Name: Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj ilościową metodę badania aktywności metylotransferazy argininy białek w komórkach z wykorzystaniem fluorescencyjnego western blottingu. Protokół umożliwia niezawodne oznaczanie aktywności enzymatycznej PRMT1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Konsorcjum Genomiki Strukturalnej jest zarejestrowaną organizacją charytatywną (nr: 1097737), która otrzymuje fundusze od AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada za pośrednictwem Ontario Genomics Institute [OGI-196], UE i EFPIA poprzez Wspólne Przedsięwzięcie Inicjatywy Leków Innowacyjnych 2 [grant EUbOPEN 875510], Janssen, Merck KGaA (aka EMD w Kanadzie i USA), Pfizer, Takeda i Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].

1. Hodowla i posiewanie komórek
UWAGA: Hoduj komórki za pomocą zalecanej pożywki i rutynowo testuj pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą. Jako przykłady wybrano komórki HEK293T, MCF7 i C2C12, ponieważ te linie komórkowe zostały z powodzeniem wykorzystane w testach PRMT.
<ol>
	<li>Hodowla HEK293T, MCF7 i C2C12 w DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną (100 U mL-1) i streptomycyną (100 μg mL−1) w 10-centymetrowych naczyniach poddanych działaniu hodowli tkankowej (TC).</li>
	<li>W przypadku testu PRMT8 hoduj indukowane przez PRMT1 komórki HEK293T knockdown w pożywce zawierającej doksycyklinę (2 μg/ml) przez 3 dni przed rozpoczęciem testu.</li>
	<li>Aby pokryć komórki, wyjmij i wyrzuć nośnik z płytki.</li>
	<li>Dodać 10 ml PBS (bez jonów Ca+2 i Mg+2) do przepłukania komórek i wyrzucić roztwór.</li>
	<li>Dodać 1 ml trypsyny-EDTA (0,25%), inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie wyrzucić roztwór. Inkubować, aż komórki staną się okrągłe i oderwać się od płytki. W razie potrzeby dotknij płytki, aby odłączyć komórki. W przypadku komórek trudnych do trypsynizacji, takich jak C2C12, inkubować płytkę przez 1-2 minuty w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Unikaj ekspozycji komórek na roztwór trypsyny przez dłuższy czas (>10 min), ponieważ zmniejszy to żywotność komórek.</li>
	<li>Dodaj 1 ml podgrzanej pożywki do płytki i delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół, aby rozbić grudki komórek. Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml i dodaj 3-5 ml pożywki.</li>
	<li>Aby zmierzyć liczbę komórek, zmieszaj 10 μl komórek z 10 μl błękitu trypanowego i przenieś 10 μl do hemocytometru lub użyj dowolnej innej metody liczenia komórek.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki do zalecanej gęstości komórek i umieścić 500 μl / basenik w 24-dołkowych płytkach TC (Tabela 1). W przypadku testów endogennych (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 i PRMT9) przejdź do kroku 3.1.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórkowa
<ol>
	<li>W przypadku testów egzogennych (PRMT3, PRMT6, PRMT8) transfekować HEK293T komórki zalecaną ilością DNA (Tabela 2). HEK293T ogniwa są łatwe do transfekcji, więc można użyć dowolnego odczynnika do transfekcji, zgodnie z instrukcją producenta.</li>
</ol>
3. Leczenie złożone
UWAGA: Nie przekraczaj 0,1% końcowego stężenia dimetylosulfotlenku (DMSO) w pożywkach hodowlanych. Utrzymuj to samo stężenie DMSO w każdym dołku. Selektywne inhibitory PRMT (sondy chemiczne) i ich blisko spokrewnione nieaktywne analogi można znaleźć w tabeli 3.
<ol>
	<li>W przypadku testów endogennych (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 i PRMT9) usuń pożywkę z komórek i zastąp 500 μl pożywki ze związkiem lub samym DMSO (kontrola). 
	UWAGA: Zwykle potrzeba 2 dni, aby zaobserwować ponad 80% spadek poziomu metylacji R.</li>
	<li>W przypadku testów egzogennych (PRMT3, PRMT6, PRMT8) usunąć pożywkę 4 godziny po transfekcji, dodać 500 μl pożywki ze związkiem lub samym DMSO (kontrola) i inkubować przez 20-24 godziny.</li>
</ol>
4. Przygotowanie lizatu komórkowego
<ol>
	<li>Usuń wszystkie pożywki ze studzienek, przemyj 100 μl PBS w celu usunięcia pozostałości pożywki i dodaj 60 μl buforu do lizy (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 10 mM MgCl2, 0,5% Triton X-100, 12,5 U mL−1 benzonazy, kompletny koktajl inhibitorów proteazy wolny od EDTA) do każdej studzienki.
	<ol>
		<li>Inkubować przez mniej niż 1 minutę w temperaturze pokojowej, kołysząc płytką w celu rozprowadzenia buforu do lizy na komórkach. Następnie dodać 3 μl 20% w/v dodecylosiarczanu sodu (SDS) do końcowego stężenia 1% i wymieszać, delikatnie wstrząsając. Przenieś lizat do probówek do mikrowirówek i trzymaj go na lodzie. 
		UWAGA: Przed użyciem dodaj świeżo benzonazę i koktajl inhibitorów białka. Dodatek benzonazy szybko hydrolizuje kwasy nukleinowe, co zmniejsza lepkość lizatu komórkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczyć stężenie białka w próbkach za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA lub użyć innej metody, która toleruje 1% SDS w roztworze.
	<ol>
		<li>Dodać 2 μl lizatu i wzorców białkowych (0, 1, 2, 4 i 8 μg/ml BSA w buforze do lizy) do studzienek 96-dołkowej przezroczystej płytki.</li>
		<li>Wymieszać odczynnik A z odczynnikiem B w stosunku 50:1 i dodać 200 μl do dołka. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C i odczytać stopień absorpcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj stężenie białka za pomocą buforu do lizy, aby było równe we wszystkich próbkach.</li>
	<li>Dodać 20 μL 4x buforu ładującego do 60 μL lizatu komórkowego i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 min. Po denaturacji cieplnej lizaty mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
5. Analiza Western blot
<ol>
	<li>Załaduj 5-20 μg całkowitego lizatu komórkowego do analizy białek histonowych i 20-100 μg dla innych białek do 4-12% żelu białkowego Bis-Tris.</li>
	<li>Uruchom żel w buforze MOPS SDS (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS w/v, 1 mM EDTA, pH 7,7) przez około 2 godziny przy 100 V lub do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do dna żelu.</li>
	<li>W przypadku wykonywania transferu na mokro zmontuj kanapkę transferową w lodowatym buforze transferowym Tris-Glycine (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% v/v metanolu i 0,05% w/v SDS).
	<ol>
		<li>Umieść gąbki, bibułę filtracyjną, membranę PVDF i żel zgodnie z instrukcjami producenta. Aktywuj membranę PVDF poprzez nasączenie w metanolu i zrównoważenie żelu w buforze transferowym przez 30 s przed montażem. 
		UWAGA: Używaj zalecanej membrany Western Blotting PVDF, ponieważ ma ona niską autofluorescencję i nadaje się do białek o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak histony (Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś białka z żelu do membrany PVDF w buforze transferowym Tris-Glycine pod napięciem 70 V przez 1,5 godziny na lodzie.</li>
	<li>Zablokuj membranę na 30 minut w buforze blokującym (5% m/v mleka w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, PBS). Przepłukać buforem do przemywania (PBST: 0,1% v/v Tween-20 w PBS) i inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami w roztworze albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (5% BSA w PBST) przez noc w temperaturze 4 °C (Tabela 3). 
	UWAGA: W celu dłuższego przechowywania przefiltruj roztwór BSA, dodaj 0,02% w/v azydku sodu i utrzymuj w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć membranę 3 x 5 min za pomocą PBST. Następnie inkubować z kozimi przeciwciałami przeciwko królikom (IR800) i osłom (IR680) w zalecanym buforze blokującym (tabela materiałów, tabela 3) przez 30 minut w temperaturze pokojowej i przemywać 3 x 5 minut PBST.</li>
	<li>Odczyt sygnału na fluorescencyjnym obrazie western blot przy długości fali 800 i 700 nm. Najlepiej używać przyrządu, który umożliwia wyraźne obrazowanie silnych i słabych pasm na jednym obrazie z wysoką czułością i zakresem dynamiki, wysokim stosunkiem sygnału do szumu, ostrzeżeniem o osiągnięciu nasycenia obrazu, a także multipleksowaniem dwóch barw fluorescencyjnych w tym samym paśmie próbki.</li>
	<li>Określ intensywności pasma do analizy western blot za pomocą odpowiedniego oprogramowania do fluorescencyjnego obrazowania western.</li>
</ol>

<ol><li>Blanc, R. S., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+Methylation%3A+The+Coming+of+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Arginine Methylation: The Coming of Age.</a> Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).</li>
<li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li>
<li>Bedford, M. T., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+an+emerging+regulator+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation an emerging regulator of protein function.</a> Molecular Cell. 18 (3), 263-272 (2005).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> The Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).</li>
<li>Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+RGG%2FRG+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Defining the RGG/RG motif.</a> Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).</li>
<li>Dhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+major+Type+I+arginine+methyltransferase+PRMT1+causes+substrate+scavenging+by+other+PRMTs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs.</a> Science Reports. 3, 1311(2013).</li>
<li>Kaniskan, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potent%2C+selective+and+cell-active+allosteric+inhibitor+of+protein+arginine+methyltransferase+3+%28PRMT3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A potent, selective and cell-active allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3 (PRMT3).</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (17), 5166-5170 (2015).</li>
<li>Eram, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potent%2C+Selective%2C+and+Cell-Active+Inhibitor+of+Human+Type+I+Protein+Arginine+Methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Potent, Selective, and Cell-Active Inhibitor of Human Type I Protein Arginine Methyltransferases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 772-781 (2016).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Potent%2C+Selective%2C+and+Cell-Active+Dual+Inhibitor+of+Protein+Arginine+Methyltransferase+4+and+Protein+Arginine+Methyltransferase+6%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Potent, Selective, and Cell-Active Dual Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 4 and Protein Arginine Methyltransferase 6.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (19), 9124-9139 (2016).</li>
<li>Nakayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TP-064%2C+a+potent+and+selective+small+molecule+inhibitor+of+PRMT4+for+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">TP-064, a potent and selective small molecule inhibitor of PRMT4 for multiple myeloma.</a> Oncotarget. 9 (26), 18480-18493 (2018).</li>
<li>Bonday, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LLY-283%2C+a+Potent+and+Selective+Inhibitor+of+Arginine+Methyltransferase+5%2C+PRMT5%2C+with+Antitumor+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">LLY-283, a Potent and Selective Inhibitor of Arginine Methyltransferase 5, PRMT5, with Antitumor Activity.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (7), 612-617 (2018).</li>
<li>Szewczyk, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+PRMT7+links+arginine+monomethylation+to+the+cellular+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of PRMT7 links arginine monomethylation to the cellular stress response.</a> Nature Communications. 11 (1), 2396(2020).</li>
<li>Goulet, I., Gauvin, G., Boisvenue, S., Cote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+yields+protein+arginine+methyltransferase+1+isoforms+with+distinct+activity%2C+substrate+specificity%2C+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing yields protein arginine methyltransferase 1 isoforms with distinct activity, substrate specificity, and subcellular localization.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 33009-33021 (2007).</li>
<li>Siarheyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+allosteric+inhibitor+of+protein+arginine+methyltransferase+3%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">An allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3.</a> Structure. 20 (8), 1425-1435 (2012).</li>
<li>Stefansson, O. A., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CARM1+and+BAF155%3A+an+example+of+how+chromatin+remodeling+factors+can+be+relocalized+and+contribute+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CARM1 and BAF155: an example of how chromatin remodeling factors can be relocalized and contribute to cancer.</a> Breast Cancer Research. 16 (3), 307(2014).</li>
<li>Pesiridis, G. S., Diamond, E., Van Duyne, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pICLn+in+methylation+of+Sm+proteins+by+PRMT5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of pICLn in methylation of Sm proteins by PRMT5.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21347-21359 (2009).</li>
<li>Guccione, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H3R2+by+PRMT6+and+H3K4+by+an+mLL+complex+are+mutually+exclusive%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H3R2 by PRMT6 and H3K4 by an mLL complex are mutually exclusive.</a> Nature. 449 (7164), 933-937 (2007).</li>
<li>Yudao Shen,, L, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+First-in-class%2C+Highly+Selective+and+Cell-active+Allosteric+Inhibitor+of+Protein+Arginine+Methyltransferase+6+%28PRMT6%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A First-in-class, Highly Selective and Cell-active Allosteric Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 6 (PRMT6).</a> BioRxiv. , 1-21 (2020).</li>
<li>Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+interacting+with+protein+arginine+methyltransferase+8%3A+the+Ewing+sarcoma+%28EWS%29+protein+binds+independent+of+its+methylation+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins interacting with protein arginine methyltransferase 8: the Ewing sarcoma (EWS) protein binds independent of its methylation state.</a> Proteins. 72 (4), 1125-1137 (2008).</li>
<li>Lee, J., Sayegh, J., Daniel, J., Clarke, S., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT8%2C+a+new+membrane-bound+tissue-specific+member+of+the+protein+arginine+methyltransferase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PRMT8, a new membrane-bound tissue-specific member of the protein arginine methyltransferase family.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (38), 32890-32896 (2005).</li>
<li>Kim, J. D., Kako, K., Kakiuchi, M., Park, G. G., Fukamizu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWS+is+a+substrate+of+type+I+protein+arginine+methyltransferase%2C+PRMT8%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">EWS is a substrate of type I protein arginine methyltransferase, PRMT8.</a> International Journal of Molecular Medicine. 22 (3), 309-315 (2008).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT9+is+a+type+II+methyltransferase+that+methylates+the+splicing+factor+SAP145%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PRMT9 is a type II methyltransferase that methylates the splicing factor SAP145.</a> Nature Communications. 6, 6428(2015).</li>
<li>Rakow, S., Pullamsetti, S. S., Bauer, U. M., Bouchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+epigenome+functions+of+PRMTs+and+their+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assaying epigenome functions of PRMTs and their substrates.</a> Methods. 1175, 53-65 (2020).</li>
<li>Musiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+profiling+of+arginine+methylation+defines+PRMT5+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Proteomics profiling of arginine methylation defines PRMT5 substrate specificity.</a> Science Signaling. 12 (575), (2019).</li>
<li>Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+Computational+Approaches+for+the+Large-Scale+Analysis+of+Protein+Arginine+Methylation+by+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Biochemical and Computational Approaches for the Large-Scale Analysis of Protein Arginine Methylation by Mass Spectrometry.</a> Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).</li>
<li>Shishkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+CARM1+substrates+defines+enzyme+specificity+and+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global mapping of CARM1 substrates defines enzyme specificity and substrate recognition.</a> Nature Communications. 8, 15571(2017).</li>
<li>Pawlak, M. R., Banik-Maiti, S., Pietenpol, J. A., Ruley, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferase+I%3A+substrate+specificity+and+role+in+hnRNP+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferase I: substrate specificity and role in hnRNP assembly.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 87 (4), 394-407 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych ani innych sprzecznych interesów, które mogliby zadeklarować.

W tym miejscu opisano szczegółowe protokoły testów komórkowych dla członków rodziny PRMT, które wykorzystują fluorescencyjne metody western blott. Wybrano unikalne substraty, dla których zmiany metylacji argininy mogą być łatwo wykryte po indywidualnej utracie PRMT lub hamowaniu katalitycznym i nie mogą być kompensowane przez innych członków rodziny. Niektóre białka są metylowane przez wiele PRMT21,23, co sugeruje nakładanie się specyficzności substratowej, gdzie niektóre PRMT wnoszą tylko niewielką ilość znacznika komórkowego w danym substracie białkowym 24,25,26,27, na przykład zarówno PRMT8, jak i PRMT1 przyczyniają się do metylacji EWS. W związku z tym każdy test wymagał dokładnej walidacji substratów i przeciwciał z eksperymentami z knockdownem i/lub nadekspresją oraz dalszej walidacji za pomocą dobrze scharakteryzowanych selektywnych inhibitorów. Zidentyfikowano substraty specyficzne dla PRMT, dla których zmiany znacznika metylacji można było wykryć w ciągu 2-3 dni po utracie/zahamowaniu PRMT, aby uniknąć narastających skutków zmniejszonej żywotności i proliferacji komórek, które mogą pośrednio wpływać na poziomy znacznika metyloargininy. Chociaż udało się znaleźć unikalne podłoża dla PRMT1, 4, 5, 7 i 9; W przypadku PRMT3, 6 i 8 konieczne było zastosowanie podejścia opartego na wzmocnieniu funkcji. Kilka przeciwciał specyficznych dla argininy methyl zostało przetestowanych pod kątem różnych celów komórkowych, ale żadne z nich nie było w stanie wykryć znaczących zmian w ciągu 3 dni od knockdownu PRMT3 i PRMT6; W związku z tym opracowano testy biomarkerów przy użyciu enzymów ulegających ekspresji ektopowej wraz z katalitycznie nieaktywnymi mutantami, które posłużyły jako kontrola podstawowej metylacji substratów. PRMT8 jest bliskim homologiem PRMT1 i ma podobne preferencje dotyczące substratów. Ponieważ nie można było zidentyfikować selektywnego biomarkera PRMT8, opracowano test w komórkach knockdown PRMT1, w którym PRMT8 ulegał jednoczesnej ekspresji wraz z EWS. PRMT1 jest również głównym enzymem odpowiedzialnym za asymetryczną metylację H4R3, dlatego aby użyć H4R3me2a jako biomarkera do testów komórkowych PRMT3 i PRMT6, wybrano komórki o niskim podstawowym poziomie H4R3me2a, a jako kontrolę tła zastosowano katalitycznie nieaktywne mutanty. Chociaż preferowane są testy endogenne, testy egzogenne okazują się nieocenione w testowaniu siły komórkowej kilku selektywnych inhibitorów PRMT 7,8,9. Wraz z rosnącą wiedzą na temat biologii PRMT spodziewamy się udoskonalić testy poprzez znalezienie bardziej specyficznych białek biomarkerowych dla PRMT3, PRMT6 i PRMT8.
Stosowanie zwalidowanych przeciwciał i odpowiednich kontroli ma kluczowe znaczenie dla wydajności testu PRMT. Wszystkie zalecane tutaj przeciwciała zostały dokładnie zwalidowane przez eksperymenty z knockdownem i nadekspresją, jednak różnice między partiami, zwłaszcza w przypadku przeciwciał poliklonalnych, mogą nadal wpływać na ich działanie. Dlatego tak ważne jest stosowanie metod genetycznych i sond chemicznych wraz z ich ściśle powiązanymi kontrolami ujemnymi w celu potwierdzenia wiarygodności testu. Dodatkowo, w przypadku testów PRMT, które wymagają nadekspresji białka, kluczowe znaczenie ma użycie katalitycznie nieaktywnych mutantów wraz z białkiem typu dzikiego w celu określenia podstawowych poziomów metylacji.
Ten zbiór testów ilościowych do profilowania aktywności PRMT w komórkach może być szeroko przydatny dla społeczności naukowej, ponieważ można go szybko i łatwo wdrożyć przy minimalnym sprzęcie i ograniczonej wiedzy technicznej, obejmując jedynie podstawowe techniki hodowli komórek i fluorescencyjnego western blotting. Zalecane przeciwciała i sondy chemiczne dla PRMT mogą być również wykorzystywane do testów profilowania białek opartych na aktywności (ABPP) w celu ustalenia przydatności danej sondy ABPP, monitorowania zaangażowania celu i oceny efektów poza celem przy użyciu konkurencyjnego formatu ABPP. Omówione tutaj podejścia do opracowywania testów można również ekstrapolować na inne rodziny enzymów, takie jak lizynotransferazy białkowe i acetylotransferazy.

Metylacja argininy jest ważną modyfikacją potranslacyjną, która reguluje interakcje białko-białko i białko-RNA, odgrywając tym samym ważną rolę w różnych procesach komórkowych, takich jak splicing pre-mRNA, uszkodzenie DNA, odpowiedź transkrypcyjna i transdukcja za pośrednictwem czynnika wzrostu1,2. Arginina jest metylowana przez białkowe metylotransferazy argininy (PRMT), w wyniku czego powstaje monometylo arginina (Rme1), asymetryczna dimetyloarginina (Rme2a) lub symetryczna dimetyloarginina (Rme2s)3. W zależności od typu metylacji, PRMT dzieli się na trzy grupy: Typ I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 i 8), które katalizują dimetylację mono- i asymetryczną; typ II (PRMT5 i PRMT9), które katalizują dimetylację mono- i symetryczną; i Typ III (PRMT7), który może tylko monometylować argininę3.
Ze względu na rosnącą liczbę dostępnych na rynku przeciwciał specyficznych dla metylacji argininy, aktywność PRMT może być mierzona za pomocą western blot. Western blot oparty na fluorescencji jest techniką preferowaną w stosunku do detekcji chemiluminescencyjnej ze względu na większy zakres dynamiki i liniowość, wyższą czułość i możliwość multipleksowania4. Aby określić ilościowo poziomy metylacji białek, wymagana jest normalizacja sygnału metylacji do całkowitych poziomów białka. Wybierając przeciwciała dla białka całkowitego i metylowanego wyhodowanego u różnych gatunków gospodarzy (np. myszy i królika), można zastosować przeciwciała drugorzędowe znakowane różnymi fluoroforami i określić sygnał dla obu przeciwciał w tym samym paśmie próbki. Przeciwciała metylo-argininowe zostały opracowane w celu identyfikacji i scharakteryzowania monometylowanych, asymetrycznych lub symetrycznie dimetylowanych białek, w których metyloarginina występuje w określonym kontekście. Ponieważ większość motywów bogatych w glicynę i argininę metylanu PRMT w ich substratach5, wyniesiono kilka przeciwciał dla peptydów zawierających monometylowe lub asymetryczne, symetryczne powtórzenia dimetylo-argininy-glicyny, takie jak odpowiednio D5A12, ASYM24 lub ASYM25 i SYM11. Inne przeciwciała metylo-argininowe zostały wygenerowane przeciwko bibliotece peptydów zawierającej asymetryczną, symetryczną dimetylo- i monometyloargininę w powtarzalnym kontekście, ułatwiając wykrycie metylo-argininy w tych konkretnych kontekstach6. Rośnie również liczba przeciwciał, które rozpoznają specyficzny znacznik argininy na pojedynczym białku, co umożliwia selektywne wykrywanie metylacji, takich jak histon H4R3me2a lub BAF155-R1064me2a.
Istnieje kilka dostępnych na rynku inhibitorów PRMT, które mogą być używane jako narzędzia do testów komórkowych PRMT. Jednak, nie wszystkie z nich są dokładnie scharakteryzowane dla selektywności i efektów off-target, a niektóre powinny być stosowane z ostrożnością. Konsorcjum Structural Genomic Consortium, we współpracy z laboratoriami akademickimi i partnerami farmaceutycznymi, opracowało dobrze scharakteryzowane silne, selektywne i przepuszczalne dla komórek inhibitory PRMT (sondy chemiczne), które mogą być stosowane bez ograniczeń przez społeczność naukową. Informacje na temat tych inhibitorów można znaleźć na stronach https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics i https://www.chemicalprobes.org/. Sondy chemiczne to małocząsteczkowe inhibitory o IC in vitro 50 lub Kd < 100 nM, ponad 30-krotnej selektywności w stosunku do białek z tej samej rodziny i znaczącej aktywności komórkowej przy 1 μM. Dodatkowo, każda sonda chemiczna ma bliski analog chemiczny, który jest nieaktywny wobec zamierzonego celu7,8,9,10,11,12.
Celem tego protokołu jest pomiar aktywności komórkowej poszczególnych członków rodziny PRMT za pomocą metody fluorescencyjnej western blot. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe informacje na temat zwalidowanych biomarkerów testowych, przeciwciał i silnych inhibitorów aktywnych komórek, a także cenne strategie skutecznego wdrożenia testu.

<table><tbody><tr><td>Naczynia TC 10 cm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki TC</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 12% Bis-Tris Żele białkowe</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF Amersham Hybond P</td><td>Millipore-Sigma</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>anty-Asym 24</td><td>Millipore-Sigma</td><td>07-414</td><td></td></tr><tr><td>anty-Asym 25</td><td>Millipore-Sigma</td><td>09-814</td><td></td></tr><tr><td>anty-B-aktyna</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anty-BAF155</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-32763</td><td></td></tr><tr><td>anty-BAF155-R1064me2a</td><td>Millipore-Sigma</td><td>ABE1339</td><td></td></tr><tr><td>anty-FLAG (#, 1:5000)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>anty-GFP</td><td>Clontech</td><td>632381</td><td></td></tr><tr><td>anty-H3</td><td>Abcam</td><td>ab10799</td><td></td></tr><tr><td>anty-H3R2me2a</td><td>Millipore-Sigma</td><td>04-848</td><td></td></tr><tr><td>anty-H3R8me2a</td><td>Rockland</td><td>600-401-I67</td><td></td></tr><tr><td>anty-H4</td><td>Abcam</td><td>ab174628</td><td></td></tr><tr><td>anty-H4R3me2a</td><td>Aktywny motyw</td><td>39705</td><td></td></tr><tr><td>anty-HSP/HSC70</td><td>Enzo</td><td>ADI-SPA-820</td><td></td></tr><tr><td>anty-PRMT1</td><td>Millipore-Sigma</td><td>07-404</td><td></td></tr><tr><td>anty-PRMT3</td><td>Abcam</td><td>ab191562</td><td></td></tr><tr><td>anty-PRMT4</td><td>Bethyl</td><td>#A300-421A</td><td></td></tr><tr><td>anty-PRMT5</td><td>Abcam</td><td>ab109451</td><td></td></tr><tr><td>anty-PRMT6</td><td>Abcam</td><td>ab47244</td><td></td></tr><tr><td>anty-PRMT7</td><td>Abcam</td><td>ab179822</td><td></td></tr><tr><td>anty-Rme1</td><td>CST</td><td>8015</td><td></td></tr><tr><td>anty-Rme2a</td><td>CST</td><td>13522</td><td></td></tr><tr><td>anty-Rme2s</td><td>CST</td><td>13222</td><td></td></tr><tr><td>anty-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)</td><td></td><td>09-814</td><td></td></tr><tr><td>anty-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)</td><td>Abcam</td><td>ab56800</td><td></td></tr><tr><td>anty-SAP145-R508me2s uprzejmy</td><td></td><td></td><td>prezent od dr Yanzhong Yanga, Beckman Research Institute of City of Hope</td></tr><tr><td>anty-SmBB'</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-130670</td><td></td></tr><tr><td>benzonaza</td><td></td><td></td><td>WYPRODUKOWANO WE WŁASNYM</td></tr><tr><td>ZAKRESIE BSA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td></td><td></td><td>prezent od dr Stephane'a Richarda, McGill University</td></tr><tr><td>cOmkompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Millipore-Sigma</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM Bisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Bioshop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>osł anty-mysz IgG-IR680</td><td>Licor</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>doksycyklina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Żubel</td><td>80150</td><td></td></tr><tr><td>glicyna</td><td>Bioshop</td><td>GLN002.5</td><td></td></tr><tr><td>kozioł-anty-królik IgG-IR800</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td>prezent od dr Sama Benchimola, York</td></tr><tr><td>University Image Studio Software ver 5.2</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor ładowania: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MCF7</td><td></td><td>ATCC&reg; HTB-22&handel;</td><td></td></tr> Można również użyć <tr><td>bufora blokującego NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS ThermoFisher</td><td>Scientiffic</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (rozcieńczony 4 x z PBST)</td>Można również użyć bufora blokującego <td>Licor</td><td>927-40000</td><td>Intercept (PBS) # 927-70001</td></tr><tr><td>System obrazowania Odyssey CLX</td><td>Numer modelu Licor</td><td>9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS (hodowla tkankowa)</td><td>Żubr</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>PBS (western blot)</td><td>Bioshop</td><td>PBS405.4</td><td></td></tr><tr><td>penstrep</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1</td><td></td></tr><tr><td>odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td></td></tr><tr><td>TC20 automatyczny licznik komórek</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (0,25%)</td><td>Żubr</td><td>325-043-EL</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bioshop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>Tritton X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td></td></tr><tr><td>trypan niebieski</td><td>GIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510.500</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

Quantitative Methods to Study Protein Arginine Methyltransferase 1-9 Activity in Cells

Metylotransferazy białkowe (PRMT) katalizują transfer grupy metylowej do reszt argininy białek substratowych. Rodzina PRMT składa się z dziewięciu członków, którzy mogą monometylować lub symetrycznie/asymetrycznie dimetylanować reszty argininy. Dostępnych jest kilka przeciwciał rozpoznających różne typy metylacji argininy różnych białek; dostarczając w ten sposób narzędzi do opracowywania testów biomarkerów aktywności PRMT. Testy oparte na przeciwciałach PRMT są trudne ze względu na nakładające się substraty i specyficzność przeciwciał opartych na motywach. Omówiono te zagadnienia oraz zestaw eksperymentalny do badania metylacji argininy wnoszonej przez poszczególne PRMT. Dzięki starannemu doborowi reprezentatywnych substratów, które są biomarkerami dla ośmiu z dziewięciu PRMT, zaprojektowano panel testów aktywności PRMT. W tym miejscu przedstawiono protokoły testów komórkowych ilościowo mierzących aktywność enzymatyczną poszczególnych członków rodziny PRMT w komórkach. Zaletą opisanych metod jest ich proste działanie w każdym laboratorium z możliwością hodowli komórkowej i fluorescencyjnego western blot. Specyficzność substratu i niezawodność wybranego przeciwciała zostały w pełni zwalidowane za pomocą podejść do knockdownu i nadekspresji. Oprócz szczegółowych wytycznych dotyczących oznaczania biomarkerów i przeciwciał przedstawiono również informacje na temat stosowania zbierania związków z narzędzi do wykrywania PRMT za pomocą inhibitora.

Te protokoły dostarczają metodologii używanej do oceny aktywności enzymatycznej poszczególnych członków rodziny białkowej metylotransferazy argininowej (PRMT) w komórkach. Opisano szczegółowe wytyczne dotyczące oceny aktywności PRMT z wykorzystaniem biomarkerów endogennych i egzogennych, przeciwciał rozpoznających metylo-argininę oraz związków narzędziowych inhibitorów.

Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

Protein methyltransferases (PRMTs) catalyze the transfer of a methyl group to arginine residues of substrate proteins. The PRMT family consists of nine ...

Celem tej procedury jest pomiar aktywności enzymatycznej poszczególnych członków rodziny metylotransferazy białkowej argininy w komórkach. Aktywność mierzy się, określając poziom metylacji argininy i całkowity poziom białka biomarkerowego za pomocą ilościowego fluorescencyjnego western blot. Zaletą opisanej metody jest prosta wydajność w każdym laboratorium z możliwością hodowli komórkowej i fluorescencyjnego Western blot.Szczegółowe wytyczne dotyczące biomarkerów, przeciwciał i związków inhibitorowych znajdują się w artykule. A tutaj opisaliśmy kluczowe kroki związane z procedurą eksperymentalną. Procedura jest pokazana dla formatu 24 dołków.Najpierw przygotuj bufor do lizy, dodaj świeżo benzonazę i koktajl inhibitorów białka przed użyciem. Usuń wszystkie media z dołków. Umyj 100 mikrolitrami PBS i dodaj 60 mikrolitrów buforu do lizy do studzienki.Inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, kołysząc płytkami w celu rozprowadzenia buforu do lizy na komórkach. Następnie dodaj trzy mikrolitry 20% SDS, aby uzyskać stężenie 1% i wymieszaj, delikatnie wstrząsając. Przenieś lizat do probówek Eppendorfa i trzymaj go na lodzie.Określ stężenie białka w swoich próbkach za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA lub użyj innych metod, które tolerują 1% SDS w roztworze. Po dostosowaniu stężenia białka za pomocą buforu do lizy, aby było równe we wszystkich próbkach przy 20 mikrolitrach czterokrotnego buforu ładującego do 60 mikrolitrów lizatu komórkowego i podgrzewania w temperaturze 95 stopni przez pięć minut. Dodanie benzonazy do buforu do lizy szybko hydrolizuje kwasy nukleinowe, które zmniejszają lepkość lizatu komórkowego.Lizaty z benzonazą nie są lepkie. Lizaty bez benzonazy mają dużą kulę lepkiego DNA, która nie osadza się podczas wirowania. Załaduj od pięciu do 20 mikrogramów całkowitego lizatu komórkowego dla białek histonowych i od 20 do 100 mikrogramów dla innych białek w gradientowym żelu białkowym od czterech do 12 bis-tris.Wokół galaretki w mopach jako otaczający bufor przez około dwie godziny przy napięciu 100 woltów lub do momentu, gdy niebieski barwnik ładujący dotrze do dna żelu. Jeśli wykonujesz transfer na mokro, zmontuj kanapkę transferową w lodowatym buforze transferowym tris-glicyny. Aktywuj membranę PVDF poprzez zanurzenie w metanolu i zrównoważenie żelu w buforze transferowym przez 30 sekund przed montażem.Ułóż gąbki, bibułę filtracyjną, membranę PVDF i żel zgodnie z instrukcjami producenta. Przenieś białka w buforze transferowym tris-glicyny pod napięciem 70 woltów przez jedną do półtorej godziny na lodzie. Po przeniesieniu inkubować błonę przez 30 minut w buforze blokującym.Przepłukać buforem do przemywania i inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze czterech stopni. Następnego dnia przemyć membranę trzy razy przez pięć minut buforem do przemywania wodą, inkubować z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej i przemywać trzy razy przez pięć minut buforem do przemywania wodą. Umieść membranę stroną zadrukowaną do dołu na szklanej płytce fluorescencyjnego termowizora Western blot.Przykryj gumowym arkuszem i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Odczyt sygnału przy 700 i 800 nanometrach. Po zakończeniu skanowania przejdź do obrazu i dostosuj sygnał 700 i 800 kanałów, aby wyraźnie zobaczyć pasma.Tutaj sygnał 700-kanałowy pokazany na czerwono reprezentuje całkowity poziom białka, a sygnał 800-kanałowy pokazany na zielono reprezentuje poziomy białka metylowego. Następnie przejdź do analizy i wybierz medianę górnego i dolnego odczytu. Aby zmierzyć intensywność pasm, wybierz narzędzie Rysuj prostokąt i narysuj kształt wokół pasm, które chcesz określić ilościowo.Przejdź do kształtów, w których znajdziesz intensywności 700 i 800 kanałów. Kolumna o nazwie sygnał podaje poziomy intensywności z odjętym tłem. Wyniki można skopiować bezpośrednio do pliku Excel.Oto przykład przedstawiający analizę aktywności PRMT1 w komórkach po zahamowaniu za pomocą inhibitora PRMT typu pierwszego MS023. Aktywność PRMT1 mierzy się, określając asymetryczne poziomy dimetylacji histonu H4 argininy 3. W tym przypadku poziomy metylacji, zielone pasma spadają w sposób zależny od dawki, podczas gdy całkowite poziomy histonów w czerwonych pasmach pozostają niezmienione.Aby określić związek IC50, należy wykreślić logarytm stężenia inhibitora w stosunku do asymetrycznych poziomów dimetylacji argininy-3 histonu H4 znormalizowanych do całkowitych poziomów histonów, a następnie przeprowadzić nieliniową analizę dopasowania. Opisana metoda pozwala na wiarygodne i powtarzalne podwójne wykrycie aktywności metylotransferazy białek w komórkach. Zaletą tej metody jest to, że wykorzystuje dobrze znaną metodologię Western blot, która jest dostępna dla laboratoriów akademickich i może być łatwo modyfikowana w zależności od wyposażenia laboratorium.Szczegóły testu, w tym białka biomarkerowe, przeciwciała i dwa związki chemiczne dla każdego indywidualnego członka rodziny PRMT, znajdują się w artykule.

quantitative-methods-to-study-protein-arginine-methyltransferase-1-9

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metylacja argininy białek, katalizowana przez klasę enzymów, tj. metylotransferazy białkowe argininy (PRMT), to proces enzymatycznego dodawania grup metylowych do arginin w białkach. Test metylacji in vitro jest najbardziej wiarygodnym narzędziem do oceny stanu metylacji znanych lub nowych substratów PRMT.

Metody in vitro Test metylacji do badania metylacji białek argininy

Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

Niniejszy raport opisuje test enzymatyczny in vitro do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy przy użyciu ekstraktów z komórek Leishmania. Test ten opiera się na przeniesieniu radioaktywnej grupy metylowej z S-[metylo-3] H]adenozylo-L-metioniny do endogennej fosfatydyloetanoloaminy.

In vitro Test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy

Tutaj prezentujemy bezstronną kwantyfikację specyficznej dla miejsca acetylacji białek i/lub zajętości sukcynylacji (stechiometria) całego proteomu poprzez analizę ratiometryczną endogennych modyfikacji modyfikacji wprowadzonych po ilościowym acylowaniu chemicznym przy użyciu stabilnych bezwodników znakowanych izotopami. W połączeniu ze spektrometrią mas akwizycji niezależnym od wrażliwych danych, uzyskuje się dokładne pomiary zajętości obiektu.

Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych

W tym badaniu zwiększyliśmy możliwości analizy danych w eksperymencie DARTS, monitorując zmiany w stabilności białek i szacując powinowactwo interakcji białko-ligand. Oddziaływania można wykreślić na dwie krzywe: krzywą proteolityczną i krzywą zależności od dawki. Jako przykładowy przypadek posłużyliśmy się oddziaływaniem mTOR-rapamycyna.

Półilościowy test stabilności docelowej reagujący na powinowactwo do leków (DARTS) do badania interakcji Rapamycyna/mTOR

Tutaj opisany jest test in vitro bez przeciwciał do bezpośredniej analizy aktywności metylotransferazy na syntetycznym lub transkrybowanym in vitro RNA.

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie i ilościowy pomiar wolnych i związanych z białkami argininy i metylo-arginin za pomocą spektroskopii 1H-NMR.

Badanie metylomu argininy za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Szybkie i dokładne testy chemiczne do badań przesiewowych pod kątem określonych inhibitorów są ważnym narzędziem w arsenale rozwoju leków. Tutaj przedstawiamy skalowalny test chemiczny acetylu do pomiaru hamowania aktywności acetylacji HAT1.

Test chemiczny Acetyl-Click do pomiaru acetylacji acetylotransferazy histonowej 1

Poznaj ilościową metodę badania aktywności metylotransferazy argininy białek w komórkach z wykorzystaniem fluorescencyjnego western blottingu. Protokół umożliwia niezawodne oznaczanie aktywności enzymatycznej PRMT1.

Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

Przeglądaj więcej filmów