Name: Zastosowanie hodowli narządów typu Trowell do badania regulacji komórek macierzystych zęba (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Poznaj metodę hodowli narządów typu Trowell do badania komórek macierzystych zęba myszy. Technika umożliwia obserwację zachowań komórek w niszy oraz testowanie czynników regulujących ich przetrwanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez Fundację Jane i Aatos Erkko.

Ten protokół obejmuje wykorzystanie zwierząt, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisje Etyczne ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami oraz Obiekt dla Zwierząt na Uniwersytecie w Helsinkach.
1. Przygotowanie naczynia do hodowli organów
<ol>
	<li>Wszystkie procedury należy wykonywać w okapie z przepływem laminarnym. Oczyść powierzchnie robocze 70% etanolem i używaj autoklawowanych szklanych narzędzi i roztworów. Sterylizuj nożyczki i inny metalowy sprzęt w sterylizatorze z kulkami szklanymi.</li>
	<li>Przygotuj filtry normalnie przechowywane w 70% etanolu, myjąc je trzy razy w 1x PBS, aby usunąć etanol (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Pokrój filtry na prostokątne kawałki (3 x 3-5 x 5 mm). 
	UWAGA: Umyte kawałki filtra można przechowywać przez kilka dni w 1x PBS w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną (1:1 DMEM:F12 uzupełniony 1% [v/v] 200 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy w 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/ml kwasu askorbinowego i 0,2% [v/v] penicyliny [10 000 j.m./ml] i streptomycyny [10,000 μg/ml]). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieść metalowe siatki o średnicy 30 mm (z otworami o średnicy 1-2 mm, które umożliwiają obrazowanie tkanek) na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Dodaj wystarczającą ilość mediów, aby dotrzeć do powierzchni siatki bez wytwarzania pęcherzyków powietrza. Przygotowane naczynie hodowlane należy wstępnie ogrzać w temperaturze 37 °C, aż tkanka zostanie wyizolowana i będzie gotowa do hodowli (w standardowym inkubatorze o zawartości 5%CO2 i wilgotności 90%-95%).</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie siekacza i izolacja bliższego końca
<ol>
	<li>Uśmiercaj zwierzęta zgodnie z zatwierdzonym protokołem opieki nad zwierzętami.</li>
	<li>Odetnij głowę myszy i przeprowadź sekcję żuchwy. Aby to zrobić, najpierw usuń skórę, aby odsłonić żuchwę i przetnij mięśnie żwaczy, aby oddzielić ją od szczęki i reszty głowy.</li>
	<li>Po odizolowaniu żuchwy usuń język i jak najwięcej tkanki miękkiej.</li>
	<li>Zbierz wszystkie żuchwy i trzymaj je na szalce Petriego zawierającej PBS na lodzie, ponieważ zwiększa to żywotność tkanek.</li>
	<li>Przenieść jedną żuchwę na szklaną szalkę Petriego i użyć jednorazowych igieł podskórnych o sile 20/26 G do wypreparowania siekacza pod mikroskopem stereoskopowym. Podziel żuchwę w linii środkowej, przecinając spojenie. Oczyść tkankę miękką i mięśniową z powierzchni kości, aby uzyskać lepszą wizualizację. 
	UWAGA: Szklana szalka Petriego jest niezbędna, ponieważ nie stępi to igieł.</li>
	<li>Żuchwy uzyskane od zwierząt w wieku poniżej 10 dni są bardziej miękkie i kruche, dlatego należy używać jednorazowych igieł podskórnych 20/26 G, aby otworzyć każdą połowę żuchwy wzdłużnie, aby odsłonić ząb siekacza. W przypadku myszy starszych niż 10 dni użyj pęsety, aby chwycić żuchwę i złamać kość, aby odsłonić ząb.</li>
	<li>Delikatnie odłącz siekacz od otaczającej kości i odetnij bliższy koniec, w którym znajduje się pętla szyjna.</li>
	<li>Odetnij bliższy koniec i usuń zmineralizowane szkliwo i macierz zębiny.</li>
	<li>Zebrane proksymalne końce należy przechowywać w PBS firmy Dulbecco na lodzie, aż będą gotowe do hodowli.</li>
</ol>
3. Kultura
<ol>
	<li>Ostrożnie umieść prostokąt filtra na górze siatki we wstępnie podgrzanym naczyniu hodowlanym.</li>
	<li>Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby prawidłowo zorientować kawałki tkanki.</li>
	<li>Umieścić w standardowym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 90%-95%.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co drugi dzień i zastępuj świeżą, ostrożnie unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Monitoruj wzrost tkanek i rób codzienne zdjęcia za pomocą kamery dołączonej do mikroskopu stereoskopowego.</li>
</ol>
4. Dodawanie rozpuszczalnych czynników do kultury
<ol>
	<li>Uzupełnij pożywkę hodowlaną o rozpuszczalne czynniki i cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania, aby zbadać ich wpływ na regulację SCs. 
	UWAGA: Protokół podawania dowolnej cząsteczki (czynniki wzrostu, cząsteczki sygnałowe, przeciwciała blokujące, związki farmakologiczne, takie jak inhibitory lub aktywatory, wektory itp.) zależy od jej okresu półtrwania i rozpuszczalności. Parametry te określają również odpowiednią kontrolę, która ma być zastosowana.</li>
</ol>
5. Analizy molekularne i histologiczne
<ol>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj lodowaty metanol do tkanek, aby zapobiec oderwaniu się od filtrów.</li>
	<li>Pozostaw metanol na 5 minut.</li>
	<li>Przenieść filtry przenoszące eksplantaty tkanek do probówek do pobierania próbek.</li>
	<li>Utrwalić eksplantaty w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 10-24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z ustalonymi protokołami przetwarzania histologicznego (parafina, mrożone itp.) lub barwienia immunologicznego.</li>
</ol>
6. Kultura plastrów tkanek
UWAGA: Istnieje kilka odmian tego protokołu, które są równie skuteczne i są kwestią osobistego wyboru, w zależności od szybkości i umiejętności użytkownika. Odnoszą się one do buforu używanego do zbierania i utrzymywania żywotności tkanek. W tym celu można zastosować bufor Krebsa, PBS uzupełniony 2% glukozą i antybiotykami lub PBS. W przypadku stosowania buforu Krebsa, należy go przygotować 1 dzień wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Przed eksperymentem należy przygotować 4%-5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia, rozpuszczając 2-2,5 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 50 ml wrzącej 2% glukozy/PBS, po czym roztwór należy umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C.</li>
	<li>Ustaw wibratom, przemyj 70% etanolem i napełnij lodowatym 2% glukozą/PBS uzupełnionym antybiotykami (100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny).</li>
	<li>Wypreparuj proksymalne końce siekacza i zbierz je w lodowatym 2% glukozie/PBS uzupełnionym antybiotykami.</li>
	<li>Umieść jeden proksymalny koniec siekacza w formie zawierającej 4%-5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia. Pod mikroskopem stereoskopowym ustaw kawałek w pożądanym kierunku i pozostaw na lodzie, aby agaroza stwardniała.</li>
	<li>Przytnij stwardniały blok agarozy i umieść go w wibratomie. Pokrój grube plastry (150-300 μm).</li>
	<li>Zbierz plastry na szalce Petriego zawierającej lodowato 2% glukozy/PBS uzupełnionej antybiotykami.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki przenieś grube plastry na prostokąt filtra umieszczony na wstępnie podgrzanej siatce przygotowanej jak w sekcji 1.3.</li>
	<li>Inkubuj grube plastry w inkubatorze i kontynuuj obrazowanie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>

<ol><li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li>
<li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li>
<li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%2B+stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li>
<li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li>
<li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li>
<li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
<li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li>
<li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li>
<li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+limits+tooth+number%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li>
<li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li>
<li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues%3A+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li>
<li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li>
<li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Luminescence%22%5BJournal%5D)">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li>
<li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).</li>
<li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Hodowla narządów in vitro jest szeroko stosowana do badania potencjału indukcyjnego i interakcji nabłonkowo-mezenchymalnych, które rządzą wzrostem i morfogenezą narządów. Laboratorium Thesleff zademonstrowało, w jaki sposób można zaadaptować modyfikację Saxéna hodowli narządów typu Trowella i wykorzystać ją do badania rozwoju zębów14. Powtarzalne warunki i postęp w dziedzinie reporterów fluorescencyjnych sprawiły, że jest to przydatna metoda monitorowania morfogenezy zębów i odrębnych pop...

Siekacze myszy rosną nieprzerwanie dzięki zachowaniu przez całe życie komórek macierzystych (SC), które wspierają nieustanną produkcję składników zębów. Należą do nich między innymi nabłonkowe SC, które generują ameloblasty wytwarzające szkliwo, oraz mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), które generują odontoblasty wytwarzające zębinę, między innymi1. Nabłonkowe SC w stale rosnących siekaczach zostały początkowo zidentyfikowane jako komórki zachowujące etykietę2,3 i od tego czasu wykazano, że wyrażają wiele dobrze znanych genów macierzystych, w tym Sox24. Komórki te mają cechy wspólne z nabłonkowymi SC w innych narządach i znajdują się w niszy SC zwanej pętlą szyjną znajdującej się po wargowej stronie siekacza. Wnęka jest dynamiczną jednostką składającą się z komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej, które kontrolują aktywność SC5. Badania nad śledzeniem linii wykazały, że nabłonkowe SC Sox2+ mogą regenerować cały przedział nabłonkowy zęba i że mają kluczowe znaczenie dla tworzenia zębów sukcesyjnych6,7. MSCs z potencjałem naprawczym lub regeneracyjnym zębiny są w dużej mierze rekrutowane z zewnątrz narządu przez naczynia krwionośne i nerwy8,9,10,11, zapewniając zatem odpowiedni model do badania rekrutacji, migracji i zakwaterowania populacji MSC.
Badanie SCs in vivo nie zawsze jest wykonalne, ponieważ wiele manipulacji genetycznych i/lub farmakologicznych może wpływać na homeostazę narządów i/lub mieć śmiertelne konsekwencje. W związku z tym hodowla narządów stanowi doskonałe narzędzie do badania regulacji SC i ich nisz in vitro. System hodowli narządów, który wykorzystuje metalową siatkę, został początkowo opracowany przez Trowell12 do badania rozwoju narządów i został następnie zmodyfikowany przez Saxen13 do badania sygnałów indukcyjnych w rozwoju nerek. Od tego czasu ta metoda in vitro, polegająca na hodowli całego narządu lub jego części, jest z powodzeniem stosowana w różnych dziedzinach. W dziedzinie rozwoju zębów metoda ta jest szeroko stosowana do badania interakcji nabłonkowo-mezenchymalnych, które rządzą rozwojem zębów14 i tworzeniem zębów sukcesyjnych15. Prace laboratorium Thesleff wykazały przydatność tego systemu do czasowej analizy wzrostu i morfogenezy zębów, do analizy wpływu różnych cząsteczek i czynników wzrostu na wzrost zębów oraz do poklatkowego obrazowania na żywo rozwoju zębów16,17. Ostatnio metoda ta została wykorzystana do zbadania regulacji SC siekaczy i ich niszy18,19, co jest szczegółowo opisane tutaj.

<table><tbody><tr><td>Plastikowe strzykawki</td><td></td><td></td><td></td>1 ml</tr><tr><td>Jednorazowe igły podskórne o rozmiarze 20/26</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14287</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Nożyczki</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>F-12</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS Ameryka Południowa (CE)</td><td>LifeTechn.</td><td>10270106</td><td>podzielić na porcje, przechowywać w temperaturze -20&deg; C</td></tr><tr><td>Sterylizator z kulkami szklanymi, Steri 250 Second-Sterilizer</td><td>Simon Keller Ltd</td><td>4AJ-6285884</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-1 (200 mM dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm średnicy</td><td>MerckMillipore</td><td>VCTP02500</td><td>Przechowywać w 70% etanolu w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Kwas L-askobinowy</td><td>Sigma</td><td>A4544-25g</td><td>rozcieńczony 100 mg / ml w MilliQ, filtr stryrylowany i podzielony na 20&mu; l alikwoty, przechowywać w ciemności, -20&deg; C</td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>TopVision</td><td>R0801</td><td></td></tr><tr><td>Siatki metalowe</td><td></td><td></td><td>Dostępne na rynku lub wykonane samodzielnie z siatki ze stali nierdzewnej (odporne na korozję, rozmiar oczek 0,7 mm). Wytnij krążek o średnicy około 30 mm i zegnij krawędzie, aby uzyskać 3 mm wysokości. Użyj gwoździ do zrobienia otworów.</td></tr><tr><td>Mikro kleszcze</td><td>Medicon</td><td>07.60.03</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000U/ml) sol.</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego, szkło sodowo-wapniowe</td><td>DWK Nauki Przyrodnicze</td><td>9170442</td><td></td></tr><tr><td>Petridish 35 mm, z odpowietrznikiem</td><td>Duran</td><td>237554008</td><td></td></tr><tr><td>Petridish 90 mm, bez odpowietrznika klasyczne</td><td>Thermo Fisher</td><td>101RT/C</td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie hodowli narządów typu trowell do badania regulacji komórek macierzystych zęba

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Rozwój, funkcja i regeneracja organów zależą od komórek macierzystych, które znajdują się w odrębnych przestrzeniach anatomicznych zwanych niszami komórek macierzystych. Stale rosnący siekacz myszy stanowi doskonały model do badania komórek macierzystych specyficznych dla tkanki. Komórki macierzyste siekacza specyficzne dla tkanki nabłonkowej znajdują się na bliższym końcu zęba w niszy zwanej pętlą szyjną. Zapewniają ciągły napływ komórek, aby zrównoważyć ciągłe ścieranie samoostrzącej się końcówki zęba. Przedstawiono szczegółowy protokół izolacji i hodowli bliższego końca siekacza myszy, w którym znajdują się komórki macierzyste i ich nisza. Jest to zmodyfikowany protokół hodowli narządów typu Trowella, który umożliwia hodowlę in vitro fragmentów tkanek (eksplantatów), a także grubych plastrów tkanek na granicy faz ciecz/powietrze na filtrze wspartym na metalowej siatce. Opisany tutaj protokół hodowli narządów umożliwia manipulacje tkankami, które nie są możliwe do wykonania in vivo, a w połączeniu z użyciem reportera fluorescencyjnego stanowi platformę do identyfikacji i śledzenia dyskretnych populacji komórek w żywych tkankach w czasie, w tym w komórkach macierzystych. W tym systemie można testować różne cząsteczki regulatorowe i związki farmakologiczne pod kątem ich wpływu na komórki macierzyste i ich nisze. Ostatecznie dostarcza to cennego narzędzia do badania regulacji i utrzymania komórek macierzystych.

Nabłonkowe komórki macierzyste (SC) znajdują się w niszy zwanej pętlą szyjną, która jest zlokalizowana w proksymalnej części siekacza (Rycina 3A). Pętle szyjne są morfologicznie odrębnymi strukturami złożonymi z wewnętrznego i zewnętrznego nabłonka emaliowego, które otaczają siateczkę gwieździstą, stanowiącą rdzeń z luźno rozmieszczonych komórek nabłonkowych (Rycina 3B,C). W każdym siekaczu znajdują się dwie pętle szyjne (Ry...

Metoda hodowli narządów typu Trowella została wykorzystana do rozwikłania skomplikowanych sieci sygnałowych, które regulują rozwój zębów, a ostatnio do badania regulacji związanych z komórkami macierzystymi stale rosnącego siekacza myszy. Fluorescencyjne modele zwierzęce i metody obrazowania na żywo ułatwiają dogłębną analizę komórek macierzystych zębów i ich specyficznego mikrośrodowiska niszowego.

Zastosowanie hodowli narządów typu Trowell do badania regulacji komórek macierzystych zęba

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Hodowla narządów typu Trowella służy do hodowli eksplantatów tkankowych. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do badania komórek macierzystych w stale rosnących zębach. Dzięki tej technice możemy badać komórki macierzyste i ich zachowanie w niszy oraz badać wpływ różnych cząsteczek na przeżycie i utrzymanie komórek macierzystych.Metoda ta może być również stosowana do badania komórek macierzystych innych narządów, takich jak skóra lub gruczoł sutkowy. Zacznij od umieszczenia 30-milimetrowych metalowych siatek z otworami o średnicy od jednego do dwóch milimetrów na 35-milimetrowej szalce Petriego. Wypełnij to miejsce nośnikiem, aż nośnik dotrze do powierzchni siatki.Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż tkanka zostanie odizolowana i gotowa do hodowli. Po odcięciu głowy myszy usuń skórę, aby odsłonić żuchwę i przeciąć mięśnie żwaczy, aby oddzielić żuchwę od szczęki i reszty głowy. Po odizolowaniu żuchwy usuń język i maksymalną ilość tkanek miękkich.Podziel żuchwę w linii środkowej, przecinając spojenie. Umieścić żuchwę na szalce Petriego zawierającej PBS na lodzie. Użyj jednorazowej igły podskórnej o wymiarach 20 na 26, aby wyciąć siekacz.Następnie oc

use-trowell-type-organ-culture-to-study-regulation-dental-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Ciągle rosnący siekacz myszy dostarcza modelu do badania odnawiania tkanek zębowych z komórek macierzystych nabłonka zębów (DESCs). Przedstawiono solidny system do konsekwentnego i niezawodnego pozyskiwania tych komórek z siekacza i namnażania ich in vitro.

Izolacja i hodowla komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza dorosłej myszy

Współkultury stanowią cenną metodę badania interakcji między nerwami a docelowymi tkankami i narządami. Systemy mikroprzepływowe umożliwiają kokulturację zwojów nerwowych i całych rozwijających się narządów lub tkanek w różnych pożywkach hodowlanych, stanowiąc w ten sposób cenne narzędzie do badania in vitro wzajemnych oddziaływań między neuronami a ich celami.

Analiza rozwoju unerwienia zarodków zębów za pomocą urządzeń do kohodowli mikroprzepływowej

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Udostępniamy protokoły oceny mezenchymalnych komórek macierzystych wyizolowanych z miazgi zębowej i interakcji komórek raka prostaty w oparciu o bezpośrednie i pośrednie metody wspólnej hodowli. Membrany Condition Medium i trans-well są odpowiednie do analizy pośredniej aktywności parakrynnej. Wysiewanie różnie barwionych komórek razem jest odpowiednim modelem bezpośredniej interakcji komórka-komórka.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki miazgi i współhodowla z komórkami nowotworowymi w celu zbadania ich interakcji

Opisujemy izolację, dyspersję i powlekanie komórek pierwotnych miazgi zębowej (DP) z neuronami trójdzielnymi (TG) hodowanymi na nałożonych na nich filtrach transwell. Odpowiedzi komórkowe komórek DP można analizować za pomocą immunofluorescencji lub analizy RNA/białka. Immunofluorescencja markerów neuronalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na analizę odpowiedzi na przerost neurytów.

Metoda kohodowli do badania przerostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej

Ten protokół przedstawia metodę hodowli i 3D hodowli komórek podobnych do ameloblastów w mikrograwitacji, aby zachować ich wydłużony i spolaryzowany kształt, a także ekspresję białek specyficzną dla szkliwa. Opisano również warunki hodowli konstruktów inżynierii przyzębia i narządów płuc w warunkach mikrograwitacji.

Rozmnażanie komórek i narządów zębów i dróg oddechowych w mikrograwitacji

Przedstawiamy protokół rozwoju kultur organoidów nabłonkowych, zaczynając od ludzkiego zęba. Organoidy są bardzo rozprężalne i rekapitulują nabłonkowe komórki macierzyste zęba, w tym ich zdolność do różnicowania ameloblastów. Unikalny model organoidowy stanowi obiecujące narzędzie do badania biologii ludzkiej uzębienia (komórek macierzystych) z perspektywami podejścia regeneracyjnego zębów.

Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku, jak założyć pierwotną hodowlę komórek macierzystych miazgi zębowej przy użyciu metody hodowli eksplantatów i charakterystykę tych komórek w oparciu o wytyczne ICSCRT. Komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu można uznać za mezenchymalne komórki macierzyste do dalszych zastosowań.

Pierwotna hodowla komórek macierzystych miazgi zębowej

Ten protokół kładzie nacisk na ekstrakcję, hodowlę i zachowanie multipotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zębowej poprzez trawienie enzymatyczne. Dodatkowo wykazano ich potencjał do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty, podkreślając znaczenie precyzji i spójności w tym procesie.

Izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych

Obrazowanie na żywo ex vivo to potężna technika badania dynamicznych procesów ruchów komórkowych i interakcji w żywych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który implementuje mikroskopię dwufotonową do śledzenia na żywo komórek nabłonka zębów w hodowanych całych siekaczach dorosłych myszy.

Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy

Poznaj metodę hodowli narządów typu Trowell do badania komórek macierzystych zęba myszy. Technika umożliwia obserwację zachowań komórek w niszy oraz testowanie czynników regulujących ich przetrwanie.

Zastosowanie hodowli narządów typu Trowell do badania regulacji komórek macierzystych zęba

Przeglądaj więcej filmów