Name: Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Poznaj metodę izolacji jąder astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania FANS. Technika umożliwia badania transkryptomiczne i epigenetyczne w zdrowej i chorej tkance mózgowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować członkom z Patologii i Neurochirurgii w Icahn School of Medicine w Mount Sinai za pomoc w pozyskiwaniu niezidentyfikowanej tkanki mózgowej oraz ISMMS's Flow Cytometry CORE za fachowe porady. Badanie zostało częściowo sfinansowane przez NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (do NMT) i R61DA048207 (do S.A.).

UWAGA: Program Ochrony Ludzi w Icahn School of Medicine at Mount Sinai (ISMMS) i jego Institutional Review Board (IRB) zapewniają etyczne prowadzenie badań i zgodność z przepisami federalnymi, stanowymi i instytucjonalnymi. W tym badaniu wszystkie wykorzystane próbki pośmiertne zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację, uzyskane za odpowiednią zgodą za pośrednictwem biorepozytorium i zostały zwolnione z oznaczenia "badania na ludziach" przez IRB ISMMS (HS#14-01007). 
1. Przygotowanie bufora
UWAGA: Jeśli wykonujesz sekwencjonowanie RNA na dalszym etapie, dokładnie potraktuj wszystkie miejsca pracy i narzędzia roztworem do dekontaminacji RNazy, aby zapobiec degradacji mRNA.
<ol>
	<li>Przygotować bufor do lizy.
	<ol>
		<li>W destylowanymH2Odo 50 ml rozpuścić: 5,47 g sacharozy (0,32 M wersja ostateczna), 250 μl 1 M CaCl2 (5 mM wersja ostateczna), 150 μl 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM wersja ostateczna), 10 μl 500 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,1 mM wersja ostateczna), 500 μl 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM wersja ostateczna), 50 μl Triton X-100 (0,1% wersja ostateczna) i 17 μl 3 M ditiotreitolu (DTT, 1 mM wersja ostateczna, dodać świeżą) (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor sacharozy
	<ol>
		<li>W destylowanymH2Odo 50 ml rozpuścić: 30,78 g sacharozy (1,8 M wersja ostateczna), 150 μl 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM wersja ostateczna), 500 μl 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM wersja ostateczna), 17 μl 3 M DTT (1 mM wersja ostateczna, dodać świeżą).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Dysocjacja zamrożonej tkanki do zawiesiny pojedynczego jądra
<ol>
	<li>Dodaj 4 ml lodowatego buforu do lizy do 7 ml szklanego młynka do tkanek i trzymaj na lodzie. Wypreparuj około 200-400 mg świeżo mrożonej dorosłej kory człowieka, odbij około 50 razy i przenieś homogenat tkankowy do 12 ml ultrawirówki polipropylenowej.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 5 ml dodaj 6,5 ml lodowatego buforu sacharozy na dno probówki ultrawirówki, uważając, aby nie naruszyć warstwy między sacharozą a homogenatem tkankowym. 
	UWAGA: W przypadku przetwarzania dodatkowych próbek należy ostrożnie zrównoważyć probówki wagowo, dodając dodatkowy bufor do lizy do lżejszej próbki. Precyzyjne wyważenie probówek ultrawirówek jest niezbędne, aby zapobiec uszkodzeniu wirnika i zapewnić obrót z odpowiednią prędkością.</li>
</ol>
3. Ultrawirowanie
<ol>
	<li>Ultraodwirować lizat przy 24 400 obr./min (101 814 × g) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant i zanieczyszczenia, nie naruszając osadu. 
	UWAGA: Osad może nie być widoczny, jeśli zaczyna się od mniej niż 200 mg tkanki.</li>
	<li>Dodać 600 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (bezCa2+, Mg2+) do osadu jądrowego i inkubować na lodzie przez 10 minut przed ponownym zawieszeniem.</li>
	<li>Pipetować w górę i w dół 50 razy, aby ponownie zawiesić osad jądra na lodzie.</li>
	<li>Użyj hemocytometru, aby uwidocznić nienaruszone jądra pod mikroskopem i upewnić się, że stężenie resuspension przekracza 105 jąder / ml przed przejściem do następnego kroku (połącz 10 μl zawieszonych jąder z 10 μl błękitu trypanowego).</li>
</ol>
4. Inkubacja przeciwciał
<ol>
	<li>Aby oznaczyć immunologicznie próbkę dla FANS, dodaj 500 μl zawieszonej osadki próbki, 490 μl 1x PBS (Ca2+, Mg2+ free), 10 μL 10% BSA (0,1% final), 1 μL mysiego przeciwciała anty-NeuN sprzężonego z AF555 (NeuN-AF555, końcowe stężenie 1:1000) i 1 μL mysiego przeciwciała anty-PAX6 sprzężonego z allofikocyjaniną (PAX6-APC, 1:1000 stężenie końcowe). 
	UWAGA: Można dodać alternatywne przeciwciała sprzężone z innymi fluoroforami (patrz dyskusja). W tym przypadku zastosowano mysi anty-OLIG2 skoniugowany z AF488 (stężenie 1:1000) z korzystnymi wynikami.</li>
	<li>Wykonaj kontrole 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolowe (DAPI) i jednokolorowe, aby ustawić parametry bramkowania, używając w razie potrzeby niewielkiej ilości próbki.
	<ol>
		<li>Aby przeprowadzić kontrolę pojedynczego koloru AF555, dodaj 20 μl zawieszonego osadu próbki, 970 μl 1x PBS (bez Ca2+, Mg2+), 10 μl 10% BSA (0,1% końcowy) i 1 μl przeciwciała NeuN-AF555 (stężenie 1:1000).</li>
		<li>Aby przeprowadzić jednokolorową kontrolę APC, dodaj 20 μl zawieszonego osadu próbki, 970 μl 1X PBS (bez Ca2+, Mg2+), 10 μl 10% BSA (0,1% końcowy) i 1 μl przeciwciała PAX6-APC (stężenie 1:1000).</li>
		<li>Aby przeprowadzić kontrolę tylko DAPI, dodaj 20 μl zawieszonego osadu próbki, 970 μl 1X PBS (bez Ca2+, Mg2+) i 10 μl 10% BSA (0,1% końcowy) (DAPI zostanie dodany później, patrz 4.4). 
		UWAGA: Jeśli stosuje się więcej niż dwa przeciwciała, oprócz kontroli jednokolorowych zaleca się wykonanie kontroli fluorescencji minus jeden (FMO).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować próbki i kontrole z rotacją w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj DAPI w stosunku 1:1000 do wszystkich próbek i kontroli, a następnie kontynuuj sortowanie.</li>
</ol>
5. Sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FANS)
UWAGA: Zaleca się korzystanie z instytucjonalnego urządzenia do cytometrii przepływowej z pomocą przeszkolonego personelu, chyba że jest już biegły w technikach cytometrii przepływowej/sortowania.
<ol>
	<li>Brama, jak pokazano poniżej.
	<ol>
		<li>Po pierwsze, dla każdej próbki, bramka przez rozproszenie do przodu (FSC-A) vs. rozproszenie boczne (SSC-A), aby uwzględnić cząstki w odpowiednim zakresie rozmiarów dla jąder, wykluczając w ten sposób czerwone krwinki i szczątki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
		UWAGA: Bardzo czysty preparat jąder może odróżnić mniejsze skupisko odłamków od klastra jąder.</li>
		<li>Następnie, dla każdej próbki, bramka według FSC-A vs. FSC-W (lub FSC-A vs. FSC-H) i SSC-A vs. SSC-W (lub SSC-A vs. SSC-H), aby uwzględnić tylko jądra singletowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Następnie, i dla każdej próbki, bramka według DAPI, aby uwzględnić nienaruszone pojedyncze jądra (DAPI - wysoka bramkowana populacja), z wyłączeniem szczątków (DAPI-niska, po lewej stronie bramkowanej populacji) i dubletów (po prawej stronie bramkowanej populacji) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Ustaw dalsze bramkowanie w oparciu o kontrolki fluorescencji, określone wizualnie jako odrębne klastry na wykresach FACS.
		<ol>
			<li>Uruchom kontrolę tylko DAPI, aby określić barwienie tła populacji przy braku przeciwciał (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
			<li>Uruchom kontrolę tylko NeuN-AF555, aby określić granicę barwienia NeuN+ w kanale dla AF555 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
			<li>Uruchom kontrolę tylko PAX6-APC, aby określić punkt odcięcia dla barwienia PAX6+ w kanale APC (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
			<li>Uruchom dodatkowe jednokolorowe kontrolki, jeśli używasz więcej przeciwciał (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2D,E). 
			UWAGA: W przypadku stosowania więcej niż dwóch przeciwciał zaleca się kontrolę FMO w celu wizualizacji wszelkich zmian w populacjach.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po uruchomieniu wszystkich kontrolek narysuj bramki dla kolekcji NeuN+ i PAX6+ powyżej ustalonych progów.
		<ol>
			<li>Bramka populacji NeuN+ w celu zebrania neuronów (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1E i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2F).</li>
			<li>Bramka populacji PAX6+ z populacji NeuN- w celu zebrania astrocytów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E,F i <silna klasa="xfig">Rysunek 2F).</li>
			<li>Bramkowanie i zbieranie dodatkowych populacji glejowych (takich jak komórki progenitorowe oligodendrocytów, jak pokazano tutaj przez OLIG2+) z populacji NeuN-PAX6- (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F). 
			UWAGA: W przypadku, gdy określenie odpowiednich punktów odcięcia bramkowania jest trudne za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej ze względu na niewyraźne populacje, pomocna może być modyfikacja liczby wizualizowanych zdarzeń (zwiększenie lub zmniejszenie liczby zdarzeń na wykresie FANS).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy pobrać próbki w odpowiedni sposób w oparciu o zamierzoną dalszą analizę.</li>
</ol>
6. Zbiór populacji FANS do dalszych analiz molekularnych
<ol>
	<li>W przypadku sekwencjonowania masowego RNA należy pobrać 50 000-500 000 jąder w PBS (patrz również punkt 7.1).
	<ol>
		<li>Dodać 2 ml roztworu sacharozy, 50 μl 1 M CaCl2 i 30 μl 1 M Mg(CH3COO)2 i wypełnić PBS do 10 ml.</li>
		<li>Odwrócić i inkubować na lodzie przez 15 minut, a następnie odwirować przy 900 × g przez 10-15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odessać supernatant, ponownie zawiesić w 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA, odwirować, zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Alternatywnie, próbki należy zebrać bezpośrednio do 200 μl odczynnika do ekstrakcji RNA. Po sortowaniu dodać odczynnik do ekstrakcji RNA do 1 ml, zachowując stosunek odczynnika do posortowanej próbki 1:1. Wirować, zamrażać na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku masowego oznaczania chromatyny dostępnej dla transpozazy za pomocą sekwencjonowania (sekwencjonowanie ATAC), należy zebrać 50 000-75 000 jąder w PBS w probówce mikrowirówkowej pokrytej 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Jądra należy zamrozić na suchym lodzie/-80 °C lub natychmiast użyć do przygotowania ATAC.</li>
	<li>W przypadku sekwencji sn RNA lub sekwencji ATAC należy zebrać jądra w 0,04% BSA w PBS (patrz również punkt 7.2).</li>
</ol>
7. Wskazówki dotyczące przygotowania biblioteki
<ol>
	<li>Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania masowego jądrowego RNA
	<ol>
		<li>Po zebraniu w odczynniku do ekstrakcji RNA należy przeprowadzić standardową ekstrakcję RNA fenol/chloroform, dodając fenol/chloroform i wytrącając RNA z górnej warstwy wodnej etanolem, a następnie wytrawiając DNazę na probówce (15 min).</li>
		<li>Przeprowadzić oczyszczanie RNA i skoncentrować w końcowej objętości 15 μl wody. 
		UWAGA: Stosując tę metodę, reprezentatywne odzysk z 300 mg próbki dorosłej kory wynosi ~300 000 jąder NeuN+ (15-20 ng/μL całkowitego RNA po oczyszczeniu i zagęszczeniu) i ~250 000 jąder PAX6+ (10-12 ng/μL całkowitego RNA po oczyszczeniu i zagęszczeniu). Ta reprezentatywna wydajność może się znacznie różnić w zależności od jakości próbki, rygorystyczności bramkowania i odzysku RNA.</li>
		<li>Wykonaj ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) przed sekwencjonowaniem, aby potwierdzić wzbogacenie astrocytów w oparciu o wysoką różnicową ekspresję kanonicznych markerów astrocytów (GFAP, SOX9), dehydrogenazę 10-formylotetrahydrofolianu (ALDH1L1)) i wyczerpanie markerów neuronalnych i innych linii komórkowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1G). 
UWAGA: Zebranie populacji podwójnie ujemnej (NeuN-PAX6-) pozwala na dokładniejszą, wielopoziomową analizę kontroli jakości qPCR pod kątem względnego wzbogacenia astrocytów (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2H).</li>
		<li>Generuj biblioteki sekwencji RNA przy użyciu zestawu zalecanego dla niskich wartości liczby integralności RNA, zgodnie z oczekiwaniami dotyczącymi próbek pośmiertnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania pojedynczego jądra
	<ol>
		<li>Wykonaj sekwencjonowanie sn za pomocą instytucjonalnego rdzenia sekwencjonowania.</li>
		<li>Do przetwarzania i sekwencjonowania opartego na nanofluidyce należy stosować zalecane stężenie 1 × 106 komórek/ml w co najmniej 60 μl 1x PBS + 0,04% BSA dla sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq) i 3 × 106 komórek/ml w co najmniej 20 μL 1x PBS + 0,04% BSA dla jednojądrowego testu chromatyny dostępnej dla transpozazy przy użyciu sekwencjonowania (snATAC-seq).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42(2008).</li>
<li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PsychENCODE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914(2008).</li>
<li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li>
<li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70(2015).</li>
<li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurogenesis-controlling+factor%2C+Pax6%2C+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li>
<li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li>
<li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6%3A+25th+anniversary+and+more+to+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li>
<li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li>
<li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue%3A+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li>
<li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+%CE%B1A%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Projekt eksperymentalny zgodny z nakreślonym protokołem powinien zostać sfinalizowany po rozważeniu kilku czynników biologicznych i technicznych. Wyjściowe próbki tkanek są świeżo mrożone, bez utrwalania, i korzystnie mają krótki odstęp między pośmiertnymi pobraniami, aby zmaksymalizować regenerację jąder. Bazując na doświadczeniu, PMI do 24 h pozwala na odpowiednią regenerację jąder; jednak PMI wynoszący 12 godzin lub mniej jest preferowany w celu optymalizacji odzyskiwania nienaruszonych jąder. Dodatkowe czynniki poza ...

Złożoność molekularna ludzkich astrocytów pozostaje słabo zdefiniowana w tkance pierwotnej, co wymaga lepszych narzędzi do ich izolacji i charakterystyki w wysokiej rozdzielczości, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Oddzielenie nienaruszonych ludzkich neuronów i komórek glejowych od ich niszy okazało się trudne ze względu na ograniczony dostęp do świeżych próbek tkanki mózgowej, silnie powiązany charakter procesów glejowych i neuronalnych oraz nieuniknioną aktywację komórkową podczas przetwarzania, z których wszystkie ograniczają charakterystykę molekularną tych typów komórek ex vivo1. Sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FANS) stało się alternatywą dla sortowania żywych komórek, umożliwiając dysocjację i immunoznakowanie populacji jąder z zamrożonej tkanki. W ciągu ostatniej dekady FANS stał się szeroko stosowany do izolowania i molekularnego charakteryzowania populacji ludzkich jąder neuronalnych (NeuN+) w różnych próbkach mózgu i regionach anatomicznych1,2,3,4.
Jednak podobne metody izolowania określonych subpopulacji jąder glejowych od ludzkiej kory mózgowej były ograniczone, co prowadzi do względnego braku wyrafinowania w zrozumieniu złożoności astrocytów zarówno w normalnych, jak i chorych tkankach. W tym celu zaadaptowano wcześniej opublikowany protokół do izolowania ludzkich populacji neuronów za pomocą FANS4, a także zatwierdzono metodę wzbogacania astrocytów (i oligodendroglialnych progenitorów) przy użyciu kombinacji potrójnych przeciwciał, wychwytując astrocyty zarówno w stanie spoczynku, jak i reaktywnym5. Aby specyficznie wzbogacić astrocyty we frakcji NeuN-, zastosowano przeciwciała przeciwko jednemu z dwóch czynników transkrypcyjnych, o których wiadomo, że mają różną ekspresję w populacjach astrocytów, PAX6 lub czynnikowi transkrypcyjnemu SRY-box 9 (SOX9)6,7. PAX6 ulega silnej ekspresji we wczesnym okresie rozwoju płodu w promienistych progenitorach podobnych do gleju w strefach rozrodczych i przyczynia się zarówno do neurogenezy, jak i glejogenezy8,9,10,11, a także do specyfikacji neuronów siatkówki12. U osoby dorosłej PAX6 ulega zróżnicowanej nadekspresji w spoczynkowych ludzkich astrocytach6 i wykazuje koekspresję białka z kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju (GFAP) w ludzkich astrocytach tkankowych padaczki13.
Ten protokół opisuje jednoczesną izolację populacji neuronów w korze nowej i wzbogaconych w astrocyty przez FANS. Świeża (nieutrwalona) zamrożona (tj. świeżo zamrożona) tkanka pośmiertna pobrana z dorosłej kory jest najpierw mechanicznie i chemicznie dysocjowana. Po lizie i ultraodwirowaniu w gradiencie sacharozy składniki cytoplazmatyczne i zewnątrzkomórkowe są odrzucane, podczas gdy jądra są zatrzymywane. Jądra są następnie znakowane fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami jądrowymi odpowiadającymi pożądanym liniom docelowym i sortowane za pomocą FANS. Zgodnie z tym podejściem, wykazano wzbogacenie astrocytów w zebranych populacjach PAX6 + NeuN-, co zostało potwierdzone zarówno przez celowany panel qPCR, jak i przez sekwencjonowanie jądrowego RNA.

<table><tbody><tr><td>10x PBS pH 7,2</td><td>Invitrogen</td><td>70013073</td><td></td></tr><tr><td>PRZECIWCIAŁO ANTY-NEUN KLON A60</td><td>Milipory</td><td>MAB377A5MI</td><td>mysie anty-NeuN sprzężone ze związkiem fluorescencyjnym AF555 (wzbudzenie, 553 nm; emisja, 568 nm)</td></tr><tr><td>PRZECIWCIAŁO ANTY-OLIG2 KLON 211</td><td>Milipore</td><td>MABN50A4MI</td><td>mysi anty-OLIG2 sprzężony ze związkiem fluorescencyjnym AF488 (wzbudzenie, 499 nm; emisja, 520 nm)</td></tr><tr><td>Bydło Albumina surowicy</td><td>Fisher</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>Komora zliczająca jasną linię</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110V</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny chlorek wapnia</td><td>Fisher</td><td>C614-3</td><td></td></tr><tr><td>Sitka komórkowe, 40 i mikro; M</td><td>SP Scienceware</td><td>136800040</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td> Zestaw biblioteki DNA <td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Illumina, Nextera</td><td>FC-121&ndash; 1030</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Młynek do tkanek</td><td>Dounce Sortownik WHEATON</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD FACSAria III</td></tr><tr><td>Tetrahydrat octanu magnezu</td><td>Fisher</td><td>M13-500</td><td></td></tr><tr><td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTÓW</td><td>Novus</td><td>NBP234705J</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Koncentrator</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635005</td><td>Czas fragmentacji 2,5 minuty, zgodnie z zaleceniami dla niskich wartości RIN RNA.</td></tr><tr><td>Sacharoza, z certyfikatem kryształowym, ACS, 500 mg</td><td>Fisher</td><td>S5500</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotor z łyżką wahadłową</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, roztwór 1M, pH 8,0, klasa biologii molekularnej, Ultrapure</td><td>Thermo Scientific</td><td>J22638AE</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td>niejonowy środek powierzchniowo czynny w buforze do lizy</td></tr><tr><td>Odczynnik</td> <td>TRIzol LSInvitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Odczynnik Invitrogen</td><td>15596026</td><td>do izolacji RNA</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter Optima XE-100</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówki PP 9/16 X 3-1/2</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Woda destylowana ( </td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>określany jako woda destylowana</td></tr><tr><td>Ultrapure EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

Złożoność ludzkich astrocytów pozostaje słabo zdefiniowana w pierwotnej tkance ludzkiej, co wymaga lepszych narzędzi do ich izolacji i charakterystyki molekularnej. Sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FANS) może być wykorzystane do skutecznego izolowania i badania populacji ludzkich jąder neuronalnych (NeuN+) z zamrożonej tkanki archiwalnej, unikając w ten sposób problemów związanych z obchodzeniem się ze świeżą tkanką. Brakuje jednak prób podobnego wyizolowania astrogleju od elementu nieneuronalnego (NeuN-). Niedawno opracowana i zwalidowana strategia znakowania immunologicznego wykorzystuje trzy przeciwciała przeciwko czynnikom transkrypcyjnym do jednoczesnej izolacji wzbogaconych populacji jąder neuronalnych (NeuN+), astrocytów (sparowane białko pudełkowe 6 (PAX6)+NeuN-) i progenitorów oligodendrocytów (OLIG2+NeuN-) z niechorych, świeżych (nieutrwalonych) zamrożonych pośmiertnie ludzkich tkanek skroniowej kory nowej.
Wykazano, że ta technika jest przydatna do charakterystyki zmian transkryptomu specyficznych dla typu komórki w pierwotnej patologicznej korze nowej padaczki. Analizy transkryptomiczne potwierdziły, że populacje posortowane w rodzaju PAX6+NeuN są silnie wzbogacone o markery panastrocytów i wychwytują astrocyty zarówno w stanie spoczynku, jak i reaktywności. W artykule opisano metodologię FANS izolacji populacji jąder wzbogaconych w astrocyty ze świeżo zamrożonej kory człowieka, w tym dysocjacji tkanek do zawiesiny jednojądrowej (sn); znakowanie immunologiczne jąder przeciwciałami fluorescencyjnie sprzężonymi anty-NeuN i anty-PAX6; Strategie bramkowania FANS i wskaźniki kontroli jakości w celu optymalizacji czułości i swoistości podczas sortowania oraz potwierdzania wzbogacenia astrocytów; oraz zalecane zamówienia na dalsze sekwencjonowanie transkryptomu i dostępności chromatyny w rozdzielczości zbiorczej lub SN. Protokół ten ma zastosowanie do nienekrotycznych, świeżo mrożonych, ludzkich próbek kory mózgowej z różnymi patologiami i zalecanym pośmiertnym pobraniem tkanek w ciągu 24 godzin.

Jądra komórkowe pobrano z utrwalonej przez szybkie zamrażanie świeżej (nieutrwalonej chemicznie) tkanki nowokory neocortex temporalnego, z czasem pobrania po śmierci wynoszącym 12 h. Po dysocjacji tkanki do postaci zawiesiny jąder, próbki inkubowano z przeciwciałami przeciwko NeuN, PAX6 i OLIG2, a następnie sortowano zgodnie z bramkowaniem przedstawionym na Rysunku 1 i Rysunku 2. Jądra komórkowe wyizolowano z populacji posortowanych NeuN+, PAX6+NeuN- oraz OLIG2+...

Opracowaliśmy metodę, która wzbogaca i izoluje ludzkie populacje astrocytów ze świeżo zamrożonej tkanki do wykorzystania w dalszych analizach molekularnych.

Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Protokół ten może pomóc naukowcom, którzy są zainteresowani badaniem funkcji molekularnej ludzkich astrocytów w ich rodzimej niszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na izolację i wzbogacenie określonego typu komórek, dorosłych astrocytów z dużych próbek ludzkiej tkanki mózgowej za pomocą sortowania jąder aktywowanych fluorescencją. Metodologia ta może być stosowana do izolowania innych typów komórek z ludzkiej kory nowej, takich jak neurony i komórki progenitorowe oligodendrocytów, przy użyciu innych odpowiednich przeciwciał sprzężonych z fluorescencyjną mocą.Rozpocznij sekcję około 200 do 400 miligramów tkanki ze świeżo zamrożonej próbki tkanki kory mózgowej dorosłego człowieka. Umieść tkankę w siedmiomililitrowym szklanym pojemniku na chusteczki zawierającym cztery mililitry lodowatego buforu do lizy na lodzie i zmiel tkankę około 50 razy. Przenieść homogenat do 12-mililitrowej probówki polipropylenowej do ultrawirówki.Użyj pięciomililitrowej pipety, aby dodać 6,5 mililitra lodowatego buforu sacharozy na dno probówki ultrawirówki, nie naruszając interfejsu między sacharozą a homogenatem tkankowym. Aby zebrać jądra, należy ultraodwirować lizat przez jedną godzinę

isolation-adult-human-astrocyte-populations-from-fresh-frozen-cortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie opisujemy metodę uzyskiwania czystej preparacji astrocytów od nowo narodzonych myszy.

Izolacja astrocytów: metoda uzyskiwania czystego przygotowania astrocytów korowych myszy

Film pokazuje prostą metodę hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych. Podczas hodowli, przy użyciu pożywek specyficznych dla astrocytów i hamowaniu przylegania komórek nieastrocytowych, metoda selektywnie hoduje astrocyty. Te hodowane astrocyty wykazują gwiaździstą morfologię z drobnymi wyrostkami.

Prosta technika izolacji i hodowli mysich astrocytów

Ten film demonstruje procedurę izolowania i sortowania jąder ze świeżo zamrożonej ludzkiej tkanki mózgowej za pomocą sortowania jąder aktywowanych fluorescencją (FANS), które umożliwia badanie różnych populacji komórek dla różnych zastosowań neurologicznych.

Izolowanie populacji komórek z tkanki mózgowej za pomocą sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Astrocyty zostały uznane za wszechstronne komórki uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu oraz naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Tutaj przedstawiamy szybką procedurę uzyskiwania czystych hodowli astrocytów myszy w celu zbadania biologii tej głównej klasy komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Opisany tutaj protokół AWESAM jest optymalny do hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych w szybki, prosty i tani sposób. Astrocyty AWESAM wykazują spontaniczną sygnalizację Ca2 +, morfologię i profile ekspresji genów podobne do astrocytów in vivo.

Hodowla mysich astrocytów podobnych do vivo przy użyciu szybkiego, prostego i niedrogiego protokołu AWESAM

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół generowania wysoce wzbogaconych kultur astrocytów pochodzących z różnych regionów ośrodkowego układu nerwowego myszy po urodzeniu i ich bezpośredniej konwersji w funkcjonalne neurony przez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Izolacja i bezpośrednie przeprogramowanie neuronów astrocytów myszy

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Ten protokół opisuje izolację oczyszczonych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, ułatwiając późniejsze zastosowania, takie jak analiza RNA i hodowla komórek. Zawiera szczegółowe metody i procedury dysocjacji komórek mające na celu poprawę zarówno jakości, jak i wydajności izolowanych komórek.

Izolacja czystych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do testów in vitro i badań transkryptomicznych

Poznaj metodę izolacji jąder astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania FANS. Technika umożliwia badania transkryptomiczne i epigenetyczne w zdrowej i chorej tkance mózgowej.

Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Przeglądaj więcej filmów