Bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 scFv i immunofluorescencji
5 lipca 2021
Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię pomiaru izolewukleryn w tkankach metodą immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała ScFv D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Modele nadciśnienia zarówno u myszy, jak i u ludzi są wykorzystywane do wyjaśnienia krok po kroku procedur i podstawowych zasad związanych z pomiarem izolewuklesyny w próbkach tkanek.
Izolewuglandyny są zaangażowane w kilka chorób, zwłaszcza choroby układu krążenia. Protokół ten został opracowany w celu wykrywania izolewuglandyn w tkankach z białkiem fuzyjnym fosfatazy alkalicznej D11 i immunofluorescencją. Obecne metody wykrywania są drogie lub wymagają przeciwciała wtórnego dla E-tag.
Znalezienie wiarygodnego przeciwciała drugorzędowego jest trudne, ale ten protokół usuwa etap przeciwciała drugorzędowego. Zanurz szkiełka tkanek zatopionych w mysiej i ludzkiej parafinie w ksylenie trzy razy na pięć minut, aby oddzielić tkanki. W celu nawodnienia tkanki umyj tkanki dwa razy 95% etanolem, a następnie dwukrotnie 70% etanolem, a następnie dwukrotnie 50% etanolem przygotowanym w wodzie.
Umyj szkiełka w trzykrotnie buforowanym roztworze soli fizjologicznej z 0,1%Tween 20, napełniając uchwyt szkiełka TBST. Następnie wyrzuć TBST. Umieścić szkiełka w podgrzanym buforze cytrynianu sodu i inkubować w szybkowarze ustawionym na cztery minuty pod wysokim ciśnieniem, aby uzyskać całkowity czas pobierania antygenu wynoszący 20 minut.
Pod koniec inkubacji wyjmij szkiełka z szybkowaru i pozwól im ostygnąć przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wykonaj trzy szybkie mycia szkiełek za pomocą TBST, jak pokazano. Zablokuj szkiełka, dodając 2% BSA rozpuszczonego w TBST.
Przykryj szkiełka taśmą parafinową i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po inkubacji wyrzucić bufor blokujący. Dodać 200 mikrolitrów fosfatazy alkalicznej D11 przygotowanej w TBST do szkiełek i przykryć szkiełka taśmą parafinową.
Po inkubacji szkiełek w wilgotnej komorze przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, umyć szkiełka trzykrotnie TBST. Opracuj slajdy z kalorymetrycznym wywoływaczem fosfatazy alkalicznej do immunohistochemii lub fluorescencyjnym wywoływaczem fosfatazy alkalicznej do immunofluorescencji. Umyj szkiełka raz za pomocą TBST, aby usunąć nadmiar wywoływacza i zapobiec dalszemu rozwojowi koloru.
Wybarwić przeciw szkiełka jednym mikrogramem na mililitr barwnika jądrowego HEX przygotowanego w PBS do immunofluorescencji. Następnie umyj szkiełka raz za pomocą TBST, aby usunąć nadmiar plam przeciwstawnych. Za pomocą medium montażowego umieść szkiełko nakrywkowe na wywołanych szkiełkach.
Obserwuj szkiełka pod mikroskopem światła odwróconego do immunohistochemii lub pod konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym do immunofluorescencji. Można przeprowadzić cztery eksperymenty kontroli ujemnej w celu potwierdzenia specyficzności barwienia D11 AP dla izolewuglandyny. W pierwszym eksperymencie kontroli ujemnej inkubować tkanki z D11 AP rozcieńczonym w TBST lub samym TBST.
Następnie inkubować tkanki z rozcieńczonym D11 AP i bakteryjnym ekstraktem pariplazmatycznym rozcieńczonym w TBST bez łącznika D11 AP. Do testu kompetycyjnego należy przygotować izoLG i izoLG addukowane do albuminy surowicy myszy w stosunku molowym osiem do jednego. Rozcieńczyć D11 AP od jednego do 10 w TBST.
Następnie inkubować rozcieńczony D11 AP z 50 mikrogramami na mililitr MSA z adduktami izolewulandyny lub nieaddukowanym MSA przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaj D11 AP z izolewuglandyną MSA lub D11 AP z nieaddukowanym MSA do tkanek w celu barwienia. Użyć odpowiedniego przeciwciała D20 o zmiennym pojedynczym fragmencie łańcucha do barwienia tkanek do końcowego zestawu kontroli ujemnej.
Immunofluorescencję aorty u myszy z nadciśnieniem tętniczym i normotensyjnym badano przy użyciu tego protokołu. Barwienie D11 AP wykazało zwiększone stężenie izoLG w aorcie myszy z nadciśnieniem indukowanym angiotensyną II w porównaniu z myszami kontrolnymi. D11 AP został użyty do wykrywania izolewuglandyn obecnych w tkankach jelitowych pacjentów z nadciśnieniem tętniczym i ludzi z prawidłowym ciśnieniem.
W tkankach pacjentów z nadciśnieniem tętniczym stwierdzono podwyższone stężenie izolewuglandyn. Tkanki barwiono ekstraktem paraplazmatycznym i bez D11 AP. Jaśniejsze zabarwienie zaobserwowano w tkance barwionej D11 AP w porównaniu z tkanką barwioną ekstraktem pariplazmatycznym, co potwierdza, że barwienie nie było spowodowane niesprzężoną bakteryjną fosfatazą alkaliczną obecną w ekstrakcie pariplazmatycznym. W teście konkurencyjnym tkanka wybarwiona D11 AP wstępnie inkubowana z konkurentem isoLG wykazywała zmniejszone barwienie, podobne do barwienia obserwowanego w tkankach z D11 AP, co wskazuje na swoistość D11 AP wobec izolewuglandyn
.W kontroli ujemnej barwienie aorty myszy D11 AP powodowało silne barwienie w porównaniu z D20, co wskazuje na swoistość D11 AP wobec izolewuglandyn w aorcie nadciśnieniowej. Ważne jest, aby dezaktywować wszelkie endogenne fosfatazy alkaliczne obecne w tkance, aby ograniczyć barwienie tła.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową metodologię pomiaru izolewuglandyn w próbkach tkanek z wykorzystaniem immunofluorescencji z zastosowaniem przeciwciała D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Wykorzystując modele nadciśnienia u myszy i ludzi, opracowano szczegółowe procedury krok po kroku w celu zwiększenia wiarygodności detekcji izolewuglandyn.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Choroby układu sercowo-naczyniowego
- Immunologia
- Analiza tkanek
Wstęp
- Izolewuglandiny są zaangażowane w rozwój kilku chorób, przede wszystkim schorzeń układu sercowo-naczyniowego.
- Obecne metody detekcji wymagają zastosowania przeciwciał wtórnych, co komplikuje protokół.
- Niniejsze badanie upraszcza ten proces poprzez wyeliminowanie konieczności stosowania przeciwciała wtórnego.
Zastosowane metody
- Immunofluorescencja z wykorzystaniem białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11
- Próbki tkanek mysich i ludzkich
- Szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący przygotowania tkanek, odsłaniania antygenów i barwienia
Główne wyniki
- Barwienie D11 AP wykazało wyższe poziomy izolewuglandyn w aortach nadciśnieniowych w porównaniu z grupą kontrolną.
- W tkankach pacjentów ludzkich również stwierdzono podwyższone stężenia izolewuglandyn u osób z nadciśnieniem.
- Specyficzność D11 AP została potwierdzona w różnych eksperymentach kontrolnych.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia niezawodną metodę wykrywania isolewuglandyn, dostarczając cennych narzędzi do badań sercowo-naczyniowych.
- Wyniki podkreślają znaczenie isolewuglandyn w nadciśnieniu tętniczym i chorobach powiązanych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Wykrywanie reaktywnych mediatorów lipidowych, takich jak izolewuglandyny w tkankach, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia szlaków zapalnych w chorobach układu sercowo-naczyniowego. Obecne metody są pracochłonne i kosztowne, co ogranicza wydajność walidacji celów oraz badań mechanistycznych. Ta metoda immunofluorescencyjna umożliwia bezpośrednią, specyficzną wizualizację akumulacji IsoLG, wspierając przesiewy oparte na hipotezach oraz poszukiwanie translacyjnych biomarkerów w nadciśnieniu tętniczym i patologiach z nim związanych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie tworzenia adduktów białkowo-IsoLG jako mechanistycznego wskaźnika peroksydacji lipidów w modelach chorób.
- Wartość operacyjna: Zapewnia bezpośrednią metodę obrazowania, która eliminuje konieczność stosowania przeciwciał wtórnych, co zmniejsza złożoność i zmienność analizy.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka związanego z wyborem celu terapeutycznego poprzez powiązanie akumulacji IsoLG z fenotypami nadciśnieniowymi w tkankach ludzkich i mysich.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje przestrzennie rozdzielone, ilościowe odczyty fluorescencji dla lokalizacji IsoLG w przedziałach tkankowych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje developer fosfatazy alkalicznej kompatybilny zarówno z detekcją chromometryczną, jak i fluorescencyjną, co zapewnia elastyczność platformy.
- Skalowalność: Kompatybilność z archiwami tkanek zatopionych w parafinie ułatwia retrospektywną analizę próbek klinicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykazana skuteczność zarówno w mysich modelach nadciśnienia, jak i w tkankach pacjentów ludzkich potwierdza ważność międzygatunkową.
- Zgodność biomarkerów: Umożliwia ocenę obciążenia IsoLG jako potencjalnego biomarkera translacyjnego stresu oksydacyjnego w chorobach układu sercowo-naczyniowego.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala na wizualizację oddziaływania z celem w kontekstach patofizjologicznych, co wzmacnia wnioskowanie przyczynowe w walidacji celu.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po walidację przedkliniczną, w szczególności w odniesieniu do szlaków stresu oksydacyjnego w programach kardio-naczyniowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację funkcjonalną mechanizmów związanych z IsoLG poprzez umożliwienie bezpośredniego wykrywania w odpowiednich tkankach.
- Przesiew: Generuje powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania, odpowiednie do standaryzacji testów pomiędzy laboratoriami.
- Analityka: Dostarcza odczyty przestrzenne i intensywnościowe, które ułatwiają porównywanie akumulacji IsoLG w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki przedkliniczne z analizą tkanek ludzkich, wspierając decyzje o rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę immunohistochemiczną/immunofluorescencyjną do wykrywania adduktów lipidowych, którą można zastosować w różnych obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Dostarcza wglądu w mechanizmy sieciowania białek oraz stanu zapalnego indukowanego przez IsoLG.
- Wartość operacyjna: Eliminuje zależność od przeciwciał wtórnych, co upraszcza proces i zmniejsza zmienność między partiami odczynników.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań dzięki dostarczaniu jasnych i specyficznych odczytów biomarkerów stresu oksydacyjnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów zaangażowanych w szlaki peroksydacji lipidów w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii immunofluorescencyjnej oraz protokołów przygotowania tkanek.
- Zależne od dostępu do systemów wywoływania fosfatazy alkalicznej oraz odpowiedniego mikroskopu (konfokalnego lub odwróconego).
- Konieczna jest standaryzacja etapów blokowania, odzyskiwania antygenu oraz płukania dla wszystkich użytkowników.
- Adaptacja do tkanek świeżo zamrożonych lub kriosekcjonowanych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Endogenna aktywność fosfatazy alkalicznej musi zostać zniesiona w celu zminimalizowania sygnału tła.
