Name: In Situ Badanie mysiej megakariopoezy przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj metodę analizy ultrastruktury megakariocytów w szpiku kostnym myszy przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta pozwala na precyzyjną identyfikację etapów dojrzewania komórek in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, Davidowi Hoffmannowi, Monique Freund za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Unię Europejską za pośrednictwem Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (EFRR) oraz przez grant ANR-17-CE14-0001-01 dla H.d.S.

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z europejskimi standardami 2010/63/UE oraz Komitetem CREMEAS ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu w Strasburgu (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Protokół jest schematycznie pokazany w Rysunek 1.
1. Pobieranie i utrwalanie szpiku kostnego ( Rysunek 1A)
UWAGA: Ta procedura obejmuje substancje rakotwórcze, mutagenne i/lub toksyczne i jest wykonywana pod kapturem do ekstrakcji chemicznej. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny, taki jak rękawice i okulary ochronne.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór utrwalający składający się z 2,5% aldehydu glutarowego w buforze kakodylowym (patrz plik uzupełniający).</li>
	<li>Pobieranie szpiku kostnego
	<ol>
		<li>Użyj dorosłych myszy C57BL/6 dowolnej płci w wieku 12-18 tygodni. Poddaj myszy eutanazji przez uduszenie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy.</li>
		<li>Cienkimi nożyczkami przetnij skórę wokół uda i użyj pęsety, aby oderwać skórę. Usuń koniec łapy, a następnie przeciąć między biodrem a udem. Odłącz kość piszczelową od kości udowej, przecinając staw kolanowy i usuń przylegającą tkankę na piszczelach i kościach udowych za pomocą skalpela.</li>
		<li>Usuń nasady ostrą żyletką. Trzymając kość udową pęsetą, użyj strzykawki o pojemności 5 ml wypełnionej buforem kakodylowym z igłą 21 G, aby przepłukać szpik kostny do 15 ml probówki wypełnionej 2 ml buforu kakodylowego. W tym celu należy wprowadzić skos igły do otworu szpiku kostnego i powoli naciskać tłok, aż szpik zostanie wydalony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zespolenie szpiku kostnego przez szybkie zanurzenie w utrwalaczu.
	<ol>
		<li>Natychmiast po przepłukaniu za pomocą plastikowej pipety przenieść cylinder szpiku kostnego do 1 ml świeżego roztworu utrwalającego aldehyd glutarowy (uprzednio przygotowanego w 1.1) przez 60 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Aby zachować tkankę, upewnij się, że cały proces, od rozwarstwienia kości do etapu utrwalenia, został zakończony w czasie krótszym niż 10 minut. Do utrwalenia upewnij się, że roztwór utrwalający ma temperaturę pokojową, aby uniknąć szoku cieplnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Osadzanie szpiku kostnego w agarozie
UWAGA: Tkanka szpiku nie jest wystarczająco spójna, aby zachować swoją integralność podczas różnych etapów mycia, a materiał może być łatwo utracony. Aby przezwyciężyć ten problem, szpik jest pokryty żelem agarowym przed odwodnieniem.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór agarozy zgodnie z opisem w dokumentacji dodatkowej.</li>
	<li>Przemyć utrwalony szpik kostny z sekcji 1.3 w buforze kakodylanowym i ostrożnie przenieść go na szkiełko podstawowe za pomocą plastikowej pipety. Za pomocą ciepłej pipety szybko nanieś kroplę 2% płynnego agaru na cylinder szpiku kostnego. 
	UWAGA: Agar szybko krzepnie podczas chłodzenia. Aby zapewnić jednorodne pokrycie szpiku kostnego, roztwór agaru musi być utrzymywany w cieple do momentu osadzenia się na szkiełku.</li>
	<li>Szybko umieść szkiełko na lodzie, aż agar zastygnie (1-2 min).</li>
	<li>Pod mikroskopem użyj ostrej żyletki, aby przeciąć i wyrzucić kończyny cylindra szpiku kostnego ze względu na możliwy ucisk tkanek w tych obszarach. Przenieść bloki szpiku kostnego do 1,5 ml probówek do mikrowirówek zawierających 1 ml buforu kakodylowego.</li>
</ol>
3. Osadzanie szpiku kostnego w żywicy
UWAGA: Składniki żywicy są toksyczne; niektóre są rakotwórcze i muszą być traktowane ostrożnie pod kapturem do ekstrakcji chemicznej. Używaj odpowiedniego sprzętu ochronnego, takiego jak rękawice i okulary ochronne. Tetratlenek osmu jest bardzo lotny w temperaturze pokojowej, a jego opary są bardzo szkodliwe dla oczu, nosa i gardła. Przed wyrzuceniem 2% tetratlenku osmu należy zneutralizować poprzez dodanie dwukrotności jego objętości oleju roślinnego.
<ol>
	<li>Przygotować żywicę epoksydową zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym.</li>
	<li>Osadzanie żywicy 
	UWAGA: Próbki należy przechowywać w tych samych probówkach do mikrowirówek podczas inkubacji w kolejnych kąpielach osmu, octanu uranylu i etanolu. Odessać supernatanty za pomocą pipety Pasteura. Objętość roztworu użytego do każdej kąpieli musi być równa co najmniej 10-krotności objętości próbki.
	<ol>
		<li>Po utrwaleniu bloków z 1% osmem w buforze kakodylowym przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, przemyć raz w buforze kakodylowym, a następnie raz w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Zabarwić 4% octanem uranylu w wodzie destylowanej przez 1 godzinę, dwukrotnie umyć w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Odwodnić za pomocą stopniowanej serii etanolu w wodzie destylowanej: 4 razy w 75% etanolu przez 5 minut, następnie 3 razy w 95% etanolu przez 20 minut, a następnie 3 razy w 100% etanolu przez 20 minut. Na tym etapie wyjmij jedną strzykawkę z żywicą epoksydową z zamrażarki. 
		UWAGA: Protokół można wstrzymać w 100% etanolu na 1 godzinę.</li>
		<li>Aby uzyskać równomierną infiltrację i polimeryzację żywicy epoksydowej wewnątrz szpiku, należy najpierw inkubować bloki w 2 kolejnych kąpielach tlenku propylenu przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać mieszaninę 1:1 100% tlenku propylenu i żywicy epoksydowej i inkubować przez 1 godzinę. Umieścić próbki na powolnej wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 100% żywicy epoksydowej, pozostawić próbkę do inkubacji przez noc pod mieszaniem.</li>
		<li>Dodaj 100% żywicy epoksydowej na 2 godziny inkubacji, nadal pod mieszaniem.</li>
		<li>Pod mikroskopem umieść bloki szpiku w płaskich silikonowych foremkach. Ułożyć próbki w taki sposób, aby umożliwić późniejsze przekroje poprzeczne całego szpiku kostnego. Wypełnij formy żywicą epoksydową i umieść je w temperaturze 60 °C na 48 h. 
		UWAGA: Wszystkie roztwory (z wyjątkiem etanolu i tlenku propylenu) są filtrowane przez filtr 0,22 μm, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek. Aby zapewnić odpowiednią polimeryzację żywicy, należy unikać pęcherzyków powietrza podczas napełniania form.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ultracienkie przekroje (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)
UWAGA: Transmisja EM wymaga cienkich odcinków tkanki, przez które mogą przechodzić elektrony, generując obraz projekcyjny wnętrza komórek, struktury i organizacji wewnętrznych organelli (ziarnistości, retikulum endoplazmatyczne, Golgiego) oraz układu wewnątrzkomórkowych błon komórkowych.
<ol>
	<li>Zamontuj blok próbki w ultramikrotomowym wsporniku. Umieść go na uchwycie na próbkę. Przycinać próbki pod kątem 45° w celu usunięcia nadmiaru żywicy wokół tkanki za pomocą obracającego się frezu diamentowego lub wolframowego.</li>
	<li>Zamontuj próbki na ultramikrotomie za pomocą diamentowego ostrza noża wyposażonego w zbiornik na wodę. Ciąć przekroje poprzeczne o grubości 500 nm i 100 nm odpowiednio do analiz histologicznych i TEM. Zbierz pływające sekcje na powierzchni wody za pomocą pętli.</li>
	<li>Umieść odcinek o grubości 500 nm na szkiełku podstawowym, a odcinki o grubości 100 nm na cienkich kratkach miedzianych o oczkach 200 z filtrem papierowym pod spodem. Przygotuj pięć siatek dla jednego warunku: najpierw zabejcuj dwie siatki i zachowaj trzy pozostałe siatki jako kopię zapasową, jeśli to konieczne.</li>
</ol>
5. Barwienie błękitem toluidynowym do histologii
UWAGA: Barwienie skrawków do histologii jest ważne z trzech powodów: 1) aby upewnić się, że tkanka jest rzeczywiście cięta, a nie żywica, 2) aby sprawdzić jakość inkluzji i 3) aby szybko ocenić próbkę szpiku. Jeśli nie jest to poprawne, wtnij głębiej w blok.
<ol>
	<li>Wysuszyć półcienkie sekcje szkiełka na płycie grzewczej (60 °C).</li>
	<li>Dodać przefiltrowany 1% błękitu toluidynowego/1% boranu sodu do wody destylowanej na szkiełka i podgrzewać na płycie grzejnej (60 °C) przez 1-2 minuty. Umyj szkiełka wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia na płycie grzewczej.</li>
	<li>Zamocuj skrawki na szkiełkach nakrywkowych za pomocą kropli podłoża montażowego z poli(metakrylanu butylu-kometakrylanu metylu) i zbadaj pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
6. Barwienie metali ciężkich do obserwacji TEM (Rysunek 1C)
UWAGA: Dla kontrastu, górna strona siatek jest odwrócona na 100 μL kropli każdej kolejnej kąpieli za pomocą pętli. Przed użyciem każdy roztwór jest filtrowany w 0,22 μm. Usuń nadmiar płynu między każdą kąpielą, delikatnie dotykając strony siatki na bibule filtracyjnej.
<ol>
	<li>Barwienie 4% octanem uranylu w wodzie destylowanej przez 5 min.</li>
	<li>Umyć 3 razy w wodzie destylowanej przez 5 min.</li>
	<li>Barwienie cytrynianem ołowiu przez 3 min.</li>
	<li>Umyć 3 razy w wodzie destylowanej przez 5 min.</li>
	<li>Umieść kratki dolną stroną w kontakcie z bibułą filtracyjną, aby mogły wyschnąć. 
	UWAGA: Metale ciężkie reagują w obecności dwutlenku węgla. Aby zminimalizować wytrącenia, unikaj przemieszczania się powietrza podczas kontrastu, nie mów, utrzymuj otoczenie w spokoju i wyłącz klimatyzację.</li>
</ol>
7. TEM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E)
UWAGA: Sekcje są wprowadzane do mikroskopu TEM i badane pod napięciem 120 kV.
<ol>
	<li>Najpierw zbadaj skrawki w małym powiększeniu (< 500x), aby ocenić ogólny aspekt preparatu (brak w żywicy, fałdy/ściskanie w sekcjach, wytrącenia się spowodowane barwieniem).</li>
	<li>Następnie zbadaj skrawki w większym powiększeniu (~2000x pozwalającym na rozróżnienie etapu dojrzewania). Policz ręcznie megakariocyty z każdego etapu dojrzewania na całych odcinkach poprzecznych (patrz Reprezentatywne wyniki, aby dowiedzieć się, jak wizualnie zidentyfikować każdy etap). 
	UWAGA: Każdy kwadrat siatki jest zdefiniowany jako obszar do zbadania (co odpowiada 16000 μm2 dla siatek miedzianych o siatce 200</li>).
	<li>Aby ocenić liczbę megakariocytów, określ ilościowo tylko kwadraty, które są w pełni pokryte sekcją. W tym celu należy użyć modelu opartego na przesiewaniu zakresów. Obserwuj pierwszy zakres kwadratów od końca sekcji do drugiego, a następnie kolejny zakres w ten sam sposób itd. Korzystając z tej procedury, należy w pełni i systematycznie przesiewać cały przekrój poprzeczny szpiku kwadrat po kwadracie.</li>
	<li>Dla każdego kwadratu należy określić liczbę megakariocytów etapu I, II lub III. 
	UWAGA: Większe powiększenia są wymagane do analizy granulek, organizacji DMS, wielkości terytoriów cytoplazmatycznych i polizbularyzowanego jądra.</li>
</ol>

<ol><li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incredible+journey%3A+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li>
<li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+%28HIV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9(1989).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+%28DMS%29+in+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li>
<li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+megakaryocytes+to+platelets%3A+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets+and+Megakaryocytes%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061(2018).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024(2020).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+%CE%B1-Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li>
<li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emperipolesis%2C+entosis+and+cell+cannibalism%3A+Demystifying+the+cloud%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92(2017).</li>
<li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Bezpośrednie badanie megakariocytów w ich naturalnym środowisku jest niezbędne do zrozumienia megakariopoezy i tworzenia płytek krwi. W niniejszej pracy przedstawiono metodę transmisyjnej mikroskopii elektronowej łączącą płukanie i utrwalanie szpiku kostnego przez zanurzenie, co pozwala na analizę in situ charakterystyki morfologicznej całego procesu morfogenezy megakariocytów zachodzącego w szpiku kostnym.
Płukanie szpiku kostnego jest kluczowym etapem tej metody, ponieważ powodzenie...

Megakariocyty to wyspecjalizowane duże komórki poliploidalne, zlokalizowane w szpiku kostnym, odpowiedzialne za produkcję płytek krwi1. Pochodzą one z hematopoetycznych komórek macierzystych w skomplikowanym procesie dojrzewania, podczas którego prekursory megakariocytów stopniowo zwiększają swój rozmiar, przechodząc jednocześnie rozległe zmiany morfologiczne w cytoplazmie i jądrze2. Podczas dojrzewania megakariocyty rozwijają szereg wyróżniających się elementów strukturalnych, w tym: jądro polizrazikowe, wgłębienia błony powierzchniowej, które tworzą system błony demarkacyjnej (DMS), strefę obwodową pozbawioną organelli otoczoną siecią cytoszkieletu opartą na aktynie oraz liczne organelle, w tym α-granulki, gęste granulki, lizosomy i wiele kompleksów Golgiego. Na poziomie ultrastrukturalnym główną zaobserwowaną modyfikacją jest cytoplazmatyczna podział na dyskretne regiony ograniczone przez DMS3. Ta rozległa podaż błon będzie napędzać wydłużenie długich procesów cytoplazmatycznych w początkowej fazie produkcji płytek krwi, które następnie przekształcą się w płytki krwi wewnątrz krążenia. Wszelkie defekty podczas różnicowania i dojrzewania megakariocytów mogą wpływać na wytwarzanie płytek krwi pod względem liczby płytek krwi i/lub funkcji płytek krwi. 
Cienkowarstwowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) jest od dziesięcioleci preferowanym podejściem do obrazowania, dostarczając wysokiej jakości ultrastruktury megakariocytów, które ukształtowały nasze zrozumienie fizjologii trombopoezy4,5. W artykule skoncentrowano się na standaryzowanej metodzie TEM pozwalającej na uchwycenie procesu biogenezy płytek krwi zachodzącego in situ w natywnym mikrośrodowisku szpiku kostnego, która może również służyć jako podstawa do analizy dowolnego typu komórek szpiku kostnego. Podajemy ultrastrukturalne przykłady rozwoju megakariocytów od niedojrzałych do w pełni dojrzałych, które rozszerzają procesy cytoplazmatyczne na mikrokrążenie sinusoidów6. Opisujemy również prostą procedurę ilościowego określania różnych etapów dojrzewania megakariocytów, instruując o zdolności regeneracji i produkcji płytek krwi szpiku kostnego.

<table><tbody><tr><td>2,4,6-Tri(dimetyloaminometylo)fenol (DMP-30)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza typu LM-3 Mikroskopia elektronowa agaru o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Sciences, USA</td><td>1670-B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Sześciowodny chlorek wapnia</td><td>Merck, Niemcy</td><td>2083</td><td></td></tr><tr><td>Siatki miedziane 200 mesh thin-bar</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, Anglia</td><td>T200-CU</td><td></td></tr><tr><td>Trójwodzian soli sodowej kwasu dimetyloarsynowego</td><td>Merck, Niemcy</td><td>8.20670.0250</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik bursztynowy Dodecenylu (DDSA)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21340</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka ze stali nierdzewnej z podwójną krawędzią</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences-EMS, USA</td><td>EM-72000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>VWR International, Francja</td><td>20821296</td><td></td></tr><tr><td>Filtr papier o średnicy 90 mm</td><td>Whatman, Anglia</td><td>512-0326</td><td></td></tr><tr><td>Płaska forma silikonowa do zatapiania</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientific, Anglia</td><td>G3533</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 25%</td> <td>Mikroskopia elektronowa Sciences-EMS, USA</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza Leica EMMP</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>705402</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy Histo 45&deg;</td><td>Diatome, Szwajcaria</td><td>1044797</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop TEM JEOL 2100 Plus</td><td>JEOL, Japonia</td><td>EM-21001BU</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu - Ultrostain 2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>70 55 30 22</td><td></td></tr><tr><td>Żywica LX-112</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma, Francja</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe - Poli(metakrylan butylu-ko-metakrylan metylu)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences-EMS, USA</td><td>15320</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik nadic metylu (NMA)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Tetroxide osmu 2%</td><td>Merck, Niemcy</td><td>19172</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek propylenu (1,2-epoksypropan)</td><td>Sigma, Francja</td><td>82320-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej do wstrzykiwań 0,9% NaCl</td><td>C.D.M Lavoisier, Francja</td><td>MA 575 420 6</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel Ostrze ze stali chirurgicznej</td><td>Swann-Morton,</td> <td>Anglia.0508</td><td></td></tr><tr><td>Tetraboran sodu - Boraks</td><td>Sigma, Francja</td><td>B-9876</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck, Niemcy</td><td>84100-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; m</td><td>Pall Corporation, Stany Zjednoczone</td><td>514-4126</td><td></td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>N10-70975</td><td></td></tr><tr><td>Trymer EM TRIM2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>702801</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>656201</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Ladd Research Industries, Stany Zjednoczone</td><td>23620</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ badanie mysiej megakariopoezy przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Różnicowanie i dojrzewanie megakariocytów zachodzi w ścisłym związku z komórkowymi i zewnątrzkomórkowymi składnikami szpiku kostnego. Procesy te charakteryzują się stopniowym pojawianiem się niezbędnych struktur w cytoplazmie megakariocytów, takich jak poliploidalne i polizbulizowane jądro, wewnętrzna sieć błonowa zwana systemem błony demarkacyjnej (DMS) oraz gęste i alfa granulki, które znajdą się w krążących płytkach krwi. W artykule opisano ustandaryzowany protokół badania ultrastrukturalnego in situ mysich megakariocytów z wykorzystaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), pozwalający na identyfikację kluczowych cech określających ich etap dojrzewania i gęstość komórkową w szpiku kostnym. Szpik kostny jest przepłukiwany, utrwalany, odwadniany w etanolu, zatapiany w żywicy z tworzywa sztucznego i montowany w celu wytworzenia przekrojów poprzecznych. Skrawki półcienkie i cienkie przygotowuje się odpowiednio do obserwacji histologicznych i TEM. Metoda ta może być stosowana do dowolnej komórki szpiku kostnego, w dowolnym zakładzie EM, a jej zaletą jest to, że wykorzystuje małe rozmiary próbek, co pozwala na połączenie kilku podejść do obrazowania na tej samej myszy.

Histologia szpiku kostnego 
Obserwacja histologiczna szpiku kostnego barwionego błękitem toluidynowym pod mikroskopem świetlnym jest kluczowa dla szybkiej analizy ogólnej architektury tkanki pod kątem m.in. zwartości tkanki, ciągłości mikronaczyni oraz wielkości i kształtu megakariocytów (Rycina 1D). Jest ona wykonywana przed przygotowaniem przekrojów ultrazadniich w celu ustalenia konieczności cięcia głębiej w bloku szpiku kostnego. Ze względu na swój ol...

Tutaj prezentujemy protokół do analizy ultrastruktury megakariocytów in situ za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Mysie szpiki kostne są zbierane, mocowane, zatapiane w żywicy epoksydowej i cięte na ultracienkie odcinki. Po barwieniu kontrastowym szpik kostny obserwuje się pod mikroskopem TEM przy napięciu 120 kV.

In Situ Badanie mysiej megakariopoezy przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja ultrastruktury megakariocytów znajdujących się w szpiku kostnym myszy oraz ilościowe określenie różnych etapów dojrzewania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości. Główną zaletą jest bezpośrednie badanie megakariocytów w rodzimym środowisku, które różni się od megakariocytów hodowanych in vitro, które jak wiemy nie osiągają pełnego poziomu dojrzałości. Po pobraniu kości piszczelowej i udowej od 12-18-tygodniowych myszy C57BL/6 zgodnie ze standardowymi protokołami, użyj ostrej żyletki, aby usunąć nasady z każdej kości.Trzymając każdą kość pęsetą, włóż igłę o rozmiarze 21 G przymocowaną do pięciomililitrowej strzykawki wypełnionej buforem kakodylowym do jednego końca kości i przepłucz szpik kostny do 15-mililitrowej probówki zbiorczej zawierającej dwa mililitry świeżego buforu kakodylanu. Natychmiast po przepłukaniu użyj plastikowej pipety, aby przenieść cylindry szpiku kostnego do jednego mililitra świeżego roztworu utrwalającego aldehyd glutarowy na 60-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. W celu zatopienia szpiku kostnego w agarozie, należy umyć utrwalone próbki w świeżym buforze kakodylowym i za pomocą plastikowej pipety ostrożnie przenieść szpik kostny do szkiełka podstawowego.Za pomocą ciepłej pipety szybko nanieś kroplę 2% płynnego agaru na cylindry szpiku kostnego i natychmiast umieść szkiełko na lodzie na jedną do dwóch minut. Gdy agar zastygnie, użyj mikroskopu stereoskopowego i ostrej żyletki, aby odrzucić kończyny każdego cylindra szpiku kostnego i przenieść przycięte bloki szpiku do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr buforu kakodylowego. W celu zatopienia żywicy należy przymocować bloki 1% tetratlenkiem osmu w buforze kakodylanu w kapturze chemicznym przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie umyć bloki raz buforem kakodylowym i raz wodą destylowaną.Po umyciu wodą zabarwić bloki 4% octanem uranylu w wodzie destylowanej przez godzinę, a następnie dwukrotnie przepłukać w wodzie destylowanej, jak pokazano. Po ostatnim praniu odwodnić bloki poprzez rosnącą serię zanurzeń w etanolu i wodzie destylowanej, jak wskazano. Aby uzyskać równomierną infiltrację i polimeryzację żywicy epoksydowej wewnątrz szpiku, należy inkubować bloki w dwóch kolejnych kąpielach tlenku propylenu przez 15 minut, a następnie inkubować próbki w mieszaninie 100% tlenku propylenu i żywicy epoksydowej jeden do jednego przez godzinę na powolnej wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji dodaj 100% żywicy epoksydowej do bloków szpiku w celu inkubacji przez noc w tych samych warunkach, a następnie dodaj 100% żywicy epoksydowej na kolejną inkubację trwającą dwie godziny. Pod koniec inkubacji użyj mikroskopu, aby zorientować bloki szpiku w płaskich formach silikonowych, aby umożliwić ich późniejsze przekrojenie poprzeczne i wypełnij formy żywicą epoksydową przed umieszczeniem ich w temperaturze 60 stopni Celsjusza na 48 godzin. W przypadku ultracienkiego przekroju zamontuj blok próbki na wsporniku ultramikrotomu i zamontuj wspornik na uchwycie próbki.Użyj frezu diamentowego, aby przyciąć próbki pod kątem 45 stopni, aby usunąć nadmiar żywicy wokół tkanki, a następnie użyj ostrza noża diamentowego wyposażonego w zbiornik na wodę do cięcia poprzecznych odcinków o grubości 500 i 100 nanometrów odpowiednio do analizy histologicznej i TEM, a następnie użyj pętli, aby przenieść odcinki o grubości 500 nanometrów unoszące się na powierzchni wody na szklane szkiełko i zdeponować 100 nanometrów grubości sekcje na siatkach miedzianych o grubości 200 siatek z cienkimi prętami z filtrem papierowym pod spodem. W przypadku barwienia błękitem toluidyny, po narysowaniu odcinków o grubości 500 nanometrów na płycie grzejnej o temperaturze 60 stopni, dodaj przefiltrowany 1% błękit toluidynowy w wodzie destylowanej do sekcji na jedną do dwóch minut inkubacji. Pod koniec inkubacji przemyć próbki wodą destylowaną.Gdy szkiełka wyschną, użyj podłoża montażowego, aby zamocować próbki za pomocą szkiełka nakrywkowego i view próbki za pomocą mikroskopii świetlnej. W celu barwienia kontrastowego oznacz odcinki o długości 100 nanometrów 4% octanem uranylu przez pięć minut, a następnie trzy pięciominutowe płukanie wodą destylowaną. Po ostatnim praniu zabarwić skrawki cytrynianem ołowiu przez trzy minuty, a następnie trzy pięciominutowe płukania w wodzie destylowanej, jak pokazano.Po ostatnim praniu należy najpierw umieścić dolną stronę każdej siatki w kontakcie z kawałkiem bibuły filtracyjnej, aby umożliwić umieszczenie kratek na bibule filtracyjnej do wyschnięcia. Aby zbadać skrawki za pomocą TEM, po wyschnięciu kratek, należy wybrać małe powiększenie, aby ocenić ogólną jakość preparatów. Aby określić liczbę megakariocytów z każdego etapu dojrzewania w każdym przekroju poprzecznym, wybierz większe powiększenie i określ ilościowo liczbę megakariocytów etapu I, II lub III tylko w kwadratach, które są całkowicie pokryte tkanką.W tej reprezentatywnej analizie histologicznej można wyraźnie zaobserwować zwartość, ciągłość mikronaczyń oraz wielkość i kształt megakariocytów. Mysie megakariocyty dzielą się na cztery etapy dojrzewania. Megakariocyty w stadium I mają duże jądro.Obecność najwcześniejszego wykrywalnego etapu systemu błon demarkacyjnych jest również kluczowym kryterium tego etapu. W II etapie rozpoczyna się tworzenie granulek i inicjowany jest rozwój systemu błon demarkacyjnych. Megakariocyty w stadium III to gigantyczne komórki z dobrze rozwiniętymi systemami błon demarkacyjnych, wyraźnie określonymi terytoriami cytoplazmatycznymi i strefami obwodowymi pozbawionymi organelli oraz ekscentrycznie położonymi jądrami.Etap pirecytów dojrzewania megakariocytów charakteryzuje się nagim jądrem. Jak pokazano, megakariocyty są często obserwowane w kontakcie z komórkami śródbłonka. Czasami megakariocyty tworzą krótkie inwazyjne wypukłości, które wnikają w śródbłonek lub przedłużają propłytki do światła sinusoidalnego.TEM pozwala również na wizualizację ultrastrukturalnych szczegółów, a także obecności komórek krwiotwórczych, które zostały pochłonięte przez megakariocyty. Przepłukanie szpiku kostnego należy przeprowadzić ostrożnie i natychmiast po wycięciu kości. Aby zmaksymalizować integralność tkanek, szpik jest otoczony żelem z agaru przed odwodnieniem.Po tej procedurze bloki szpiku kostnego mogą być obrazowane w różnych powiększeniach lub mogą być wykorzystywane do innych analiz mikroskopii elektronowej 3D, takich jak skaningowa mikroskopia elektronowa ze skupioną wiązką jonów.

in-situ-exploration-murine-megakaryopoiesis-using-transmission

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę identyfikacji populacji enukleujących się ortochromatycznych erytroblastów za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej, zapewniając wizualizację procesu enukleacji erytroblastów.

Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Monocyty są ważnymi mediatorami arteriogenezy w kontekście choroby tętnic obwodowych. Wykorzystując macierz przypominającą błonę podstawną i mikroskopię przyżyciową, protokół ten bada naprowadzanie monocytów i angiogenezę związaną z nowotworem po wstrzyknięciu monocytów w mysim modelu podwiązania tętnicy udowej.

Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Opisujemy tutaj metodę obrazowania megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kości czaszki żywych myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

Tutaj prezentujemy strategię immunofenotypowania do charakterystyki różnicowania megakariocytów i pokazujemy, jak ta strategia pozwala na sortowanie megakariocytów na różnych etapach za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją. Metodologia ta może być stosowana do pierwotnych tkanek ludzkich, ale także do megakariocytów wytwarzanych w hodowli in vitro.

Immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich MK ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych

Procedura nawleczenia ran kłutych w celu tworzenia hemostatycznej skrzepliny jest przedstawiona tutaj. Powstałe skrzepliny są duże i mają średnicę setek mikronów. W związku z tym odpowiednie są podejścia do obrazowania objętościowego. Sugerujemy zmontowaną transmisyjną mikroskopię elektronową o dużym obszarze jako podejście o wysokiej rozdzielczości dostępne dla wielu osób i szczegółowo opisując protokół przygotowawczy.

Hemostaza rany kłutej i przygotowanie próbek do analizy w zmontowanej mikroskopii elektronowej

Poznaj metodę analizy ultrastruktury megakariocytów w szpiku kostnym myszy przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta pozwala na precyzyjną identyfikację etapów dojrzewania komórek in situ.

In Situ Badanie mysiej megakariopoezy przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów