych modyfikacji. Jednak wiele artykułów zawiera tylko jedno lub dwa zdani...

Definicja biofilmu ewoluowała w ciągu ostatnich kilku dekad i obejmuje związek mikrobiologiczny z różnymi powierzchniami biologicznymi i/lub niebiologicznymi, włączając komponenty niekomórkowe1, które wykazują różny wzrost i ekspresję genetyczną2 w matrycy. Biofilm zapewnia ochronę przed stresami środowiskowymi, takimi jak wysuszanie, i może sprawić, że działanie chemicznych środków dezynfekcyjnych będzie mniej skuteczne, co spowoduje przetrwanie drobnoustrojów. Osoby, które przeżyły w biofilmie, mogą potencjalnie stanowić źródło mikroorganizmów chorobotwórczych, które stanowią zagrożenie dla zdrowia publicznego3.
Metody biofilmu składają się z czterech etapów: wzrostu, obróbki, pobierania próbek (zbioru i dezagregacji) oraz analizy. Wzrost, pierwszy krok, w którym użytkownik określa warunki wzrostu organizmu, temperaturę, pożywkę itp., jest najczęściej rozważany i opisywany w literaturze dotyczącej biofilmu4,5,6,7. Na etapie leczenia oceniane są środki przeciwdrobnoustrojowe (np. środki dezynfekujące) w celu określenia ich skuteczności w stosunku do dojrzałego biofilmu3,8,9 lub środek przeciwdrobnoustrojowy może zostać włączony do powierzchni, aby określić zdolność produktu do zapobiegania lub zmniejszania wzrostu biofilmu10. Trzeci krok, pobieranie próbek, obejmuje etapy zbierania biofilmu z powierzchni, na której rósł, i dezagregacji usuniętych grudek3,8,11. Czwarty krok, analiza, może obejmować zliczanie żywych komórek, mikroskopię, pomiary fluorescencji, wyniki molekularne i/lub ocenę składowych matrycy8,9. Ocena danych dostarcza informacji o wyniku eksperymentu. Spośród tych czterech, pobieranie próbek jest często najczęściej pomijanym krokiem, ponieważ zakłada, że wybrana technika zbierania i/lub dezagregacji biofilmu jest w 100% skuteczna, często bez weryfikacji11.
Planktonowe zawiesiny bakterii, często uważane za jednorodne, wymagają prostego wirowania przed analizą. Biofilmy są jednak złożonymi społecznościami złożonymi z mikroorganizmów (prokariotycznych i/lub eukariotycznych), egzopolisacharydów, białek, lipidów, zewnątrzkomórkowego DNA i komórek gospodarza12. Konieczne są kroki wykraczające poza tradycyjne metody hodowli mikrobiologicznej planktonu, aby odpowiednio zebrać biofilm z powierzchni, a następnie zdezagregować go do jednorodnej zawiesiny jednokomórkowej. Obszerny przegląd piśmiennictwa (informacje nieuwzględnione w niniejszej publikacji) wykazał, że wybór techniki usuwania i dezagregacji zależy od wielu czynników, w tym od gatunków obecnych w biofilmie, powierzchni, do której biofilm jest przyczepiony (nieporowatej lub porowatej), dostępności do powierzchni wzrostu (łatwo usuwalny kupon lub fizyczne zniszczenie aparatury, w której rośnie biofilm), geometria powierzchni (obszar i kształt), gęstość biofilmu na powierzchniach wzrostu oraz dostępny sprzęt laboratoryjny.
Gdy biofilm jest pobierany z powierzchni, powstała zawiesina komórek jest niejednorodna. Jeśli ta niejednorodna zawiesina ma być dokładnie policzona, musi zostać zdezagregowana na poszczególne komórki. Żywe liczenie płytek zakłada, że jednostka tworząca kolonię pochodzi od jednej bakterii. Jeśli agregaty biofilmu zostaną umieszczone na pożywce wzrostowej, niemożliwe jest rozróżnienie poszczególnych komórek, co może prowadzić do niedokładnych szacunków. Na przykład podczas badania skuteczności środka dezynfekującego, jeśli zabieg bardzo skutecznie usuwa biofilm z powierzchni w porównaniu z kontrolą, redukcja logarytmu może wydawać się sztucznie duża w porównaniu z kontrolą. Z drugiej strony, chemiczny środek dezynfekujący, który utrwala biofilm na powierzchni w porównaniu z kontrolą, będzie wydawał się mieć niższą redukcję logarytmiczną11. Tego typu scenariusz może prowadzić do tendencyjnej interpretacji danych eksperymentalnych.
W ramach przygotowań do publikacji, przegląd literatury ustalił, że powszechne podejścia do zbierania i dezagregacji biofilmu obejmują skrobanie, wymazy, sonikację, wirowanie lub kombinację tych metod. Skrobanie definiuje się jako fizyczne usuwanie biofilmu z powierzchni za pomocą sterylnego patyczka, szpatułki lub innego narzędzia. Wymazywanie odnosi się do usuwania biofilmu z powierzchni za pomocą patyczka z bawełnianą końcówką lub innego stałego materiału chłonnego. Sonikacja odnosi się do rozerwania biofilmu z powierzchni za pomocą fal ultradźwiękowych rozchodzących się po wodzie. Wirowanie odnosi się do użycia mieszalnika w celu uzyskania ciekłego wiru próbki wewnątrz probówki. Homogenizacja wykorzystuje obracające się ostrza do ścinania zebranych grudek biofilmu w zawiesinę pojedynczej komórki. W artykule przedstawiono trzy metody zbioru i dezagregacji dla dwóch różnych typów powierzchni: twardej/nieporowatej i porowatej.
Znajduje się lista zalecanych minimalnych informacji, które badacze powinni zawrzeć w sekcjach poświęconych metodom publikacji. Mamy nadzieję, że uwzględnienie tych informacji umożliwi innym badaczom odtworzenie ich pracy. Nie ma idealnej metody zbioru i dezagregacji, dlatego podano również zalecenia dotyczące sposobu sprawdzenia tej techniki.
W tym artykule przedstawiono trzy popularne metody zbierania i dezagregacji biofilmu z typowych powierzchni wzrostu. Informacje te umożliwią naukowcom lepsze zrozumienie ogólnej precyzji i stronniczości metody badania biofilmu. Opisane metody są następujące: (1) Biofilm Pseudomonas aeruginosa wyhodowany na kuponach poliwęglanowych (twarda, nieporowata powierzchnia) pod wysokim ścinaniem płynu w reaktorze CDC Biofilm jest zbierany i dezagregowany po pięcioetapowej kombinacji wirowania i sonikacji w celu uzyskania zbierania i dezagregacji biofilmu (2) A P. aeruginosa Biofilm wyhodowany na kuponach szkła borokrzemianowego (twarda nieporowata powierzchnia) w reaktorze przepływowym w warunkach niskiego ścinania płynu jest zbierany i dezagregowany za pomocą skrobania i homogenizacji (3) Biofilm Escherichia coli wyhodowany w rurkach silikonowych (porowata powierzchnia) jest zbierany i dezagregowany za pomocą skrobania, a następnie sonikacji i wirowania.

<table><tbody><tr><td>Fiolki stożkowe 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki szklane 100 ml</td><td>Fisher Scientific FB102100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-12D</td><td>Do dodawania leku do fiolek zawierających kupony.</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-14C</td><td>Do dodawania neutralizatora do fiolek pod koniec czasu kontaktu z lekiem.</td></tr><tr><td>Aplikator w sztyfcie</td><td>Puritan</td><td>807</td><td></td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-115</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka metalowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373</td><td></td></tr><tr><td>PTFE policjanci</td><td>Saint-Gobain</td><td>06369-04</td><td></td></tr><tr><td>S 10 N - 10 G - ST Narzędzie dyspergujące</td><td>IKA</td><td>4446700</td><td>Do homogenizacji próbek biofilmu.</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowy cewnik Foleya, rozmiar 16 Francuski</td><td>Medline Industries</td><td>DYND11502</td><td></td></tr><tr><td>Rurki silikonowe, rozmiar 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW96400-16</td><td></td></tr><tr><td>Osłony przeciwbryzgowe</td><td>BioSurface Technologies, Inc.</td><td>CBR 2232</td><td></td></tr><tr><td>T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser</td><td>IKA</td><td>3737001</td><td>Do homogenizacji próbek biofilmu.</td></tr><tr><td>Złączki do węży</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW02023-86</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>Elma</td><td>TI-H15</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 Pionowy uchwyt na probówkę 50 ml</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-V506</td><td></td></tr></tbody></table>

zbiór i dezagregacja: pomijany krok w badaniach nad metodami biofilmu

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

Metody biofilmu składają się z czterech odrębnych etapów: hodowli biofilmu w odpowiednim modelu, obróbki dojrzałego biofilmu, zbierania biofilmu z powierzchni i dezagregacji grudek oraz analizy próbki. Spośród czterech etapów, zbieranie i dezagregacja są najmniej zbadane, ale mimo to mają kluczowe znaczenie przy rozważaniu potencjalnego błędu systematycznego testu. W artykule przedstawiono powszechnie stosowane techniki zbioru i dezagregacji biofilmu uprawianego na trzech różnych powierzchniach. Trzy techniki zbierania i dezagregacji biofilmu, zebrane z obszernego przeglądu literatury, obejmują wirowanie i sonikację, skrobanie i homogenizację oraz skrobanie, wirowanie i sonikację. Pod uwagę brane są dwa rodzaje powierzchni: twarda nieporowata (szkło poliwęglanowe i borokrzemianowe) oraz porowata (silikon). Ponadto przedstawiamy zalecenia dotyczące minimalnej ilości informacji, które należy zawrzeć podczas raportowania zastosowanej techniki zbioru, oraz towarzyszącą metodę sprawdzania stronniczości.

Walidacja/Potwierdzenie metody zbioru 
W kilku badaniach przeprowadzonych w naszym laboratorium zbadano zdolność mieszania w wirówce (vortexingu) i sonikacji do efektywnego zbioru biofilmu wyhodowanego w reaktorze do biofilmu (ASTM E2562)2 z zastosowaniem metody jednej probówki (Single Tube Method, ASTM E2871)8.
Biofilm z P. aeruginosa ATCC 15442 wyhodowano zgodnie ze standardem ASTM E25622 na ...

Ten artykuł szczegółowo opisuje metody, które demonstrują trzy popularne techniki zbierania i dezagregacji biofilmu na dwóch typach powierzchni, testowanie odporności metody zbierania oraz minimum informacji do rozważenia przy wyborze i optymalizacji technik zbioru i dezagregacji w celu zwiększenia odtwarzalności.

Zbiór i dezagregacja: pomijany krok w badaniach nad metodami biofilmu

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

Ogólnym celem tych procedur jest zebranie i dezagregacja biofilmów w optymalny sposób, aby zwiększyć odtwarzalność. W tym filmie zostaną zademonstrowane trzy techniki, z których każda koncentruje się na zbiorze i dezagregacji z innego rodzaju powierzchni. Ten film zademonstruje właściwe techniki dla jednego, wirowania i sonikacji biofilmu z twardej, nieporowatej powierzchni, takiej jak poliwęglan z reaktora biofilmu CDC.Po drugie, zeskrobywanie i homogenizacja biofilmu z twardej, nieporowatej powierzchni szkła borokrzemianowego, powszechnie występującej w reaktorze z przepływem kroplowym. I po trzecie, skrobanie, wirowanie i sonikowanie biofilmu z porowatej powierzchni rurki silikonowej powszechnie spotykanej w modelu cewnika. Cześć, nazywam się Kelly Buckingham-Meyer w Laboratorium Standaryzowanych Metod Biofilmu.W naszym laboratorium dzielimy metody biofilmu na cztery elementy: wzrost, leczenie, pobieranie próbek i analizę. W recenzowanej literaturze szczegółowe informacje na temat tego, w jaki sposób pobierane są próbki biofilmów lub zbierane i dezagregowane z powierzchni, są zazwyczaj skąpe. To jest powód powstania tego filmu.Ponieważ nasze laboratorium opracowuje i testuje ust

harvesting-disaggregation-an-overlooked-step-biofilm-methods

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Biofilmy tworzące się na powierzchniach zębów są wysoce złożone i narażone na stałe wrodzone oraz egzogenne wyzwania środowiskowe, które modulują ich architekturę, fizjologię oraz transkryptom. Opracowaliśmy zestaw narzędzi do badania składu, organizacji strukturalnej i ekspresji genów w biofilmach jamy ustnej, które można zaadaptować do innych obszarów badań nad biofilmami.

Analityczny zestaw narzędzi do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkrypcyjnej biofilmów jamy ustnej indukowanych przez paciorkowce z grupy mutans

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

To badanie przedstawia rozwój powtarzalnych metodologii badania inhibitorów biofilmu i ich wpływu na wielokomórkowość Bacillus subtilis.

Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Cytometria przepływowa w połączeniu z wizualnym grupowaniem oferuje łatwą w użyciu i szybką metodę badania biofilmów wodnych. Może być stosowany do charakteryzowania biofilmu, wykrywania zmian w strukturze zbiorowiska biofilmu oraz wykrywania cząstek abiotycznych osadzonych w biofilmie.

Charakterystyka biofilmów wodnych za pomocą cytometrii przepływowej

Immunoprecypitacja chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (ChIP-seq) to metoda stosowana do ustalania interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a kontrolowanymi przez nie sekwencjami genomowymi. Protokół ten przedstawia techniki wykonywania sekwencji ChIP-seq z biofilmami bakteryjnymi, na przykładzie biofilmu bakteryjnego Salmonella enterica Typhimurium serovar.

Odkrywanie celów regulatorowych CsgD w biofilmie Salmonelli przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Szybka i ustandaryzowana procedura tworzenia synergicznych wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z różnych gleb ryzosfery jest przedstawiona tutaj. Jest to unikalny protokół przeznaczony do badania i symulacji złożonej mikrobioty glebowej ryzosfery.

Podejście do konstruowania wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z gleby ryzosfery

Protokół ten zapewnia modułowy workflow BSL-2, łączący testy biomasy kryształowo-fioletowej, kinetykę kontrastu fazowego poklatkowego, konfokalne mapowanie 3D/matrycowe macierzy, ultrastrukturę SEM oraz moduł in vivo dla infekcji chomików, aby kultywować, ilościować, charakteryzować i badać funkcjonalną rolę biofilmu Leptospira , umożliwiając standaryzowaną ocenę mutantów i interwencji antybiofilmowych w różnych laboratoriach.

Modułowy workflow do analizy ilościowej, strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów Leptospira

Poznaj trzy techniki zbierania i dezagregacji biofilmu z różnych powierzchni: poliwęglanu, szkła borokrzemowego oraz silikonowej rurki. Metody te zwiększają powtarzalność badań mikrobiologicznych.

Zbiór i dezagregacja: pomijany krok w badaniach nad metodami biofilmu

Przeglądaj więcej filmów