Name: Precyzyjnie wycięte plastry płuc jako skuteczne narzędzie do badań ex vivo struktury i kurczliwości naczyń płucnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj metodę precyzyjnie wyciętych plastrów płuc do badań struktury i kurczliwości naczyń płucnych ex vivo. Technika ta zachowuje trójwymiarową architekturę tkanki i umożliwia analizy molekularne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Yuan Hao i Kaifeng Liu za ich wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez NIH 1R01 HL150106-01A1, stypendium Parker B. Francis Fellowship oraz nagrodę Aldrighetti Research Award przyznawaną przez Pulmonary Hypertension Association dr Ke Yuan.

Cała opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi Szpitala Dziecięcego w Bostonie oraz zatwierdzonymi protokołami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt. Myszy użyte w tym badaniu to myszy typu dzikiego C57 / B6 i myszy skrzyżowane Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj wcześniej fosforanowy roztwór buforowy (1x PBS) i 2% roztwór agarozy wymagany podczas eksperymentu.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 2 g agarozy w proszku ze 100 ml wody w autoklawie. Podgrzewaj go w kuchence mikrofalowej przez kilka sekund, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Zarówno PBS, jak i 2% agaroza mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja płuca myszy
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez przedawkowanie izofluranu. Przedawkowanie izofluranu należy uzyskać, umieszczając niewielką ilość izofluranu na bibułce na dolnym poziomie i umieszczając mysz na górnym poziomie w eksykatorze. Mysz pozostaje w eksykatorze do utraty przytomności.</li>
	<li>Upewnij się, że mysz umrze, wywierając mniejszy nacisk na szyję i ciągnąc ogon za ogon. Przyłóż mysz do powierzchni preparcyjnej.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i przymocuj ją do stołu taśmą klejącą, przyklejając łapy i nos do stołu.</li>
	<li>Spryskaj brzuszną powierzchnię myszy 70% etanolem i zetrzyj nadmiar etanolu.</li>
	<li>Podnieś skórę brzucha myszy kleszczami w miejscu pęcherza moczowego i przetnij w linii środkowej nożyczkami chirurgicznymi, przesuwając się wyżej do odcinka szyjnego, odsłaniając tchawicę.</li>
	<li>Podnieś leżącą pod spodem warstwę powięziową za pomocą pęsety i przetnij nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić narządy trzewne i przedział śródpiersia, ponownie przecinając poniżej góry.</li>
	<li>Przetnij mostek w linii środkowej, aby odsłonić serce i płuco.</li>
	<li>Za pomocą rozwarstwienia odłącz przeponę od wątroby i przedziału brzusznego.</li>
	<li>Zlokalizuj żyłę główną dolną (IVC) pod jelitami i przetnij IVC.</li>
	<li>Zlokalizuj prawą komorę. 
	UWAGA: Prawa komora będzie miała jaśniejszy wygląd w porównaniu z lewą komorą i należy uwidocznić przegrodę śródkomorową, oddzielającą prawą komorę od lewej komory.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,5 ml 1% frakcjonowanej heparyny do prawej komory za pomocą igły motylkowej 25-30 G, a następnie powoli, ale równomiernie przepłukać 10-15 ml 1x PBS (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Należy uważać, aby nie wprowadzać igły przez serce i nie wstrzykiwać heparyny do jamy śródpiersia. 
		UWAGA: Wstrzyknięcie 1x PBS sprawia, że tkanka płucna staje się biała. Płyn wynaczyniony z aorty brzusznej powinien być przezroczysty i bezbarwny, a wątroba może stać się biała po udanym płukaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zlokalizuj krtań i wypreparuj otaczającą powięź i tkankę za pomocą pęsety z końcówką.</li>
	<li>Umieść szew chirurgiczny pod tchawicą i luźno zawiąż węzeł chirurgiczny.</li>
	<li>Umieść mały otwór w tchawicy powyżej sznurka i kanaluj igłą o końcu 20 G.</li>
	<li>Zaciśnij szew wokół igły i tchawicy za pomocą węzła chirurgicznego.</li>
	<li>Wstrzyknąć 2,5-4 ml agarozy do tchawicy i monitorować napompowanie płuc.</li>
	<li>Po wkropleniu agarozy wlej zimny, schłodzony 1x PBS na płuca, aby agaroza zestaliła się.</li>
	<li>Przeciąć tchawicę powyżej szwu chirurgicznego i wypreparować płuco i serce ze śródpiersia, usuwając wszelkie zrosty i powięź.</li>
	<li>Po zestaleniu umieść w 1x DMEM (wystarczająco dużo, aby zanurzyć tkankę) na szalce Petriego, aby utrzymać na lodzie. Natychmiast przetnij jeden płat za pomocą maszyny wibratomicznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
</ol>
3. Precyzyjnie wycięte plastry płuc
<ol>
	<li>Przymocuj próbkę do platformy za pomocą kleju superglue, trzymając środkową stronę próbki skierowaną do góry.</li>
	<li>Napełnij pojemnik na próbkę 1x PBS, upewniając się, że próbka jest całkowicie zanurzona.</li>
	<li>Napełnij pojemnik otaczający pojemnik na próbkę lodem, aby utrzymać otaczający PBS i próbkę w niskiej temperaturze.</li>
	<li>Włącz wibratomium i dostosuj żądane ustawienia poniżej.
	<ol>
		<li>Ustaw grubość na 300um.</li>
		<li>Ustaw częstotliwość na 100 Hz.</li>
		<li>Ustaw amplitudę na 0,6 mm.</li>
		<li>Ustaw prędkość na 5 μm/s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą klucza imbusowego obróć uchwyt ostrza do bezpiecznej pozycji i otwórz szczęki, aby włożyć ostrze.</li>
	<li>Dokręć szczęki kluczem imbusowym i obróć uchwyt ostrza do odpowiedniej pozycji do krojenia.</li>
	<li>Umieść próbkę i platformę na pudełku i wsuń przed ostrze.</li>
	<li>Napełnij pudełko wokół platformy próbki 1x PBS, aż próbka zostanie zanurzona.</li>
	<li>Przyłóż ostrze wibratomu do krawędzi bloku i ręcznie opuść ostrze, aż zrówna się z górną częścią próbki.</li>
	<li>Potwierdź odpowiednie ustawienia i uruchom wibratomem (<klasa strong="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Gdy świeże plastry są krojone, wyjmij próbki z PBS i umieść je na sterylnej szalce Petriego z 10 ml 1x DMEM zawierającego 1x antybiotyk-antybiotyk.</li>
	<li>Po zakończeniu całkowicie schuj ostrze, a następnie użyj klucza imbusowego, aby podnieść ostrze do bezpiecznej pozycji.</li>
	<li>Przechowywać próbki w 1x DMEM w inkubatorze w temperaturze 37 °C z zachowaniem żywotności przez okres do 10 dni (patrz doświadczenie żywotności poniżej).</li>
</ol>
4. Przykładowy eksperyment z czynnikiem zwężającym naczynia krwionośne
<ol>
	<li>Umieść plasterek wibratomu na szkiełku mikroskopowym.</li>
	<li>Przed umieszczeniem go na szkiełku użyj chusteczki czyszczącej, aby pozbyć się nadmiaru podłoża (PBS).</li>
	<li>Umieść próbkę pod mikroskopią z kontrastem fazowym i użyj 10-20-krotnego powiększenia, aby zidentyfikować naczynie.</li>
	<li>Umieść 500 μl środków zwężających naczynia krwionośne, takich jak 60 mM KCl lub 1 μM Endothelin-1, aby całkowicie zanurzyć szkiełko.</li>
	<li>Obserwuj i nagrywaj wideo, nagrywając przez 30 s-60 s (Wideo 1).</li>
</ol>
5. Przygotowanie tkanki do lizy RNA lub białka na PCLS
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu napełnij małe pudełko z pianki polistyrenowej 1 litrem ciekłego azotu.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem umieść dwie małe probówki do mikrowirówek (1,5 ml) w pojemniku z ciekłym azotem. 
	UWAGA: Ciekły azot powinien ochładzać się na zewnątrz rur, jednak nie powinien znajdować się w środku. Należy ostrożnie obchodzić się z ciekłym azotem i nie wystawiać skóry na działanie ciekłego azotu. Użyj kleszczyków i rękawiczek, aby umieścić i wyjąć probówki z pudełka.</li>
	<li>Umieść 4-5 świeżych plasterków wibratomu w misce z moździerzem.</li>
	<li>Wlej 5-10 ml płynu N2 na plastry w misce moździerza.</li>
	<li>Szybko użyj tłuczka, aby zmielić plastry błyskawicznego zamrażania na proszek, zanim ciekły azot wyparuje. 
	UWAGA: Tkanka powinna skondensować się w drobny proszek. Jeśli nie, dodaj więcej ciekłego azotu, aż do uzyskania tego celu.</li>
	<li>Za pomocą stalowej łyżki laboratoryjnej (wstępnie schłodzonej ciekłym azotem) nabierz proszek do dwóch schłodzonych probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Zjonizuj proszek, dodając 500 μl odczynnika do ekstrakcji RNA, aby przystąpić do izolacji RNA lub 500 μl buforu RIPA (zawiera 1x inhibitory proteazy), aby kontynuować lizę białek.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dodatkowej izolacji RNA, pomiaru BCA i western blot.</li>
</ol>
6. Określanie żywotności
<ol>
	<li>Po przygotowaniu wibratomu umieść dwa wycinki płuc na 24-dołkowej płytce hodowlanej z 450 μl pożywki DMEM i 50 μl odczynnika żywotności komórek (upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona).</li>
	<li>Umieścić próbki z powrotem w 5% CO2 w inkubatorze o temperaturze 37 °C na noc, przy minimalnym naświetleniu.</li>
	<li>Rano obserwuj roztwór pod kątem zmiany koloru. Niebieski roztwór zmienia kolor na różowy, gdy tkanka jest żywotna.</li>
</ol>
7. Zachowanie oznakowania komórek
<ol>
	<li>Leczyć transgeniczną Cdh5-CreERT2 skrzyżowaną z myszą Ai14 tdTomato wstrzyknięciem IP tamoksyfenu (2 mg / dobę) przez łącznie 5 dni (całkowita dawka 10 mg tamoksyfenu) w celu indukcji komórek Cre dodatnich znakowania tdTomato.</li>
	<li>Tydzień po wstrzyknięciu należy przygotować płuca, wykonując powyższe czynności od 1 do 3.</li>
	<li>Po przygotowaniu precyzyjnie wyciętego wycinka płuca należy umieścić tkankę na szkiełku mikroskopowym i umieścić szkiełko nakrywkowe na wierzchu tkanki.</li>
	<li>Użyj mikroskopu konfokalnego, aby wykryć barwienie tdPomidor (przy użyciu długości fali wzbudzenia 555 nm).</li>
</ol>

<ol><li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Gerontology+%26+Geriatrics%22%5BJournal%5D)">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li>
<li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+%283D-LTCs%29+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437(2019).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480(2020).</li>
<li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li>
<li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lung+slices%3A+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li>
<li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li>
<li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li>
<li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Xenobiotica%22%5BJournal%5D)">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li>
<li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li>
<li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902(2019).</li>
<li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698(2011).</li>
<li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT%2C+ACH%2C+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li>
<li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128(2014).</li>
<li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventitial+dissection%3A+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Interactive+Cardiovascular+and+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li>
<li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), Bethesda, Md. 1119-1124 (2005).</li>
<li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li>
<li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis & Rheumatology. 72 (3), Hoboken, N.J. 477-487 (2020).</li>
<li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+Ca2%2B+sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+function+and+endothelin-1%3A+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), Bethesda, Md. 354-360 (2017).</li>
<li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li>
<li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2%2B+from+intracellular+stores%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, Dallas, Tex. 222-227 (1997).</li>
<li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym artykule opisano ulepszoną metodę wytwarzania obrazów o wysokiej rozdzielczości mysiej tkanki płucnej, która zachowuje strukturę naczyniową i optymalizuje elastyczność eksperymentalną, w szczególności wykorzystując zastosowanie PCLS do uzyskania mikroplasterków tkanki płucnej, które można oglądać w trzech wymiarach z zachowaną kurczliwością naczyń krwionośnych. Korzystając z odczynnika żywotności, protokół wykazuje, że starannie przygotowane i zakonserwowane plastry mogą zachować żywotność przez ponad tydzień. Zach...

Postępy w przygotowaniu i obrazowaniu tkanki płucnej, która zachowuje składniki komórkowe bez poświęcania struktury anatomicznej, dostarczają szczegółowego zrozumienia chorób płuc. Zdolność do identyfikacji białek, RNA i innych związków biologicznych przy zachowaniu struktury fizjologicznej dostarcza istotnych informacji na temat przestrzennego rozmieszczenia komórek, które mogą poszerzyć wiedzę na temat patofizjologii w wielu chorobach płuc. Te szczegółowe obrazy mogą prowadzić do lepszego zrozumienia chorób naczyń płucnych, takich jak nadciśnienie tętnicze płucne, w zastosowaniu do modeli zwierzęcych, potencjalnie prowadząc do poprawy strategii terapeutycznych.
Pomimo postępu technologicznego, uzyskanie wysokiej jakości obrazów tkanki płucnej myszy pozostaje wyzwaniem. Cykl oddechowy jest napędzany przez ujemne ciśnienie w klatce piersiowej wytwarzane podczas inhalacji1. Podczas tradycyjnego pobierania biopsji i przygotowywania próbek płuc do obrazowania, gradient podciśnienia jest tracony, co powoduje zapadnięcie się dróg oddechowych i naczyń krwionośnych, które nie reprezentują już swojego obecnego stanu. Aby uzyskać realistyczne obrazy odzwierciedlające aktualne warunki, płucne drogi oddechowe muszą zostać ponownie napompowane, a naczynia krwionośne ukrwione, zmieniając dynamiczne płuco w statyczne urządzenie. Zastosowanie tych odrębnych technik pozwala na zachowanie integralności strukturalnej, układu naczyniowego płuc i składników komórkowych, w tym komórek odpornościowych, takich jak makrofagi, co pozwala na oglądanie tkanki płucnej jak najbardziej zbliżonej do jej stanu fizjologicznego.
Precision cut lung sliting (PCLS) to idealne narzędzie do badania anatomii i fizjologii układu krążenia płuc2. PCLS zapewnia szczegółowe obrazowanie tkanki płucnej w trzech wymiarach, przy jednoczesnym zachowaniu składników strukturalnych i komórkowych. PCLS został wykorzystany w modelach zwierzęcych i ludzkich, aby umożliwić uzyskanie na żywo obrazów funkcji komórkowych w wysokiej rozdzielczości w trzech wymiarach, co czyni go idealnym narzędziem do badania potencjalnych celów terapeutycznych, pomiaru skurczu małych dróg oddechowych i badania patofizjologii przewlekłych chorób płuc, takich jak POChP, ILD i rak płuc3. Stosując podobne techniki, narażenie próbek PCLS na działanie środków zwężających naczynia krwionośne może zachować strukturę płuc i kurczliwość naczyń, odtwarzając warunki in vitro. Oprócz zachowania kurczliwości, przygotowane próbki mogą zostać poddane dodatkowej analizie, takiej jak sekwencjonowanie RNA, Western blot i cytometria przepływowa, jeśli są prawidłowo przygotowane. Wreszcie, komórki oznaczone kolorem reporterowym oznaczone fluorescencją tdTomato po pobraniu płuc mogą zachować etykietowanie po przygotowaniu mikroplasterków, co czyni je idealnymi do badań śledzenia komórek. Integracja tych technik zapewnia zaawansowany model zachowujący przestrzenny układ komórek i kurczliwość naczyń, który może prowadzić do bardziej szczegółowego zrozumienia kaskad sygnałowych i potencjalnych opcji terapeutycznych w chorobie naczyń płucnych.
W tym manuskrypcie mysia tkanka płucna PCLS jest narażona na działanie czynników zwężających naczynia krwionośne, wykazując zachowaną integralność strukturalną i kurczliwość naczyń. Badanie pokazuje, że tkanka przygotowana i odpowiednio traktowana może pozostać żywotna przez 10 dni. Badanie wykazało również zachowanie komórek z endogenną fluorescencją (tdTomato), co pozwala próbkom na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości naczyń i architektury płuc. Na koniec opisano sposoby obchodzenia się z wycinkami tkanek i przygotowywania ich do pomiaru RNA i Western blot w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw.

<table><tbody><tr><td>0,5 cm³ frakcjonowanej heparyny w strzykawce</td><td>BD</td><td>100 jednostek USP na ml</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>20 1/2 cala igła końcowa do kaniulacji tchawicy</td><td>Cml Supply</td><td>90120050D</td><td></td></tr><tr><td>30cc strzykawka</td><td>BD</td><td>309650</td> Anti Anti Solution Gibco 15240096 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowany mikrotom z ostrzem wibracyjnym</td><td>Odczynnik</td> do żywotności komórek Leica <td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>(alamarBlue)</td> <td>Thermofisher</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium i GLutaMAX, uzupełniony o 10% FBS, 1% Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz i tłuczek</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RIPA bufor do lizy i ekstrakcji</td><td>Thermoscientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Szew chirurgiczny 6/0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Invitrogen, Thermofisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Skrzydlaty zestaw do pobierania krwi (igła motylkowa) 25-30G</td><td>BD</td><td>25-30G</td><td></td></tr></tbody></table>

precyzyjnie wycięte plastry płuc jako skuteczne narzędzie do badań ex vivo struktury i kurczliwości naczyń płucnych

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Wizualizacja mysiej tkanki płucnej dostarcza cennych informacji strukturalnych i komórkowych dotyczących leżących pod nią dróg oddechowych i naczyń krwionośnych. Jednak zachowanie naczyń płucnych, które naprawdę reprezentują warunki fizjologiczne, nadal stanowi wyzwanie. Ponadto delikatna konfiguracja mysich płuc powoduje wyzwania techniczne związane z przygotowaniem próbek do wysokiej jakości obrazów, które zachowują zarówno skład, jak i architekturę komórkową. Podobnie, testy kurczliwości komórkowej można przeprowadzić w celu zbadania potencjału komórek do reagowania na środki zwężające naczynia krwionośne in vitro, ale testy te nie odtwarzają złożonego środowiska nienaruszonego płuca. W przeciwieństwie do tych problemów technicznych, metoda precyzyjnie wyciętego plastra płuc (PCLS) może być stosowana jako skuteczna alternatywa do wizualizacji tkanki płucnej w trzech wymiarach bez odchyleń regionalnych i służyć jako żywy model kurczliwości zastępczej przez okres do 10 dni. Tkanka przygotowana za pomocą PCLS zachowała strukturę i orientację przestrzenną, dzięki czemu idealnie nadaje się do badania procesów chorobowych ex vivo. Lokalizacja endogennych komórek znakowanych tdTomato w PCLS pobranych z indukowalnego mysiego modelu reporterowego tdTomato można z powodzeniem uwidocznić za pomocą mikroskopii konfokalnej. Po ekspozycji na leki zwężające naczynia krwionośne, PCLS wykazuje zachowanie zarówno kurczliwości naczyń, jak i struktury płuc, które mogą być uchwycone przez moduł poklatkowy. W połączeniu z innymi procedurami, takimi jak western blot i analiza RNA, PCLS może przyczynić się do kompleksowego zrozumienia kaskad sygnałowych, które leżą u podstaw wielu różnych zaburzeń i prowadzić do lepszego zrozumienia patofizjologii w chorobach naczyń płucnych.

Po dodaniu do komórek lub tkanki, odczynnik do badania żywotności zostaje zmodyfikowany przez środowisko redukujące w żywej tkance i zmienia barwę na różową/czerwoną, stając się silnie fluorescencyjnym. Reprezentatywne zmiany koloru wykryte w dniach 0-1 oraz 9-10 przedstawiono na Ryc. 3. Jak zauważono, roztwór początkowo był niebieski, a w ciągu nocy stał się różowy, co potwierdziło żywotność. Zmiana barwy następuje zazwyczaj w ciągu 1-4 h, jednak może być wymagany dłuższy czas. Aby ocenić ż...

Przedstawiony tutaj jest protokół zachowania kurczliwości naczyniowej mysiej tkanki płucnej PCLS, co daje wyrafinowany trójwymiarowy obraz układu oddechowego i dróg oddechowych, który może być zachowany przez okres do 10 dni, który jest podatny na liczne zabiegi.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc jako skuteczne narzędzie do badań ex vivo struktury i kurczliwości naczyń płucnych

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

Metoda precyzyjnie wycinanych plastrów płuc pozwoli zachować strukturę i orientację przestrzenną w trzech wymiarach bez odchyleń regionalnych i może służyć jako żywy model zastępczy do pomiarów kurczliwości naczyń i dróg oddechowych. W połączeniu z obrazowaniem poklatkowym, Western blot i analizą RNA, precyzyjnie wycięte wycinki płuc przyczyniają się do kompleksowego zrozumienia kaskad sygnałowych, które leżą u podstaw wielu różnych zaburzeń i prowadzą do lepszego zrozumienia patofizjologii w chorobach naczyń płucnych. Na początek umieść uśpioną dorosłą mysz w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz ją na miejscu, przyklejając łapy i nos do stołu taśmą klejącą.Spryskaj brzuszną powierzchnię myszy 70% etanolem. Użyj kleszczy, aby podnieść skórę brzucha myszy w miejscu pęcherza moczowego i nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć w linii środkowej, przesuwając się wyżej do odcinka szyjnego, aby odsłonić tchawicę. Następnie użyj pęsety, aby podnieść leżącą poniżej warstwę powięzi i użyj nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić narządy trzewne i przedział śródpiersia, ponownie przecinając poniżej góry.Przetnij mostek w linii środkowej, aby odsłonić serce i płuco. Ostrożnie wypreparuj przeponę z wątroby i przedziału brzusznego. Zlokalizuj żyłę główną dolną pod jelitami i przetnij ją.Po zlokalizowaniu prawej komory użyj igły motylkowej o rozmiarze od 25 do 30, aby wstrzyknąć 0,5 mililitra 1% frakcjonowanej heparyny do prawej komory i przepłukać ją powoli, ale stabilnie 10 do 15 milimetrów PBS. Po zlokalizowaniu krtani za pomocą pęsety z końcówką należy wypreparować otaczającą powięź i tkankę, a następnie umieścić szew chirurgiczny pod tchawicą i luźno zawiązać węzeł chirurgiczny. Umieść mały otwór w tchawicy powyżej sznurka i kaniuluj igłą o rozmiarze 20.Zaciśnij szew wokół igły i tchawicy za pomocą węzła chirurgicznego. Następnie wstrzyknij 2,5 do 4 mililitrów agarozy do tchawicy i monitoruj napompowanie płuc. Po wstrzyknięciu agarozy wlej zimny PBS na płuca, aby zestalić agarozę.Następnie przeciąć tchawicę nad szwem chirurgicznym i wypreparować płuco i serce ze śródpiersia, usuwając wszelkie zrosty i powięź. Po zestaleniu umieść tkankę w DMEM na szalce Petriego na lodzie i natychmiast przystąp do krojenia jednego płata za pomocą maszyny wibratomowej. Aby przygotować plastry płuc, przymocuj próbkę do platformy za pomocą kleju superglue, trzymając środkową stronę skierowaną do góry.Następnie napełnij pojemnik na próbkę PBS. Napełnij pojemnik lodem, aby otaczający PBS i próbka były zimne. Włącz wibratom.Dostosuj grubość do 300 mikrometrów, częstotliwość do 100 herców, amplitudę do 0,6 milimetra i prędkość do pięciu mikrometrów na sekundę. Za pomocą klucza imbusowego obróć uchwyt ostrza do bezpiecznej pozycji i otwórz szczęki, aby włożyć ostrze. Następnie dokręć szczęki kluczem imbusowym.Umieść próbkę w pudełku, upewniając się, że jest zanurzona w PBS. Przesuń pudełko do góry we właściwej pozycji i upewnij się, że jest bezpieczne. Obróć uchwyt ostrza do odpowiedniej pozycji do krojenia.Przyłóż ostrze wibratomu do krawędzi bloku i ręcznie opuść ostrze, aż zrówna się z górną częścią próbki. Potwierdź ustawienia i uruchom wibratom. Po pokrojeniu świeżych plastrów wyjmij próbki z PBS i umieść je na sterylnej szalce Petriego z 10 mililitrami DMEM zawierającym jednorazowy antybiotyk przeciwgrzybiczy.Po umieszczeniu wszystkich plastrów na szalce Petriego całkowicie schować ostrze i za pomocą klucza imbusowego podnieść ostrze do bezpiecznej pozycji. Przechowywać próbki w DMEM w temperaturze 37 stopni Celsjusza. I umieść plasterek wibratomu na szkiełku mikroskopowym.Użyj chusteczki czyszczącej, aby usunąć nadmiar medium. Umieść próbkę pod mikroskopią z kontrastem fazowym i użyj powiększenia od 10 do 20 razy, aby zidentyfikować naczynie. Następnie dodaj 500 mikrolitrów środków zwężających naczynia krwionośne, takich jak 60-milimolowy chlorek potasu lub jeden mikromolowy endotelin-1, aby całkowicie zanurzyć szkiełko.Obserwuj i nagrywaj wideo, nagrywając przez 30 do 60 sekund. Przed rozpoczęciem eksperymentu napełnij małe pudełko z pianki polistyrenowej jednym litrem ciekłego azotu i umieść dwie 1,5 mililitrowe probówki mikrowirówkowe w pojemniku z ciekłym azotem. Umieść cztery do pięciu świeżych plasterków wibratomu w misce z moździerzem.Wlej od 5 do 10 mililitrów ciekłego azotu na plasterki i szybko użyj tłuczka, aby zmielić plastry na proszek, zanim ciekły azot wyparuje. Użyj wstępnie schłodzonej stalowej łyżki laboratoryjnej, aby nabrać proszek do dwóch schłodzonych probówek do mikrowirówek i poddać proszek lizie, dodając 500 mikrolitrów odczynnika do ekstrakcji RNA w celu izolacji RNA lub 500 mikrolitrów buforu RIPA do lizy białek. W reprezentatywnym eksperymencie żywotności wykryto zmianę koloru warstw PCLS od dnia zerowego do pierwszego i od dnia dziewiątego do dziesiątego.Roztwór był początkowo niebieski i z dnia na dzień zmienił kolor na różowy, wykazując żywotność. Zmiana koloru zwykle następowała w ciągu jednej do czterech godzin, ale może być konieczne dłuższe czas. Dzienna różnica między absorbancją przy długościach fal 562 i 613 nanometrów dla tkanki przygotowanej wibratomem pokazano tutaj.Można tu uwidocznić zwężenie układu krwionośnego w tkance płucnej przygotowanej wibratomem za pomocą endoteliny-1 i chlorku potasu. W tych wycinkach płuc wykazano zachowanie znakowania tdPomidor w komórkach tydzień po wstrzyknięciu tamoksyfenu. Najważniejsze jest, aby dobrze wykonać krok oczyszczania i napełniania płuc, aby usunąć całą krew z krążenia przed dodatkowymi eksperymentami i obrazowaniem.Oprócz chorób naczyniowych, PCLS może być stosowany do badania fizjobiologii chorób związanych z drogami oddechowymi i może być dalej testowany na ludzkich tkankach płucnych w klinicznie istotnych scenariuszach.

precision-cut-lung-slices-as-an-efficient-tool-for-ex-vivo-pulmonary

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Organotypowe pierwotne kultury eksplantatów tkankowych, które zawierają precyzyjnie wycięte plastry, reprezentują trójwymiarową (3-D) architekturę tkanki, jak również wielokomórkowe interakcje natywnej tkanki. Ten film opisuje hodowlę wycinków tkanek pochodzących z mysiego guza płuc przy użyciu obrotowej jednostki inkubacyjnej, systemu, który umożliwia okresową ekspozycję tkanek na tlen i składniki odżywcze. Protokół opisuje metodologię generowania i hodowli precyzyjnie wyciętych wycinków guza...

Hodowla eksplantatów tkanki guza płuc: procedura generowania i hodowli precyzyjnie wyciętych plastrów guza płuc

W tym filmie opisujemy procedurę napełniania wyizolowanych ludzkich płuc agarozą i przygotowywania precyzyjnie wyciętych ludzkich plastrów płuc. Przygotowane ex vivo wycinki płuc można wykorzystać do dalszych eksperymentów immunologicznych.

Preparat na bazie agarozy z precyzyjnie pokrojonymi ludzkimi plastrami płuc

Niedotlenienie naczyń płucnych (HPV) jest ważnym zjawiskiem fizjologicznym, dzięki któremu przy niedotlenieniu pęcherzyków płucnych perfuzja płuc jest dopasowana do wentylacji. Głównym segmentem naczyniowym przyczyniającym się do HPV jest tętnica wewnątrzgroniasta. W tym miejscu opisujemy nasz protokół analizy HPV mysich naczyń płucnych o średnicach 20-100 μm.

Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Opisujemy metodę generowania precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) i ich barwienia immunologicznego, aby zobrazować lokalizację różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Nasz protokół można rozszerzyć w celu wizualizacji lokalizacji i funkcji wielu różnych typów komórek w różnych warunkach.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

Z punktu widzenia zasady 3R, modele oddechowe jako alternatywa dla badań na zwierzętach ewoluują. Zwłaszcza w odniesieniu do oceny ryzyka związanego z substancjami oddechowymi brakuje odpowiednich testów. W tym miejscu opisujemy zastosowanie precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinków płuc do oceny substancji unoszących się w powietrzu.

Ocena cytotoksycznego i immunomodulującego działania substancji w precyzyjnie pokrojonych ludzkich wycinkach płuc

Ten protokół zapewnia prostą i niezawodną metodę produkcji żywotnych, precyzyjnie wyciętych plastrów wątroby od myszy. Próbki tkanek ex vivo mogą być utrzymywane w laboratoryjnych warunkach hodowli tkankowej przez wiele dni, zapewniając elastyczny model do badania patobiologii wątroby.

Precyzyjnie wycięte plastry wątroby jako model biologii wątroby ex vivo

Ten protokół opisuje metodę generowania powtarzalnych, małych tkanek płuc, poprzez ponowne zaludnienie decelularyzowanych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2, fibroblastami i komórkami śródbłonka.

Zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc

Obecny protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie precyzyjnie wyciętych plastrów płuc myszy do oceny kurczliwości dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic wewnątrzpłucnych w środowisku prawie in vivo.

Wykorzystanie precyzyjnie wyciętego wycinka płuc do badania regulacji skurczowej dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic śródpłucnych

Opracowaliśmy technikę przetwarzania tkanek wykorzystującą wibratomę i tkankę płucną zatopioną agarozą do generowania skrawków płuc, co pozwala na uzyskanie obrazów architektury płuc w wysokiej rozdzielczości. Zastosowaliśmy barwienie immunofluorescencyjne, aby obserwować przestrzenną ekspresję białek przy użyciu specyficznych markerów strukturalnych płuc.

Zautomatyzowane cięcie wibratomiczne tkanki płucnej zatopionej w agarozie do multipleksowego obrazowania fluorescencyjnego

Tutaj opisujemy prosty i ekonomiczny protokół do przeprowadzenia bezstronnej kwantyfikacji gęstości mikrokrążenia płuc dla całej tkanki płucnej myszy za pomocą pojedynczego barwienia izolektyny B4.

Kwantyfikacja gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy w poprzek zrazików

Poznaj metodę precyzyjnie wyciętych plastrów płuc do badań struktury i kurczliwości naczyń płucnych ex vivo. Technika ta zachowuje trójwymiarową architekturę tkanki i umożliwia analizy molekularne.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc jako skuteczne narzędzie do badań ex vivo struktury i kurczliwości naczyń płucnych

Przeglądaj więcej filmów