Zbiór i dezagregacja: pomijany krok w badaniach nad metodami biofilmu

Ogólnym celem tych procedur jest zebranie i dezagregacja biofilmów w optymalny sposób, aby zwiększyć odtwarzalność. W tym filmie zostaną zademonstrowane trzy techniki, z których każda koncentruje się na zbiorze i dezagregacji z innego rodzaju powierzchni. Ten film zademonstruje właściwe techniki dla jednego, wirowania i sonikacji biofilmu z twardej, nieporowatej powierzchni, takiej jak poliwęglan z reaktora biofilmu CDC.

Po drugie, zeskrobywanie i homogenizacja biofilmu z twardej, nieporowatej powierzchni szkła borokrzemianowego, powszechnie występującej w reaktorze z przepływem kroplowym. I po trzecie, skrobanie, wirowanie i sonikowanie biofilmu z porowatej powierzchni rurki silikonowej powszechnie spotykanej w modelu cewnika. Cześć, nazywam się Kelly Buckingham-Meyer w Laboratorium Standaryzowanych Metod Biofilmu.

W naszym laboratorium dzielimy metody biofilmu na cztery elementy: wzrost, leczenie, pobieranie próbek i analizę. W recenzowanej literaturze szczegółowe informacje na temat tego, w jaki sposób pobierane są próbki biofilmów lub zbierane i dezagregowane z powierzchni, są zazwyczaj skąpe. To jest powód powstania tego filmu.

Ponieważ nasze laboratorium opracowuje i testuje ustandaryzowane metody biofilmu, przeprowadziliśmy obszerny przegląd literatury, w którym zidentyfikowano trzy najpopularniejsze metody zbierania i dezagregacji biofilmu. Metody te to wirowanie i sonikacja biofilmu z próbki poliwęglanu, skrobanie i homogenizacja biofilmu z próbki szkła borokrzemianowego oraz skrobanie, wirowanie i sonikacja biofilmu z rurki silikonowej. Chociaż metody zapisane na papierze są potężne, mamy nadzieję, że film ze szczegółami technicznymi przedstawionymi przez mnie i moją współpracowniczkę Lindsey Miller będzie pomocny.

Na początek wyhoduj dojrzały biofilm Pseudomonas aeruginosa 15442 zgodnie z normą ASTM E2562, standardową metodą testową do oznaczania ilościowego biofilmu Pseudomonas aeruginosa uprawianego z wysokim ścinaniem i ciągłym przepływem przy użyciu reaktora CDC Biofilm. Pod koniec 48-godzinnego okresu wzrostu należy przygotować się do obróbki i pobrania próbek próbek zgodnie z normą ASTM E2871, standardową metodą testową służącą do określania skuteczności środka dezynfekującego przeciwko biofilmowi hodowanemu w reaktorze CDC Biofilm przy użyciu metody pojedynczej probówki. Następnie aseptycznie włóż autoklawowane osłony przeciwbryzgowe do sterylnych 50-mililitrowych stożkowych probówek za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem.

Powtórz tę czynność dla wszystkich probówek, które zostaną poddane leczeniu. Rurki do kuponów kontrolnych nie wymagają osłony przeciwbryzgowej. W asepcie wyjmij pręt z reaktora biofilmu CDC i przepłucz go w 30 mililitrach sterylnej wody rozcieńczającej.

Spowoduje to usunięcie luźno przyczepionych komórek z biofilmu. Trzymaj pręt równolegle do blatu stołu nad probówkami na próbki z osłonami przeciwbryzgowymi. Za pomocą wysterylizowanego płomieniowo klucza imbusowego poluzuj dociskowe, aby wrzucić kupon pokryty biofilmem do tuby.

Powtórz dla żądanej liczby kuponów. Zdejmij osłony przeciwbryzgowe i umieść osłony przeciwbryzgowe w osobnym pojemniku w celu sterylizacji. Używając pięciomililitrowej pipety serologicznej, powoli odpipetuj cztery mililitry leku lub kontroli do probówek, tak aby płyn spłynął po wewnętrznej stronie ścianki probówki.

Delikatnie zakręć dnem tuby, aby wszelkie pęcherzyki powietrza pod kuponem zostały przemieszczone. Odczekaj od 30 do 60 sekund między każdym dodawaniem. Pod koniec określonego czasu kontaktu należy odpipetować 36 mililitrów neutralizatora do probówek w tej samej kolejności, w jakiej zastosowano zabieg lub kontrolę.

Wiruj każdą rurkę na najwyższym ustawieniu przez 30 plus minus pięć sekund i upewnij się, że osiągnięto pełny wir. Umieść probówki w stojaku na probówki zawieszonym w odgazowanym sonikatorze tak, aby poziom wody w kąpieli był równy poziomowi wody w rurkach. Sonikuj próbki z częstotliwością 45 kiloherców, 100% mocy i normalną funkcją przez 30 plus minus pięć sekund.

Powtórz cykle wirowania i sonikacji, a zakończ ostatnim wirem, w sumie pięć cykli. Na koniec seryjnie rozcieńczyć próbkę, rozcieńczyć rozcieńczenie na agarze R2A i inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 36 stopni Celsjusza. Policz kolonie zgodnie z metodą posiewu i zapisz dane.

Ta kolejna technika zbierania i dezagregacji biofilmu jest przydatna w przypadku twardych, nieporowatych kuponów, które są standardem w reaktorze z przepływem kroplowym. Wyhoduj dojrzały biofilm Pseudomonas aeruginosa 15442 zgodnie z normą ASTM E2647, standardową metodą testową do oznaczania ilościowego biofilmu Pseudomonas aeruginosa uprawianego przy użyciu reaktora biofilmu z przepływem kroplowym o niskim ścinaniu i ciągłym przepływie. Ustawić stację pobierania próbek tak, aby zawierała tablicę do pobierania próbek, 95% etanol w zlewce, palnik alkoholowy, hemostatyki, narzędzie do usuwania kuponów, zlewki ze sterylną wodą rozcieńczającą oraz probówki do rozcieńczania kuponów.

Wyłączyć pompę, zdjąć pokrywę kanału i użyć sterylnego narzędzia do usuwania kuponów i hemostatów, aby usunąć kupon, uważając, aby nie naruszyć biofilmu. Przepłukać kupon, delikatnie zanurzając płynnym ruchem w 45 mililitrach sterylnej wody rozcieńczającej znajdującej się w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Natychmiast cofnij ruch, aby usunąć kupon.

Umieść kupon w zlewce zawierającej 45 mililitrów sterylnej wody do rozcieńczania. Zeskrobywać pokrytą biofilmem powierzchnię kuponu w dół przez około 15 sekund za pomocą sterylnej szpatułki lub skrobaka. Opłucz szpatułkę lub skrobak, mieszając je w zlewce.

Powtórz proces skrobania i płukania trzy do czterech razy, zapewniając pełne pokrycie powierzchni kuponu. Przepłukać kupon, trzymając go pod kątem 60 stopni nad sterylną zlewką i pipetując jeden mililitr sterylnej wody rozcieńczającej na powierzchnię kuponu. Powtórz w sumie pięć płukań.

Ostateczna objętość w zlewce wynosi teraz 50 mililitrów. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, homogenizuj zeskrobaną próbkę biofilmu. Podłącz sterylną sondę homogenizatora do homogenizatora.

Umieść końcówkę sondy w cieczy i włącz homogenizator i zwiększ prędkość do 20 500 obr./min. Homogenizować próbkę przez 30 sekund. Zmniejsz prędkość obrotową i wyłącz homogenizator.

Odkaż sondę między próbkami biofilmu, homogenizując w dziewięciomililitrowym sterylnym ślepym rozcieńczeniu przy 20, 500 obr./min przez 30 sekund, jak opisano powyżej. Homogenizuj dziewięciomililitrową probówkę z 70% etanolem przez 30 sekund, odłącz sondę i pozostaw ją w probówce z etanolem na jedną minutę. Homogenizować dwie dodatkowe ślepe próby rozcieńczenia.

Do każdej próbki można również użyć sterylnej jednorazowej sondy homogenizatora. Seryjnie rozcieńczyć homogenizowaną próbkę, rozcieńczyć rozcieńczenia na R2A przy użyciu odpowiedniej metody posiewu i inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 36 stopni Celsjusza. Policz kolonie i zapisz dane.

Ta końcowa technika zbierania i dezagregacji biofilmu jest przydatna w przypadku biofilmu hodowanego w porowatych rurkach, takich jak rurki silikonowe stosowane w modelu cewnika. Aby rozpocząć tę procedurę, wyhoduj dojrzały biofilm E.coli 53498 w silikonowej rurki cewnika. Przygotuj materiały do pobierania próbek: wypłukane probówki, sterylną probówkę wirówkową, pustą sterylną szalkę Petriego, wysterylizowane płomieniowo hemostatyki ze stali nierdzewnej, nożyczki, minutnik i linijkę.

Gdy pompa jest zatrzymana, użyj 70% etanolu do oczyszczenia zewnętrznej części rurki. Zmierz dwa centymetry od końca, omijając obszar przymocowany do złącza, i zaznacz rurkę, aby określić miejsca cięcia. Za pomocą nożyczek wysterylizowanych płomieniem przetnij rurkę na znaku dwóch centymetrów.

Opłucz segment rurki, aby usunąć komórki planktonu. Za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem delikatnie zanurz segment rurki w 20 mililitrach sterylnej wody do rozcieńczania, a następnie natychmiast wyjmij. Umieść segment w 10 mililitrach neutralizatora.

Za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem przytrzymaj segment rurki i zeskrob sterylnym drewnianym aplikatorem w sztyfcie, aż wszystkie wewnętrzne obszary rurki zostaną zeskrobane. Od czasu do czasu przepłucz patyczek w 10 mililitrach neutralizatora i umieść segment z powrotem w probówce z próbką. Zeskrobany segment rurki ma teraz rozcieńczenie od 10 do zera lub zero.

Obracaj każdą rurkę na najwyższym ustawieniu przez 30 plus minus pięć sekund. Umieść rurki w stojaku na probówki zawieszonym w kąpieli sonikatora, tak aby poziom wody w kąpieli był równy poziomowi cieczy w rurkach. Sonikacja przy 45 kilohercach, 100% mocy i normalnej funkcji przez 30 plus minus pięć sekund.

Powtórz ten cykl wiru i sonikacji, a następnie zakończ ostatnim wirem. Próbki należy stopniowo rozcieńczać w wodzie buforowej. Płytkę na tryptycznym agarze sojowym przy użyciu odpowiedniej metody posiewu, a następnie inkubować probówki w temperaturze 36 plus minus dwóch stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Policz kolonie odpowiednio do zastosowanej metody posiewu i zapisz dane w celu obliczenia średniej arytmetycznej. Te cztery zdjęcia wykonane przez Danielle Or i Blaine'a Fritza pomagają zilustrować znaczenie tej procedury zbioru i dezagregacji. Wszystkie cztery z tych kuponów zostały zabarwione fioletem krystalicznym, aby pomóc w wizualizacji ilości biofilmu Pseudomonas aeruginosa obecnego na kuponach przed i po procesie wirowania i sonikacji.

Kupon A jest całkowicie pokryty biofilmem, podczas gdy kupony B, C i D mają znacznie mniej biofilmu na swojej powierzchni. Kupony B, C i D zostały poddane opisanemu wcześniej procesowi wirowania i sonikacji. Te dwa zdjęcia wykonane przez Lindsey Miller pod mikroskopem konfokalnym przy 12,5-krotnym powiększeniu przedstawiają biofilm Pseudomonas aeruginosa, który został potraktowany żywą/martwą plamą w świetle tylnym.

Obraz po lewej stronie został poddany sonikacji z częstotliwością 45 kiloherców i 10% mocy, podczas gdy obraz po prawej został poddany sonikacji z częstotliwością 45 kiloherców i 100% mocy. Wyraźnie widać, że kupon po lewej stronie ma znacznie więcej biofilmu pozostającego na swojej powierzchni w porównaniu z kuponem po prawej. Ten ostatni rysunek pokazuje, w jaki sposób manipulacja różnymi parametrami sonikacji wpływa na ilość biofilmu Pseudomonas aeruginosa usuniętego z powierzchni kuponu.

Wszystkie te kupony były sonikowane z częstotliwością 45 kiloherców, 100% mocy i na normalnym ustawieniu przez 30 plus minus pięć sekund. Zdjęcia te zostały wykonane w powiększeniu 12,5x przez Lindsey Miller. Kupony w pierwszym rzędzie poddano sonikacji w wodzie rozcieńczającej, podczas gdy kupony w drugim rzędzie poddano sonikacji w bulionie neutralizującym DE.

Wydaje się, że na kuponach, które zostały poddane sonikacji w bulionie DE, który zawiera środek powierzchniowo czynny, pozostało mniej biofilmu w porównaniu z wodą rozcieńczającą. Kupony A, B, E i F zostały poddane sonikacji w objętości 10 mililitrów, podczas gdy kupony C, D, G i H poddano sonikacji w 40 mililitrach roztworu. Na kuponach jest wyraźnie mniej biofilmu, który został poddany sonikacji w mniejszych objętościach.

Kupony A, C, E i G zostały poddane sonikacji w kąpieli z trzema probówkami jednocześnie, podczas gdy kupony B, D, F i H zostały poddane sonikacji w kąpieli z 12 probówkami jednocześnie. Wydaje się, że próbki poddane sonikacji przy użyciu mniejszej liczby probówek wykazywały lepsze zbieranie biofilmu. Ostatecznie, minimalizacja objętości w probówkach, zmniejszenie liczby probówek poddanych jednoczesnej sonikacji oraz użycie bulionu neutralizującego DE wydają się przyczyniać do lepszego zbierania biofilmu.

Nie ma idealnej metody zbierania i dezagregacji biofilmu, ale niektóre podejścia są lepsze dla różnych powierzchni i/lub zastosowań. Techniki przedstawione w tym filmie są trzema najczęstszymi metodami według przeglądu literatury. Te trzy techniki mogą stanowić punkt wyjścia dla badaczy.

Ważne jest, aby poświęcić czas na walidację wybranej metody zbioru i dezagregacji. Każdy sprzęt jest nieco inny, więc nawet jeśli metoda została ustandaryzowana, nadal rozsądnie jest potwierdzić proces dla używanego sprzętu. Badania wykazały, że niewłaściwe wybory mogą prowadzić do stronniczych wyników testów.

Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu informacje te pomogą naukowcom w podejmowaniu bardziej świadomych decyzji dotyczących metody i udzielą wskazówek dotyczących poprawy odtwarzalności dla trzech typów powierzchni oraz uzupełniających technik zbioru i dezagregacji.