Name: Izolacja progenitorów megakariocytów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę izolacji progenitorów megakariocytów (MEP i MKp) z kości myszy z wykorzystaniem grzebienia biodrowego. Protokół zapewnia wysoką czystość komórek przy zmniejszonej liczbie zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Monique Freund, Catherine Ziessel i Ketty za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) oraz przez Grant ANR-17-CE14-0001-01 dla Henri.de la. Salle.

Protokoły z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu Etyki Eksperymentów na Zwierzętach CREMEAS Uniwersytetu w Strasburgu (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg. Numer zezwolenia: E67-482-10).
1. Pobieranie kości myszy
<ol>
	<li>Uśmierć zwierzę zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. 
	UWAGA: Dane przedstawione w niniejszym opracowaniu uzyskano od myszy C57Bl/6 w wieku od 8 do 12 tygodni. Liczba uzyskanych komórek oraz częstość występowania cytowanych populacji mogą różnić się w zależności od wieku i szczepu myszy.</li>
	<li>Spryskaj ciało 70% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie skóry o długości 0,5-1 cm prostopadle do kręgosłupa i odrze skórę z całego ciała. Odsuń skórę z dolnej części ciała i usuń ją.</li>
	<li>Połóż zwierzę na podkładce do sekcji, brzuchem do dołu. Zlokalizuj kości miednicy, przesuwając palcami wzdłuż odsłoniętego kręgosłupa od góry do dołu. Aby zlokalizować grzebień biodrowy, zidentyfikuj niewielkie uwypuklenie w odcinku lędźwiowym w pobliżu kończyn tylnych (przednio-górny obszar kości miednicy). Rysunek 1A,B przedstawia schemat anatomiczny myszy.</li>
</ol>
<img alt="Schemat anatomii szkieletu myszy z opisanymi kośćmi miednicy, kością udową i piszczelową do celów edukacyjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Anatomia myszy. (A) RTG myszy przedstawiające kości kończyn dolnych. Należy zwrócić uwagę na przestrzeń między kością miednicy a kręgosłupem (żółta strzałka), w którą należy wsunąć nożyczki, aby prawidłowo oddzielić kończyny dolne od tułowia myszy (żółta linia przerywana). (B) Schematyczne przedstawienie wybranych kości bogatych w szpik kostny. Kości miednicy zaznaczono na czerwono, kości udowe na fioletowo, a kości piszczelowe na zielono. (C) Schematyczne przedstawienie kości miednicy myszy. Kość biodrowa odpowiada części kości miednicy bogatej w szpik i jest wyróżniona na czerwono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="5">
	<li>Umieść nożyczki równolegle do kręgosłupa, przytrzymując je przy kręgach i blisko wybrzuszenia grzebienia biodrowego. Przystąp do rozcięcia mięśni wzdłuż kręgosłupa nad kością miednicy, przesuwając nożyczki wzdłuż kręgów aż do ogona. 
	UWAGA: To pierwsze cięcie mięśni można wykonać również za pomocą ostrza skalpela.</li>
	<li>Umieść nożyczki równolegle do kręgosłupa i rozetnij tkanki między kręgami a grzebieniem biodrowym, zgodnie z żółtą linią przerywaną na Rysunku 1A. Pamiętaj, aby pozostać jak najbliżej kręgów. Dotnij pozostałe mięśnie, aby oddzielić kończynę od ciała. 
	UWAGA: Opór powinien być niewielki lub w ogóle go nie być.</li>
	<li>Powtórz czynność po drugiej stronie, aby oddzielić drugą kończynę.</li>
	<li>Przenieś kończyny na czystą powierzchnię, a resztę ciała zutylizuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Odsłoń kości miednicy, kości udowe i piszczelowe, usuwając pęsetą i skalpelami jak najwięcej otaczających tkanek.</li>
	<li>Przystąp do ostrożnego zwichnięcia głowy kości udowej z kości miednicy, trzymając dystalny koniec kości udowej pęsetą i delikatnie rozcinając skalpelami mięśnie wokół stawu. Poruszaj kośćmi, aby ułatwić zwichnięcie.</li>
	<li>Zeskrob pozostałe mięśnie z kości miednicy i wykonaj skalpelem nacięcie w środku jamki, w której znajdowała się głowa kości udowej. Kość biodrowa zostaje zachowana, ponieważ jest bogata w progenitorów hematopoetycznych, natomiast trójkątna, bardzo cienka część kości zostaje odrzucona, jak pokazano na Rysunku 1C.</li>
	<li>Usuń pozostałe tkanki wokół kości biodrowej skalpelem i umieść oczyszczoną kość w sterylnym PBS uzupełnionym o 2% Newborn Calf Serum (PBS-2%NBCS).</li>
	<li>Za pomocą nożyczek odetnij stopę od nogi na wysokości kostki.</li>
	<li>Przytrzymaj dolną część kości piszczelowej pęsetą i zeskrob mięśnie w kierunku kolana. Usuń kości strzałkowe i przetnij skalpelem plateau kości piszczelowej. Umieść kość piszczelową w sterylnym PBS-2%NBCS.</li>
	<li>Usuń pozostałe tkanki wokół kości udowej za pomocą skalpeli.</li>
	<li>Przytrzymaj górną część kości udowej pęsetą; ustaw ostrze skalpela u podstawy rzepki. Przyłóż siłę w kierunku rzepki równolegle do kości udowej, aż do oddzielenia rzepki. Umieść kość udową w sterylnym PBS-2%NBCS. Usunięcie rzepki zapewnia swobodny dostęp do wprowadzenia igły do płukania szpiku.</li>
</ol>
2. Magnetyczne usuwanie komórek lineage-dodatnich
<ol>
	<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieść kości do sterylnej szalki Petriego wypełnionej sterylnym PBS-2%NBCS.</li>
	<li>Za pomocą skalpela odciąć głowy kości udowych.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę 1 mL sterylnym PBS-2%NBCS i przymocować do wylotu igłę 21 G.</li>
	<li>Napełnić polipropylenową probówkę 5 mL ilością 2 mL sterylnego PBS-2%NBCS.</li>
	<li>Przytrzymać kość udową pęsetą; ostrożnie wprowadzić igłę w zagłębienie powstałe po usunięciu rzepki. Podczas wprowadzania obracać igłę, aby zapobiec jej zapchaniu. Upewnić się, że igła została całkowicie wprowadzona do kości aż do ścięcia.</li>
	<li>Przenieść kość wraz z igłą do probówki zawierającej 2 mL PBS-2%NBCS. Wypłukiwać kość, tłocząc i zasysając PBS-2%NBCS ze strzykawki, aż zostanie ona oczyszczona.</li>
	<li>Wyjąć igłę z kości udowej i wprowadzić ją w otwór po przeciwnej stronie, w miejscu, gdzie znajdowała się głowa kości udowej. Ponownie tłoczyć i zasysać bufor, a następnie zutylizować kość.</li>
	<li>W przypadku grzebieni biodrowych i kości piszczelowych przytrzymać kość pęsetą; ostrożnie wprowadzić igłę z otwartej strony. Podczas wprowadzania obracać igłę, aby zapobiec jej zapchaniu. Upewnić się, że igła została całkowicie wprowadzona do kości aż do ścięcia. Przenieść kość wraz z igłą do probówki zawierającej 2 mL PBS-2%NBCS. Wypłukiwać kość, tłocząc i zasysając PBS-2%NBCS ze strzykawki, aż zostanie ona oczyszczona. Zutylizować kości. 
	UWAGA: Kości z maksymalnie trzech myszy można wypłukać do jednej probówki. Połączyć zawiesiny komórkowe.</li>
	<li>Przepuścić połączoną zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 40 µm umieszczone na sterylnej polistyrenowej probówce 5 mL.</li>
	<li>Przejść do zliczania komórek. 
	UWAGA: Zliczanie komórek można przeprowadzić za pomocą dowolnego hemocytometru, stosując błękit trypanu do oceny żywotności, lub za pomocą dowolnego automatycznego licznika komórek. Jedna mysz dostarcza zazwyczaj 105 ± 7 x 106 komórek.</li>
	<li>Odbrać 100 µL zawiesiny komórkowej jako całkowity szpik kostny (Total Bone Marrow), dodać 500 µL PBS-2%NBCS i przechowywać w lodzie do procedury barwienia.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowaną zawiesinę przy 400 x g przez 5 min w 4 °C i usunąć nadsącz. 
	UWAGA: Erytrocyty można zlizować, resuspendując osad w świeżo przygotowanym roztworze lizującym (Lysis Solution, 1/10th w dH2O). Inkubować przez 5 min, aż zawiesina stanie się przejrzysta i jasnoczerwona, a następnie dodać 10 objętości sterylnego PBS. Przejść do przemycia komórek w PBS-2%NBCS poprzez wirowanie przy 400 x g przez 5 min w 4 °C. Należy zachować ostrożność podczas usuwania nadsączu, ponieważ osad komórkowy jest bardzo luźny. Przeprowadzić drugie przemycie w PBS-2%NBCS przez wirowanie przy 400 x g przez 5 min w 4 °C i przejść do kroku 2.13.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w świeżo przygotowanym koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych w stosunku 100 µL na 1 x 107 komórek. Inkubować w lodzie przez 30-45 min.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Przeciwciało</td>
			<td >Rozcieńczenie</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Gr-1-biotin</td>
			<td >1:500</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >B220-biotin</td>
			<td >1:500</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Mac-1-biotin</td>
			<td >1:500</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD3-biotin</td>
			<td >1:500</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD4-biotin</td>
			<td >1:500</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD5-biotin</td>
			<td >1:500</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD8-biotin</td>
			<td >1:500</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >TER119-biotin</td>
			<td >1:1000</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CD127-biotin</td>
			<td >1:500</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1.
<ol start="14">
	<li>Odbierz 10 µL zawiesiny komórkowej do sterylnej probówki polistyrenowej o pojemności 5 mL oznaczonej jako Lin-Pos Fraction. Dodaj 90 µL PBS-2%NBCS i przechowuj na lodzie do czasu przeprowadzenia procedury barwienia.</li>
	<li>Przeprowadź dwukrotne przemycie komórek sterylnym PBS-2%NBCS poprzez wirowanie przy 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że ostatnie przemycie zostanie wykonane w sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 5 mL.</li>
	<li>Podczas etapów przemywania przygotuj kuleczki do magnetycznego usuwania.
	<ol>
		<li>Resuspenduj kuleczki w fiolce, intensywnie mieszając w vortexie przez 30 s.</li>
		<li>Przenieś objętość kuleczek odpowiadającą dwóm kuleczkom na jedną komórkę docelową do probówki polipropylenowej o pojemności 5 mL.</li>
		<li>Przemyj kuleczki dwukrotnie roztworem PBS-2%NBCS, umieszczając probówkę na magnesie i usuwając bufor myjący za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura.</li>
		<li>Resuspenduj kuleczki w 500 µL sterylnego PBS-2NBCS%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Resuspenduj osad oznakowanych komórek w 250 µL zawiesiny kuleczek i mieszaj delikatnie przez 5 min na lodzie. Dodaj 2 mL sterylnego PBS-2%NBCS i wymieszaj delikatnie. Nie potrząsaj probówką.</li>
	<li>Umieść probówkę na magnesie na 2 min.</li>
	<li>Zbierz frakcję niemagnetyczną za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura i dodaj ją do pozostałych 250 µL kuleczek magnetycznych. Zamknij probówkę paraflem.</li>
	<li>Umieść probówkę na rotatorze do probówek na 20 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 2 mL sterylnego PBS-2%NBCS i wymieszaj delikatnie. Nie potrząsaj probówką.</li>
	<li>Umieść probówkę w magnesie na 2 min.</li>
	<li>Zbierz frakcję niemagnetyczną do sterylnej probówki polipropylenowej o pojemności 5 mL oznaczonej jako Lin-Neg Fraction za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura.</li>
	<li>Zwiruj komórki przy 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad, a następnie usuń nadsącz.</li>
	<li>Resuspenduj komórki niemagnetyczne w 500 µL sterylnego PBS-2%NBCS.</li>
	<li>Przejdź do zliczenia komórek. 
	UWAGA: Jedna mysz dostarcza zazwyczaj 3,9 ± 1,1 x 106 komórek. Typowe barwienie linii przed i po usuwaniu przedstawiono na Rysunku 2B.</li>
</ol>
3. Sortowanie komórek progenitorowych megakariocytów metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Pobrać probówki oznakowane jako Total Bone Marrow, Lin-Pos Fraction oraz Lin-Neg Fraction.</li>
	<li>Zawartość probówki Total Bone Marrow rozdzielić w równych częściach do sześciu sterylnych polistyrenowych probówek o pojemności 5 mL. Probówki ponumerować od 1 do 6.</li>
	<li>Probówkę Lin-Pos Fraction oznakować numerem 7.</li>
	<li>Zawartość probówki Lin-Neg Fraction rozdzielić w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przenieść 50 µL do sterylnej polistyrenowej probówki o pojemności 5 mL zawierającej 250 µL sterylnego PBS-2%NBCS. Następnie zawartość tę rozdzielić w równych częściach do 3 sterylnych polistyrenowych probówek o pojemności 5 mL. Probówki te ponumerować od 8 do 10.</li>
		<li>Pozostałe 450 µL zawiesiny komórkowej Lin-Neg Fraction stanowi zawartość probówki numer 11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do probówek dodać przeciwciała zgodnie z opisem w Tabeli 2.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Probówka</td>
			<td >Etykieta</td>
			<td >Koktajl przeciwciał</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3" >Całkowity szpik kostny</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >1</td>
			<td >Kontrola niebarwiona</td>
			<td></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >2</td>
			<td >Kontrola barwiona pojedynczo</td>
			<td >CD45-FITC (1/200)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >3</td>
			<td >Kontrola barwiona pojedynczo</td>
			<td >CD45-PE (1/200)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >4</td>
			<td >Kontrola barwiona pojedynczo</td>
			<td >TER119-APC (1/200)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >5</td>
			<td >Kontrola barwiona pojedynczo</td>
			<td >CD45-PECy7 (1/200)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >6</td>
			<td >Kontrola barwiona pojedynczo</td>
			<td >CD45-APC-Cy7 biotyna (1/200)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3" >Frakcja Lin-Pos</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >7</td>
			<td >Kontrola barwiona pojedynczo</td>
			<td >Kontrola barwiona pojedynczo. Streptawidyna-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="3" >Frakcja Lin-Neg</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >8</td>
			<td >Kontrola FMO FITC</td>
			<td > c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + 
			CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptawidyna-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >9</td>
			<td >Kontrola FMO PE</td>
			<td >CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptawidyna-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >10</td>
			<td >Kontrola FMO PECy7</td>
			<td >CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + 
			CD16/32-PE (1/200) + Streptawidyna-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >11</td>
			<td >Probówka pozytywna do sortowania</td>
			<td >CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + 
			CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptawidyna-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2.
<ol start="6">
	<li>Inkubować na lodzie przez 30-45 min w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki sterylnym PBS-2%NBCS poprzez wirowanie przy 400 x g przez 5 min w 4 °C.</li>
	<li>Resuspender osady komórkowe w następujący sposób.
	<ol>
		<li>W przypadku probótek od 1 do 10, resuspender osad w 300 µL sterylnego PBS-2%NBCS uzupełnionego o 7AAD (stężenie końcowe 2,5 µg/mL) (PBS-7AAD). 
		OSTROŻNIE: 7AAD jest interkalatorem DNA, dlatego należy z nim obchodzić się w odpowiednich środkach ochrony osobistej (rękawice).</li>
		<li>W przypadku probótki 11, resuspender osad w sterylnym PBS-7AAD przy maksymalnym stężeniu 5 x 106 komórek na mL i minimalnej objętości 1 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować dwie polipropylenowe probótki do zbierania, oznaczone jako MEP i MKp, zawierające 2 mL PBS-2%NBCS. 
	UWAGA: Alternatywnie komórki można zbierać do pożywki hodowlanej lub buforu do lizy komórek, w zależności od dalszego zastosowania posortowanych komórek. Nie zaleca się stosowania probótek polistyrenowych ze względu na możliwe zakłócenia naładowanych kropli zawierających interesujące nas komórki.</li>
	<li>Przechowywać wszystkie probótki na lodzie w ciemności.</li>
	<li>Przejść do konfiguracji sortera komórkowego.
	<ol>
		<li>Użyć probótek 1-7 do ustawienia napięcia i kompensacji, probótek 7-10 do wyznaczenia bramek sortowania dla interesujących populacji komórek oraz probótki 11 do sortowania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pierwsze kroki strategii bramkowania mają na celu wykluczenie dubletów i martwych komórek z analizy, jak opisano na Rysunku 3. Zidentyfikować pojedyncze żywe komórki i wyświetlić wykres kropkowy SSC-vs Lin-APC-Cy7, aby potwierdzić wydajność usuwania komórek linii (lineage depletion). Z komórek Lin- ustawia się bramkę w celu wyboru komórek pozytywnych dla c-kit oraz negatywnych lub słabo pozytywnych (dim) dla Sca-1 i CD16/32. Wykres kropkowy ekspresji CD9 vs CD150 dla wybranych komórek pozwala na identyfikację czterech populacji. 
	UWAGA: Komórki MEP i MKp są obie pozytywne dla CD150. Można zdefiniować trzy poziomy ekspresji CD9 (neg, dim i high). MKp wykazują wysoki poziom CD9, a MEP wykazują CD9 na pośrednim poziomie intensywności fluorescencji. Populacja MEP odpowiada Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9dim, a populacja MKp odpowiada Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9bright. Rozróżnienie między populacjami CD9 high i CD9 dim dla komórek pozytywnych dla CD150 jest ustalane na podstawie maksymalnego poziomu ekspresji CD9 w populacji negatywnej dla CD150. Jedna mysz dostarcza zazwyczaj 5,3 ± 0,6 x 103 MKp i 27,2 ± 2,4 x 103 MEP.</li>
</ol>

<ol><li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+review%3A+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li>
<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li>
<li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2%2Fflt3%2B+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li>
<li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+bipotent+%28erythroid+and+megakaryocytic%29+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li>
<li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+phenotypic%2C+functional%2C+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li>
<li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li>
<li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+thrombopoietin+%28TPO%29-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li>
<li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJOVE%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li>
<li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li>
<li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14(2014).</li>
<li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Metoda opisana w niniejszej pracy pozwala na ekstrakcję i oczyszczanie mysich MEP i MKp. Ważnym parametrem w optymalizacji protokołu było uzyskanie wystarczającej liczby komórek, które byłyby kompatybilne z większością testów molekularnych i komórkowych. Ogólna praktyka pobierania kości myszy w celu ekstrakcji komórek krwiotwórczych zwykle polega na pobieraniu zarówno kości udowych, jak i piszczelowych każdej myszy. Kość miednicy, kolejne źródło materiału krwiotwórczego, jest więc często pomijana. Powodem, dla którego ni...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Hematopoietic cell separation diagram with flow cytometry result, showing Lin+ and Lin- fractions." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Hematopoietic cell separation process diagram with antibody labeling and magnet use, flow cytometry results." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Płytki krwi są wytwarzane przez megakariocyty. Te duże komórki poliploidalne znajdują się w szpiku kostnym i podobnie jak w przypadku wszystkich komórek krwi, pochodzą z hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)1. Klasyczny szlak produkcji megakariocytów w szpiku kostnym wywodzi się z HSC i obejmuje generowanie różnych komórek progenitorowych, które stopniowo ograniczają swój potencjał różnicowania2. Pierwszym protoplastą podpisującym zobowiązanie do linii megakariocytarnej jest Megakariocyt-Erythrocyte Progenitor (MEP), bipotencjalny protoplasta zdolny do wytwarzania zarówno komórek erytroidalnych, jak i megakariocytów3,4,5. Następnie MEP wytwarza unipotencjalny prekursor / prekursor (MKp), który różnicuje się w dojrzały megakariocyt zdolny do wytwarzania płytek krwi. Mechanizmy związane z powstawaniem tych progenitorów, a także ich różnicowaniem i dojrzewaniem do megakariocytów są złożone i tylko częściowo poznane. Ponadto niejednorodność populacji MEP pod względem potencjału różnicowania i wewnętrzny poziom zaangażowania tych komórek są nadal niejasne. Aby rozszyfrować te procesy, konieczne jest uzyskanie (lub dostęp do) oczyszczonych populacji MEP i MKp do precyzyjnych analiz molekularnych i jednokomórkowych.
Kilka badań wykazało szczególne kombinacje markerów powierzchni komórek do identyfikacji przodków związanych z linią megakariocytów u myszy<klasa sup="xref">6,7,8. Na ich podstawie opracowano metodę pozwalającą na oczyszczanie MEP i MKp z myszy. Metoda ta została zoptymalizowana w celu uzyskania komórek w odpowiedniej liczbie i jakości dla dużej liczby testów. Mając na uwadze względy etyczne i w celu zminimalizowania liczby zwierząt biorących udział w eksperymentach, poprosiliśmy o pobranie szpiku kostnego z kości udowej i piszczelowej, a także z grzebienia biodrowego. Kość ta zawiera dużą częstotliwość i liczbę krwiotwórczych komórek progenitorowych i w większości przypadków ulega uszkodzeniu podczas długiego pobierania kości. Przedstawiona jest tutaj szczegółowa metoda niezawodnego zbierania tej kości.
Drugim kryterium optymalizacji jest produkcja wysoce oczyszczonych populacji komórek. Sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) jest metodą z wyboru w celu uzyskania oczyszczonych populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania. Jednak niskie plony osiąga się, gdy populacja komórek będących przedmiotem zainteresowania jest bardzo rzadka. W związku z tym konieczne są procedury wzbogacania. W protokole tym zdecydowano się na procedurę selekcji negatywnej przy użyciu kulek magnetycznych.

<table><tbody><tr><td>Igły o rozmiarze 21 BD</td><td>Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Gr-1-biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-85</td><td>Przeciwciało zubożenia magnetycznego</td></tr><tr><td>B220-biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-0452-85</td><td>Przeciwciało zubożenia magnetycznego</td></tr><tr><td>Mac-1-biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-85</td><td>Magnetyczne zubożenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD3e-biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-0031-85</td><td>Zubożenie magnetyczne</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD4-biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-9766-82</td><td>Zubożenie magnetyczne</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD5-biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-85</td><td>Przeciwciało zubożenia magnetycznego</td></tr><tr><td>CD8a-biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-0081-85</td><td>Przeciwciało zubożenia magnetycznego</td></tr><tr><td> TER119-biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-85</td><td>Przeciwciało zubożenia magnetycznego</td></tr><tr><td>CD127-biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td>Przeciwciało zubożenia magnetycznego</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Przeciwciało do sortowania komórek</td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td>Przeciwciało do sortowania komórek</td></tr><tr><td>TER119-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5921-83</td><td>Sortowanie komórek</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD45-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0451-82</td><td>Przeciwciało do sortowania komórek</td></tr><tr><td>CD45-biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td>Przeciwciało do sortowania komórek</td></tr><tr><td>CD9-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0091-82</td><td>Przeciwciało do sortowania komórek</td></tr><tr><td>&nbsp; c-kit-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Przeciwciało do sortowania komórek</td></tr><tr><td>Sca-1-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-83</td><td>Przeciwciało do sortowania komórek</td></tr><tr><td>CD16/32-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0161-83</td><td>Przeciwciało do sortowania komórek</td></tr><tr><td>CD150-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-1502-82</td><td>Pożywka hodowlana do sortowania komórek</td></tr><tr><td>StemSpan-SFEM</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka preparcyjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>10452395</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>vWR Chemicals</td><td>83813.360</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Euronexia</td><td>P-120-AS</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta pasteura</td><td>Dutscher</td><td>42011</td><td></td></tr><tr><td>Magnes :&nbsp; DynaMag-5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne: Dynabeads Owce Anti-Rat IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Megacult Technologie komórek macierzystych</td><td>#04970</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult SF M3436</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>#03436</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla noworodków</td><td>Dutscher</td><td>50750-500</td><td></td></tr><tr><td>Liza czerwonych krwinek rozwiązanie</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele</td><td>Fisher Scientific</td><td>12308009</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Euronexia</td><td>C-165-ASB</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne strzykawki 1 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki polipropylenowe 5 ml</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki polistyrenowe 5 ml</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki z 70&mikro; m nasadka sitka do komórek</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna szalka Petriego</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-APC-Cy7</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>554063</td><td>Sortowanie komórek</td></tr><tr><td>Rolka rurowa</td><td>Benchmark Scientific</td><td>R3005</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Megakariocyty szpiku kostnego to duże poliploidalne komórki, które zapewniają produkcję płytek krwi. Powstają z hematopoetycznych komórek macierzystych poprzez megakariopoezę. Końcowe etapy tego procesu są złożone i klasycznie obejmują bipotencjalne progenitory megakariocytów-erytrocytów (MEP) i unipotencjalne progenitory megakariocytów (MKp). Populacje te poprzedzają powstawanie megakariocytów w dobrej wierze, a ich izolacja i charakterystyka mogą pozwolić na solidną i bezstronną analizę powstawania megakariocytów. W protokole tym szczegółowo przedstawiono procedurę pobierania komórek krwiotwórczych ze szpiku kostnego myszy, wzbogacanie krwiotwórczych komórek progenitorowych poprzez zubożenie magnetyczne i wreszcie strategię sortowania komórek, która daje wysoce oczyszczone populacje MEP i MKp. Najpierw pobiera się komórki szpiku kostnego z kości udowej, piszczelowej, a także grzebienia biodrowego, kości zawierającej dużą liczbę krwiotwórczych komórek progenitorowych. Stosowanie kości grzebienia biodrowego drastycznie zwiększa całkowitą liczbę komórek uzyskanych na mysz, a tym samym przyczynia się do bardziej etycznego wykorzystywania zwierząt. Zubożenie linii magnetycznej zostało zoptymalizowane przy użyciu kulek magnetycznych o długości fali 450 nm, co pozwoliło na bardzo wydajne sortowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Wreszcie, w protokole przedstawiono strategię znakowania i bramkowania do sortowania dwóch wysoce oczyszczonych populacji progenitorów megakariocytów: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9 dim) i MKp (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9jasny). Technika ta jest łatwa do wdrożenia i zapewnia wystarczającą ilość materiału komórkowego do przeprowadzenia i) charakterystyki molekularnej w celu głębszej wiedzy na temat ich tożsamości i biologii, ii) testów różnicowania in vitro, które zapewnią lepsze zrozumienie mechanizmów dojrzewania megakariocytów, lub iii) modeli interakcji in vitro z ich mikrośrodowiskiem.

Analizę fenotypową komórek zidentyfikowanych jako MEP i MKp przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki znakowano przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją przeciwko CD41a i CD42c, które są klasycznymi markerami linii megakariocytowej i płytkowej. Oba markery były ekspresjonowane przez komórki populacji MKp, podczas gdy w populacji MEP nie wykryto ich jeszcze na powierzchni komórek (Rysunek 4Ai,4Aii). Poliploidia jest cechą charakterystyczną megakariocytów. Pr...

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Izolacja kluczowych populacji progenitorów megakariocytów pozwala na dokładną analizę hierarchii linii w hodowli komórkowej na testach molekularnych, aż do poziomu pojedynczej komórki. Protokół ten łączy w sobie bardziej etyczną praktykę poprzez zminimalizowanie liczby wymaganych zwierząt, w wydajnym procesie sortowania komórek populacji MEP i MKP. W przypadku kości spryskaj ciało ośmio- do 12-tygodniowej czarnej myszy sześcioletniej C57 z 70% etanolem.Użyj nożyczek, aby zrobić punkt od pięciu do jednego centymetra nacięcia skóry, prostopadle do kręgosłupa. I rozerwij skórę wokół całego ciała, ciągnąc ją w dół. Połóż mysz twarzą w dół na podkładce preparacyjnej, a następnie zlokalizuj kości miednicy, przesuwając palcami lub nożyczkami wzdłuż odsłoniętego kręgosłupa, od góry do dołu.Aby zlokalizować grzebień biodrowy, zidentyfikuj mały guzek w okolicy lędźwiowej w pobliżu tylnych kończyn. Po umieszczeniu nożyczek równolegle do kręgosłupa, przy kręgach i blisko guza grzebienia biodrowego, przystąp do cięcia mięśni wzdłuż boku kręgosłupa powyżej kości miednicy, przesuwając nożyczki wzdłuż kręgów, w dół do ogona. Następnie przeciąć między kręgami a grzebieniem biodrowym, trzymając się jak najbliżej kręgów.I odetnij pozostałe mięśnie, aby odłączyć kończynę od ciała. Przenieś oderwane kończyny na czystą powierzchnię. Po odrzuceniu reszty ciała zgodnie z wytycznymi instytucji, użyj kleszczy i skalpeli, aby odsłonić kości miednicy, kości udowej i piszczelowej, usuwając otaczające tkanki.Użyj kleszczy, aby przytrzymać dystalny koniec kości udowej i ostrożnie zwichnij głowę kości udowej od kości miednicy, delikatnie przecinając mięśnie wokół stawu skalpelem. Zeskrob pozostały mięsień z kości miednicy i przetnij środek jamy, w której znajdowała się głowa kości udowej. Zachowaj kość biodrową i wyrzuć trójkątną cienką stronę kości.Za pomocą skalpela usuń resztki tkanek wokół kości biodrowej i umieść oczyszczoną kość w sterylnym PBS uzupełnionym 2% surowicą cielęcą noworodka. Następnie użyj nożyczek, aby odciąć stopę od nogi w kostce. Trzymając dolną część kości piszczelowej kleszczami, zeskrob mięsień w kierunku kolana.Odrzuć kość strzałkową. Następnie wykonaj skalpelem nacięcie w poprzek płaskowyżu piszczelowego i umieść piszczel w sterylnym PBS 2%NBCS. Po usunięciu resztek tkanek wokół kości udowej przytrzymaj górną część kości udowej kleszczami i umieść ostrze skalpela u podstawy rzepki.Zastosuj siłę w kierunku rzepki, równolegle do kości udowej, aby odłączyć rzepkę. Następnie umieść kość udową w sterylnym PBS 2% NBCS. W komorze z przepływem laminarnym przenieś kości na sterylną szalkę Petriego wypełnioną sterylnym PBS 2%NBCS.Użyj skalpela, aby odciąć głowę kości udowej. Napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra sterylnym PBS 2%NBCS i przymocuj igłę o rozmiarze 21 do wylotu. Następnie napełnij pięciomililitrową probówkę polipropylenową dwoma mililitrami sterylnego PBS 2%NBCS.Trzymając kość udową kleszczami, wbij igłę w rowek po lewej stronie, po zdjęciu rzepki, wykonując obrót, upewniając się, że igła jest całkowicie włożona w kość, aż do skosu. Po wprowadzeniu igły przenieść kość z igłą do probówki zawierającej dwa mililitry PBS 2%NBCS. Następnie dozować i odsysać PBS 2%NBCS ze strzykawki, aż kość będzie czysta.Wyjmij igłę z kości udowej i włóż ją do otworu po przeciwnej stronie, w miejscu, w którym znajdowała się głowa kości udowej. Po dozowaniu i odessaniu buforu należy wyrzucić kość. W przypadku grzebienia biodrowego i kości piszczelowej użyj kleszczy, aby przytrzymać kość i delikatnie włóż igłę w otwartą stronę, stosując rotację.Upewnienie się, że igła jest całkowicie włożona w kość, aż do skosu. Następnie przenieś kość za pomocą igły do probówki zawierającej dwa mililitry PBS 2%NBCS. Dozować i odsysać PBS 2%NBCS ze strzykawki, aż kość będzie czysta.Przełóż całą zawiesinę komórek przez 40-mikronową nasadkę sitka do komórek, umieszczoną na sterylnej pięciomililitrowej probówce z polistyrenu i dodaj 500 mikrolitrów PBS 2% NBCS. Odłożyć 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej jako całkowity szpik kostny. Następnie przechowuj go na lodzie w celu przeprowadzenia procedury barwienia.Przefiltrowaną zawiesinę osadzić przez odwirowanie. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w świeżo przygotowanym koktajlu przeciwciał pierwotnych, z inkubacją na lodzie, przez 30 do 45 minut. Odłóż 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do sterylnej pięciomililitrowej probówki z polistyrenu, oznaczonej Lin Pores Fraction i dodaj 90 mikrolitrów PBS 2% NBCS.W międzyczasie przygotuj kulki do wyczerpania magnetycznego, ponownie zawieszając je w fiolce, z dokładnym wirowaniem przez 30 sekund. Przenieś objętość koralików odpowiadającą dwóm koralikom na komórkę docelową do pięciomililitrowej probówki polipropylenowej i umyj koraliki dwukrotnie, za pomocą PBS 2% NBCS, umieszczając rurkę na magnesie. Po wyjęciu buforu myjącego sterylną szklaną pipetą Pasteura, ponownie zawiesić kulki w 500 mikrolitrach sterylnego PBS 2%NBCS.W pierwszym etapie wyczerpania magnetycznego dodaj 250 mikrolitrów kulek do osadu umytych komórek i inkubuj z delikatnym mieszaniem przez pięć minut na lodzie. Następnie dodaj dwa mililitry sterylnego PBS 2%NBCS, delikatnie mieszając i umieść probówkę w magnesie na dwie minuty. Przystąp do zbierania frakcji niemagnetycznej za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura.A w drugim etapie wyczerpywania się pola magnetycznego dodaj go do pozostałych 250 mikrolitrów kulek magnetycznych. Umieść probówkę uszczelnioną parafiną na wałku rurowym na 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj dwa mililitry sterylnego PBS 2%NBCS z delikatnym mieszaniem.I umieść rurkę z magnesem na dwie minuty. Zbierz frakcję niemagnetyczną do sterylnej pięciomililitrowej probówki polipropylenowej, oznaczonej jako niemagnetyczna frakcja Lin Neg, za pomocą sterylnej szklanej pipety pastreurowej i przystąp do sortowania komórek progenitorowych megakariocytów, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Do strategii bramkowania sortowania komórek, w populacji Lin Neg, wybiera się komórki wykazujące ekspresję C-kit i niską lub żadną ekspresję antygenu Sca-1 lub CD16/32.W tej populacji MEP są identyfikowane jako komórki ciemne CD150 dodatnie i CD9. MKP jako CD150 dodatnie i jasne komórki CD9. W reprezentatywnej analizie cytometrii przepływowej komórki zidentyfikowane jako MEP i Mkp zostały znakowane fluorescencyjnymi sprzężonymi przeciwciałami dla klasycznych markerów CD41a i CD42c linii megakariocytarnych i płytek krwi.Oba markery ulegały ekspresji w komórkach populacji MKp i nie były wykrywane na powierzchni komórek populacji MEP. Zawartość DNA w posortowanych megakariocytach wykazała, że komórki mają w większości 2n dla populacji MEP. Niewielka część komórek MKp jest obca.Wyższe komórki ploidalne nie zostały istotnie wykryte w tych populacjach. W półstałych testach klonogennych CFU-MK wykryto zarówno w populacjach MEP, jak i MKp. BFU-E nie został wykryty w populacji MKp, ale wykryty w populacji komórek progenitorowych MEP i CD150 z ujemnym ujemnym CD9.Obserwacja mikroskopowa w trzecim dniu różnicowania pokazuje, że MEP i MKp wytwarzały głównie megakariocyty, identyfikowane jako duże komórki. Megakariocyty uzyskane po trzech dniach hodowli zidentyfikowano za pomocą ekspresji CD41 i CD42c i reprezentują 54 i 82% komórek wytworzonych odpowiednio z populacji komórek MEP i MKp. Ploidalność wytwarzanych megakariocytów była większa w przypadku megakariocytów pochodzących z populacji MKp, w porównaniu z populacją MEP.Tylko komórki pochodzące z populacji MKp były zdolne do emisji propłytkowej, co sugeruje bardziej zaawansowany etap dojrzewania populacji MKp. Użycie kości miednicy drastycznie zwiększa liczbę komórek, podczas gdy dwuetapowe zubożenie magnetyczne poprawia skuteczność zubożenia linii. Protokół ten pozwala na późniejszą hodowlę populacji MEP i MKp pojedynczych komórek, które wraz z analizą transkryptomiczną i proteomiczną z pewnością będą musiały rozszyfrować mechanizmy zachodzącej, realizowanej biogenezy.

isolation-of-mouse-megakaryocyte-progenitors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda enzymatycznej dysocjacji, znakowania powierzchniowego i oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej progenitorów fibro/adipogennych i miogennych z mięśni szkieletowych myszy.

Oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Tutaj opisujemy zoptymalizowany, wysoce powtarzalny protokół izolacji mezodermalnych komórek progenitorowych (MPC) od ludzkiego szpiku kostnego (hBM). MPC scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej i ekspresji gniazdyny. Wykazali oni zdolność do tworzenia wykładniczo rosnących kultur komórkowych podobnych do MSC, przy jednoczesnym zachowaniu ich potencjału angiogennego.

Izolowanie mezangiogennych komórek progenitorowych (MPC) z ludzkiego szpiku kostnego

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę eksplantacji szpiku kostnego, od przygotowania próbki do analizy mikroskopowej, aby ocenić zdolność megakariocytów, które zróżnicowały się w swoim środowisku fizjologicznym, do tworzenia propłytek.

Dynamika tworzenia propłytek świeżych eksplantatów szpiku kostnego myszy

Teraz uznaje się, że trójwymiarowe środowisko komórek może odgrywać ważną rolę w ich zachowaniu, dojrzewaniu i/lub różnicowaniu. Protokół ten opisuje trójwymiarowy model hodowli komórkowej przeznaczony do badania wpływu fizycznego zamknięcia i ograniczeń mechanicznych na megakariocyty.

Hodowla megakariocytów w hydrożelu 3D na bazie metylocelulozy w celu poprawy dojrzewania komórek i zbadania wpływu sztywności i uwięzienia

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

To badanie ustaliło stabilną i efektywną metodę izolacji, hodowli i funkcjonalnego określania komórek macierzystych CD34+ rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych (CD34+ VW-SCs). Ta łatwa do naśladowania i efektywna czasowo metoda izolacji może być wykorzystana przez innych badaczy do badania potencjalnych mechanizmów związanych z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Izolacja immunomagnetyczna komórek macierzystych CD34 + rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych od myszy

Poznaj metodę izolacji progenitorów megakariocytów (MEP i MKp) z kości myszy z wykorzystaniem grzebienia biodrowego. Protokół zapewnia wysoką czystość komórek przy zmniejszonej liczbie zwierząt.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Przeglądaj więcej filmów