Name: Ocena odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego na Haemophilus influenzae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj metody oceny odpowiedzi immunologicznej na Haemophilus influenzae w tkance płucnej i krwi. Wykorzystaj cytometrię przepływową i mikroskopię konfokalną do analizy fagocytozy, cytokin i aktywności proteaz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować personelowi Immunologii Klinicznej w Monash Health za pomoc w tej pracy.

Ta praca została zatwierdzona przez komisję etyki badań na ludziach Monash Health. Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach.
1. Preparat antygenowy
UWAGA: Trzy różne preparaty antygenowe mogą być użyte do oceny odpowiedzi immunologicznej na Hi. Są to: 1) składnik subkomórkowy (zwykle ze ściany komórkowej bakterii); 2) zabite i inaktywowane bakterie; oraz 3) żywe bakterie. Określić zastosowanie każdego preparatu antygenowego przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów.
<ol>
	<li>Składniki subkomórkowe
	<ol>
		<li>Pozyskiwanie składników subkomórkowych ze źródeł, w tym preparatów komercyjnych, składników opracowanych przez nas i/lub od innych badaczy. 
		UWAGA: Można stosować składniki subkomórkowe zwykle pochodzące ze ściany komórkowej bakteryjnej i obejmują białka błony zewnętrznej, takie jak P6 i lipooligosacharyd (LOS)11,12. Te subkomórkowe składniki są zwykle pozyskiwane w wyspecjalizowanych ośrodkach. Opis tego, jak są wykonane, wykracza poza zakres tego artykułu. W celu uzyskania tych składników zaleca się bezpośredni kontakt z ekspertami w tej dziedzinie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bakterie zabite/inaktywowane
	<ol>
		<li>Pobrać bakterie z odpowiedniej próbki (np. plwociny lub bronchoskopii). Potwierdzić szczep jako H. influenzae za pomocą odpowiedniego laboratorium mikrobiologicznego. Wykonaj typowanie próbek H. influenzae, aby potwierdzić, że nie nadają się do pisania (przez specjalistyczne laboratorium mikrobiologiczne).</li>
		<li>Aby uzyskać reprezentatywny antygen, należy użyć wielu szczepów NTHi (co najmniej 5, każdy w przybliżeniu tej samej ilości) w celu wytworzenia połączonego antygenu. Szczepy należy przechowywać w temperaturze -70 °C w bulionie glicerolowym w probówkach do mikrowirówek. 
		UWAGA: W tym eksperymencie użyto dziesięciu różnych szczepów.</li>
		<li>Rozmrozić szczepy (po jednej probówce mikrowirówkowej na raz) na czekoladowych płytkach agarowych i hodować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Dodaj bakterie do 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i umyj je dwukrotnie (wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut). Użyj standardowego miernika MacFarland10 lub spektrofotometru13, aby podsycić NTHi do stężenia 10-8 ml (przy użyciu pojemnika o pojemności 5 ml lub równoważnego).</li>
		<li>Ciepło dezaktywuje bakterie, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C na 10 minut.</li>
		<li>Sonikuj bakterie za pomocą ciągłego ustawienia sonikacji z prędkością od niskiej do średniej przez 30 s.</li>
		<li>Podwielokrotność odpowiedniej objętości próbek należy rozmieścić w probówkach do mikrowirówek. Dla próbki o objętości 108 ml należy użyć podwielokrotności 50 μl (tj. 20 próbek na ml), zamrozić je w temperaturze -70 °C, aż będzie to wymagane14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Żywe bakterie
	<ol>
		<li>Najpierw scharakteryzuj żywe bakterie, jak wspomniano w kroku 1.2.1. Użyj jednego dobrze scharakteryzowanego szczepu. Upewnij się, że szczep jest również przechowywany w bulionie glicerolowym w temperaturze -70 °C jako rezerwa.</li>
		<li>Hoduj bakterie na wzbogaconych podłożach, takich jak czekoladowe talerze agarowe lub w bulionie.
		<ol>
			<li>Aby użyć czekoladowych talerzy agarowych, rozprowadzaj bakterie co najmniej co 3-4 dni za pomocą sterylnych rozsiewaczy.</li>
			<li>Alternatywnie użyj bulionu Brain Heart Infusion (BHI) wzbogaconego w czynniki X (hemina) i V (dinukleotyd adeninowy β-nikotynamidu) do hodowli bakterii. Zaszczepić NTHi z nocnych szalek w 5-10 ml bulionu BHI uzupełnionego dinukleotydem heminy i β-nikotynamidoadeniny (oba 10 μg/ml) i hodować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2. 
			UWAGA: Ma to tę zaletę, że jest odtwarzalny, ma wyższą liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) i wszystkie bakterie są w podobnej fazie wzrostu logarytmicznego (na płytkach żywotność bakterii może być większa w zależności od pozycji w kulturze)13,15.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj wielokrotności infekcji (MOI) 100 bakterii w jednej komórce, aby wywołać silną odpowiedź immunologiczną przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek. Użyj MacFarland Standard10 lub spectrophotometer13, aby ocenić liczbę bakterii.</li>
		<li>Upewnij się, że pożywka używana do testów NTHi na żywo jest wolna od jakiejkolwiek ludzkiej surowicy, ponieważ spowoduje to zabicie bakterii16. Próbki surowicy zwierzęcej (np. płodowa surowica cielęca) na ogół nie sprawiają żadnych problemów. 
		UWAGA: Metody opisane poniżej należy stosować do analizy standardowych próbek tkanek, takich jak krew obwodowa, próbki bronchoskopowe (w szczególności płukanie oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BAL)) oraz wycięta tkanka płucna. Próbki należy inkubować z antygenem Hi przez 10 minut do 24 godzin lub dłużej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocena funkcji fagocytarnej za pomocą cytometrii przepływowej
UWAGA: Ten test wymaga komórek w roztworze i zazwyczaj jest wykonywany w pełnej krwi lub przy użyciu płynu BAL. Test ten jest modyfikowany w stosunku do wcześniej opublikowanego protokołu opartego na użyciu inaktywowanego preparatu Staphylococcus aureus i Pansorbin17. Inaktywowana krew pełna i utrwalona H. influenzae jest podstawiona przez Pansorbin17.
<ol>
	<li>Zmieszać zabity, inaktywowany NTHi (1.2) z jodkiem propidyny (PI) w stężeniu 100 μg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w stosunku 1:1 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przy 450 x g przez 5 minut, a następnie przemyć w 500 μl PBS. Wirować w temperaturze 450 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić granulat w 500 μl PBS.</li>
	<li>Inkubować 450 μl krwi obwodowej (z nakłucia żyły człowieka) z 50 μl inaktywowanego PI znakowanego H. influenzae przez 20 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C w probówce o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Wyjąć próbki z łaźni wodnej i dodać 5 μl dihydrorodaminy-1,2,3 (DHR). Wiruj przez 10 s, a następnie umieść go z powrotem w łaźni wodnej na kolejne 10 minut.</li>
	<li>Wyjąć próbki z łaźni wodnej i poddać erytrocyty lizie (500 μl objętości, jak podano powyżej w kroku 2.2) roztworem 10:1 (tj. 5 ml) 0,8% chlorku amonu (150 mM NH4Cl, 1 mM NaHCO3 i 0,1 mM EDTA). 
	UWAGA: Alternatywnie można użyć zautomatyzowanego systemu, takiego jak Q-prep.</li>
	<li>Przeanalizować próbki na cytometrze przepływowym w ciągu godziny. Przeanalizuj co najmniej 3 000-5 000 komórek (z każdego podzbioru zainteresowania) z każdej próbki, aby uzyskać reprezentatywne wyniki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Aby przeanalizować próbki pod kątem fagocytozy, określ proporcję komórek, które zostały połknięte znakowane bakterie (zmierz proporcję komórek z barwnikiem fluorescencyjnym).</li>
		<li>Określ ilościowo ROS przez utlenianie DHR, w wyniku czego powstaje sygnał fluorescencyjny (zmiana mediany fluorescencji jest porównywana między próbkami wyjściowymi i stymulowanymi). 
		UWAGA: Neutrofile są bardziej ziarniste i mają więcej rozproszenia bocznego, podczas gdy makrofagi są większe i mają większe rozproszenie do przodu.</li>
		<li>Odróżniaj neutrofile i makrofagi morfologicznie od siebie na podstawie ich wielkości (makrofagi są większe) i ziarnistości (neutrofile są bardziej ziarniste). 
		UWAGA: Specyficzne markery dla neutrofili i makrofagów nie są powszechnie stosowane, chociaż CD14 może być używany do znakowania monocytów krwi. Cytometria przepływowa może być potencjalnie wykorzystana do rozróżnienia różnych funkcjonalnych form monocytów i makrofagów (np. podzbiorów M1 i M2)18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby zmodyfikuj test (np. użyj żywego, nieznakowanego NTHi do stymulacji fagocytów i zmierz ekspresję ROS przez rozszczepienie DHR).
	<ol>
		<li>Wyizolować jednojądrzaste komórki krwi obwodowej przez wirowanie w gradiacji gęstości. Warstwę krwi na wyznaczonym polimerze w celu odwirowania w gradiacji gęstości i wirować z prędkością 2300 x g przez 30 minut. Usunąć warstwę jednojądrzastą za pomocą pipety, przemyć ją dwukrotnie PBS i ponownie zawiesić komórki w PBS w stężeniu10-6 komórek na ml.</li>
		<li>Alternatywnie użyj makrofagów BAL.</li>
		<li>Zawiesić monocyty/makrofagi w stężeniu 10-6 komórek/ml w pożywce hodowlanej (RPMI). Zainfekuj je żywym NTHi przy MOI 100:1 przez 1 godzinę, jak opisano w kroku 1.3.</li>
		<li>Dodać DHR do zawiesiny zgodnie z opisem w kroku 2.3 przez 10 minut. Przeprowadzić analizę ROS za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena funkcji limfocytów we krwi obwodowej
<ol>
	<li>Do testów cytometrii przepływowej należy używać preparatów krwi pełnej lub komórek jednojądrzastych14.</li>
	<li>Pobieraj próbki od każdego obiektu przez nakłucie żyły. Zebrać 4 ml krwi z żyły obwodowej w probówce z heparyną litową i podzielić próbki na podwielokrotności w celu kontroli i stymulacji antygenu.</li>
	<li>Dodać przeciwciała kostymulujące (anty-CD28 i CD49d, 1 μL/ml) do obu próbek. Dodać NTHi do próbki antygenu i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę. W przypadku zabitego preparatu NTHi dodać 200 μl antygenu do 2 ml krwi. W przypadku żywych NTHi dodaj żywe komórki NTHi o MOI 100:1 do białych krwinek (mierzonych hemocytometrem).</li>
	<li>Dodać do próbek środek blokujący Golgiego Brefeldin A (10 μl/ml) i inkubować je przez kolejne 5 godzin 
	UWAGA: Zablokowanie aparatu Golgiego zapobiega eksportowi cytokin na zewnątrz komórki.</li>
	<li>Jeśli używana jest krew pełna, należy poddać erytrocyty lizie 0,8% chlorku amonu (krok 2.4), aby w roztworze pozostały tylko leukocyty. Utrwal leukocyty za pomocą 500 μl 1%-2% paraformaldehydu przez 1 godzinę.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru, przepuszczaj 106 komórek 100 μl 0,1% saponiny przez 15 minut i inkubuj komórki z przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Umyj komórki i przeanalizuj je za pomocą cytometru przepływowego. 
	UWAGA: Ilość przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie będzie specyficzna dla każdej cytokiny. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Zazwyczaj 106 komórek w 100 μl roztworu będzie barwionych przez 1 godzinę. Większość komercyjnie uzyskanych przeciwciał wystarczy do wykonania 25-100 testów.</li>
	<li>Określ proporcję komórek reagujących na antygen poprzez bramkowanie odpowiedniej populacji limfocytów (komórki są bramkowane przez CD45, następnie przez CD3, a później przez ekspresję CD4 lub CD8), jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 2. Wykonaj barwienie tła na niestymulowanych komórkach dla wszystkich cytokin, które mają być analizowane. Przebadaj 100 000 komórek, aby przeanalizować każdą cytokinę zarówno pod kątem stymulowanych komórek, jak i kontroli.</li>
</ol>
4. Ocena funkcji limfocytów/mediatorów stanu zapalnego w tkance płucnej
<ol>
	<li>Zwykle nie jest możliwe uzyskanie wystarczającej liczby limfocytów z bronchoskopii, dlatego należy użyć tkanki płucnej z próbek po lobektomii. Optymalizacja próbek tkanki płucnej wymaga ścisłej współpracy ze służbą patologii anatomicznej. Upewnij się, że tkanka ma margines co najmniej 3 cm od guza i jest tkanką komórkową bez znaczącej rozedmy płuc (zgodnie z ustaleniami patologa).</li>
	<li>Rozbij tkankę płucną na zawiesinę komórkową, zanim będzie można ją wykorzystać do testów cytometrii przepływowej. Tkankę płucną trawić chemicznie (np. za pomocą kolagenazy) lub dezagregować mechanicznie. 
	UWAGA: Mechaniczna dezagregacja tkanki może być preferowana, ponieważ wiąże się to z lepszym barwieniem powierzchni komórek (np. znakowanie CD3/4)19.
	<ol>
		<li>Uzyskaj próbki lobektomii od patologa (zwykle uzyskiwane od pacjentów poddawanych leczeniu raka płuc). Pokrój około 20-40 g próbki na3-5 mm 3 sekcje. Umieść je w sterylnej komorze o pojemności 50 μl, a następnie poddaj je mechanicznemu rozdrobnieniu za pomocą odpowiedniego deagregatora.</li>
		<li>Po dezagregacji tkanek należy poddać lizie czerwone krwinki za pomocą 0,8% NH4Cl, jak wspomniano w kroku 2.4.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w sterylnym RPMI (objętość będzie zależeć od liczby komórek i zwykle wynosi 10-20 ml), a następnie przefiltruj je przez sterylną siatkę nylonową o wielkości 100 μm. Policz liczbę żywotnych komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test zakażenia NTHi
	<ol>
		<li>Zawiesić komórki płuc do końcowego stężenia komórek 4 x 106 komórek/ml na probówkę (próbki kontrolne i stymulowane).</li>
		<li>Użyj zawiesiny 4 x 106-6 x 106 komórek w 1 ml RPMI dla probówki kontrolnej (ujemnej). Tę samą ilość należy zastosować do probówki NTHi (każda dodatkowa próbka może być użyta jako kontrola pozytywna z SEB). Zainfekuj komórki w probówce NTHi przy MOI 100 bakterii na komórkę. Poluzuj nasadkę o pół obrotu, aby umożliwić przepływ gazu w rurkach.</li>
		<li>Umieścić komórki w rotatorze probówkowym i inkubować je w temperaturze 37 °C, obracając się z prędkością 12 obr./min.</li>
		<li>Aby zapobiec zewnątrzkomórkowemu eksportowi cytokin, należy dodać bloker Golgiego (Brefeldin A) do zawiesin komórkowych 1 godzinę po stymulacji do końcowego stężenia 10 μg/ml. Zawiesiny komórek należy zwrócić na kolejne 16-22 godziny inkubacji na zmianę (etap 4.3.3).</li>
		<li>Przepłukać zawiesinę komórkową 500 μl PBS zawierającego 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,01% NaN3. Napraw i przepuszczalność komórek zgodnie z opisem odpowiednio w kroku 3.5 i kroku 3.6.</li>
		<li>Dodać przeciwciała do wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin (wybór przeciwciał jest określany przez badacza, jak wymieniono w UWAGA w kroku 3.6). Wybarwić zawiesinę komórkową pod kątem określonych markerów powierzchniowych ludzkich limfocytów (np. CD45, CD3 itp.) przez 1 godzinę. Umyj komórki PBS, utrwal je i przepuszczaln zgodnie z opisem w krokach 3.5-3.6.</li>
		<li>Inkubować komórki z wewnątrzkomórkowymi przeciwciałami barwiącymi cytokiny (np. IFN-γ i TNF-α lub IL-13 i IL-17A) przez 1 godz. 
		UWAGA: Zaleca się najpierw wybarwienie markerów powierzchniowych, a następnie wewnątrzkomórkowych, ponieważ utrwalenie może powodować zmiany konformacyjne w białkach powierzchniowych, z którymi wiążą się przeciwciała.</li>
		<li>Przemyć komórki 500 μl PBS i ponownie zamieszać w 100 μl PBS przed pobraniem danych na cytometrze przepływowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test z matrycą kulek może być stosowany w połączeniu do analizy supernatantu opisanego w kroku 3.2 (należy to wykonać bez Brefeldina A). Pozwala to na analizę szerokiej gamy różnych mediatorów stanu zapalnego (potencjalnie do 40-50 mediatorów). Zebrać supernatant w podwielokrotnościach 100 μl i przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu przygotowania do analizy. Alternatywnie można użyć multipleksowych testów chemiluminescencyjnych20.
	<ol>
		<li>Użyj matryc wielopoziomowych do analizy rozmrożonych próbek. Przechowywać w supernatancie należy wykorzystać do analizy produkcji cytokin zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Wykonaj akwizycję matrycy koralików multipleksowych na cytometrze przepływowym. Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby przeprowadzić dalszą analizę danych. 
		UWAGA: Ten test z matrycą kulek można również przeprowadzić na supernatantze z krwi obwodowej i/lub próbek BAL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ocena proteolizy płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej
UWAGA: Fluorescencyjna mikroskopia konfokalna jest uzupełnieniem cytometrii przepływowej i może być używana do oceny reakcji zapalnych proteazy i ROS. Pułapki zewnątrzkomórkowe, takie jak NET i MET, składają się z chromatyny zewnątrzkomórkowej (DNA) z innymi mediatorami stanu zapalnego, w szczególności proteazami, takimi jak elastaza neutrofilowa (NE) i metaloproteinazy macierzy (MMP). Można je ocenić w BAL i tkance płucnej za pomocą mikroskopii konfokalnej, co zostało wcześniej opisane przez Sharma, R. et al.21.
<ol>
	<li>Oceń bezpośrednią ekspresję proteazy w tkance płucnej (zgodnie z opisem w kroku 4.2.1) za pomocą mikroskopii konfokalnej i zymografii in situ15,17.
	<ol>
		<li>Użyć świeżej lub mrożonej, nieutrwalonej tkanki płucnej. Zamontuj sekcje przycięte do grubości 4 μm na szkiełkach superfrost/adhezyjnych. Wstępnie podgrzej sekcje w 1x buforze reakcyjnym przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać znakowany fluoresceiną substrat żelatynowy (30 μg/ml na sekcję) bezpośrednio na poszczególne szkiełka, aby zmierzyć proteolizę poprzez działanie metaloproteinaz.</li>
		<li>Umieścić szkiełka w pozycji poziomej i inkubować w osłonie przed światłem, nawilżonej komorze w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przepłukać sekcje w 1x buforze reakcyjnym przed zamontowaniem.</li>
		<li>Jako kontrolę ujemną dodać do skrawków tylko bufor reakcyjny bez żelatyny fluorescencyjnej.</li>
		<li>Użyj mikroskopu konfokalnego, aby oznaczyć lizę substratu przez badanie. Użyj ImageJ, aby określić obszar płuc z dowodami proteolizy. W tym celu należy zmierzyć obszar płuc, w którym występują przebarwienia powyżej tła stłumionej próbki. Jako kolejną kontrolę użyj tkanki płucnej bez dodatku fluorescencyjnej żelatyny15. 
		UWAGA: Wykonaj to na co najmniej 10 polach widzenia o dużej mocy (FOV) dla każdej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz zewnątrzkomórkową ekspresję ROS w tkance płucnej za pomocą immunoreaktywności 3-nitrotyrozyny (toksycznego produktu stresu oksydacyjnego)13.</li>
</ol>

<ol><li>Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+genetic+diversity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+compared+to+nonencapsulated+H.+influenzae+in+a+population+in+which+H.+influenzae+is+highly+endemic%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic.</a> Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).</li>
<li>Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+TF+%22Harrisons+Principles+of+Internal+Medicine%22">Harrisons Principles of Internal Medicine</a>. 152, (2018).</li>
<li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lung+immune+response+to+nontypeable+haemophilus+influenzae+%28lung+immunity+to+NTHi%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi).</a> Journal of Immunology Research. , 706376(2015).</li>
<li>Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+persistent+airway+infection+by+non-typeable+Haemophilus+influenzae+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Pathogens and Disease. 75, 9(2017).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+is+immunity+the+second+function+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).</li>
<li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+and+macrophages%3A+new+roles+for+the+versatile+phagocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).</li>
<li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+balancing%3A+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers in Immunology. 4, 1(2013).</li>
<li>Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+airway+bacterial+colonization+patterns+and+species-specific+interactions+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).</li>
<li>Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtyping+isolates+of+Haemophilus+influenzae+type+b+by+outer-membrane+protein+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles.</a> The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).</li>
<li>Barenkamp, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+proteins+and+lipopolysaccharides+of+nontypeable+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae.</a> The Journal of Infectious Diseases. 165, Suppl 1 181-184 (1992).</li>
<li>Johnston, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+growth+and+maintenance+of+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 6, Unit 6D (2010).</li>
<li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immunity+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).</li>
<li>Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+media+for+growth+of+Haemophilus+influenzae+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).</li>
<li>King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+humoral+immunity+to+non-typeable+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae.</a> Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).</li>
<li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PLoS One. 10, 0120371(2015).</li>
<li>Aaron, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+inflammatory+markers+and+airway+infection+during+acute+exacerbation+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).</li>
<li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+T-cell+responses+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).</li>
<li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cell+detection+and+segmentation+for+image+cytometry+reveal+th17+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity.</a> Cytometry A. 95, 389-398 (2019).</li>
<li>Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+macrophage+extracellular+traps+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459(2017).</li>
<li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. 15, 36(2015).</li>
<li>Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+Lactobacillus+plantarum+to+monitor+lag+times%2C+cell+division+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury.</a> Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).</li>
<li>Essilfie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Haemophilus+influenzae+respiratory+infection+and+allergic+airways+disease+drives+chronic+infection+and+features+of+neutrophilic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma.</a> Thorax. 67, 588-599 (2012).</li>
<li>Huvenne, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbation+of+cigarette+smoke-induced+pulmonary+inflammation+by+Staphylococcus+aureus+enterotoxin+B+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice.</a> Respiratory Research. 12, 69(2011).</li>
<li>Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+Techniques+for+Optimal+Performance+of+Bronchoalveolar+Lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bronchology+%26+Interventional+Pulmonology%22%5BJournal%5D)">A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage.</a> Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).</li>
<li>Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+disaggregation+method+for+human+lung+tumors+that+preserves+the+phenotype+and+function+of+the+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).</li>
<li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+thoracic+society+workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606(2016).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wymienione tutaj metody wykorzystują techniki cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji i mikroskopii konfokalnej, które można stosować w połączeniu w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat odpowiedzi zapalnej płuc na Hi.
Ustalenie odpowiedniej postaci antygenowej Hi, która ma być stosowana, ma kluczowe znaczenie i zaleca się uzyskanie specjalnego wkładu od mikrobiologa w tym zakresie. Live Hi indukuje silniejszą reakcję, podczas gdy zabite preparaty Hi i składniki Hi są bardz...

Haemophilus influenzae (Hi) to normalna bakteria komensalna obecna w gardle większości zdrowych dorosłych. Hi może mieć kapsułkę polisacharydową (typy A-F, np. typ B lub HiB) lub nie mieć kapsułki i być nietypowalny (NTHi)1. Kolonizacja błony śluzowej tą bakterią rozpoczyna się we wczesnym dzieciństwie i następuje rotacja różnych szczepów kolonizujących2. Bakteria ta jest również zdolna do inwazji zarówno górnych, jak i dolnych dróg oddechowych; W tym kontekście może indukować aktywację odpowiedzi immunologicznej i stan zapalny3,4. Ta reakcja zapalna może powodować chorobę kliniczną i przyczyniać się do wielu ważnych chorób układu oddechowego, w tym zapalenia zatok, zapalenia ucha środkowego, zapalenia oskrzeli, mukowiscydozy, zapalenia płuc i przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP). Większość z tych warunków jest spowodowana przez szczepy NTHi2. W tym artykule zostaną opisane metody oceny odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego na Hi za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej.
Metody opisane poniżej zostały zaadaptowane z dobrze znanych technik, które zostały zmodyfikowane w celu oceny odpowiedzi zapalnej na Hi. Wybór odpowiedniej formy antygenowej Hi jest kluczowym elementem tej oceny. Preparaty antygenowe obejmują zarówno składniki ściany komórkowej, jak i żywe bakterie. Aby ustalić i ustandaryzować testy, początkowo bardzo pomocne może być użycie próbek krwi obwodowej.
Cytometria przepływowa umożliwia pomiar różnych parametrów i testów funkcjonalnych z jednej próbki na poziomie komórkowym. Technika ta ma tę zaletę, że można ocenić specyficzne odpowiedzi komórkowe (np. produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) lub produkcję cytokin wewnątrzkomórkowych) w porównaniu z innymi, bardziej ogólnymi metodami, takimi jak test immunoenzymatyczny (ELISA) lub ELISspot.
Pułapki zewnątrzkomórkowe są wyrażane przez neutrofile (NETs)5,6,7 oraz przez inne komórki, takie jak makrofagi (METs)8. Są one coraz częściej uznawane za kluczową reakcję zapalną, szczególnie w infekcji płuc9. Można je ocenić za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta pozwala na ostateczną identyfikację NET/MET i odróżnia ich ekspresję od innych form śmierci komórki6.
Zarówno cytometria przepływowa, jak i mikroskopia konfokalna są testami opartymi na fluorescencji. Ich sukces zależy od optymalnych protokołów naprężania próbek biologicznych. Nauczenie się tych metod zajmuje trochę czasu i wymaga odpowiedniej wiedzy specjalistycznej. Instrumenty, które się z tym wiążą, są również drogie zarówno w zakupie, jak i eksploatacji. Optymalnym miejscem do ich stosowania są duże uniwersytety i szpitale trzeciego stopnia referencji.
Metody użyte w tym protokole można przenieść do badania innych podobnych organizmów związanych z chorobami układu oddechowego (np. Moxarella catarrhalis i Streptococcus pneumoniae). NTHi wchodzi również w interakcje z innymi powszechnymi bakteriami układu oddechowego10.

<table><tbody><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213330</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD28</td><td>Thermofisher</td><td>16-0289-81</td><td></td></tr><tr><td>CD49d</td><td>Thermofisher</td><td>534048</td><td></td></tr><tr><td>DAPI prolong złoty</td><td>Thermofisher</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DHR123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109244-58-8</td><td></td></tr><tr><td>Filcon sterylna siatka nylonowa</td><td>Becton Dickinson</td><td>340606</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże żelatynowe, Enzchek</td><td>Sondy molekularne</td><td>E12055</td><td></td></tr><tr><td>Obracacz rurki mieszającej MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Medimachine</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Numer katalogowy niedostępny</td></tr><tr><td>Medicons 50 &micro; m</td><td>Becton Dickinson</td><td>340592</td><td></td></tr><tr><td>Pansorbin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>507858</td><td></td></tr><tr><td>jodek propidium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8047152</td><td></td></tr><tr><td>zjeżdżalnie Superfrost</td><td>Thermofisher</td><td>11562203</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego na haemophilus influenzae

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) to powszechna bakteria występująca w różnych chorobach układu oddechowego. Do oceny odpowiedzi immunologicznej/zapalnej układu oddechowego na tę bakterię można zastosować wiele różnych testów/technik. Cytometria przepływowa i mikroskopia konfokalna to technologie oparte na fluorescencji, które umożliwiają szczegółową charakterystykę odpowiedzi biologicznych. Można stosować różne formy antygenu Hi, w tym składniki ściany komórkowej, zabite/inaktywowane preparaty i żywe bakterie. Hi to wybredna bakteria, która wymaga wzbogaconej pożywki, ale na ogół jest łatwa w uprawie w standardowych warunkach laboratoryjnych. Próbki tkanek do stymulacji Hi można pobrać z krwi obwodowej, bronchoskopii lub wyciętego płuca (np. u pacjentów poddawanych zabiegom chirurgicznym w leczeniu raka płuc). Funkcję makrofagów i neutrofili można kompleksowo ocenić za pomocą cytometrii przepływowej z mierzonymi różnymi parametrami, w tym fagocytozą, reaktywnymi formami tlenu i produkcją cytokin wewnątrzkomórkowych. Funkcja limfocytów (np. funkcja limfocytów T i komórek NK) może być specyficznie oceniana za pomocą cytometrii przepływowej, głównie do wewnątrzkomórkowego wytwarzania cytokin. Infekcja Hi jest silnym induktorem produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych, zarówno przez neutrofile (NET), jak i makrofagi (MET). Mikroskopia konfokalna jest prawdopodobnie najbardziej optymalnym sposobem oceny ekspresji NET i MET, która może być również wykorzystana do oceny aktywności proteazy. Odporność płuc na Haemophilus influenzae można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej.

Reprezentatywne wyniki pokazują, w jaki sposób odpowiedzi immunologiczne o charakterze zapalnym na NTHi mogą być oceniane/ilościowo określane za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej. Kluczowym elementem interpretacji wyników jest porównanie fluorescencji między próbkami kontrolnymi a stymulowanymi. Optymalizacja barwienia próbek zazwyczaj wymaga przeprowadzenia szeregu eksperymentów wstępnych. Liczba kolorów, które można badać jednocześnie, zależy od liczby kanałów dostępnych w cytometrze przepływowym...

Haemophilus influenzae wywołuje stan zapalny w drogach oddechowych. W tym artykule skupimy się na zastosowaniu cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej do określenia odpowiedzi immunologicznej fagocytów i limfocytów w odpowiedzi na tę bakterię.

Ocena odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego na Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

Haemophilus influenza jest główną przyczyną stanu zapalnego w różnych przewlekłych chorobach płuc, w tym POChP i zapaleniu płuc. W protokole tym opisano metody oceny wpływu hemofila na stan zapalny płuc. Zaletą tej techniki jest to, że pozwala na kompleksową ocenę wrodzonych i nabytych odpowiedzi immunologicznych.Inkubować 450 mikrolitrów krwi obwodowej z 50 mikrolitrami aktywowanego jodku propidyny oznaczonego jako H influenzae w pięciomililitrowej probówce przez 20 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usunąć próbkę z łaźni wodnej, dodać pięć mikrolitrów DHR i wirować przez 10 sekund. Następnie umieść go z powrotem w łaźni wodnej na kolejne 10 minut.Po wyjęciu próbki z łaźni wodnej należy poddać erytrocyty lizie pięcioma mililitrami 0,8% roztworu chlorku amonu i przeanalizować próbki na cytometrze przepływowym, jak opisano w tekście. Podzielić próbkę krwi obwodowej na podwielokrotności w celu kontroli i stymulacji antygenu. Dodaj przeciwciała kostymulujące do obu próbek.Następnie dodaj nietypowalną grypę H do próbki antygenu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez godzinę. Następnie dodać do próbek środek blokujący Golgiego brefeldynę A i inkubować je przez kolejne pięć godzin. Po lizie erytrocytów, jak wykazano wcześniej, utrwal leukocyty za pomocą 500 mikrolitrów od jednego do 2% para-formaldehydu przez jedną godzinę.Policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie przeniknij 1 milion komórek 100 mikrolitrami 0,1% saponiny przez 15 minut. Następnie inkubuj komórki z odpowiednimi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Umyj komórki, a następnie przeanalizuj je za pomocą cytometru przepływowego.Określ proporcję komórek reagujących na antygen, uzyskując odpowiednie populacje limfocytów. Wykonaj barwienie tła na niestymulowanych komórkach dla wszystkich cytokin, które mają być analizowane. Pokrój około 20 do 40 gramów próbki lobektomii na trzy do pięciu milimetrowych odcinków sześciennych.Umieść je w sterylnej komorze o pojemności 50 mikrolitrów i mechanicznie rozdrobnij tkankę za pomocą odpowiedniego deagregatora. Po dezagregacji tkanek poddać lizie czerwone krwinki, jak pokazano, i ponownie zawiesić komórki w sterylnym RPMI. Następnie przefiltruj komórki przez sterylną siatkę nylonową o grubości 100 mikrometrów i policz żywe komórki za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego.W teście infekcji należy ponownie zawiesić komórki płuc w RPMI do końcowego stężenia 4 milionów komórek na mililitr na probówkę. Następnie zainfekuj komórki przy MOI wynoszącym 100 bakterii na komórkę. Poluzuj nasadkę o pół obrotu, aby umożliwić przepływ gazu w rurkach.Umieść komórki w rotatorze probówki i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza, obracając się z prędkością 12 obr./min. Godzinę po stymulacji dodaj grefeldynę A, aby zapobiec zewnątrzkomórkowemu eksportowi cytokin i inkubuj zawiesiny komórek przez kolejne 16 do 22 godzin z rotacją. Następnego dnia przemyć zawiesinę komórkową 500 mikrolitrami PBS zawierającego 1% albuminę surowicy bydlęcej i 0,01% azydku sodu.Następnie barwić zawiesinę komórek pod kątem określonych ludzkich limfocytów markerów powierzchniowych komórek przez jedną godzinę. Następnie umyj komórki PBS i utrwal je i przepuszczalność, jak pokazano wcześniej. Następnie inkubuj komórki z wewnątrzkomórkowymi przeciwciałami barwiącymi cytokiny przez godzinę.Następnie umyj komórki i ponownie zawieś je w 100 mikrolitrach PBS przed pobraniem danych na cytometrze przepływowym. Zmierz proteolizę poprzez działanie metaloproteinaz, dodaj substrat żelatynowy znakowany fluoresceiną bezpośrednio na szkiełka sekcji tkanki płucnej. Umieść szkiełka poziomo i inkubuj je w chronionej przed światłem wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Aby przygotować kontrole ujemne, dodać jeden x bufor reakcyjny bez żelatyny fluorescencyjnej do sekcji do dalszej analizy. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej bramkowano przy użyciu rozpraszania do przodu i na boki w celu zdefiniowania populacji fagocytów. Populacja fagocytów została dodatkowo zdefiniowana przez ekspresję CD14 w celu oznakowania monocytów.Pomiar ROS przeprowadzono poprzez utlenianie DHR 123 w celu uzyskania fluorescencji. Medianę fluorescencji stymulowanej próbki porównano z kontrolą. Wytwarzanie cytokin wewnątrzkomórkowych przez limfocyty mierzono za pomocą cytometrii przepływowej.Komórki analizowano najpierw pod kątem ekspresji markera leukocytów CD45, a następnie CD trzeciego i CD cztery, CD ósmego. Komórki CD trzy, CD cztery dodatnie oceniano pod kątem produkcji cytokin wewnątrzkomórkowych w próbkach kontrolnych i stymulowanych. Aktywność proteazy mierzono za pomocą zymografii NC two w nieutrwalonych skrawkach tkanki płucnej.Barwienie fluorescencyjne wykazało obecność aktywności MMP, która była również współzlokalizowana z ekspresją chromatyny. Dodanie przeciwciał do próbek tkanki płucnej wymaga koncentracji, a barwienie komórek będzie wymagało optymalizacji we wstępnych eksperymentach. Supernatant próbek tkanki płucnej może być dalej analizowany pod kątem innych mediatorów stanu zapalnego przy użyciu technik takich jak ELISA i Techniki te można wykorzystać do oceny wpływu potencjalnych terapii na zapalenie płuc.

assessing-respiratory-immune-responses-to-haemophilus-influenzae

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę in vitro do stymulacji limfocytów za pomocą nietypizowanego Haemophilus influenzae (NTHi) i oceny odpowiedzi immunologicznej. Inkubacja izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z NTHi powoduje, że komórki bakteryjne stymulują limfocyty T, co prowadzi do produkcji cytokin. Po zahamowaniu wydzielania cytokin przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne w celu wykrycia nagromadzonych cytokin wewnątrzkomórkowych w stymulowanych limfocytach T.

Technika in vitro do stymulacji limfocytów przez bakterie chorobotwórcze

Ten film demonstruje ilościowe określanie mediatorów stanu zapalnego podczas infekcji poprzez inkubację ludzkich komórek odpornościowych pochodzących z tkanki płucnej z Haemophilus influenzae. Cytometria przepływowa służy do pomiaru fluorescencji cytokin w znakowanych limfocytach, korelującej z produkcją cytokin prozapalnych w odpowiedzi na infekcję bakteryjną.

Kwantyfikacja mediatorów stanu zapalnego w zakażonych komórkach pochodzących z tkanek ludzkich

Ten film przedstawia test do pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV). Wstępna inkubacja z surowicą zawierającą przeciwciała neutralizujące RSV neutralizuje cząsteczki wirusa, zmniejszając infekcję komórkową i tworzenie się blaszek miażdżycowych. Komórki zakażone wirusem są następnie poddawane utrwalaniu, blokowaniu i znakowaniu przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem w celu wizualizacji płytki nazębnej. Proces ten umożliwia identyfikację...

Test do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących specyficznego dla syncytialnego wirusa oddechowego

Ludzki syncytialny wirus oddechowy (HRSV) może powodować ciężkie zapalenie oskrzelików u małych niemowląt. Część patogenezy ciężkiej choroby HRSV jest spowodowana odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Stymulacja pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych za pomocą HRSV zapewnia szybki i powtarzalny system modelowy do badania aktywacji szlaków zapalnych i infekcji.

Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego

Demonstrujemy procedurę dotchawniczego inokulacji Haemophilus influenzae do dolnych dróg oddechowych myszy. Jest to bardzo przydatne narzędzie do badania szlaków sygnałowych regulujących stan zapalny dróg oddechowych w modelach mysich.

Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania zapalenia dróg oddechowych

Ten protokół opisuje nieinwazyjną technikę pobierania próbek nienaruszonego płynu z błony śluzowej z górnych dróg oddechowych. Może być stosowany do ilościowego oznaczania in vivo poziomów mediatorów białkowych, takich jak cytokiny i chemokiny, u osób w każdym wieku.

Nieinwazyjne pobieranie próbek płynu wyściełającego błonę śluzową w celu ilościowego określenia in vivo poziomów mediatorów immunologicznych w górnych drogach oddechowych

Przedstawione protokoły opisują, jak przeprowadzić test hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla grypy z próbek surowicy biorców szczepionki przeciw grypie. Pierwszy test określa optymalne stężenia antygenu wirusowego za pomocą hemaglutynacji. Drugi test określa ilościowo miana przeciwciał swoistych dla grypy poprzez hamowanie hemaglutynacji.

Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy

Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.

Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu zalecanych procedur oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii.

Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii

Tutaj prezentujemy elegancki protokół do oceny in vivo skuteczności szczepionki i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Protokół ten można dostosować do modeli szczepionek, które badają patogeny wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze.

Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje badanie wczesnych interakcji między wirusowo zakażonymi komórkami nabłonka nosa a aktywacją komórek wrodzonych. Poszczególne podzbiory komórek odpornościowych można rozróżnić na podstawie ich aktywacji w odpowiedzi na infekcje wirusowe. Następnie można je dalej badać w celu określenia ich wpływu na wczesne odpowiedzi przeciwwirusowe.

Bezkontaktowy model kohodowli do badania aktywacji wrodzonych komórek odpornościowych podczas infekcji wirusem układu oddechowego

Poznaj metody oceny odpowiedzi immunologicznej na Haemophilus influenzae w tkance płucnej i krwi. Wykorzystaj cytometrię przepływową i mikroskopię konfokalną do analizy fagocytozy, cytokin i aktywności proteaz.

Ocena odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego na Haemophilus influenzae

Przeglądaj więcej filmów