Name: Bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 scFv i immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniego wykrywania izolewuglandyn w tkankach myszy i ludzkich przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 i immunofluorescencji. Protokół eliminuje potrzebę stosowania przeciwciała wtórnego, zwiększając niezawodność badań nad chorobami układu krążenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 i R03HL155041 dla A.K. Dziękujemy Digital Histology Shared Resource - Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 za wizualizację i skanowanie slajdów.

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Vanderbilt zatwierdził wszystkie procedury opisane w tym manuskrypcie. Myszy są trzymane i pielęgnowane zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed włączeniem się do badania, zgodnie z aprobatą Institutional Review Board Uniwersytetu Vanderbilt. Wszystkie zabiegi zostały wykonane zgodnie z Deklaracją Helsińską.
1. Przygotowanie plazmidów kodujących białko fuzyjne fosfatazy alkalicznej D11 i wektory kontroli ujemnej
<ol>
	<li>Skonstruuj zmodyfikowaną wersję plazmidu pCANTAB5E class13,14, w której segment zmiennej pojedynczego fragmentu łańcucha (scFv) jest połączony na końcu 3' z sekwencją kodującą bakteryjną fosfatazę alkaliczną (AP). 
	UWAGA: Bezpośrednio za miejscem ograniczenia NotI sekwencji scFv, zmodyfikowany plazmid nie zawiera już sekwencji kodującej znacznika E, a zamiast tego koduje sekwencję łącznika GGSGGHMGSGG, po której następuje sekwencja dla AP (numer dostępu GenBank AXY87039.1, T16-K464)15,16. Za AP plazmid zakoduje znaczniki 8xHis i DYKDDDDK. Na końcu 3' znaczników sekwencja kodowania kończy się bursztynowym kodonem stop. Zmodyfikowany plazmid nazywa się pCANTAB5-AP.</li>
	<li>Sklonuj D11 scFv (numer dostępu GenBank AAW28931.1) do pCANTAB5-AP z witrynami ograniczeń SfiI/NotI.</li>
	<li>Sklonuj D20 scFv do pCANTAB5-AP z witrynami ograniczeń SfiI/NotI. 
	UWAGA: D20 scFv jest kontrolą ujemną przeznaczoną do oceny wzorca interakcji tkankowej nieistotnego scFv. Ten scFv został pierwotnie wybrany przez wyświetlacz fagowy ze względu na jego zdolność do interakcji z grupą glikanów znaną jako A2.</li>
	<li>Wygeneruj "pusty" wektor, całkowicie usuwając część scFv z plazmidu i zastępując ją sekwencją kodującą "AP linker" składającą się z aminokwasów GGGGSGRAGSGGGGS.</li>
	<li>Przekształć wszystkie plazmidy w kompetentne TG1 E. coli i hoduj bakterie przez noc w temperaturze 30 °C, na 0,5% płytkach agarowych zawierających 2xYT uzupełnione 100 μg/ml ampicyliny i 2% glukozy (2xYTAG) podłoże. 
	UWAGA: Szczepy z genem supE (takie jak TG1 E. coli) nie tłumią w 100% bursztynowego kodonu stop. Szacunki wahają się od 0,8 do 20% czasu, więc nadal istnieje wiele produktów, które kończą się tuż za BAP, tak jak jest to przeznaczone dla tych eksperymentów17. TG1 E. coli są stosowane głównie ze względów praktycznych, takich jak redukcja czasu i kosztów, ich kompatybilność z systemem ekspresji białek pCANTAB oraz ich zastosowanie w wyświetlaniu fagów, które jest powszechnie przeprowadzane w laboratorium. Poniżej bursztynowego kodonu stop następującego po BAP znajduje się sekwencja genu III. Białka fuzyjne genu III muszą ulegać rzadkiej ekspresji, aby wyświetlanie fagów działało zgodnie z przeznaczeniem, ponieważ białka fuzyjne scFv-gen III zakłócają działanie tego konkretnego białka genu III, aby ponownie zainfekować naiwne bakterie. W związku z tym, wolne od fuzji białka genu III muszą istnieć podczas składania wirionu do wytworzenia funkcjonującego faga, tj. produkty białkowe scFv-geneIII są zwykle stosunkowo rzadkie wewnątrz bakterii. D11-AP, D20-AP, pusty wektor i wszystkie konstrukty użyte w tym artykule są podobnie dotknięte okazjonalną ekspresją białka fuzyjnego genu III. Nadal obserwuje się różnice w zachowaniu tych białek.</li>
	<li>Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep świeże 5 ml kultury 2xYTAG. Pozostawić bakterie do rozwoju przez noc w temperaturze 30 °C i wstrząsnąć przy 150 obr./min.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml 85% 2xYTAG i 15% glicerolu.</li>
	<li>Utrzymuj zapasy glicerolu w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Ekspresja białka i generacja ekstraktu peryplazmatycznego
UWAGA: Wytwarzanie ekstraktu peryplazmatycznego jest powszechnie stosowaną metodą ekspresji białek w wyświetlaczu fagowym, głównie dlatego, że tworzenie wiązań dwusiarczkowych jest ważne w scFv i wytwarzaniu przeciwciał. Metoda ta pozwala uniknąć konieczności wytwarzania lizatów (zwykle zawierających ciała inkluzyjne) i zapewnia prawidłowe fałdowanie białek. pCANTAB ma sekwencję sygnałową gIII przed częścią scFv białka fuzyjnego D11-BAP. Sekwencja sygnałowa zapewnia, że białko jest transportowane do przestrzeni peryplazmatycznej bakterii, a następnie sekwencja sygnałowa jest rozszczepiana. Przestrzeń peryplazmatyczna zapewnia środowisko utleniające, które ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego tworzenia mostków dwusiarczkowych. Szok osmotyczny jest używany do uzyskiwania ekstraktów peryplazmatycznych, ponieważ przerywa błonę zewnętrzną na tyle, aby uwolnić białka peryplazmatyczne do otaczającego środowiska, jednocześnie utrzymując bakterię w stanie nienaruszonym.
<ol>
	<li>Zaszczepić zapasy glicerolu TG1 E. coli zawierające odpowiednie plazmidy do 60 ml kultury 2xYTAG i hodować przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min.</li>
	<li>Aby wywołać ekspresję białka, należy zawiesić kultury bakterii w osadach przy 3 000 x g przez 10 minut, ponownie zawiesić w 60 ml pożywki 2xYTA i hodować przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min. 
	UWAGA: Przejście z pożywki 2xTYAG na 2xYTA pomaga w wystarczającej indukcji ekspresji białka18. Gdy glukoza jest obecna w pożywce bakteryjnej, promotor lac jest tłumiony, ponieważ bakterie preferencyjnie spożywają glukozę i ignorują laktozę, ponieważ glukoza zużywa mniej energii do przetworzenia. Kiedy glukoza jest usuwana po przełączeniu pożywki, bakterie polegają na węglowodanach dostarczanych przez pożywkę 2xYT. Ekstrakt drożdżowy (składnik Y w 2xYT) zawiera węglowodany, w tym laktozę, dzięki czemu jest w stanie napędzać ekspresję białka przez promotor lak. IPTG nie jest konieczne w przypadku konstruktu pCANTAB i może powodować nadmierną ekspresję białka, wraz z ciałami inkluzyjnymi, które skutkują niefunkcjonalnym białkiem.</li>
	<li>Generuj ekstrakty peryplazmatyczne za pomocą szoku osmotycznego.
	<ol>
		<li>Osadzanie kultur bakterii w ilości 3.000 x g przez 10 min.</li>
		<li>Zawiesić w 20 ml 1xTES (0,2 M Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 0,5 M sacharozy) i inkubować przez 1 godzinę na lodzie.</li>
		<li>Ponownie osadzać w 3,000 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić w 15 ml 0,05 M Tris, pH 7,6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować tę zawiesinę na lodzie przez 1 godzinę, a następnie sklarować przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieść supernatanty do świeżej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne do oczyszczenia lub bezpośredniego użycia w eksperymentach.</li>
	<li>Oceń lizę komórek na podstawie obecności aktywnego D11-BAP w teście ELISA. Dodaj 3-5 μl ekstraktu peryplazmatycznego do jednego ml pNPP, a następnie obserwuj, czy w ciągu następnych 10 minut nastąpi zmiana koloru (kolor przechodzi od jasnożółtego do intensywnie żółtego). 
	UWAGA: Kolor można porównać obok siebie z probówką pNPP, która nie otrzymała żadnego lizatu lub probówką pNPP, która otrzymała lizat naiwnych bakterii TG1. Określić ilościowo z absorbancją przy długości fali 405 nm.</li>
</ol>
4. Charakterystyka miana D11-AP w teście ELISA
<ol>
	<li>Pokryj 384-dołkową płytkę polistyrenową przez noc w temperaturze 4 °C 25 μl/basenik soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (1,8 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl) zawierającej 5 μg/ml albuminy surowicy myszy (MSA) (kontrola ujemna) lub 5 μg/ml IsoLG/MSA (kontrola pozytywna).</li>
	<li>Opróżnij talerz i stuknij do sucha. Umyj raz za pomocą PBS + 0,1% Tween (PBS-T). Opróżnij talerz i stuknij do sucha.</li>
	<li>Napełnić płytkę PBS-T jako buforem blokującym (120 μl/studzienkę). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opróżnij talerz i stuknij do sucha. Zastosować seryjne rozcieńczenia 1:2 ekstraktów peryplazmatycznych D11-AP w 25 μl/studzienkę i rozcieńczyć w PBS-T. Dołączyć jedną studzienkę zawierającą tylko PBS-T jako kontrolę ujemną. 
	UWAGA: Typowe zakresy rozcieńczeń dla ekstraktów peryplazmatycznych to 1:8 - 1:4096. W przypadku objętości testu 25 μl należy rozpocząć od 50 μl początkowego stężenia "1:8": 6,25 μl ekstraktu peryplazmatycznego i 43,75 μl PBS-T. Następnie należy przeprowadzić 2-krotne rozcieńczenie, usuwając 25 μl tego roztworu i dodając go do następnego dołka zawierającego 25 μl PBS-T i pipetując w górę iw dół. Ta studzienka zawiera teraz rozcieńczenie "1:16". Powtarzaj 2-krotne rozcieńczenie, aby wygenerować opisaną serię rozcieńczeń 1:2.</li>
	<li>Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opróżnij talerz i stuknij do sucha. Umyj 5 razy za pomocą PBS-T. Opróżnij i wysusz.</li>
	<li>Przygotować roztwór pNPP, rozpuszczając 1 g pNPP w 1 l 930 mM dietanoloaminy (98% roztwór podstawowy rozcieńczony w stosunku 1:10 wH2O) w 0,5 mM MgCl2 i dostosowany do pH 9,5 za pomocą HCl.</li>
	<li>Zastosować 25 μl/dołek roztworu pNPP w celu wytworzenia AP. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i oznaczyć absorbancję przy 405 nm w każdym dołku za pomocą kompatybilnego czytnika płytek.</li>
	<li>Porównaj sygnał generowany z dołków IsoLG/MSA z szumem generowanym przez studnie MSA i znajdź zakres rozcieńczeń, w których sygnał jest co najmniej 5-krotnie wyższy niż szum.</li>
	<li>Narysuj tę serię rozcieńczeń sygnału D11-AP na wykresie, określ zakres liniowy krzywej i ustal rozcieńczenie, w którym można zaobserwować 50% sygnału. 
	UWAGA: Jeśli to rozcieńczenie jest równoważne w przybliżeniu 1:1,000, wówczas roztwór D11-AP może być użyty w stężeniu 1:10 w IHC/IF.</li>
</ol>
5. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Wyciąć seryjne odcinki tkanek zatopionych w parafinie mysim i ludzkim (o grubości 5 μm) za pomocą mikrotomu i umieścić w ciepłej łaźni wodnej (37 °C). Zamontuj skrawki chusteczek higienicznych na szkiełkach podstawowych i pozostaw do wyschnięcia na noc. 
	UWAGA: W tym badaniu aortę uzyskano od myszy. Wycinki jelita grubego u ludzi z normotensją i nadciśnieniem uzyskano z Vanderbilt Cooperative Human Tissue Network.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w ksylenie trzy razy na 5 minut w celu odparafinowania tkanek.</li>
	<li>Uwodnić tkanki w 2 płukaniach z 95%, 70% i 50% etanolu wH2O.</li>
	<li>Umyj szkiełka w roztworze soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) z 0,1% Tween20 (TBST) trzykrotnie z szybkimi płukaniami, napełniając uchwyt szkiełka TBST, a następnie wyrzucając TBST. 
	UWAGA: Uwodnione szkiełka można przechowywać w TBST w temperaturze 4 °C nie dłużej niż tydzień przed pobraniem antygenu.</li>
	<li>Aby przeprowadzić indukowane ciepłem pobieranie szkiełek z antygenu, należy umieścić szkiełka we wstępnie podgrzanym (80-95 °C) buforze cytrynianu sodu (10 mM cytrynianu sodu, 0,05% Tween 20, pH 6,0) i inkubować w szybkowarze ustawionym na 4 minuty pod wysokim ciśnieniem, aby uzyskać całkowity czas pobierania antygenu wynoszący 20 minut.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka z szybkowaru i pozwól im ostygnąć przez 20 minut do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka w TBST trzy razy z szybkim praniem. 
	UWAGA: Szkiełka mogą być przechowywane w TBST po pobraniu antygenu nie dłużej niż tydzień przed barwieniem.</li>
	<li>Dodaj 2% BSA rozpuszczonego w TBST, aby zablokować szkiełka. Przykryj szkiełka paskiem folii parafinowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Odrzuć bufor blokujący ze slajdów.</li>
	<li>Dodaj 200 μl 1:10 D11-AP w TBST do szkiełek i przykryj paskiem folii parafinowej.</li>
	<li>Inkubować w wilgotnej komorze, aby zminimalizować parowanie roztworu przeciwciała przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka trzy razy w TBST.</li>
	<li>Opracuj za pomocą kolorymetrycznego lub fluorescencyjnego wywoływacza fosfatazy alkalicznej odpowiednio do immunohistochemii lub immunofluorescencji. Umyj szkiełka raz za pomocą TBST, aby usunąć nadmiar wywoływacza i zapobiec dalszemu rozwojowi koloru.</li>
	<li>Preparaty do barwienia przeciwstawnego z barwnikiem jądrowym Hoechst o stężeniu 1 μg/ml w PBS do immunofluorescencji. Umyj szkiełka raz w TBST, aby usunąć nadmiar plam przeciwstawnych.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe nakładać za pomocą podłoża montażowego.</li>
	<li>Obejrzyj szkiełka pod mikroskopem światła odwróconego do immunohistochemii lub konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym do immunofluorescencji.</li>
</ol>
6. Kontrole negatywne
UWAGA: Można przeprowadzić cztery eksperymenty kontroli ujemnej, aby potwierdzić specyficzność barwienia D11-AP dla IsoLG. Doświadczenia kontroli ujemnej powinny być przeprowadzane w tym samym zestawie do barwienia w tych samych warunkach.
<ol>
	<li>W pierwszym eksperymencie kontroli ujemnej inkubować tkanki z D11-AP rozcieńczonym w TBST lub samym TBST.</li>
	<li>Inkubować tkanki z rozcieńczonym D11-AP w TBST i bakteryjnym ekstraktem perplazmatycznym bez D11-AP (AP Linker) rozcieńczonym w TBST.</li>
	<li>Wykonaj test konkurencyjny z IsoLG/MSA lub nieaddukowanym MSA, jak opisano wcześniej12.
	<ol>
		<li>Przygotuj IsoLG i IsoLG addukowane do albuminy surowicy myszy (MSA), jak opisano wcześniej19, w stosunku molowym 8 IsoLG: 1 MSA (8:1 IsoLG/MSA).</li>
		<li>Rozcieńczyć D11-AP w stosunku 1:10 w TBST.</li>
		<li>Rozcieńczony D11-AP inkubować z 50 μg/ml IsoLG/MSA lub nieaddukowanym MSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj D11-AP z IsoLG/MSA lub D11-AP z nieaddukowanym MSA do tkanek w celu barwienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyć nieistotnego przeciwciała scFv, D20, do barwienia tkanek do końcowego zestawu kontroli ujemnej.</li>
</ol>

<ol><li>Brame, C. J., Salomon, R. G., Morrow, J. D., Roberts, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+extremely+reactive+gamma-ketoaldehydes+%28isolevuglandins%29+as+products+of+the+isoprostane+pathway+and+characterization+of+their+lysyl+protein+adducts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of extremely reactive gamma-ketoaldehydes (isolevuglandins) as products of the isoprostane pathway and characterization of their lysyl protein adducts.</a> Journal of Biological Chemistry. 274, 13139-13146 (1999).</li>
<li>Brame, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+proteins+by+isoketal-containing+oxidized+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modification of proteins by isoketal-containing oxidized phospholipids.</a> Journal of Biological Chemistry. 279, 13447-13451 (2004).</li>
<li>May-Zhang, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenging+reactive+lipids+to+prevent+oxidative+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Scavenging reactive lipids to prevent oxidative injury.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 61, 291-308 (2021).</li>
<li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2019+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 139, 56(2019).</li>
<li>Collins, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cardiovascular+risk+assessment+in+the+primary+prevention+of+cardiovascular+disease+in+adults%3A+Systematic+review+of+systematic+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Global cardiovascular risk assessment in the primary prevention of cardiovascular disease in adults: Systematic review of systematic reviews.</a> BMJ Open. 7, 013650(2017).</li>
<li>Whelton, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2017+ACC%2FAHA%2FAAPA%2FABC%2FACPM%2FAGS%2FAPhA%2FASH%2FASPC%2FNMA%2FPCNA+Guideline+for+the+prevention%2C+detection%2C+evaluation%2C+and+management+of+high+blood+pressure+in+adults%3A+Executive+summary%3A+A+report+of+the+American+College+of+Cardiology%2FAmerican+Heart+Association+Task+Force+on+clinical+practice+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the prevention, detection, evaluation, and management of high blood pressure in adults: Executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on clinical practice guidelines.</a> Circulation. 138, 426-483 (2018).</li>
<li>Patrick, D. M., Van Beusecum, J. P., Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+inflammation+in+hypertension%3A+Novel+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The role of inflammation in hypertension: Novel concepts.</a> Current Opinion in Physiology. 19, 92-98 (2021).</li>
<li>Davies, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolevuglandins+as+mediators+of+disease+and+the+development+of+dicarbonyl+scavengers+as+pharmaceutical+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Isolevuglandins as mediators of disease and the development of dicarbonyl scavengers as pharmaceutical interventions.</a> Pharmacology and Therapeutics. 205, 107418(2020).</li>
<li>Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+isolevuglandins+in+immunity%2C+inflammation%2C+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 312, 368-374 (2017).</li>
<li>Kirabo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC+isoketal-modified+proteins+activate+T+cells+and+promote+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4642-4656 (2014).</li>
<li>Yan, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolevuglandins+as+a+gauge+of+lipid+peroxidation+in+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolevuglandins as a gauge of lipid peroxidation in human tumors.</a> Free Radical Biology and Medicine. 106, 62-68 (2017).</li>
<li>Davies, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+isoketal+adducts+in+vivo+using+a+single-chain+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of isoketal adducts in vivo using a single-chain antibody.</a> Free Radical Biology and Medicine. 36, 1163-1174 (2004).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-chain+fragment+variable+antibody+piezoimmunosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-chain fragment variable antibody piezoimmunosensors.</a> Analytical Chemistry. 77, 797-805 (2005).</li>
<li>Hennig, E. E., Mernaugh, R., Edl, J., Cao, P., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+among+Helicobacter+pylori+strains+in+expression+of+the+outer+membrane+protein+BabA%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity among Helicobacter pylori strains in expression of the outer membrane protein BabA.</a> Infections and Immunity. 72, 3429-3435 (2004).</li>
<li>Martin, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+vector+system+to+improve+performance+and+utilisation+of+recombinant+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A simple vector system to improve performance and utilisation of recombinant antibodies.</a> BMC Biotechnology. 6, 46(2006).</li>
<li>Han, Z., Karatan, E., Scholle, M. D., McCafferty, J., Kay, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+screening+of+phage-display+output+with+alkaline+phosphatase+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+and+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Accelerated screening of phage-display output with alkaline phosphatase fusions.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 7, 55-62 (2004).</li>
<li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+J+%22Handbook+for+a+short+course+in+bacterial+genetics%22">Handbook for a short course in bacterial genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1992).</li>
<li>Nair, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+extract+mediated+autoinduction+of+lacUV5+promoter%3A+An+insight%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Yeast extract mediated autoinduction of lacUV5 promoter: An insight.</a> New Biotechnology. 26 (6), 282-288 (2009).</li>
<li>Davies, S. S., Amarnath, V., Roberts, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoketals%3A+Highly+reactive+%CE%B3-ketoaldehydes+formed+from+the+H2-isoprostane+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Isoketals: Highly reactive γ-ketoaldehydes formed from the H2-isoprostane pathway.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 128 (1-2), 85-99 (2004).</li>
<li>Ngwenyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolevuglandin-modified+cardiac+proteins+drive+CD4%2B+T-Cell+activation+in+the+heart+and+promote+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Isolevuglandin-modified cardiac proteins drive CD4+ T-Cell activation in the heart and promote cardiac dysfunction.</a> Circulation. 143 (12), 1242-1255 (2021).</li>
<li>Prinsen, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reactive+Isolevuglandins+promote+atrial+fibrillation+caused+by+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+to+Translational+Science+JACC%22%5BJournal%5D)">Highly reactive Isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension.</a> Basic to Translational Science JACC. 5 (6), 602-615 (2020).</li>
<li>Ferguson, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+dietary+salt-induced+dendritic+cell+activation+underlies+microbial+dysbiosis-associated+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension.</a> JCI Insight. 5 (13), 126241(2019).</li>
<li>Madhur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertension%3A+Do+inflammation+and+immunity+hold+the+key+to+solving+this+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Hypertension: Do inflammation and immunity hold the key to solving this epidemic.</a> Circulation Research. 128 (7), 908-933 (2021).</li>
<li>Estaki, M., DeCoffe, D., Gibson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+intestinal+alkaline+phosphatase%2C+diet%2C+gut+microbes+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Interplay between intestinal alkaline phosphatase, diet, gut microbes and immunity.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15650-15656 (2014).</li>
<li>Millán, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMill%C3%A1n%2C+JL+%22Mammalian+alkaline+phosphatases%3A+From+biology+to+applications+in+medicine+and+biotechnology%22">Mammalian alkaline phosphatases: From biology to applications in medicine and biotechnology</a>. , John Wiley and Sons. (2006).</li>
<li>Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endogenous+tissue+alkaline+phosphatase+with+the+use+of+alkaline+phosphatase+conjugates+in+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (8), 981-984 (1981).</li>
<li>Goldstein, D. J., Rogers, C. E., Harris, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+alkaline+phosphatase+loci+in+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Expression of alkaline phosphatase loci in mammalian tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 77 (5), 2857-2860 (1980).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of immunohistochemistry.</a> Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).</li>
<li>Coleman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li>
<li>Harper, J. E., Toth, R. L., Mayo, M. A., Torrance, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+a+panel+of+single+chain+variable+fragments+against+Potato+leafroll+virus+obtained+from+two+phage+display+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Properties of a panel of single chain variable fragments against Potato leafroll virus obtained from two phage display libraries.</a> Journal of Virological Methods. 81 (1-2), 159-168 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

D11 jest szeroko stosowany do wykrywania białek addukowanych przez IsoLG w komórkach lub tkankach jako marker stanu zapalnego lub stresu oksydacyjnego w chorobie 8,9,20. Wcześniej D11 zawierał znacznik E, a rozwój IHC wymagał użycia drugorzędowego przeciwciała anty-E sprzężonego z HRP 10,20,21. W tym miejscu opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokół wykrywania białek addukowanych przez IsoLG za pomocą przeciwciała D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną zamiast znacznika E, co eliminuje potrzebę wtórnej inkubacji przeciwciał.
Aby określić swoistość D11-AP, przeprowadzono cztery eksperymenty kontroli ujemnej. Wykonaliśmy protokół bez obecności D11 i mieliśmy minimalny rozwój. Wyniki te mają dwojakie wskazanie: endogenna fosfataza alkaliczna nie przyczynia się do rozwoju, a obserwowane barwienie jest spowodowane D11, a nie innym czynnikiem przyczyniającym się. Następnie poplamiliśmy slajdy łącznikiem AP bez D11. Eksperyment ten spowodował niewielkie zabarwienie, co wskazuje, że wolny AP lub inne czynniki w ekstrakcie peryplazmatycznym nie powodują plamy, którą obserwujemy w obecności D11. Aby zapewnić specyficzność D11 dla IsoLG, przed barwieniem szkiełek wstępnie inkubowaliśmy D11-AP z oczyszczonym IsoLG. Zaobserwowaliśmy spadek rozwoju, co wskazuje, że D11-AP był związany z białkiem IsoLG, wyczerpując w ten sposób ilość wolnego D11-AP do wiązania się z IsoLG obecnym w tkance. Wreszcie, aby upewnić się, że D11-AP wiąże się z IsoLG, a nie z białkiem MSA, z którym IsoLG był związany, wstępnie inkubowaliśmy D11-AP tylko z MSA. Nie zaobserwowano żadnych zmian w rozwoju, co wskazuje, że D11-AP nie wiązał się z MSA, ale z białkiem IsoLG. Wreszcie, naukowcy opracowujący protokół barwienia byli ślepi na stan nadciśnienia w ludzkiej tkance jelitowej. Różnice w barwieniu obserwowane między pacjentami z nadciśnieniem tętniczym a pacjentami z normociśnieniem nie wynikały z błędu systematycznego i zostały opisane wcześniej22,23.
Chociaż nasz protokół wykrywania białek addukowanych przez IsoLG przy użyciu przeciwciała D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną zamiast znacznika E jest rygorystyczny i solidny oraz eliminuje potrzebę wtórnej inkubacji przeciwciał, ma pewne ograniczenia. Jednym z ograniczeń jest to, że użyliśmy D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną w ekstrakcie peryplazmatycznym i może dojść do fałszywego zabarwienia endogennej fosfatazy alkalicznej w ekstrakcie peryplazmatycznym lub niektórych tkankach, takich jak jelito24. Jednak pierwszym krokiem do opracowania tego protokołu było wyłączenie endogennej fosfatazy alkalicznej, która może być obecna w tkankach25. Początkowo testowano zimny kwas octowy, BME i lewamizol26 pod kątem skuteczności. Żaden z nich nie zmniejszył całkowicie obecności aktywnej endogennej fosfatazy alkalicznej. Ciepło zostało użyte do dezaktywacji fosfatazy alkalicznej27, więc przetestowaliśmy dezaktywację termiczną fosfatazy alkalicznej w różnych. Odkryliśmy, że podgrzewane i uwodnione szkiełka w buforze cytrynianowym eliminowały większość endogennej fosfatazy alkalicznej. Preparaty zostały początkowo opracowane przy użyciu podłoża chemiluminescencyjnego/fluorescencyjnego, ale podczas obrazowania bez tego podłoża występowała duża ilość autofluorescencji. VectorRed jest substratem, który rozwija się w obecności fosfatazy alkalicznej w celu wytworzenia chromogenu, który można uwidocznić w zakresie kanałów Texas Red/TRITC. Korzystając z tego podłoża, byliśmy w stanie łatwiej zaobserwować sygnał powyżej autofluorescencji tła. Podczas procesu barwienia należy zachować ostrożność, aby zminimalizować sztuczne plamy. Wysuszenie tkanek na szkiełkach po nawodnieniu do czasu obrazowania spowodowało zwiększony rozwój. D11-AP należy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C. Podczas pracy z D11-AP należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) może również wpływać na aktywność enzymatyczną fosfatazy alkalicznej i nie powinna być stosowana jako bufor do przemywania28. Podobnie jak w przypadku każdego podejścia opartego na przeciwciałach, należy przeprowadzić dokładne testy i optymalizację, aby upewnić się, że barwienie jest specyficzne i że sygnał nie jest nadmiernie lub niedostatecznie wzmocniony.
Podsumowując, opracowaliśmy potężny, rygorystyczny i solidny, zoptymalizowany protokół do wykrywania białek addukowanych przez IsoLG za pomocą przeciwciała D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną zamiast znacznika E. Protokół ten ma kilka zalet: po pierwsze, stosowanie D11 jako białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej jest tańsze. D11 pierwotnie pochodził z biblioteki przeciwciał fagowych, których nie można było skomercjalizować i których oczyszczanie było drogie. Chociaż D11 w ekstrakcie peryplazmatycznym E. coli może stanowić niedrogą alternatywę, był nieskuteczny w większości testów. Po drugie, podejście oparte na fuzji fosfatazy alkalicznej pozwala D11 scfv na fuzję użytecznego reportera15 (fosfatazy alkalicznej) i nie musiałaby być oczyszczana do stosowania w testach immunologicznych, ponieważ substraty są dostępne na rynku. Po trzecie, fosfataza alkaliczna E. coli tworzy dimery29. Tak więc D11 po fuzji z fosfatazą alkaliczną również tworzy dimery, a to zwiększa awidność przeciwciała i aktywność wiązania30. Wreszcie, D11 sprzężony z fosfatazą alkaliczną w ekstrakcie peryplazmatycznym można łatwo oczyścić za pomocą Cibacron Blue Sepharose. D11 ma wysoki punkt izoelektryczny (~9,2 pH). W związku z tym jest naładowany dodatnio i może wiązać się z błękitem Cibacron poprzez interakcje kationowe. Większość zanieczyszczeń w ekstrakcie peryplazmatycznym E. coli można wymyć z żywicy. D11 sprzężony z fosfatazą alkaliczną można następnie eluować przy użyciu wysokiej zawartości soli (~1,5 M NaCl) w wodzie. Eluowany D11 sprzężony z fosfatazą alkaliczną jest dość stabilny w temperaturze 4-8 °C w roztworze o wysokiej zawartości soli. W związku z tym opracowaliśmy protokół, który nie tylko sprawia, że przeciwciało D11 jest dostępne po niskich kosztach, ale także eliminuje dodatkowe etapy i potrzebę wtórnej inkubacji przeciwciał. Protokół ten ułatwia powtarzalny pomiar IsoLG, które gromadzą się w tkankach w wielu chorobach, w których rolę odgrywa zwiększony stres oksydacyjny.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62603">Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence</a>. The Authors section was updated from:
Cassandra Warden1 
Alan J. Simmons2 
Lejla Pasic3 
Sean S. Davies4 
Justin H. Layer5 
Raymond L. Mernaugh3 
Annet Kirabo4,6 
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center 
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University 
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University 
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center 
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine 
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University
to:
Cassandra Warden1 
Alan J. Simmons2 
Lejla Pasic3 
Ashley Pitzer4,6 
Sean S. Davies4 
Justin H. Layer5 
Raymond L. Mernaugh3 
Annet Kirabo4,6 
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center 
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University 
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University 
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center 
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine 
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62603">Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence

Isolevuglandins (IsoLGs), znane również jako izoketale, są izomerami z rodziny 4-ketoaldehydów, które są produktami peroksydacji lipidów i reagują z aminami pierwszorzędowymi na białkach i do nich się przyłączają1,2. IsoLG są zaangażowane w wiele chorób, w tym choroby układu krążenia, chorobę Alzheimera, choroby płuc i wątroby oraz wiele rodzajów raka3. IsoLG zostały najszerzej przebadane pod kątem ich udziału w chorobach sercowo-naczyniowych (CVD), które stanowią poważne obciążenie zdrowotne i ekonomiczne na całym świecie, w tym w Stanach Zjednoczonych. Szacuje się, że 92,1 miliona dorosłych Amerykanów cierpi na co najmniej jeden rodzaj CVD, a szacunkowe prognozy na 2030 r. sięgają 43,9% dorosłej populacji USA4. Obniżenie ciśnienia krwi, poziomu cholesterolu i rzucenie palenia zmniejsza ogólne ryzyko wystąpienia zdarzeń sercowo-naczyniowych5.
Wysokie ciśnienie krwi lub nadciśnienie jest głównym czynnikiem ryzyka chorób sercowo-naczyniowych i dotyka około połowy populacji USA6. Wcześniejsze badania wykazały, że stan zapalny jest podstawową przyczyną nadciśnienia tętniczego i że IsoLG odgrywają pewną rolę7. Bodźce nadciśnieniowe, w tym angiotensyna II, katecholaminy, aldosteron i nadmiar soli w diecie, indukują akumulację IsoLG w komórkach prezentujących antygen, w tym w komórkach dendrytycznych (DC), które z kolei aktywują limfocyty T do proliferacji i produkcji cytokin zapalnych, które przyczyniają się do nadciśnienia8,9.
Poprzednio, IsoLGs były mierzone za pomocą immunohistochemii, spektrometrii mas, testu immunoenzymatycznego i cytometrii przepływowej10,11. Aby ułatwić pomiar IsoLGs, opracowano rekombinowane przeciwciało (D11) z jednołańcuchową zmienną fragmentową (scfv) przeciwko IsoLGs12. Początkowo to przeciwciało D11 zawierało znacznik E 11 aminokwasów i wymagało przeciwciała drugorzędowego do wykrywania immunohistochemicznego11. Trudno było jednak znaleźć wiarygodne przeciwciało drugorzędowe przeciwko E-znacznikowi po zaprzestaniu jego produkcji przez producenta. Dlatego opracowaliśmy niezawodny protokół barwienia immunofluorescencyjnego IsoLG przy użyciu D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną (D11-AP), który wykazaliśmy w tkankach myszy i ludzi z nadciśnieniem tętniczym i bez.

<table><tbody><tr><td>1 ml kolumna TALON HiTrap (Cobalt-CMA)</td><td>Cytiva</td><td>28953766</td><td></td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>2xYT w proszku</td><td>MP Biomedicals</td><td>3012-032</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowe, przezroczyste, płaskodenne mikropłytki polistyrenowe</td><td>ThermoFisher (NUNC)</td><td>242757</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodna sól disodowa fosforanu 4-nitrofenylu (pNPP)</td><td>Carbosynth</td><td>EN08508</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan 5-bromo-4-chloro-3indoksylowy, sól p-toluidyny (BCIP)</td><td>Karbosynter</td><td>EB09335</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina, sól sodowa</td><td>Międzynarodowe Produkty Badawcze (RPI)</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>RPI</td><td>A30075</td><td></td></tr><tr><td>Chemicznie kompetentna TG1 E. coli</td><td>Amid Biosciences</td><td>TG1-201</td><td></td></tr><tr><td>Dietanoloamina, >98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8885</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Pożywka do wydobywania</td></tr><tr><td>glukozy</td><td>Międzynarodowe Produkty Badawcze Glukozy (RPI)</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-200</td><td>Alternatywa dla ksylenu</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>roztwór podstawowy = 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals</td><td>ThermoFisher</td><td>MK-2624-212</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>I52000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (bezwodny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy myszy (MSA)</td><td>Sigma-Aldrich/Calbiochem</td><td>126674</td><td></td></tr><tr><td>Nitroniebieski chlorek tetrazolu (NBT)</td><td>Carbosynth</td><td>EN13587</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, monozasadowy (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Szybkowar</td>Kasety dializacyjne <td>Cuisinart</td><td>CPC-600</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-Lyzer, 10K MWCO, 3 ml</td><td>ThermoFisher</td><td>66380</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1064461000</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu, dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Produkty badawcze Międzynarodowa (RPI)</td><td>S23100</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Produkty Badawcze Międzynarodowe (RPI)</td><td>S24065</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Produkty Badawcze Międzynarodowe (RPI)</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana Tris</td><td>Boston Bio-Products</td><td></td><td>25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td> Research <td>Products International (RPI)</td><td>T60050</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Wektor Czerwony</td><td>Vector Labs</td><td>SK-5105</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej d11 scfv i immunofluorescencji

Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence

Isolevuglandins (IsoLGs) to wysoce reaktywne gamma-ketoaldehydy tworzone z H2-izoprostanów poprzez peroksydację lipidów i białka sieciujące, co prowadzi do stanów zapalnych i różnych chorób, w tym nadciśnienia. Wykrycie akumulacji IsoLG w tkankach ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia ich udziału w procesach chorobowych. Jednak pomiar IsoLG w tkankach jest niezwykle trudny, a obecnie dostępne narzędzia, w tym analiza spektrometrii mas, są pracochłonne i niezwykle kosztowne. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę wykrywania in situ IsoLG w tkankach przy użyciu sprzężonego z fosfatazą alkaliczną D11 ScFv i rekombinowanego przeciwciała fagowego wytwarzanego w E. coli za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Do walidacji barwienia użyto czterech kontroli: (1) barwienie z D11 i bez niego, (2) barwienie bakteryjnym ekstraktem perplazmatycznym z łącznikiem fosfatazy alkalicznej, (3) barwienie nieistotnymi przeciwciałami scFV oraz (4) kontrola konkurencyjna z IsoLG przed barwieniem. Wykazujemy skuteczność D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną zarówno w tkankach ludzkich, jak i mysich z nadciśnieniem tętniczym lub bez. Metoda ta prawdopodobnie posłuży jako ważne narzędzie do badania roli IsoLG w wielu różnych procesach chorobowych.

W reprezentatywnych eksperymentach w immunofluorescencji wykorzystano scFv D11 sprzężone z fosfatazą alkaliczną (D11-AP) do wykrycia IsoLGs obecnych u myszy traktowanych angiotensyną II w porównaniu z normalnymi myszami kontrolnymi (sham), a także u ludzi z nadciśnieniem w porównaniu z osobami normotensyjnymi. Myszy otrzymywały angiotensynę II w dawce 490 ng/kg/min przez dwa tygodnie, a nadciśnienie potwierdzono poprzez wzrost skurczowego ciśnienia krwi w porównaniu z myszami kontrolnymi10. Aby zapewnić specyficzność D11-AP, tkanki barwiono z zastosowaniem lub bez zastosowania D11-AP. Jak wykazano w barwieniu D11-AP, aorta myszy z nadciśnieniem indukowanym angiotensyną II wykazywała podwyższone stężenie IsoLGs w porównaniu z myszami kontrolnymi (Rysunek 1). Barwienie tła lub autofluorescencja były ograniczone, co wykazały kontrole negatywne, których nie barwiono przy użyciu D11-AP.
Przeciwciało D11-AP wykorzystano do wykrywania IsoLG obecnych w tkankach jelitowych u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym (HTN) oraz u osób z ciśnieniem w normie (NTN). Status nadciśnienia ustalono na podstawie dokumentacji szpitalnej jako skurczowe ciśnienie krwi powyżej 140 i rozkurczowe ciśnienie krwi powyżej 80 mmHg. Badacze opracowujący protokół immunofluorescencji dla D11-AP nie znali statusu nadciśnienia w badanych tkankach ludzkich. Prשbarwienia przekrojów przeprowadzono w obecności i wykluczeniu D11-AP, aby potwierdzić swoistość przeciwciała oraz ocenić barwienie tła lub autofluorescencję. Jak pokazano na Rysunku 2, stwierdzono, że tkanki pobrane od pacjentów z HTN charakteryzowały się podwyższonym stężeniem IsoLG w porównaniu z pacjentami z NTN. Barwienie bez użycia D11-AP wykazało również minimalne barwienie tła i autofluorescencję. Endogenna fosfataza alkaliczna jest ekspresowana przez nabłonek jelitowy, zatem ograniczona fluorescencja tkanek barwionych bez D11-AP wskazuje, że zastosowana w tym protokole procedura odzyskiwania antygenu była wystarczająca do inaktywacji endogennej fosfatazy alkalicznej obecnej w tkankach. W połączeniu z wynikami uzyskanymi u myszy, dane te wykazują, że protokół immunofluorescencji skutecznie obrazuje podwyższony poziom IsoLG w nadciśnieniu w porównaniu do stanu normotensyjnego.
D11-AP został wyizolowany i przechowywany w ekstrakcie peryplazmatycznym bakterii. Tkanki myszy i człowieka barwiono za pomocą D11-AP oraz ekstraktu peryplazmatycznego zawierającego łącznik AP bez D11, aby upewnić się, że inne czynniki, które mogą występować w ekstrakcie peryplazmatycznym, takie jak nadmiar lub nieprzymocowana fosfataza zasadowa, nie przyczyniają się do barwienia obserwowanego w tkankach traktowanych D11-AP (Rysunek 3). Tkanki barwione D11-AP wykazały intensywniejsze barwienie w porównaniu z tkankami barwionymi ekstraktem peryplazmatycznym. Wyniki te potwierdzają, że barwienie tkanek jest wynikiem działania D11-AP, a nie nieprzymocowanej bakteryjnej fosfatazy zasadowej, która potencjalnie może występować w ekstrakcie peryplazmatycznym i prowadzić do fałszywego barwienia IsoLG lub przyczyniać się do barwienia tła.
Przeprowadzono kontrolę konkurencyjną poprzez inkubację D11-AP z IsoLG przyłączonym do MSA lub niezmodyfikowanym MSA przed barwieniem tkanek, aby wykazać specyficzność D11-AP względem IsoLG. Jeśli D11-AP jest specyficzne dla IsoLG, przeciwciało związałoby się z IsoLG-MSA, co doprowadziłoby do zmniejszenia dostępności D11-AP do barwienia tkanek, natomiast D11-AP inkubowane z niezmodyfikowanym MSA wykazałoby barwienie zbliżone do standardowego D11-AP. W tkankach barwionych D11-AP uprzednio inkubowanym z konkurentem IsoLG zaobserwowano osłabienie barwienia w porównaniu z tkankami barwionymi D11-AP bez żadnej inkubacji wstępnej (Rycina 4). W tkankach barwionych D11-AP uprzednio inkubowanym z niezmodyfikowanym MSA barwienie było zbliżone do barwienia obserwowanego w tkankach z D11-AP. Wyniki te wykazują specyficzność D11-AP względem IsoLG, ze względu na zredukowane barwienie tkanek w przypadku inkubacji D11-AP z IsoLG/MSA, a nie z niezmodyfikowanym MSA. W końcowej kontroli negatywnej tkankę mysią barwiono przeciwciałem D11-AP lub nieistotnym przeciwciałem scFv, D20. Barwienie aorty mysiej za pomocą D11-AP doprowadziło do silnego zabarwienia w porównaniu z D20, co wskazuje na specyficzność D11-AP względem IsoLG w aortach nadciśnieniowych (Rycina 5).
<img alt="Mikroskopia konfokalna tkanki naczyniowej; grupy angiotensyna II vs. sham; analiza w punkcie czasowym D11." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62603/62603fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Immunofluorescencja aorty u myszy z nadciśnieniem i normotensyjnych. Tętnice od myszy poddanych infuzji angiotensyny II oraz myszy z grupy sham barwiono z użyciem i bez użycia D11-AP (D11), aby wykazać obecność IsoLGs. (A) Tętnica od myszy leczonej angiotensyną II z użyciem przeciwciała D11-AP (zielony) i barwieniem jądrowym (magenta), (B) Tętnica od kontrolnej myszy z grupy sham z użyciem D11-AP, (C) Tętnica od myszy leczonej angiotensyną II bez użycia D11-AP, (D) Tętnica od kontrolnej myszy z grupy sham bez użycia D11-AP (pasek skali = 100 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62603/62603fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat histologiczny, mikroskopia fluorescencyjna, przekroje tkanek, struktura komórkowa, porównanie HTN vs. NTN." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62603/62603fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Immunofluorescencja tkanek jelitowych ludzi od pacjentów z nadciśnieniem i bez nadciśnienia. Tkanki pacjentów z nadciśnieniem tętniczym (HTN) oraz osób z ciśnieniem w normie (NTN) barwiono z użyciem i bez użycia D11-AP (D11), aby wykazać obecność IsoLG u pacjentów z HTN. (A) tkanki HTN barwione D11-AP (zielony) i barwnikiem jądrowym (magenta), (B) tkanki NTN barwione D11-AP, (C) tkanki HTN barwione bez D11-AP, (D) tkanki NTN barwione bez D11-AP (pasek skali = 100 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62603/62603fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Immunofluorescencja tkanek mysich i ludzkich, Angiotensyna II vs Sham, HTN i NTN, markery białkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62603/62603fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Tkanki mysie i ludzkie barwione ekstraktem peryplazmatycznym z D11-AP i bez D11-AP. Tkanki mysie i ludzkie barwiono ekstraktami peryplazmatycznymi z dodatkiem D11-AP oraz bez D11-AP. Obrazy wykazują ograniczone barwienie tkanek ekstraktem peryplazmatycznym bez D11-AP, co wskazuje, że barwienie wynika głównie z wiązania D11-AP, a nie z innego składnika, który może być obecny w ekstrakcie peryplazmatycznym. (A) aorta myszy Ang barwiona D11-AP (zielony) i przeciwbarwienie jąder komórkowych (magenta), (B) aorta myszy Ang barwiona ekstraktem peryplazmatycznym, (C) aorta myszy Sham barwiona D11-AP, (D) aorta myszy Sham barwiona ekstraktem peryplazmatycznym, (E) ludzka tkanka jelitowa z nadciśnieniem tętniczym barwiona D11-AP, (F) ludzka tkanka jelitowa z nadciśnieniem tętniczym barwiona ekstraktem peryplazmatycznym, (G) ludzka tkanka jelitowa z prawidłowym ciśnieniem tętniczym barwiona D11-AP, (H) ludzka tkanka jelitowa z prawidłowym ciśnieniem tętniczym barwiona ekstraktem peryplazmatycznym (pasek skali = 100 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62603/62603fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Przekroje histologiczne tkanki aorty; porównanie warunków Angiotensyny II i Sham; eksperyment." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62603/62603fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Kontrola konkurencyjna w naczyniach myszy Ang i Sham. W tej kontroli konkurencyjnej D11-AP poddano preinkubacji z MSA z adduktem IsoLG lub MSA bez adduktu. Jako kontrolę zastosowano D11-AP bez preinkubacji. Wyniki te wykazują specyficzność D11-AP względem IsoLG, ponieważ w przypadku zastosowania konkurenta IsoLG-MSA zaobserwowano zmniejszenie intensywności barwienia tkanek w porównaniu do D11-AP. Redukcja ta wynika z obecności IsoLG, a nie MSA, ponieważ preinkubacja z MSA bez adduktu doprowadziła do barwienia podobnego do kontroli D11-AP. Aorty myszy z grupy Angiotensyny II (A) i Sham (B) wybarwione D11-AP (kolor zielony) oraz barwnikiem jądrowym (kolor magenta), aorty myszy z grupy Angiotensyny II (C) i Sham (D) wybarwione D11-AP po inkubacji z IsoLG-MSA, aorty myszy z grupy Angiotensyny II (E) i Sham (F) wybarwione D11-AP po inkubacji z MSA bez adduktu (pasek skali =100 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62603/62603fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna tkanki serca; A: zielone włókna, B: różowe jądra; skala 100 μm, 150 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62603/62603fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Aorty mysie barwione D11 oraz nieistotnym fragmentem scFv, D20. Tkanka mysia została zabarwiona D11-AP i porównana z nieistotnym przeciwciałem kontrolnym, D20, które jest specyficzne dla glikoproteiny A2. Barwienie tkanki D11-AP (zielony) i przeciwbarwienie jąder (magenta) (A) doprowadziło do intensywnej immunofluorescencji w porównaniu z D20 (zielony) i przeciwbarwieniem jąder (magenta) (B), co wskazuje na specyficzność D11-AP wobec IsoLGs (pasek skali = 100 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62603/62603fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię pomiaru izolewukleryn w tkankach metodą immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała ScFv D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Modele nadciśnienia zarówno u myszy, jak i u ludzi są wykorzystywane do wyjaśnienia krok po kroku procedur i podstawowych zasad związanych z pomiarem izolewuklesyny w próbkach tkanek.

Bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 scFv i immunofluorescencji

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to ...

Izolewuglandyny są zaangażowane w kilka chorób, zwłaszcza choroby układu krążenia. Protokół ten został opracowany w celu wykrywania izolewuglandyn w tkankach z białkiem fuzyjnym fosfatazy alkalicznej D11 i immunofluorescencją. Obecne metody wykrywania są drogie lub wymagają przeciwciała wtórnego dla E-tag.Znalezienie wiarygodnego przeciwciała drugorzędowego jest trudne, ale ten protokół usuwa etap przeciwciała drugorzędowego. Zanurz szkiełka tkanek zatopionych w mysiej i ludzkiej parafinie w ksylenie trzy razy na pięć minut, aby oddzielić tkanki. W celu nawodnienia tkanki umyj tkanki dwa razy 95% etanolem, a następnie dwukrotnie 70% etanolem, a następnie dwukrotnie 50% etanolem przygotowanym w wodzie.Umyj szkiełka w trzykrotnie buforowanym roztworze soli fizjologicznej z 0,1%Tween 20, napełniając uchwyt szkiełka TBST. Następnie wyrzuć TBST. Umieścić szkiełka w podgrzanym buforze cytrynianu sodu i inkubować w szybkowarze ustawionym na cztery minuty pod wysokim ciśnieniem, aby uzyskać całkowity czas pobierania antygenu wynoszący 20 minut.Pod koniec inkubacji wyjmij szkiełka z szybkowaru i pozwól im ostygnąć przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wykonaj trzy szybkie mycia szkiełek za pomocą TBST, jak pokazano. Zablokuj szkiełka, dodając 2% BSA rozpuszczonego w TBST.Przykryj szkiełka taśmą parafinową i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po inkubacji wyrzucić bufor blokujący. Dodać 200 mikrolitrów fosfatazy alkalicznej D11 przygotowanej w TBST do szkiełek i przykryć szkiełka taśmą parafinową.Po inkubacji szkiełek w wilgotnej komorze przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, umyć szkiełka trzykrotnie TBST. Opracuj slajdy z kalorymetrycznym wywoływaczem fosfatazy alkalicznej do immunohistochemii lub fluorescencyjnym wywoływaczem fosfatazy alkalicznej do immunofluorescencji. Umyj szkiełka raz za pomocą TBST, aby usunąć nadmiar wywoływacza i zapobiec dalszemu rozwojowi koloru.Wybarwić przeciw szkiełka jednym mikrogramem na mililitr barwnika jądrowego HEX przygotowanego w PBS do immunofluorescencji. Następnie umyj szkiełka raz za pomocą TBST, aby usunąć nadmiar plam przeciwstawnych. Za pomocą medium montażowego umieść szkiełko nakrywkowe na wywołanych szkiełkach.Obserwuj szkiełka pod mikroskopem światła odwróconego do immunohistochemii lub pod konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym do immunofluorescencji. Można przeprowadzić cztery eksperymenty kontroli ujemnej w celu potwierdzenia specyficzności barwienia D11 AP dla izolewuglandyny. W pierwszym eksperymencie kontroli ujemnej inkubować tkanki z D11 AP rozcieńczonym w TBST lub samym TBST.Następnie inkubować tkanki z rozcieńczonym D11 AP i bakteryjnym ekstraktem pariplazmatycznym rozcieńczonym w TBST bez łącznika D11 AP. Do testu kompetycyjnego należy przygotować izoLG i izoLG addukowane do albuminy surowicy myszy w stosunku molowym osiem do jednego. Rozcieńczyć D11 AP od jednego do 10 w TBST.Następnie inkubować rozcieńczony D11 AP z 50 mikrogramami na mililitr MSA z adduktami izolewulandyny lub nieaddukowanym MSA przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaj D11 AP z izolewuglandyną MSA lub D11 AP z nieaddukowanym MSA do tkanek w celu barwienia. Użyć odpowiedniego przeciwciała D20 o zmiennym pojedynczym fragmencie łańcucha do barwienia tkanek do końcowego zestawu kontroli ujemnej.Immunofluorescencję aorty u myszy z nadciśnieniem tętniczym i normotensyjnym badano przy użyciu tego protokołu. Barwienie D11 AP wykazało zwiększone stężenie izoLG w aorcie myszy z nadciśnieniem indukowanym angiotensyną II w porównaniu z myszami kontrolnymi. D11 AP został użyty do wykrywania izolewuglandyn obecnych w tkankach jelitowych pacjentów z nadciśnieniem tętniczym i ludzi z prawidłowym ciśnieniem.W tkankach pacjentów z nadciśnieniem tętniczym stwierdzono podwyższone stężenie izolewuglandyn. Tkanki barwiono ekstraktem paraplazmatycznym i bez D11 AP. Jaśniejsze zabarwienie zaobserwowano w tkance barwionej D11 AP w porównaniu z tkanką barwioną ekstraktem pariplazmatycznym, co potwierdza, że barwienie nie było spowodowane niesprzężoną bakteryjną fosfatazą alkaliczną obecną w ekstrakcie pariplazmatycznym. W teście konkurencyjnym tkanka wybarwiona D11 AP wstępnie inkubowana z konkurentem isoLG wykazywała zmniejszone barwienie, podobne do barwienia obserwowanego w tkankach z D11 AP, co wskazuje na swoistość D11 AP wobec izolewuglandyn.W kontroli ujemnej barwienie aorty myszy D11 AP powodowało silne barwienie w porównaniu z D20, co wskazuje na swoistość D11 AP wobec izolewuglandyn w aorcie nadciśnieniowej. Ważne jest, aby dezaktywować wszelkie endogenne fosfatazy alkaliczne obecne w tkance, aby ograniczyć barwienie tła.

direct-detection-isolevuglandins-tissues-using-d11-scfv-alkaline

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje test wydzielania embrionalnej fosfatazy alkalicznej przy użyciu komórek reporterowych interferonu HEK-Blue α/β do ilościowego określenia interferonów typu I (IFN) uwolnionych po stymulacji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych przez limfocyty T CD4+ zakażone HIV-1.

Oznaczanie ilościowe bioaktywnych interferonów typu I przy użyciu testu reporterowego wydzielanej embrionalnej fosfatazy alkalicznej

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

Tutaj prezentujemy protokół oparty na immunohistologicznej detekcji białka c-FOS, klasycznej technice używanej do identyfikacji populacji neuronów zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo.

Wykrywanie immunohistologiczne białka c-FOS: użyteczne narzędzie jako marker centralnych szlaków zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo

Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.

Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) może być użyta do badania in vivo biodystrybucji przeciwciał i koniugatów przeciwciał do celów onkologicznych w organizmach żywych przy użyciu kombinacji metod celowania w nowotwory in vivo i barwienia immunologicznego ex vivo.

Lokalizacja immunofluorescencji in vivo do oceny terapeutycznej i diagnostycznej biodystrybucji przeciwciał w badaniach nad rakiem

Protokół przedstawia kompletny, potwierdzony, indukowany przez TNBS mysi model choroby Leśniowskiego-Crohna oraz metody wizualizacji receptorów estrogenowych za pomocą immunohistochemii przy użyciu immunofluorescencji utrwalonych formaliną odcinków jelita grubego zanurzonych w parafinie.

Wizualizacja receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji

Opisujemy protokoły oceny stopnia transdukcji przez peptydy penetrujące komórki, wykorzystując systemy obrazowania ex vivo, a następnie zatapianie parafiny, cięcie i konfokalną mikroskopię fluorescencyjną na przykładzie peptydu celującego w serce. W naszym protokole pojedyncze zwierzę może być wykorzystane do uzyskania obu rodzajów oceny obrazowej tych samych narządów, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do badań o połowę.

Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce

Badanie acylacji tłuszczów ma ważne implikacje w interakcjach i chorobach białek komórkowych. Przedstawiono tutaj zmodyfikowany protokół mający na celu poprawę wykrywania chemicznego acylowanych białek tłuszczowych, który może być stosowany w różnych typach komórek i łączony z innymi testami, w tym pościgiem impulsowym i spektrometrią mas.

Zoptymalizowane wprowadzanie analogów alkinylowych kwasów tłuszczowych do wykrywania acylowanych białek tłuszczowych za pomocą chemii Click

Identyfikacja typu komórki odpowiedzialnej za wydzielanie cytokin jest niezbędna do zrozumienia patobiologii choroby nerek. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego barwienia tkanki nerkowej pod kątem cytokin wytwarzanych przez komórki nabłonka nerki lub śródmiąższu przy użyciu brefeldyny A, inhibitora wydzielania i markerów specyficznych dla typu komórkowego.

Identyfikacja źródła wydzielanych białek w nerkach za pomocą wstrzyknięcia Brefeldin A

Zaburzenia laminopatii często prowadzą do zmian w otoczce jądrowej, co może powodować pęcherzyki jądrowe i wycieki. W badaniu przedstawiono metodę immunofluorescencji do wizualizacji blaszki jądrowej wraz z dwuniciowym DNA (dsDNA), zapewniając środki do oceny struktury i integralności jądra w komórkach ssaków.

Wykrywanie pęcherzyków jądrowych i wycieku DNA w komórkach ssaków za pomocą immunofluorescencji

Poznaj metodę bezpośredniego wykrywania izolewuglandyn w tkankach myszy i ludzkich przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 i immunofluorescencji. Protokół eliminuje potrzebę stosowania przeciwciała wtórnego, zwiększając niezawodność badań nad chorobami układu krążenia.

Bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 scFv i immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal

Bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 scFv i immunofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów