Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

Celem tej procedury jest pomiar aktywności enzymatycznej poszczególnych członków rodziny metylotransferazy białkowej argininy w komórkach. Aktywność mierzy się, określając poziom metylacji argininy i całkowity poziom białka biomarkerowego za pomocą ilościowego fluorescencyjnego western blot. Zaletą opisanej metody jest prosta wydajność w każdym laboratorium z możliwością hodowli komórkowej i fluorescencyjnego Western blot.

Szczegółowe wytyczne dotyczące biomarkerów, przeciwciał i związków inhibitorowych znajdują się w artykule. A tutaj opisaliśmy kluczowe kroki związane z procedurą eksperymentalną. Procedura jest pokazana dla formatu 24 dołków.

Najpierw przygotuj bufor do lizy, dodaj świeżo benzonazę i koktajl inhibitorów białka przed użyciem. Usuń wszystkie media z dołków. Umyj 100 mikrolitrami PBS i dodaj 60 mikrolitrów buforu do lizy do studzienki.

Inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, kołysząc płytkami w celu rozprowadzenia buforu do lizy na komórkach. Następnie dodaj trzy mikrolitry 20% SDS, aby uzyskać stężenie 1% i wymieszaj, delikatnie wstrząsając. Przenieś lizat do probówek Eppendorfa i trzymaj go na lodzie.

Określ stężenie białka w swoich próbkach za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA lub użyj innych metod, które tolerują 1% SDS w roztworze. Po dostosowaniu stężenia białka za pomocą buforu do lizy, aby było równe we wszystkich próbkach przy 20 mikrolitrach czterokrotnego buforu ładującego do 60 mikrolitrów lizatu komórkowego i podgrzewania w temperaturze 95 stopni przez pięć minut. Dodanie benzonazy do buforu do lizy szybko hydrolizuje kwasy nukleinowe, które zmniejszają lepkość lizatu komórkowego.

Lizaty z benzonazą nie są lepkie. Lizaty bez benzonazy mają dużą kulę lepkiego DNA, która nie osadza się podczas wirowania. Załaduj od pięciu do 20 mikrogramów całkowitego lizatu komórkowego dla białek histonowych i od 20 do 100 mikrogramów dla innych białek w gradientowym żelu białkowym od czterech do 12 bis-tris.

Wokół galaretki w mopach jako otaczający bufor przez około dwie godziny przy napięciu 100 woltów lub do momentu, gdy niebieski barwnik ładujący dotrze do dna żelu. Jeśli wykonujesz transfer na mokro, zmontuj kanapkę transferową w lodowatym buforze transferowym tris-glicyny. Aktywuj membranę PVDF poprzez zanurzenie w metanolu i zrównoważenie żelu w buforze transferowym przez 30 sekund przed montażem.

Ułóż gąbki, bibułę filtracyjną, membranę PVDF i żel zgodnie z instrukcjami producenta. Przenieś białka w buforze transferowym tris-glicyny pod napięciem 70 woltów przez jedną do półtorej godziny na lodzie. Po przeniesieniu inkubować błonę przez 30 minut w buforze blokującym.

Przepłukać buforem do przemywania i inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze czterech stopni. Następnego dnia przemyć membranę trzy razy przez pięć minut buforem do przemywania wodą, inkubować z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej i przemywać trzy razy przez pięć minut buforem do przemywania wodą. Umieść membranę stroną zadrukowaną do dołu na szklanej płytce fluorescencyjnego termowizora Western blot.

Przykryj gumowym arkuszem i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Odczyt sygnału przy 700 i 800 nanometrach. Po zakończeniu skanowania przejdź do obrazu i dostosuj sygnał 700 i 800 kanałów, aby wyraźnie zobaczyć pasma.

Tutaj sygnał 700-kanałowy pokazany na czerwono reprezentuje całkowity poziom białka, a sygnał 800-kanałowy pokazany na zielono reprezentuje poziomy białka metylowego. Następnie przejdź do analizy i wybierz medianę górnego i dolnego odczytu. Aby zmierzyć intensywność pasm, wybierz narzędzie Rysuj prostokąt i narysuj kształt wokół pasm, które chcesz określić ilościowo.

Przejdź do kształtów, w których znajdziesz intensywności 700 i 800 kanałów. Kolumna o nazwie sygnał podaje poziomy intensywności z odjętym tłem. Wyniki można skopiować bezpośrednio do pliku Excel.

Oto przykład przedstawiający analizę aktywności PRMT1 w komórkach po zahamowaniu za pomocą inhibitora PRMT typu pierwszego MS023. Aktywność PRMT1 mierzy się, określając asymetryczne poziomy dimetylacji histonu H4 argininy 3. W tym przypadku poziomy metylacji, zielone pasma spadają w sposób zależny od dawki, podczas gdy całkowite poziomy histonów w czerwonych pasmach pozostają niezmienione.

Aby określić związek IC50, należy wykreślić logarytm stężenia inhibitora w stosunku do asymetrycznych poziomów dimetylacji argininy-3 histonu H4 znormalizowanych do całkowitych poziomów histonów, a następnie przeprowadzić nieliniową analizę dopasowania. Opisana metoda pozwala na wiarygodne i powtarzalne podwójne wykrycie aktywności metylotransferazy białek w komórkach. Zaletą tej metody jest to, że wykorzystuje dobrze znaną metodologię Western blot, która jest dostępna dla laboratoriów akademickich i może być łatwo modyfikowana w zależności od wyposażenia laboratorium.

Szczegóły testu, w tym białka biomarkerowe, przeciwciała i dwa związki chemiczne dla każdego indywidualnego członka rodziny PRMT, znajdują się w artykule.