Name: Nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Poznaj metodę nano-DSF do przesiewowego badania fragmentów wykrywających wiązanie się z białkami. Technika ta pozwala na szybką, ekonomiczną identyfikację stabilizujących i destabilizujących ligandów bez konieczności etykietowania próbek białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

"Ta praca skorzystała z dostępu do NKI Protein Facility, centrum Instruct-ERIC. Wsparcia finansowego udzieliły iNEXT, projekt nr 653706, oraz iNEXT-Discovery, projekt numer 871037, finansowane z programu Horyzont 2020 Komisji Europejskiej".

<ol><li>Hoffer, L., Muller, C., Roche, P., Morelli, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry-driven+hit-to-lead+optimization+guided+by+structure-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Informatics%22%5BJournal%5D)">Chemistry-driven hit-to-lead optimization guided by structure-based approaches.</a> Molecular Informatics. 37 (9-10), 1800059(2018).</li>
<li>Lamoree, B., Hubbard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+in+fragment-based+lead+discovery+%28FBLD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD).</a> Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).</li>
<li>Ress, D. C., Congreve, M., Murray, C. W., Carr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment-based+lead+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Fragment-based lead discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 660-672 (2004).</li>
<li>Carr, R. A. E., Congreve, M., Murray, C. W., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment-based+lead+discovery%3A+Leads+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Fragment-based lead discovery: Leads by design.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 987-992 (2005).</li>
<li>Bradley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SGC+beyond+structural+genomics%3A+Redefining+the+role+of+3D+structures+by+coupling+genomic+stratification+with+fragment-based+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The SGC beyond structural genomics: Redefining the role of 3D structures by coupling genomic stratification with fragment-based discovery.</a> Essays in Biochemistry. 61 (5), 495-503 (2017).</li>
<li>Davies, T. G., Tickle, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment+screening+using+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fragment screening using X-ray crystallography.</a> Topics in Current Chemistry. 317, 33-59 (2012).</li>
<li>Ma, R., Wang, P., Wu, J., Ruan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+of+fragment-based+lead+discovery+-+A+perspective+from+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Process of fragment-based lead discovery - A perspective from NMR.</a> Molecules. 21 (7), 854(2016).</li>
<li>Troelsen, N. S., Clausen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+design+strategies+to+accelerate+fragment-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Library design strategies to accelerate fragment-based drug discovery.</a> Chemistry. 26 (50), 11391-11403 (2020).</li>
<li>Shi, Y., von Itzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+size+matters%3A+Diversity+for+fragment+library+design%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">How size matters: Diversity for fragment library design.</a> Molecules. 24 (15), 2838(2019).</li>
<li>Taylor, A., Doak, B. C., Scanlon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+fragment-screening+library%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Design of a fragment-screening library.</a> Methods in Enzymology. 610, 97-115 (2018).</li>
<li>Cox, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP%282%29%2C+an+atypical+bromodomain%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).</li>
<li>Sreeramulu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+quality+control+of+fragment+libraries+for+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">NMR quality control of fragment libraries for screening.</a> Journal of Biomolecular NMR. 74 (10-11), 555-563 (2020).</li>
<li>Pfaff, S. J., Chimenti, M. S., Kelly, M. J. S., Arkin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+methods+for+identifying+fragment-based+inhibitors+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Biophysical methods for identifying fragment-based inhibitors of protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1278, 587-613 (2015).</li>
<li>Fattori, D., Squarcia, A., Bartoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment-based+approach+to+drug+lead+discovery%3A+Overview+and+advances+in+various+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs+in+R+%26+D%22%5BJournal%5D)">Fragment-based approach to drug lead discovery: Overview and advances in various techniques.</a> Drugs in R & D. 9 (4), 217-227 (2008).</li>
<li>Winter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+and+computational+fragment-based+approaches+to+targeting+protein-protein+interactions%3A+Applications+in+structure-guided+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Biophysical and computational fragment-based approaches to targeting protein-protein interactions: Applications in structure-guided drug discovery.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (4), 383-426 (2012).</li>
<li>Boelens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iNEXT%3A+a+European+facility+network+to+stimulate+translational+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology.</a> FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).</li>
<li>Zhang, R., Monsma, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+thermal+shift+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Drug+Discovery+and+Development%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based thermal shift assays.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 13 (4), 389-402 (2010).</li>
<li>Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+purification+and+characterization+using+Thermofluor+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens.</a> Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).</li>
<li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+thermal+shift+assay%3A+a+novel+biophysical+assay+for+in+situ+drug+target+engagement+and+mechanistic+biomarker+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li>
<li>Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+stabilize+protein%3A+stability+screens+for+thermal+shift+assays+and+nano+differential+scanning+fluorimetry+in+the+Virus-X+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">How to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the Virus-X Project.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (144), e58666(2019).</li>
</ol>

Nie ma żadnych ujawnień.

Niniejszy protokół opisuje metodę o średniej i wysokiej przepustowości do przesiewania bibliotek fragmentów z wykorzystaniem powszechnie stosowanej robotyki i instrumentów pomiarowych. Przesiewania, takie jak opisane w tym protokole, mogą być rutynowo przeprowadzane przez NKI Protein Facility w Amsterdamie, na przykład w ramach usługi iNEXT-Discovery, często nawet bezpłatnie dla użytkowników po złożeniu wniosku i recenzji. W takich przypadkach placówka może zapewnić bibliotekę DSi-Poised, jednak możliwość wykorzystania innych bibliotek może być również omawiana w kontekście każdego indywidualnego zastosowania użytkownika i umowy serwisowej. Wybór instrumentów w niniejszym protokole stanowi praktyczne rozwiązanie dla wielu laboratoriów, lecz nie powinien być traktowany jako złoty standard. Do pomiaru stabilności termicznej białka docelowego w przesiewaniu fragmentów zaleca się stosowanie metod bezznakowych, zamiast metod wykorzystujących wrażliwe na środowisko znaczniki do wykrywania rozfałdowania w termocyklerze do reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją.
Metody bez znakowania, takie jak zaprezentowana tutaj z wykorzystaniem instrumentu Prometheus, mają pewne zalety: wymagają niewielkich ilości białka, często o kilka rzędów wielkości mniejszych; umożliwiają jednoczesny pomiar rozpraszania próbki, a tym samym agregacji; ponadto znaczniki stosowane do wykrywania rozfałdowania w innych podejściach mogą różnie oddziaływać z każdym fragmentem, co prowadzi do powstawania artefaktów pomiarowych. Niniejszy protokół został opisany w kontekście robota Mosquito, który umożliwia pipetowanie bardzo małych objętości próbki (0.3 µL), co nie jest możliwe do wykonania ręcznie. Mosquito jest popularnym robotem, dostępnym w wielu laboratoriach zajmujących się biologią strukturalną oraz projektami odkrywania leków; jednak protokół ten może być oczywiście realizowany z wykorzystaniem alternatywnych metod pipetowania małych objętości.
Biblioteki fragmentów zawierają związki rozpuszczone w DMSO. Jednym z początkowych wyzwań jest znalezienie optymalnego stężenia DMSO, przy którym białko pozostaje stabilne, a związki pozostają rozpuszczalne. Wymaga to przeprowadzenia pomiarów przy różnych stężeniach DMSO w celu określenia optymalnych warunków przesiewania. Zastosowane tutaj rozcieńczenie białka w stosunku do fragmentu skutkuje stężeniem DMSO na poziomie 0,2%; większość białek jest w tych warunkach dość stabilna. Ilość białka wymagana do przeprowadzenia przesiewania biblioteki 768 związków wynosi łącznie ~2-3 mg, ponieważ pomiary są zazwyczaj wykonywane przy niskich stężeniach białka (0,2 mg mL-1). Praca z tak relatywnie niskimi stężeniami białka nie tylko obniża koszty jego produkcji, ale także zmniejsza prawdopodobieństwo precypitacji białka. Niskie stężenie białka nie wpływa na detekcję wiązania fragmentów, ponieważ stężenie fragmentów w eksperymencie wynosi ~2 mM, co pozwala na zidentyfikowanie również słabych ligandów.
Ponieważ detekcja przejścia topnienia w tych eksperymentach opiera się na intensywności fluorescencji, kluczowym aspektem jest określenie mocy wzbudzenia lasera, przy której należy przeprowadzić pomiary. Oddziaływanie związków z białkiem może (i) nie mieć wpływu na jego fluorescencję wewnętrzną, (ii) prowadzić do wygaszania lub (iii) zwiększać jego fluorescencję wewnętrzną. Ponadto praca z niskimi stężeniami białka sprawia, że liczba zliczeń fluorescencji dla natywnego białka byłaby niska. Moc wzbudzenia musi zatem zostać dostosowana w taki sposób, aby możliwe było zmierzenie większości próbek. Profil rozpraszania z każdego pomiaru dostarcza istotnych informacji o efektach agregacji, które mogą zostać wywołane przez dodanie dowolnego fragmentu. Ponadto na profilu rozpraszania można zaobserwować wpływ temperatury na rozpuszczalność związku.
Nieoczekiwanie, w przypadku wielu związków zaobserwowano, że rozproszenie w rzeczywistości zmniejszało się wraz ze wzrostem temperatury (Rysunek 6). Dlatego ważne jest przeanalizowanie zarówno krzywej przejścia topnienia, jak i towarzyszącego jej profilu rozproszenia, aby ocenić wiarygodność każdego eksperymentu, szczególnie w odniesieniu do tych fragmentów, które są uważane za kandydatów do bardziej wymagających pomiarów metodą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR, bądź nawet uznawane za trafienia (hits) do dalszych badań chemicznych. Jednym z konkretnych ograniczeń tej metody w celach screeningu fragmentów jest fakt, że wiele fragmentów w bibliotece DSi-Poised wykazuje znaczącą fluorescencję wewnętrzną, czasami przekraczającą nawet limit nasycenia detektora, przez co nie mogą one być prawidłowo badane pod kątem wiązania z celem, nawet przy niskiej mocy wzbudzenia. Kolejną kwestią wartą odnotowania w przypadku tej metody jest to, że można ją stosować wyłącznie w odniesieniu do białek zawierających reszty tryptofanu.
<img alt="Analiza denaturacji termicznej, wykresy temperatury względem stosunku/pierwszej pochodnej oraz wykresy rozpraszania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig6v11.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wpływ temperatury na rozpuszczalność związku. Krzywa przejścia topnienia i profil rozpraszania Hec1 z dwoma różnymi związkami. (A) Profil rozpraszania pokazuje, że w przypadku tej próbki rozpuszczalność nie jest zależna od temperatury. (B) Profil rozpraszania pokazuje, że rozpuszczalność tej próbki zwiększa się wraz ze wzrostem temperatury. Krzywa przejścia topnienia w tym przypadku nie jest zatem wiarygodna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig6v11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Otwartym pytaniem pozostaje kwestia tego, co należy uznać za istotną zmianę Tm, nie z perspektywy matematycznej, lecz z punktu widzenia praktycznego: jaka zmiana Tm jest na tyle ważna, aby uznać ją za wskaźnik wiązania liganda z białkiem? W tych przykładach przesunięcia mniejsze niż 1 °C zaobserwowano dla 74% fragmentów wiążących Hec1, 66% dla Mps1 oraz 53% dla Nsp5. Przyjęcie wartości 1 °C jako „istotnej zmiany” prawdopodobnie nie dostarczyłoby trafień wartych dalszego opracowania chemicznego. Na wykresach zbiorczych (Rysunek 5) uwzględniono przedziały przesunięcia Tm wynoszące 1, 2, 5 lub więcej niż 5 stopni, zarówno w kierunku dodatnim, jak i ujemnym. Wymaga to modyfikacji w zależności od konkretnego przypadku, aby uzyskać przejrzysty obraz i umożliwić podejmowanie świadomych decyzji dotyczących kolejnych kroków. Co istotne, w przypadku niektórych białek zaobserwowano zarówno stabilizację, jak i destabilizację celu, w zależności od rozważanych fragmentów. Oba zjawiska są interesujące, ponieważ oba mogą być wynikiem wiązania fragmentu i oba mogą prowadzić do otrzymania odpowiedniej cząsteczki w kolejnych etapach w celu manipulacji zachowaniem białka.
Pozostaje ostatnie pytanie: „co definiuje użyteczny hit?”. W rzeczywistości odpowiedź zależy od konkretnej sytuacji. Na przykład w przypadku Hec1 wszystkie fragmenty, które stabilizowały białko o ponad 2 stopnie lub destabilizowały je o ponad 5, zostały przekazane naszym współpracownikom chemikom, którzy zaprojektowali nowe cząsteczki na podstawie tych hitów. W przypadku Nsp5 natomiast hity najsilniej destabilizujące przekazano współpracownikom zajmującym się NMR w celu potwierdzenia hitów uzyskanych metodą nanoDSF za pomocą eksperymentów NMR. Innymi słowy, wyniki przesiewania uzyskane za pomocą tego protokołu należy analizować z ostrożnością i w zależności od kontekstu, podejmując świadome decyzje w oparciu o konkretne pytanie badawcze i zastosowaną metodologię. W każdym przypadku opisana tutaj metoda stanowi podejście komplementarne do istniejących metod, takich jak przesiewanie oparte na krystalografii rentgenowskiej i NMR, które mogą służyć do potwierdzania, priorytetyzacji lub generowania nowych pomysłów dla kampanii chemicznych.
Tabela uzupełniająca S1: Lista buforów wykorzystanych do skriningu białek.Skróty: HEPES = kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy; DTT = ditiotreitol; MOBS = kwas 4-(N-morfolino)butanosulfonowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Supp_Table_S1.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca S2: Właściwości płytki MRC z 2 studniami do zastosowania z robotem nanodozownikiem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Suppl_Table_S2.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca S3: Właściwości płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V do użytku z robotem nanodyspenserem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Suppl_Table_S3.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca S4: Bufor, stężenie białek i Tm białek omówionych w reprezentatywnych wynikach. Skróty: DTT = ditiotreitol; Hec1 = białko Highly Expressed in Cancer 1; Mps1 = kinaza wrzeciona monopolarnego 1; Nsp5 = proteaza 3C-podobna SARS-CoV-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469_Suppl_Table_S4.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Parametry przeglądowe-przykładowe dane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/Supplementaty_file_1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: wartości Tm i ΔTm dla 406 fragmentów – dane przykładowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/Supplementary_file_2.xlsx" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Programy odkrywania leków często zaczynają się od badania związków chemicznych pod kątem ich zdolności do interakcji i/lub modyfikacji funkcji celów leków, najczęściej białek. Tak zwane "trafienia", które znajdują się na takich ekranach, stanowią podstawę do odkrycia nowych tropów i kandydatów do rozwoju, a także dla większości nowych leków, które są obecnie licencjonowane. Dostępność metod o wysokiej przepustowości jest zatem niezbędna do przesiewania ogromnej liczby dostępnych celów za pomocą ogromnej liczby różnych związków w celu szybkiego zidentyfikowania ich ścisłego wiązania lub zdolności do modulowania określonej funkcji celu. Po zidentyfikowaniu trafień, najbardziej obiecujące kombinacje trafienia-celu są wprowadzane do obszernego procesu opracowywania leków przy użyciu innych, często kosztownych i czasochłonnych technologii, aby zrozumieć "zależności między strukturą a aktywnością" (SAR).
Podejścia do biologii strukturalnej, takie jak te oferowane przez finansowane przez UE programy dostępu "Infrastruktura dla NMR, EM, and X-rays for Translational Research" (iNEXT) i jego obecnego następcy iNEXT-Discovery, są często używane do badania interakcji wielu związków w ekstremalnych szczegółach, jednocześnie poprawiając powinowactwo i właściwości farmakologiczne początkowych uderzeń przez zazwyczaj kilka rund chemii syntetycznej1. Związki ołowiu, które powstają w wyniku tych kampanii "od trafienia do ołowiu", stają się kandydatami do rozwoju i wchodzą do badań przedklinicznych. Dobrze rozwiniętą metodologię molekularnych badań przesiewowych można z grubsza podzielić na dwa podejścia, a mianowicie odkrywanie ołowiu oparte na ligandach (LBLD) i odkrywanie ołowiu oparte na fragmentach (FBLD). W kampaniach LBLD receptory białkowe są badane za pomocą kilku tysięcy ręcznie wybranych ligandów (w oparciu o strukturę naturalnych ligandów lub strukturę celu) lub za pomocą wielu dziesiątek tysięcy związków w bibliotekach ligandów podobnych do leków, które pokrywają dużą część przestrzeni chemicznej.
Zazwyczaj, związki są testowane pod kątem ich aktywności hamującej w teście aktywności, zazwyczaj monitorując funkcję enzymatyczną. W kampaniach FBLD2,3,4,5, jednak kilkaset związków, które są zwykle mniejsze niż leki (100-200 daltonów), jest testowanych pod kątem ich zdolności do bezpośredniego wiązania celu, bez użycia testu aktywności. To wiązanie może zakłócać aktywność celu i może być mierzone za pomocą wielu metod biofizycznych, które bezpośrednio informują o zdolności fragmentów do wiązania się z celem, lub za pomocą metod strukturalnych, takich jak krystalografia rentgenowska6 i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego7, a ostatnio także mikroskopia krioelektronowa. Kiedy fragmenty wiążą się w różnych miejscach, które są blisko siebie na białku, różne, zwykle o niskim powinowactwie fragmenty wiążące można racjonalnie połączyć chemicznie, aby stworzyć mały zestaw przewodów, który można badać bardziej szczegółowo. Często prowadzi to do powstania silniejszych związków o wyższym powinowactwie, a ta metodologia zaczęła prowadzić do uzyskania ważnych cząsteczek o potencjale klinicznym. Wybór "idealnej" biblioteki fragmentów, która efektywnie wykorzystuje grupy chemiczne, był aktywnym obszarem badań od wielu lat8,9,10.
Podczas gdy początkowo nacisk kładziono na pokrycie pełnej przestrzeni chemicznej, późniejsza uwaga skupiła się na umożliwieniu dalszego chemicznego łączenia uderzeń fragmentów w celu wytworzenia związków ołowiu. Takie badania doprowadziły do powstania tak zwanych "opanowanych" bibliotek. Zawierają one fragmenty z co najmniej jedną grupą funkcyjną, które umożliwiają szybką, tanią kontynuację chemii syntetycznej w celu skutecznego postępu w badaniu SAR. Jednym z działań zainicjowanych w ramach projektu iNEXT była aktualizacja biblioteki opracowanej przez naukowców z konsorcjum Diamond Light Source and Structural Genomics Consortium. Ten wspólny wysiłek zaowocował powstaniem biblioteki DSi-Poised11, która została również zweryfikowana w iNEXT12. Później biblioteka ta została dostosowana do dostępności związków w REAL Database firmy Enamine Ltd., organizacji zajmującej się badaniami chemicznymi i producenta dużych zbiorów bloków budulcowych i bibliotek związków do badań przesiewowych. DSi-Poised jest teraz dostępny do zakupu dla każdego, ale jest również dostępny w wielu laboratoriach partnerskich iNEXT-Discovery dla wspieranych projektów badań przesiewowych fragmentów.
Zaawansowane technologie krystalografii rentgenowskiej i biologii strukturalnej NMR mają swoje zalety i wady dla FBLD. Oba wymagają izolowanych próbek docelowych i dają szczegóły atomowe o wysokiej rozdzielczości, które są wymagane dla FBLD. Jednak kryształy są niezbędne do krystalografii rentgenowskiej, a fragmenty wiążą się z wnękami w dobrze uporządkowanych regionach białkowych, które nie są zaangażowane w budowę trójwymiarowej sieci krystalicznej. NMR w roztworze często daje inne wyniki niż krystalografia rentgenowska, ponieważ nie ma na niego wpływu środowisko krystaliczne i jest dobry w wykrywaniu wiązania również w częściowo uporządkowanych regionach białka. Jednakże, chociaż eksperymenty NMR oparte na ligandach są stosunkowo szybkie, nadal wymagają znacznej ilości czasu i materiału i można je rutynowo wykonywać tylko dla stosunkowo małych celów białkowych lub domen. W celu priorytetyzacji związków do eksperymentów krystalograficznych lub NMR zastosowano podejścia biofizyczne13,14,15.
Ponieważ najnowsze oprzyrządowanie i protokoły obliczeniowe pozwalają na efektywne krystalograficzne badania przesiewowe FBLD poprzez bardzo efektywne określanie struktur i analizowanie ~1,000 fragmentów, ta priorytetyzacja stała się mniej istotna w badaniach opartych na promieniowaniu rentgenowskim. Jednak w przypadku NMR pożądane jest stosowanie tańszych i szybszych eksperymentów, aby nadać priorytet selekcji bibliotek i zaoszczędzić czas na sprzęcie najwyższej klasy. Jednocześnie, zastosowanie kombinacji zasadniczo różnych technologii może zapewnić niezależne potwierdzenie zdarzeń wiązania, a nawet dodatkowe trafienia, które nie są wychwytywane przy użyciu wyłącznie metody krystalograficznej lub NMR. Zarówno techniki krystalograficzne, jak i NMR wymagają bardzo drogiego sprzętu i często można je wykonać tylko w dedykowanych obiektach zewnętrznych z pomocą lokalnych, wysoko wykwalifikowanych ekspertów. Ponadto właściwa analiza wyników również wymaga wysokiej wiedzy specjalistycznej. Podczas gdy programy takie jak iNEXT i iNEXT-Discovery demokratyzują dostęp do takich obiektów16, uznano, że tanie, szybkie i wysokowydajne badania przesiewowe FBLD innymi metodami mogą zachęcić do programów badań przesiewowych leków w znacznie szerszym zakresie laboratoriów. Takie wyniki mogą być następnie wykorzystane jako wskazówka do nawiązania współpracy z chemikami medycznymi oraz do nadania priorytetu najdroższym eksperymentom przesiewowym w stosunku do najbardziej obiecujących związków, jeśli NMR i urządzenia krystalograficzne nałożą ograniczenia na liczbę związków, które można poddać badaniom przesiewowym.
TSA tworzy szybką, efektywną i stosunkowo tanią i dostępną metodę biofizyczną17, która może być wykorzystana do badań przesiewowych FBLD. Był używany w wielu sytuacjach, od pomocy w znalezieniu stabilnych warunków białkowych do prób krystalizacji18, po znajdowanie związków, które wiążą się z określonymi celami w komórkach19. TSA są również używane do pomiaru stałych dysocjacji ligandów wiążących białka docelowe, ponieważ wiązanie ligandów często prowadzi do zmian w stabilności termicznej. We wszystkich TSA zmiana temperatury denaturacji białka (jego stabilności) jest mierzona jako funkcja powolnego wzrostu temperatury. Skutecznym sposobem śledzenia denaturacji białek po podgrzaniu jest DSF lub Thermofluor, który określa ilościowo wygaszanie fluorescencji barwnika hydrofobowego (zwykle Sypro Orange) po interakcji z odsłoniętymi hydrofobowymi regionami białka, które rozwijają się pod wpływem wzrostu temperatury.
Nano-DSF zazwyczaj odnosi się do pomiaru stabilności termicznej białka przy braku zewnętrznych barwników. Jednym z pierwszych instrumentów, który oferował taką możliwość, był OPTIM1000, który mierzy szerokie spektrum natężenia światła, a także rozpraszania światła próbki. Maszyna ta pozwoliła na jednoczesny pomiar fałdowania białek (zwykle po fluorescencji tryptofanu) i agregacji białek (ponieważ powstałe nanocząstki powodują wzrost rozpraszania światła przy ~400 nm). Później Prometheus wprowadził zastosowanie odbicia wstecznego do pomiaru agregacji i czułego wykrywania sygnału fluorescencji, co pozwoliło na badanie przesiewowe niskich stężeń białek z dobrą czułością20. W poniższej sekcji opisano, w jaki sposób Prometheus został wykorzystany do zademonstrowania protokołu badania przesiewowego fragmentów w celu wykrywania trafień dla różnych celów białkowych. Po krótkim wprowadzeniu na temat oczekiwanej jakości i ilości białka następuje protokół krok po kroku dotyczący przygotowania, przeprowadzenia i analizy eksperymentów przesiewowych fragmentów. Wyniki badań przesiewowych dla trzech białek przedstawiono jako przykładowe dane uzyskane w ramach współpracy w ramach projektu iNEXT-Discovery.

<table><tbody><tr><td>Arkusze ClearVue</td> Wymiary <td></td><td>molekularne</td><td>samoprzylepna folia uszczelniająca do płytki białkowej</td></tr><tr><td>Aluminiowa taśma uszczelniająca CORNING 6570</td><td>Samoprzylepna folia uszczelniająca CORNING</td><td></td><td></td> do płytki fragmentacyjnej</tr><tr><td>Biblioteka DSi Poised</td><td>Biblioteka fragmentów enaminy</td><td></td><td>zawierająca 768 związków użytych w tym badaniu</td></tr><tr><td>Elisa Reservior</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15075</td><td>Rezerwator odczynnika używany do pipetowania</td></tr><tr><td>okrągłych (U) płytek dolnych białka Greiner Cat</td><td></td><td>. Nie.&nbsp; 650201</td><td>Fragmenty dostarczane w tych płytkach</td></tr><tr><td>Mosquito typ X1</td><td>sptlabtech</td><td>Nr części- 3019-0003</td><td>Dozownik nanolitrów</td></tr><tr><td>MRC 2-dołkowa płytka</td><td></td> krystalizacyjna <td>MRC96T-PS</td><td></td></tr><tr><td>Zbiorniki odczynników Pierce ELISA</td><td>Kapilary Pierce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prometheus o wysokiej czułości</td><td>Katalog PR-C006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prometheus NT.48 nanoDSF</td><td>Nanotemper</td><td>Katalog nr PR001 (+ Optyka detekcji agregacji, nr katalogowy PR-AGO)</td><td>nanoDSF i rozpraszanie wsteczne</td></tr><tr><td>światła Prometheus Standardowy typ kapilarny</td><td>Katalog PR-C002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TX-1000</td><td>Wirówka termologiczna</td><td>do płytek</td><td></td></tr></tbody></table>

nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Testy przesunięcia termicznego (TSA) badają, jak zmienia się temperatura topnienia (Tm) docelowego białka w odpowiedzi na zmiany w jego otoczeniu (np. skład buforu). Użyteczność TSA, a w szczególności nano-różnicowej fluorymetrii skaningowej (nano-DSF), została ustalona na przestrzeni lat, zarówno w celu znalezienia warunków, które pomagają ustabilizować określone białko, jak i w celu przyjrzenia się wiązaniu ligandów poprzez monitorowanie zmian w pozornymTM. W artykule przedstawiono efektywne badanie przesiewowe biblioteki fragmentów Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) (768 związków) za pomocą nano-DSF, monitorując Tm w celu identyfikacji potencjalnego wiązania fragmentów. Pokrótce przedstawiono warunki wstępne dotyczące jakości i stężenia białka do przeprowadzania eksperymentów nano-DSF, a następnie przedstawiono protokół krok po kroku, który wykorzystuje nanolitrowy automatyczny dozownik powszechnie używany w laboratoriach biologii strukturalnej do przygotowywania wymaganych próbek na 96-dołkowych płytkach. Protokół opisuje, w jaki sposób mieszaniny odczynników są przenoszone do kapilar potrzebnych do pomiarów nano-DSF. Ponadto w artykule przedstawiono protokoły pomiaru denaturacji termicznej (monitorowanie wewnętrznej fluorescencji tryptofanu) i agregacji (monitorowanie rozpraszania wstecznego światła) oraz kolejne etapy przesyłania i analizy danych. Na koniec omówiono eksperymenty przesiewowe z trzema różnymi docelowymi białkami, aby zilustrować zastosowanie tej procedury w kontekście kampanii odkrywania potencjalnych klientów. Ogólna zasada opisanej metody może być łatwo przeniesiona do innych bibliotek fragmentów lub dostosowana do innych instrumentów.

Przeprowadzono pełny przesiew biblioteki DSi-Poised (768 fragmentów) w odniesieniu do trzech białek o znaczeniu medycznym: białka zewnętrznego kinetochoru Highly Expressed in Cancer 1 (Hec1 lub Ndc80), regulatorowej domeny tetraricopeptide repeat (TPR) kinazy wrzeciona monopolarnego 1 (Mps1) oraz proteazy 3C-podobnej SARS-CoV-2, Nsp5, która odcina koniec C-końcowy poliproteiny replikazy w 11 miejscach. Warunki buforowe wybrane dla każdego białka, a także stężenie białek i ich Tm, przedstawiono w Tabeli uzupełniającej S4.
<img alt="Wykresy słupkowe przedstawiające ΔTm w funkcji liczby fragmentów dla białek Hec1, Mps1, Nsp5; wyniki analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62469/62469fig5v12.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Rozkład częstotliwości przesunięcia temperatury topnienia (ΔTm) dla trzech białek, Hec1, Mps1 i Nsp5, przedstawione w niniejszej pracy jako wyniki reprezentatywne.Skróty: Hec1 = białko Highly Expressed in Cancer 1; Mps1 = monopolar spindle kinase 1; Nsp5 = proteaza 3C-like SARS-CoV-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62469/62469fig5v11large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wyniki trzech przesiewów przeprowadzonych zgodnie z opisanym powyżej protokołem, przedstawione jako rozkład częstości zmiany Tm w funkcji liczby fragmentów, ukazano na Rysunku 5. Wykresy te zostały wygenerowane zgodnie z opisem w sekcji 5.3 protokołu, poprzez naniesienie częstości zaobserwowanej zmiany Tm. Istotność przesunięcia musi zostać określona w sposób subiektywny dla każdego projektu, zgodnie z opisem w poniższej sekcji dyskusji. Wartości ujemne wskazują na obniżenie temperatury topnienia w obecności fragmentu, natomiast wartość dodatnia oznacza wzrost Tm. Z takich wykresów łatwo zauważyć, że w przypadku Nsp5 wszystkie fragmenty wykazują działanie destabilizujące, podczas gdy dla Hec1 i Mps1 obserwuje się zarówno trafienia stabilizujące, jak i destabilizujące. Jest to wynik oczekiwany i zostanie omówiony w dalszej części.

Monitorowanie zmian temperatury topnienia docelowego białka (np. test przesunięcia termicznego, TSA) jest efektywną metodą badania bibliotek fragmentów kilkuset związków. Przedstawiamy protokół TSA implementujący wspomaganą robotyką nanoróżnicową fluorymetrię skaningową (nano-DSF) do monitorowania wewnętrznej fluorescencji tryptofanu i rozpraszania wstecznego światła w celu badania przesiewowego fragmentów.

Nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

Protokół ten jest przydatny w kampaniach odkrywania leadów opartych na fragmentarycznej bazie jako dodatkowe narzędzie do wybierania obiecujących fragmentów jako kandydatów do ciepła. Nano DSO do badań przesiewowych fragmentów wykorzystuje ograniczoną ilość nieznakowanej próbki białka i może być rutynowo stosowany do prawie wszystkich docelowych białek. Ta metoda może być stosowana do przesiewania dowolnych kolekcji ligandów.lub w celu sprawdzenia ciepła za pomocą innych metod. Wyjmij płytkę fragmentową z zamrażarki o temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza i pozwól jej rozmrozić się w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając na wytrząsarce stołowej. Odwirować płytkę w temperaturze 500 razy G przez 30 sekund, aby zebrać wszelkie krople przyklejające się do boku studzienek.Pobrać 2-dołkową płytkę krystalizacyjną MRC i odpipetować 15 mikrolitrów podstawowego roztworu białka do każdej podstudzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Aby sprawdzić definicje fragmentów i płytek białkowych na Mosquito, włącz dozownik nano i upewnij się, że wokół ruchomych elementów nie ma żadnych przeszkód. Otwórz graficzny interfejs użytkownika, kliknij zakładkę Setup i w sekcji Deck Configuration sprawdź, czy rodzaj płytki, w której dostarczane są związki, oraz ta, w której przenoszone jest białko, znajdują się już na liście dostępnych płytek.Jeśli nie, kliknij Opcje, a następnie Blachy i utwórz nową definicję blachy, wprowadzając poprawne wartości dla typu właściwości. Na karcie Ustawienia określ pozycje blach w obszarze Konfiguracja pokładu. Korzystając z menu rozwijanego, wybierz dolną płytkę Grainier U dla pozycji pierwszej i płytkę 2-dołkową MRC dla pozycji drugiej i zapisz protokół.Umieścić płytkę z odłamkami w pozycji pierwszej, a płytkę białkową w pozycji drugiej pokładu. W zakładce protokół kliknij na Plik i wybierz zapisany w poprzednim kroku protokół dozowania fragmentów. Określ objętość dozowanych fragmentów na 0,3 mikrolitra.W przypadku typowej blachy, w której kolumny pierwsza i 12 nie zawierają fragmentów, zdefiniuj położenie początkowe do kolumny drugiej i położenie końcowe do kolumny 11. W przypadku niektórych blach, jeśli kolumny druga lub 11 są puste, należy użyć kolumn 3 i 10 jako wartości początkowych i końcowych. Kliknij Uruchom, aby uruchomić program.Po zakończeniu dozowania, które trwa około dwóch minut, należy usunąć płytki białkowe i fragmentaryczne z robota i uszczelnić je samoprzylepną folią uszczelniającą. Krótko odwirować płytkę białkową w temperaturze 500 razy G przez 30 sekund, aby zebrać krople przyklejające się do boków studzienek przed przejściem do następnego kroku. Sprawdź wzrokowo studzienki płytki białkowej pod kątem wytrąceń, które mogły wystąpić w wyniku dodania fragmentów.Jeśli w wielu studniach obserwuje się opady, zmniejsz stężenie fragmentów i powtórz eksperyment. Włącz instrument Prometheus. Na ekranie dotykowym naciśnij Otwórz szufladę, aby uzyskać dostęp do kapilarnego modułu ładowania urządzenia.Zdejmij pasek magnetyczny z modułu ładującego i wyczyść lustro etanolem, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu. Aby przenieść roztwór z płytki z fragmentami białka do naczyń włosowatych, umieść płytkę białkową i naczynia włosowate obok urządzenia, aby uzyskać łatwy dostęp do modułu ładowania kapilarnego. Weź jedną kapilarę, trzymając ją na jednym końcu i dotknij roztworu w płytce białkowej drugim końcem kapilary, aby przenieść próbkę.Zawsze noś rękawiczki i upewnij się, że nie dotykasz kapilary pośrodku, ponieważ zanieczyszczenia z rękawic wpłynęłyby na pomiar. Umieść kapilarnę w wyznaczonej pozycji uchwytu, upewniając się, że jest prawidłowo wyrównana i wyśrodkowana, powtórz te kroki, aby wypełnić wszystkie pozycje w module załadowczym. Na koniec umieść pasek magnetyczny na kapilarnach, aby utrzymać je na miejscu i naciśnij Zamknij szufladę, aby rozpocząć eksperyment Nano-DSF.Otwórz żądanie ściągnięcia aplikacji Prometheus. ThermControl i utwórz nowy projekt, klikając Rozpocznij nową sesję. Najpierw wykonaj skanowanie odkrywcze, aby wykryć fluorescencję próbek. Zmień sygnał fluorescencyjny próbek, dostosowując moc wzbudzenia lasera.W celu denaturacji termicznej kliknij zakładkę Melting Scan, ustaw temperaturę początkową na 20 stopni Celsjusza, temperaturę końcową na 95 stopni Celsjusza, a nachylenie temperatury na jeden stopień Celsjusza na minutę. Następnie kliknij Rozpocznij pomiar. Przedstawiono tutaj rozkład częstotliwości przesunięcia i temperatury topnienia dla zewnętrznego, kinetycznego lub wysoce eksprymowanego w raku białka jednego, regulatorowej domeny powtórzeń tetratrikopeptydu kinazy monopolarnej wrzeciona 1 i proteazy podobnej do SARS-CoV-2 3c.Wartości ujemne wskazują na obniżenie temperatury topnienia w obecności fragmentu, podczas gdy wartość dodatnia wskazuje na wzrost temperatury topnienia. W przypadku Nsp5 wszystkie fragmenty mają działanie destabilizujące, podczas gdy w przypadku Hec1 i Mps1 obserwuje się zarówno trafienia stabilizujące, jak i destabilizujące. Jest to tania i szybka metoda przesiewania bibliotek fragmentów.Inne metody, takie jak NMR lub krystalografia rentgenowska, mogą pokazać dokładne wiązanie fragmentów i są również dostępne dzięki odkryciu INX. Wyniki badań nad proteazą koronawirusa pomogły zaproponować nowe związki, które można przekształcić w leki przeciwko COVID-19.

nano-differential-scanning-fluorimetry-for-screening-fragment-based

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Badanie przesiewowe fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin odbywa się za pomocą przepływu pracy z dedykowanymi bibliotekami związków, narzędziami do obsługi kryształów, szybkimi urządzeniami do zbierania danych i w dużej mierze zautomatyzowaną analizą danych. Przedstawiony protokół ma na celu maksymalizację wyników takich eksperymentów, aby zapewnić obiecujące punkty wyjścia do projektowania ligandów opartych na dalszej strukturze.

Przebieg pracy i narzędzia do badania przesiewowego fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin

Badania przesiewowe oparte na fragmentach za pomocą NMR to solidna metoda szybkiej identyfikacji małych cząsteczek wiążących biomakromolekuły (DNA, RNA lub białka). Przedstawiono protokoły opisujące przygotowanie próbek w oparciu o automatyzację, eksperymenty NMR i warunki akwizycji oraz przepływy pracy analizy. Technika ta pozwala na optymalne wykorzystanie do detekcji jąder aktywnych zarówno 1H, jak i 19F NMR.

Badanie przesiewowe fragmentów oparte na NMR w minimalnym trybie próbki, ale maksymalnym trybie automatyzacji

Ten artykuł opisuje cały proces XChem do badania fragmentów na bazie kryształów, począwszy od złożenia wniosku o dostęp i wszystkich kolejnych kroków do rozpowszechniania danych.

Osiągnięcie efektywnego przesiewania fragmentów w zakładzie XChem w Diamond Light Source

Ten protokół opisuje unikalną metodę wykrywania wiązania między związkami a cząsteczkami białka, oferując korzyści w postaci minimalnej utraty próbki białka i wysokiej dokładności danych.

Wykrywanie interakcji białko-baldaszek CD40 za pomocą różnicowej fluorescencji skaningowej

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Tutaj opisujemy przygotowanie i użycie sondy opartej na aktywności (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]karbaminianu), która pozwala na wykrycie i ilościowe określenie aktywnej formy prozapalnego enzymu amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego (NAAA), zarówno in vitro, jak i ex vivo.

Przygotowanie i zastosowanie in vivo sondy aktywności dla amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego

Opisujemy tutaj protokoły pomiaru powinowactwa i kinetyki wiązania przeciwciało-antygen przy użyciu czterech powszechnie używanych platform biosensorów.

Oznaczanie kinetyki wiązania przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie przy użyciu czterech platform biosensorowych

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Poznaj metodę nano-DSF do przesiewowego badania fragmentów wykrywających wiązanie się z białkami. Technika ta pozwala na szybką, ekonomiczną identyfikację stabilizujących i destabilizujących ligandów bez konieczności etykietowania próbek białkowych.

Nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów

Przeglądaj więcej filmów