Nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów

Protokół ten jest przydatny w kampaniach odkrywania leadów opartych na fragmentarycznej bazie jako dodatkowe narzędzie do wybierania obiecujących fragmentów jako kandydatów do ciepła. Nano DSO do badań przesiewowych fragmentów wykorzystuje ograniczoną ilość nieznakowanej próbki białka i może być rutynowo stosowany do prawie wszystkich docelowych białek. Ta metoda może być stosowana do przesiewania dowolnych kolekcji ligandów.

lub w celu sprawdzenia ciepła za pomocą innych metod. Wyjmij płytkę fragmentową z zamrażarki o temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza i pozwól jej rozmrozić się w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając na wytrząsarce stołowej. Odwirować płytkę w temperaturze 500 razy G przez 30 sekund, aby zebrać wszelkie krople przyklejające się do boku studzienek.

Pobrać 2-dołkową płytkę krystalizacyjną MRC i odpipetować 15 mikrolitrów podstawowego roztworu białka do każdej podstudzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Aby sprawdzić definicje fragmentów i płytek białkowych na Mosquito, włącz dozownik nano i upewnij się, że wokół ruchomych elementów nie ma żadnych przeszkód. Otwórz graficzny interfejs użytkownika, kliknij zakładkę Setup i w sekcji Deck Configuration sprawdź, czy rodzaj płytki, w której dostarczane są związki, oraz ta, w której przenoszone jest białko, znajdują się już na liście dostępnych płytek.

Jeśli nie, kliknij Opcje, a następnie Blachy i utwórz nową definicję blachy, wprowadzając poprawne wartości dla typu właściwości. Na karcie Ustawienia określ pozycje blach w obszarze Konfiguracja pokładu. Korzystając z menu rozwijanego, wybierz dolną płytkę Grainier U dla pozycji pierwszej i płytkę 2-dołkową MRC dla pozycji drugiej i zapisz protokół.

Umieścić płytkę z odłamkami w pozycji pierwszej, a płytkę białkową w pozycji drugiej pokładu. W zakładce protokół kliknij na Plik i wybierz zapisany w poprzednim kroku protokół dozowania fragmentów. Określ objętość dozowanych fragmentów na 0,3 mikrolitra.

W przypadku typowej blachy, w której kolumny pierwsza i 12 nie zawierają fragmentów, zdefiniuj położenie początkowe do kolumny drugiej i położenie końcowe do kolumny 11. W przypadku niektórych blach, jeśli kolumny druga lub 11 są puste, należy użyć kolumn 3 i 10 jako wartości początkowych i końcowych. Kliknij Uruchom, aby uruchomić program.

Po zakończeniu dozowania, które trwa około dwóch minut, należy usunąć płytki białkowe i fragmentaryczne z robota i uszczelnić je samoprzylepną folią uszczelniającą. Krótko odwirować płytkę białkową w temperaturze 500 razy G przez 30 sekund, aby zebrać krople przyklejające się do boków studzienek przed przejściem do następnego kroku. Sprawdź wzrokowo studzienki płytki białkowej pod kątem wytrąceń, które mogły wystąpić w wyniku dodania fragmentów.

Jeśli w wielu studniach obserwuje się opady, zmniejsz stężenie fragmentów i powtórz eksperyment. Włącz instrument Prometheus. Na ekranie dotykowym naciśnij Otwórz szufladę, aby uzyskać dostęp do kapilarnego modułu ładowania urządzenia.

Zdejmij pasek magnetyczny z modułu ładującego i wyczyść lustro etanolem, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu. Aby przenieść roztwór z płytki z fragmentami białka do naczyń włosowatych, umieść płytkę białkową i naczynia włosowate obok urządzenia, aby uzyskać łatwy dostęp do modułu ładowania kapilarnego. Weź jedną kapilarę, trzymając ją na jednym końcu i dotknij roztworu w płytce białkowej drugim końcem kapilary, aby przenieść próbkę.

Zawsze noś rękawiczki i upewnij się, że nie dotykasz kapilary pośrodku, ponieważ zanieczyszczenia z rękawic wpłynęłyby na pomiar. Umieść kapilarnę w wyznaczonej pozycji uchwytu, upewniając się, że jest prawidłowo wyrównana i wyśrodkowana, powtórz te kroki, aby wypełnić wszystkie pozycje w module załadowczym. Na koniec umieść pasek magnetyczny na kapilarnach, aby utrzymać je na miejscu i naciśnij Zamknij szufladę, aby rozpocząć eksperyment Nano-DSF.

Otwórz żądanie ściągnięcia aplikacji Prometheus. ThermControl i utwórz nowy projekt, klikając Rozpocznij nową sesję. Najpierw wykonaj skanowanie odkrywcze, aby wykryć fluorescencję próbek. Zmień sygnał fluorescencyjny próbek, dostosowując moc wzbudzenia lasera.

W celu denaturacji termicznej kliknij zakładkę Melting Scan, ustaw temperaturę początkową na 20 stopni Celsjusza, temperaturę końcową na 95 stopni Celsjusza, a nachylenie temperatury na jeden stopień Celsjusza na minutę. Następnie kliknij Rozpocznij pomiar. Przedstawiono tutaj rozkład częstotliwości przesunięcia i temperatury topnienia dla zewnętrznego, kinetycznego lub wysoce eksprymowanego w raku białka jednego, regulatorowej domeny powtórzeń tetratrikopeptydu kinazy monopolarnej wrzeciona 1 i proteazy podobnej do SARS-CoV-2 3c.

Wartości ujemne wskazują na obniżenie temperatury topnienia w obecności fragmentu, podczas gdy wartość dodatnia wskazuje na wzrost temperatury topnienia. W przypadku Nsp5 wszystkie fragmenty mają działanie destabilizujące, podczas gdy w przypadku Hec1 i Mps1 obserwuje się zarówno trafienia stabilizujące, jak i destabilizujące. Jest to tania i szybka metoda przesiewania bibliotek fragmentów.

Inne metody, takie jak NMR lub krystalografia rentgenowska, mogą pokazać dokładne wiązanie fragmentów i są również dostępne dzięki odkryciu INX. Wyniki badań nad proteazą koronawirusa pomogły zaproponować nowe związki, które można przekształcić w leki przeciwko COVID-19.