Name: In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj metodę dwufotonowej mikroskopii do obrazowania megakariocytów i propłytek w szpiku kostnym czaszki myszy. Technika umożliwia wizualizację tworzenia płytek krwi in vivo z minimalną reakcją zapalną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Florianowi Gaertnerowi (Instytut Nauki i Technologii Austria, Klosterneuburg, Austria) za jego fachowe porady dotyczące eksperymentów z mikroskopią dwufotonową w czasie, gdy ustaliliśmy tę technikę w laboratorium, oraz Yves'owi Lutzowi z Centrum Obrazowania IGBMC /CBI (Illkirch, Francja) za jego ekspertyzę i pomoc przy mikroskopie dwufotonowym. Dziękujemy również Jean-Yves'owi Rinkelowi za pomoc techniczną i Ines Guinard za narysowanie schematu na rysunku 1. Dziękujemy firmie ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) za wsparcie w zakupie mikroskopu dwufotonowego. AB było wspierane przez stypendia podoktorskie z Etablissement Français du Sang (APR2016) oraz z Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

<ol><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+kinase+2+%28Sphk2%29+regulates+platelet+biogenesis+by+providing+intracellular+sphingosine+1-phosphate+%28S1P%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P).</a> Blood. 122 (5), 791-802 (2013).</li>
<li>Kowata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+demand+modulates+the+type+of+intravascular+protrusion+of+megakaryocytes+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow.</a> Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1alpha+induces+thrombopoiesis+through+megakaryocyte+rupture+in+response+to+acute+platelet+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs.</a> Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).</li>
<li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li>
<li>Potts, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+budding+is+a+major+mechanism+of+in+vivo+platelet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206(2020).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683(2014).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pf4-Cre+transgenic+mice+allow+the+generation+of+lineage-restricted+gene+knockouts+for+studying+megakaryocyte+and+platelet+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo.</a> Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).</li>
<li>Pertuy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broader+expression+of+the+mouse+platelet+factor+4-cre+transgene+beyond+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).</li>
<li>Calaminus, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+Pf4-Cre+marks+hematopoietic+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny.</a> PLoS One. 7 (12), 51361(2012).</li>
<li>Stegner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoiesis+is+spatially+regulated+by+the+bone+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 127(2017).</li>
<li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+suppresses+platelet+aggregation+possibly+by+suppressed+inositol+triphosphate+formation+and+subsequent+suppression+of+cytosolic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase.</a> Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).</li>
<li>Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+time-lapse+in+vivo+imaging+of+tibia+bone+marrow+to+visualize+dynamic+hematopoietic+stem+cell+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment.</a> Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).</li>
<li>Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window+chamber+model+for+in+vivo+cell+tracking+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Kim, J., Bixel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+the+bone+and+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment.</a> Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Mechanizmy powstawania płytek krwi są w dużym stopniu zależne od środowiska szpiku kostnego. W związku z tym mikroskopia przyżyciowa stała się ważnym narzędziem w tej dziedzinie do wizualizacji procesu w czasie rzeczywistym. Myszy z fluorescencyjnymi megakariocytami można uzyskać, krzyżując myszy z ekspresją rekombinazy Cre w megakariocytach z dowolnymi myszami reporterowymi z floksami zawierającymi warunkową kasetę ekspresji genu fluorescencyjnego. Tutaj użyto myszy reporterowych mTmG (B6.129 (Cg) -Gt (ROSA) 26Sor<s...

Płytki krwi są wytwarzane przez wyspecjalizowane komórki megakariocytów znajdujące się w szpiku kostnym. Dokładny sposób, w jaki megakariocyty uwalniają płytki krwi w krążeniu, długo pozostawał niejasny ze względu na wyzwanie techniczne związane z obserwacją zdarzeń w czasie rzeczywistym przez kość. Mikroskopia dwufotonowa pomogła przezwyciężyć to wyzwanie i doprowadziła do znacznych postępów w zrozumieniu procesu powstawania płytek krwi. Pierwsze obserwacje megakariocytów in vivo zostały przeprowadzone przez von Andriana i współpracowników w 2007 roku, z wizualizacją fluorescencyjnych megakariocytów przez skull1. Było to możliwe, ponieważ warstwa kostna w czaszce czołowo-ciemieniowej młodych dorosłych myszy ma grubość kilkudziesięciu mikronów i jest wystarczająco przezroczysta, aby umożliwić wizualizację komórek fluorescencyjnych w leżącym poniżej szpiku kostnym2.
Kolejne badania stosowały tę procedurę do oceny powstawania propłytek krwi w różnych warunkach i do rozszyfrowania mechanizmów leżących u ich podstaw3,4,5,6. Badania te dostarczyły ostatecznych dowodów na to, że megakariocyty dynamicznie wydłużają wypukłości, zwane propłytkami, przez barierę śródbłonkową naczyń sinusoidalnych (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Te propłytki są następnie uwalniane jako długie fragmenty, które reprezentują objętość kilkuset płytek krwi. Płytki krwi powstaną po przebudowie płytek krwi w mikrokrążeniu narządów znajdujących się w dalszej części narządu, zwłaszcza w płucach7. Do tej pory jednak dokładny proces i mechanizmy molekularne pozostają przedmiotem dyskusji. Na przykład proponowana rola białek cytoszkieletu w wydłużaniu propłytek krwi różni się w warunkach in vitro i in vivo3, a różnice w tworzeniu propłytek krwi wykazano w stanach zapalnych6. Sprawę dodatkowo komplikuje niedawne badanie, w którym zakwestionowano koncepcję propłytek krwi i zaproponowano, że in vivo płytki krwi są zasadniczo tworzone przez mechanizm pączkowania błony na poziomie megakariocytów8.
Ten artykuł przedstawia protokół obserwacji megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym z kości czaszki u żywych myszy, przy użyciu minimalnie inwazyjnej procedury. Podobne podejścia zostały wcześniej opisane w celu wizualizacji innych komórek szpiku, w szczególności hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych9. Nacisk kładziony jest tutaj na obserwację megakariocytów i płytek krwi w celu wyszczególnienia niektórych parametrów, które można zmierzyć, w szczególności morfologii propłytek i prędkości płytek krwi. Protokół ten przedstawia, jak wprowadzić cewnik do żyły szyjnej w celu wstrzyknięcia fluorescencyjnych znaczników i leków oraz obserwacji przez kość czaszki. Kość kości nazębnej jest odsłaniana za pomocą drobnej operacji, tak aby pierścień był przyklejony do kości. Pierścień ten służy do unieruchamiania głowy i zapobiegania ruchom spowodowanym oddychaniem oraz tworzy kubek wypełniony solą fizjologiczną jako medium zanurzeniowe soczewki. Technika ta doskonale nadaje się do: i) obserwacji w czasie rzeczywistym geometrii sinusoidy i megakariocytów oddziałujących ze ścianą naczynia; ii) śledzić megakariocyty w procesie tworzenia, wydłużania i uwalniania propłytków; oraz iii) mierzyć ruchy płytek krwi w celu monitorowania złożonego sinusoidalnego przepływu krwi. Dane uzyskane przy użyciu tego protokołu zostały niedawno opublikowane3.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie GNU Octave</td><td>Projekt GNU https://www.gnu.org/software/octave/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Histoacryl 5 x 0,5 mL</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>roztwór do wstrzykiwań kleju chirurgicznego</td></tr><tr><td>Detektory hybrydowe HyD Leica Microsystems 4tunes</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>GNU project</td><td></td><td>Wymagana minimalna wersja</td></tr><tr><td>Imalgen/Ketamina 1000 fl/10 mL</td><td>Boehring</td><td>03661103003199</td><td>ochrona oczu</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica SP8 MP DIVE wyposażony w 25-krotny obiektyw wodny, apertura numeryczna 0,95</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>jednoczesne wzbudzenie AlexaFluor-488 i Qtracker-655</td></tr><tr><td></td><td>Matlab MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Ocrygel 10 g</td><td>Laboratoires T.V.M.</td><td>03700454505621</td><td>Silikonowa pasta dentystyczna niebiesko-żółta</td></tr><tr><td>Picodent twinsin speed</td><td>Rotec</td><td>13001002</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 655 etykieta naczyniowa</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>roztwór do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Skaner rezonansowy, 8 lub 12 kHz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun Ksylazyna 2% fl/25 mL</td><td>Bayer</td><td>04007221032311</td><td></td></tr><tr><td>Żel</td><td></td><td></td> <td>Supergluedo przyklejenia pierścienia do kości</td></tr><tr><td>Cewnik Surflo IV - Niebieski 22 G</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225C1</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Laser pulsacyjny Saph (koherentny) (femtosekundowy)</td><td>Koherentny</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Płytki krwi są wytwarzane przez megakariocyty, wyspecjalizowane komórki znajdujące się w szpiku kostnym. Możliwość obrazowania megakariocytów w czasie rzeczywistym i ich rodzimego środowiska została opisana ponad 10 lat temu i rzuca nowe światło na proces powstawania płytek krwi. Megakariocyty rozciągają wydłużone wypukłości, zwane płytkami krwi, przez śródbłonek wyściółki naczyń sinusoidalnych. W pracy przedstawiono protokół jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym znakowanych fluorescencyjnie megakariocytów w czaszce, szpiku kostnym i naczyniach sinusoidalnych. Technika ta opiera się na drobnej operacji, która utrzymuje czaszkę w stanie nienaruszonym, aby ograniczyć reakcje zapalne. Głowa myszy jest unieruchomiona za pomocą pierścienia przyklejonego do czaszki, aby zapobiec ruchom podczas oddychania.
Korzystając z mikroskopii dwufotonowej, megakariocyty mogą być wizualizowane przez okres do kilku godzin, umożliwiając obserwację wypukłości komórek i propłytek w procesie wydłużania wewnątrz naczyń sinusoidalnych. Pozwala to na ilościowe określenie kilku parametrów związanych z morfologią występów (szerokość, długość, obecność obszarów zwężenia) i ich zachowaniem wydłużeniowym (prędkość, regularność lub obecność przerw lub faz retrakcji). Technika ta pozwala również na jednoczesną rejestrację krążących płytek krwi w naczyniach sinusoidalnych w celu określenia prędkości płytek krwi i kierunku przepływu krwi. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania roli genów będących przedmiotem zainteresowania w tworzeniu płytek krwi u genetycznie zmodyfikowanych myszy, a także podlega testom farmakologicznym (badanie mechanizmów, ocena leków w leczeniu zaburzeń produkcji płytek krwi). Stała się nieocenionym narzędziem, zwłaszcza uzupełniającym badania in vitro, ponieważ obecnie wiadomo, że tworzenie propłytek krwi in vivo i in vitro opiera się na różnych mechanizmach. Wykazano na przykład, że mikrotubule in vitro są niezbędne do wydłużenia propłytek jako takich. Jednak in vivo służą raczej jako rusztowanie, a wydłużenie jest głównie wspomagane przez siły przepływu krwi.

Stosując ten protokół, marker fluorescencyjny Qtracker-655 podano dożylnie w celu zobrazowania anastomozujących naczyń zatokowych szpiku w szpiku kostnym czaszki oraz kierunku przepływu, który przedstawiono za pomocą strzałek (Rycina 4A, lewo). Wykorzystując myszy mTmG, zarejestrowano fluorescencyjne płytki krwi eGFP przez 20 s w każdym odgałęzieniu naczynia, a ich prędkość zmierzono przy użyciu oprogramowania ImageJ oraz GNU Octave (Rysunek 4A, prawo). Zwróć uw...

Opisujemy tutaj metodę obrazowania megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kości czaszki żywych myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Metoda ta pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym różnych zdarzeń, zachodzących w szpiku kostnym myszy czaszkowej, takich jak megakariocyty, wydłużające propłytki krwi wewnątrz naczyń sinusoidalnych. Główną zaletą tej techniki jest konieczność przeprowadzenia drobnej operacji minimalizującej reakcję zapalną, co pozwala na wizualizację zdarzeń in vivo w warunkach niemal fabrycznych. Aby rozpocząć, przenieś mysz do pokoju obrazowania.Włącz mikroskop i komputer i ustaw wymagane parametry. Gdy mysz zostanie całkowicie znieczulona, umieść mysz na rozgrzanej płycie, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza dla wszystkich kolejnych manipulacji, ogol głowę i gardło myszy i nałóż żel na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Połóż mysz na plecach i przymocuj przednie nogi taśmą chirurgiczną, aby rozciągnąć gardło.Po zdezynfekowaniu gardła wykonaj nożyczkami nacięcie o długości od 0,7 do 1 centymetra nad prawą lub lewą żyłą szyjną i rozciągnij sąsiednią tkankę łączną, aby odsłonić zewnętrzną żyłę żonglerską na szczycie mięśnia piersiowego. Napełnij cewnik ciepłą, sterylną solą fizjologiczną. Przebij cewnik przez mięsień piersiowy, a następnie wprowadź cewnik do żyły.Delikatnie wyjąć igłę, połączyć strzykawkę ze znacznikami fluorescencyjnymi i wstrzyknąć martwą objętość cewnika. Umieść kroplę kleju chirurgicznego, aby ustabilizować cewnik. Ostrożnie przywróć mysz do pozycji leżącej.Zdezynfekuj skórę głowy 70% etanolem za pomocą ręcznika papierowego, jednocześnie usuwając luźne włosy. Użyj sterylnych cienkich nożyczek i pęsety, aby wykonać nacięcie w kształcie litery T na linii środkowej do jednego centymetra między uszami na skórze głowy, aby odsłonić kalwarię. Odsłoń czaszkę pęsetą, a następnie użyj nożyczek i pęsety, aby ostrożnie usunąć okostną.Użyj sterylnego wacika nasączonego solą fizjologiczną, aby usunąć całą okostną i wszelkie zanieczyszczenia lub włosy, które mogłyby zmienić obrazowanie. Opłucz czaszkę solą fizjologiczną, aby usunąć wszelkie ślady krwi i szybko osusz kość bawełnianym wacikiem. Nałóż klej w żelu na pierścień, umieść pierścień na odsłoniętej kości i utrzymuj go przez kilka sekund, aby pierścień mocno przymocował się do czaszki.Lekko zwilż czaszkę wacikiem z soli fizjologicznej. Przygotuj silikonową pastę dentystyczną, ostrożnie mieszając niebieskie i żółte składniki w stosunku jeden do jednego. Uszczelnij pierścień, nakładając pastę dentystyczną, aby zapobiec wyciekom podczas obrazowania.Ostrożnie usuń pastę dentystyczną lub klej, które mogły dostać się do pierścienia. Następnie napełnij pierścień solą fizjologiczną, aby sprawdzić wyciek. Umieść mysz na wsporniku i umieść złożony kompres pod głową zwierzęcia, aby podnieść głowę i zapobiec odklejeniu się pierścienia od czaszki po przymocowaniu do uchwytu.Przykręć pierścień do uchwytu bloku. Umieść wspornik i zespół myszy w podgrzewanej komorze mikroskopu. Ustaw odpowiednie długości fal lasera dla wybranych czterech czwórek i odzyskuj emitowane światła.Za pomocą cewnika międzyżonglerskiego wstrzyknij 50 mikrolitrów 0,2 mikromolowego roztworu znacznika fluorescencyjnego, aby oznaczyć naczynia krwionośne. Umieść stolik mikroskopu z podporą i myszą pod obiektywem mikroskopu. Upewnij się, że pierścień jest zawsze wypełniony solą fizjologiczną i napełnij go w razie potrzeby, a następnie zanurz obiektyw i sól fizjologiczną.Użyj epifluorescencji, aby zlokalizować naczynia szpiku kostnego i obserwować megakariocyty ustawione wzdłuż naczyń sinusoidalnych. W przypadku długich akwizycji skonfiguruj akwizycję czasoprzestrzenną 3D z obrazem o wymiarach 384 na 384 piksele za pomocą skanera rezonansowego o częstotliwości ośmiu kiloherców i trybu dwukierunkowego. Użyj uśredniania linii z dobrą rozdzielczością, a następnie wybierz zoptymalizowany rozmiar kroku Z i ustaw interwał czasu potrzebny przed rozpoczęciem akwizycji.W przypadku krótkich i szybkich akwizycji wybierz typ akwizycji przestrzeni i czasu i zminimalizuj rozmiar obrazu. W razie potrzeby dostosuj obraz do naczynia, obracając pole obrazowania. Korzystaj z najwyższej dostępnej szybkości skanowania i skanowania dwukierunkowego.Zminimalizuj uśrednianie linii, aby znaleźć optymalny kompromis między rozdzielczością obrazu a szybkością akwizycji. Uzyskaj tylko jeden plan Z i zminimalizuj interwał czasu na akwizycję. Do pomiaru prędkości płytek krwi powinno wystarczyć od 10 do 20 sekund od pobrania.Znacznik fluorescencyjny podawano dożylnie w celu zobrazowania zespolenia naczyń sinusoidalnych szpiku kostnego w szpiku kostnym czaszki, z kierunkiem przepływu przedstawionym przez strzałkę. Prędkość fluorescencyjnych płytek krwi rejestrowano w każdej gałęzi naczynia i obserwowano zmienność. Naczynia sinusoidalne wykazują złożone przepływy z powodu zespoleń, z obecnością przepływu zwrotnego, a nawet zastoju.Strzałki wskazywały przeciwny kierunek przepływu w rozwidleniu. Prędkość płytek krwi mierzono również dla lewej i prawej gałęzi naczynia, co wykazało nieregularność w czasie w każdej gałęzi naczynia z fazami przyspieszania, zastoju i zwalniania. Zaobserwowano różne morfologie proplatetek, w tym proplatetki o nieregularnych brzegach, następnie wydłużone proplatetki oraz grube i krótkie proplatetki.Kiedy megakariocyty rozszerzały propłytki w obszarach złożonych przepływów, propłytki przerzucały się z jednego naczynia rozgałęziającego się do drugiego, zgodnie z kierunkiem przepływu. Po zatrzymaniu przepływu krwi propłytki rozluźniły się, a u myszy nieoczekiwanie doszło do zatrzymania akcji serca, co wskazywało na znaczenie sił hydrodynamicznych w wydłużaniu propłytek. Zmierzono również szerokość i długość propłytek o średniej szerokości 5,2 mikrometra i zaobserwowano średnią długość maksymalną około 185 mikrometrów.Wykreślenie długości propłytek krwi w funkcji czasu pozwala na wizualizację zachowania propłytek krwi podczas faz wydłużania, zastoju, a nawet retrakcji. Zaobserwowano średnią prędkość wydłużenia wynoszącą około 10 mikrometrów na minutę. Instalacja cewnika, pozwoliła na wstrzykiwanie leków w celu zbadania wpływu na tworzenie się propłytek krwi lub inne interesujące zdarzenia w czasie rzeczywistym.

in-vivo-two-photon-imaging-megakaryocytes-proplatelets-mouse-skull

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie opisujemy zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu zespołu pierścienia czaszkowego na odsłoniętą kość czaszki i dalszym unieruchomieniu głowy myszy w celu obrazowania mózgu w wysokiej rozdzielczości na długi czas.

Instalacja zespołu pierścienia czaszkowego w modelu mysim: zabieg chirurgiczny do montażu okna wizualizacji implantu na czaszce myszy w celu obrazowania szpiku kostnego czaszki w wysokiej rozdzielczości

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Protokół opisuje nowatorski model komory okiennej kości udowej dla myszy, który może być używany do śledzenia ruchu komórek w szpiku kości udowej in vivo. Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa służy do obrazowania trzech składników szpiku kostnego kości udowej (układu naczyniowego, macierzy kolagenowej i neutrofili) w czasie.

Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy protokół do analizy ultrastruktury megakariocytów in situ za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Mysie szpiki kostne są zbierane, mocowane, zatapiane w żywicy epoksydowej i cięte na ultracienkie odcinki. Po barwieniu kontrastowym szpik kostny obserwuje się pod mikroskopem TEM przy napięciu 120 kV.

In Situ Badanie mysiej megakariopoezy przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę eksplantacji szpiku kostnego, od przygotowania próbki do analizy mikroskopowej, aby ocenić zdolność megakariocytów, które zróżnicowały się w swoim środowisku fizjologicznym, do tworzenia propłytek.

Dynamika tworzenia propłytek świeżych eksplantatów szpiku kostnego myszy

Mikroskopia przyżyciowa umożliwia badanie dynamicznych procesów biologicznych, takich jak regeneracja tkanek i rozwój guza. Szpik kostny kalwarii, wysoce dynamiczna tkanka, oferuje wgląd w hematopoezę i funkcję naczyń krwionośnych. Korzystanie z biokompatybilnego, wydrukowanego w 3D implantu mocującego głowę pozwala na powtarzalne obrazowanie podłużne, zwiększając naszą wiedzę na temat dynamiki tkanek i mikrośrodowiska guza.

Przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej

Poznaj metodę dwufotonowej mikroskopii do obrazowania megakariocytów i propłytek w szpiku kostnym czaszki myszy. Technika umożliwia wizualizację tworzenia płytek krwi in vivo z minimalną reakcją zapalną.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

Przeglądaj więcej filmów