Name: Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Poznaj metodę wymiany wodorowo-deuterowej opartą na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół. Technika ta umożliwia analizę różnic struktur wyższego rzędu w pojedynczym pomiarze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC 21974069). Autorzy otrzymali również wsparcie od Instytutu Analizy Komórkowej, Shenzhen Bay Laboratory, Chiny; Jiangsu Collaborative Innovation Center of Biomedical Functional Materials; oraz Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials na Nanjing Normal University w Chinach.

<ol><li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169(2020).</li>
<li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li>
<li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta%281-42%29+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li>
<li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta%281-40%29+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li>
<li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li>
<li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United.+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li>
<li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li>
<li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li>
<li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+review%3A+%CE%B2-lactoglobulin%3A+binding+properties%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li>
<li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+%CE%B2-lactoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li>
<li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides%2C+proteins%2C+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li>
<li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li>
<li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li>
<li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+Poiseuille%27s+law%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechanics%22%5BJournal%5D)">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li>
<li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li>
<li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li>
<li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProSight+Lite%3A+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MASH+Suite+Pro%3A+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li>
<li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+%CE%B2-lactoglobulin+A%2C+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li>
<li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li>
<li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds%3A+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li>
<li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173(2019).</li>
<li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li>
<li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li>
</ol>

D. D. Y. Chen jest jednym z założycieli Instytutu Wiedzy dla Zdrowia (Knowledge for Health Institute for Biomolecules), który zajmuje się komercjalizacją przepływowego interfejsu CE-MS z mikrofiolkami. Inni autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Cele pokrycia wewnętrznej ścianki kapilary CE obejmują minimalizację przepływu elektroosmotycznego i absorpcji białek podczas procesu CE13. Chociaż przepływ elektroosmotyczny jest korzystny dla konwencjonalnej analizy CE małych cząsteczek ze względu na jego zdolność do kierowania neutralnych lub przeciwnie naładowanych gatunków do detektora, pogarsza on skuteczność separacji form białek o podobnych rozmiarach i ładunkach netto w roztworze. Pokrycie kapilary HPC minimalizuje przepływ elektroosmotyc...

Rozróżnianie gatunków białek w różnych stanach konformacji, wiązania lub modyfikacji oraz charakteryzowanie ich różnic strukturalnych jest ważne dla monitorowania ścieżek przejść między tymi gatunkami zaangażowanymi w zdarzenia biologiczne, począwszy od rozpoznawania molekularnego po katalizę enzymatyczną, oraz zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw tych zdarzeń. Konwencjonalne techniki biofizyczne nie zapewniają kompletnego rozwiązania ze względu na ograniczenia, takie jak niewystarczająca rozdzielczość i utrata dynamicznych informacji w roztworze. Wymiana wodór/deuter sprzężona ze spektrometrią mas (HDX MS) to technika znakowania cech strukturalnych i konformacyjnych białek deuterem (2H) poprzez wymianę między labilnymi atomami wodoru białek i 2H z celowo wprowadzonego roztworu 2H2O. Protony biorące udział w wiązaniach wodorowych lub sekwestrowane z rozpuszczalnika we wnętrzu białka nie wymieniają się łatwo1. Tak więc, ponieważ kurs wymiany w miejscu wymiennym jest w dużym stopniu zależny od jego udziału w strukturach wyższego rzędu, struktury białkowe mogą zostać ujawnione w wysokiej rozdzielczości przestrzennej przez MS, który bada zakres i szybkość wychwytu 2H w oparciu o różne masy atomowe między 1H a 2H. W ciągu ostatnich dziesięcioleci HDX MS stał się niezwykle skuteczną techniką badania konformacji i dynamiki białek2.
W klasycznym podejściu oddolnym HDX MS, zespół gatunków białek w różnych stanach konformacji, wiązania lub modyfikacji jest proteolizowany bez separacji na nienaruszonym poziomie białka, co sprawia, że niemożliwe jest scharakteryzowanie poszczególnych gatunków poprzez analizę powstałych fragmentów proteolitycznych o zawiłej zawartości deuteru. W przeciwieństwie do tego, w podejściu odgórnym, różne stany białek lub proteoformy, które zawierają różną zawartość deuteru, powodują wielokrotne rozkłady nienaruszonych mas białkowych w skanowaniu stwardnienia rozsianego. Pozwala to na rozdzielenie poszczególnych gatunków poprzez selekcję masową jonów odpowiadających każdemu rozkładowi masy przy użyciu odpowiedniego filtra masowego (takiego jak kwadrupol) i scharakteryzowanie ich różnic konformacyjnych w późniejszej tandemowej analizie MS3,4,5,6. Jednak skuteczność rozdzielania stanów białkowych lub proteoform w tej strategii jest ograniczona przez zakres różnic w odpowiadających im rozkładach masy.
Elektroforeza kapilarna (CE) umożliwia rozdzielanie form białek na podstawie ich różnych ładunków i rozmiarów hydrodynamicznych w fazie roztworu z wysoką wydajnością7. Połączenie CE z HDX zapewnia dodatkową separację stanów białkowych lub proteoform w fazie roztworu. Ponadto niewielka objętość kapilary CE pozwala na wykorzystanie w pełni zdeuterowanego roztworu jako roztworu elektrolitu tła (BGE), tj. bufora bieżącego, dzięki czemu kapilara staje się reaktorem HDX dla próbek białkowych. Ze względu na różnicę w ruchliwości elektroforetycznej między białkami a odczynnikami protonowymi w procesie elektroforezy, prowadzenie HDX podczas CE skutkuje prawie całkowitym środowiskiem deuteracyjnym dla analitów białkowych z minimalną resztkową zawartością niedeuterowaną, zwiększając w ten sposób czułość analizy strukturalnej przy użyciu danych HDX. W związku z tym opracowaliśmy oparte na CE różnicowe podejście HDX w połączeniu z odgórnym MS, aby scharakteryzować struktury białek wyższego rzędu w sposób specyficzny dla stanu lub proteozy8.
Ten artykuł opisuje protokoły dla tego podejścia, szczegółowo opisując etapy przygotowania materiału, procedury eksperymentalnej i analizy danych. Czynniki, które mogą mieć wpływ na wydajność metody lub jakość danych, są wymienione w krótkich notatkach. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki obejmują zróżnicowane dane HDX mieszanin różnych białek i naturalnych wariantów bydlęcej β-laktoglobuliny (β-lg), głównego białka serwatkowego obecnego w klasie milk<sup="xref">9. Wykazujemy skuteczność separacji, odtwarzalność i wydajność znakowania 2H dwóch licznych wariantów β-lg, tj. A i B10,11 podczas HDX opartej na CE i specyficznej dla wariantu charakterystyki ich konformacji.

<table><tbody><tr><td>octan amonu</td><td>Fisher Chemical</td><td>A/3446/50</td><td>&ge; 99%</td></tr><tr><td>CESI 8000 plus system elektroforezy kapilarnej</td><td>Sciex, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5406000097</td><td></td></tr><tr><td>filtr odśrodkowy</td><td>Merck</td><td>UFC201024</td><td>10 kDa odcięcie</td></tr><tr><td>tlenku deuteru</td><td>Energia chemiczna</td><td>E090001</td><td>99,9 % D</td></tr><tr><td>kwas mrówkowy</td><td>Acros Organics</td><td>&nbsp; </td><td></td>270480250</tr><tr><td>kapilara ze szkła krzemionkowego</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td>ID 50&mu; m, OD 360&mu; m</td></tr><tr><td>chromatografia gazowa</td><td>Agilent</td><td>GC6890N</td><td></td></tr><tr><td>kwas solny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>hydroksypropyloceluloza</td><td>Aladdin</td><td>H113415</td><td>MW 100000</td></tr><tr><td>mieszadła magnetyczne</td><td>DLAB</td><td>8030101212</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A456-4</td><td>MS klasa</td></tr><tr><td>mikroobjętość UV-Vis spektrofotometr</td><td>DeNovix</td><td>84677JK7731</td><td></td></tr><tr><td>mioglobina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Orbitrap Fusion Lumos</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus Analiza farmaceutyczna System CE</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td></td><td></td></tr> Q <tr><td>Exactive Spektrometr masowy UHMR</td><td>Thermo Fisher Scientific, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sód&nbsp; wodorotlenek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>ubikwityna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6253</td><td></td></tr><tr><td>ultrasonograf</td><td>SCIENTZ</td><td>SB-5200</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-laktoglobulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0130</td><td></td></tr></tbody></table>

wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Rozwiązanie niejednorodności konformacyjnej wielu stanów białkowych, które współistnieją w roztworze, pozostaje jedną z głównych przeszkód w charakterystyce terapii białkowej i określaniu konformacyjnych szlaków przejściowych krytycznych dla funkcji biologicznych, począwszy od rozpoznawania molekularnego po katalizę enzymatyczną. Reakcja wymiany wodor/deuter (HDX) w połączeniu z analizą spektrometrii mas (MS) od góry do dołu umożliwia scharakteryzowanie struktur i dynamiki białek wyższego rzędu w sposób specyficzny dla konformisty. Konformacyjna zdolność rozdzielcza tej techniki jest w dużym stopniu zależna od skuteczności rozdzielania stanów białkowych na poziomie nienaruszonego białka i minimalizacji resztkowej zawartości niedeuterowanego protonu podczas reakcji HDX. 
Tutaj opisujemy wariant metody HDX MS oparty na elektroforezie kapilarnej (CE), który ma na celu poprawę rozdzielczości konformacyjnej. W tym podejściu białka ulegają reakcjom HDX podczas migracji przez deuterowany roztwór elektrolitu tła (BGE) podczas kapilarnej separacji elektroforetycznej. Różne stany białek lub proteoformy, które współistnieją w roztworze, można skutecznie rozdzielić na podstawie ich różnych stosunków ładunku do wielkości. Różnica w ruchliwości elektroforetycznej między białkami a cząsteczkami rozpuszczalnika protycznego minimalizuje pozostałości rozpuszczalnika niedeuterowanego, co skutkuje prawie całkowitym środowiskiem deuteracji podczas procesu HDX. Przepływowy interfejs mikrofiolki CE-MS umożliwia wydajną jonizację elektronatryskową eluowanych form białek po szybkim zmieszaniu z roztworem modyfikatora hartującego i denaturującego na wylocie opryskiwacza. Odgórna analiza stwardnienia rozsianego online mierzy globalny poziom deuteracji elutulowanych nienaruszonych form białek, a następnie deuterację ich fragmentów w fazie gazowej. W niniejszej pracy przedstawiono to podejście w różnicowym HDX dla układów, w tym naturalnych wariantów białek współistniejących w mleku.

Zmiana ciśnienia infuzji BGE pozwala na regulację zarówno wydajności rozdzielania, jak i czasu migracji, który jest równoważny czasowi reakcji HDX białek poddawanych rozdzielaniu (Rysunek 3). Niższe ciśnienie infuzji skutkuje lepszym rozdzieleniem piku CE kosztem czasu trwania eksperymentu (Rysunek 3A). Dłuższy czas migracji/reakcji HDX prowadzi do wyższego poziomu deuteracji analitów białkowych (Rysunek 3B-...

Prezentowany tutaj jest protokół metody wymiany wodoru i deuteru (HDX) opartej na elektroforezie kapilarnej w połączeniu ze spektrometrią mas z góry na dół. Podejście to charakteryzuje różnicę w strukturach wyższego rzędu między różnymi gatunkami białek, w tym białkami w różnych stanach i różnymi proteoformami, poprzez prowadzenie jednoczesnej różnicowej separacji HDX i elektroforetycznej.

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Metoda ta pozwala na oddzielenie współistniejących gatunków białek, w tym różnych konformerów lub wariantów, oraz na scharakteryzowanie online różnic w ich strukturze wyższego rzędu w jednym pomiarze CEMS. Wykorzystuje efekt elektroforetyczny, aby zapewnić prawie 100% czas trwania środowiska dla reakcji HDX i ortogonalnej separacji współistniejących gatunków białek podczas HDX w celu analizy MS od góry do dołu. Rozpocznij od wstępnego kondycjonowania elektroforezy kapilarnej, wymiany wodorowo-deuterowej lub konfiguracji CE HDX.Stosując ultradźwięki w mieszaninie 50% metanolu, 49% wody i 1% kwasu mrówkowego, należy oczyścić przepływ przez granicę faz CE-MS mikrofiolki przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Zamontuj zmodyfikowaną kapilarnę HPC na elektroferezie kapilarnej lub przyrządzie CE. Przepłucz kapilarnę roztworem elektrolitu tła lub BGE przez 10 minut za pomocą automatycznego próbnika i pozostaw ją wypełnioną BGE.Użyć odpowiedniej długości rurki kapilarnej z niezmodyfikowanej stopionej krzemionki jako rurki infuzyjnej dla roztworu modyfikującego. Za pomocą złączki i odpowiedniej tulei podłączyć rurkę modyfikatora do gazoszczelnej szklanej strzykawki o temperaturze i płukać rurkę roztworem modyfikatora przez co najmniej 10 minut za pomocą pompy infuzyjnej. Włóż wyloty rurki kapilary i modyfikatora CE z kodowaniem HPC załadowane odpowiednimi roztworami do oczyszczonego interfejsu CE-MS.Przesunąć strzykawkę z pompami infuzyjnymi w taki sposób, aby roztwór modyfikujący dotarł do końcówki interfejsu. Zamontuj zmontowany interfejs CE-MS na obudowie źródła jonizacji w natrysku nanoelektronów spektrometru masowego. Zastosuj napięcie natrysku 3-5 kilowoltów do interfejsu CE-MS.Zaparzaj roztwór modyfikatora za pomocą pompy zaparzającej z natężeniem przepływu w zakresie od 0,1 do 10 mikrolitrów na minutę i zapewnij stabilne rozpylanie elektryczne na końcówce interfejsu CE-MS. Umieścić fiolkę z próbką zawierającą BGE i próbnik automatyczny, który zostanie później użyty do uzyskania ślepych elektroferogramów i ślepych widm masowych. Oszacować objętość wtrysku, korzystając z zależności między objętością wtrysku a parametrami wtrysku.I wstrzyknąć roztwór próbki za pomocą automatycznego próbnika przy dwóch PSI przez odpowiedni czas. Rozpocznij separację CE, przykładając napięcie elektroforetyczne 20 kilowoltów przy ciśnieniu infuzji w zakresie 0-2 PSI i uzyskaj elektroferogram. W międzyczasie należy pozyskać dane MS w trybie chromatograficznym, w którym wykres prądu jonowego jest pozyskiwany w funkcji czasu, a odpowiadające mu skany MS nie są automatycznie łączone w jedno widmo.Zapisz ślepy elektroferogram i widma masowe jako odniesienia. Umieścić fiolki z próbkami zawierające żądane stężenia roztworów próbek białkowych w próbniku automatycznym i pobrać elektroferogramy oraz widma MS1 oddzielonych elektroforetycznie i znakowanych deuterem form białek. Wykonać tandemowe pomiary Ms. dla interesujących gatunków, albo po uzyskaniu widm MS1 w tym samym przebiegu, albo w kolejnym oddzielnym przebiegu.Po każdym pomiarze przepłukiwać kapilarę BGE pod ciśnieniem 20 PSI przez co najmniej 10 minut. Wyczyść interfejs CEMS i wszystkie rurki do przechowywania po zakończeniu eksperymentów. Uzyskaj zestaw danych próbki punktu końcowego HDX ze stwardnieniem rozsianym w trybie infuzji bezpośredniej.Niskie ciśnienie infuzji skutkowało lepszą separacją pików CE, ale doprowadziło do wydłużenia zarówno czasu migracji, jak i czasu trwania eksperymentu. Dłuższy czas reakcji HDX skutkował wyższym poziomem wydłużenia czasu stwardnienia analitów białkowych. Wariancja A i B immunoglobuliny beta lub beta IG, które różnią się tylko dwiema resztami aminokwasowymi w swojej sekwencji, spowodowała powstanie dwóch odpowiednio oddzielonych pików w elektroferogramie pochodzącym z EIC.Różnicowa wariancja oznaczona deuterem spowodowała wyraźny rozkład masy jonów. Zaobserwowano mniejszą liczbę we względnej obfitości jonów Z niż jonów C ze względu na unikalne dysofiedowane wiązanie w potwierdzeniu beta IG, które ogranicza efektywność fragmentacji między CS 82 i CS 176. Większość jonów fragmentacyjnych wytwarzanych z beta IGA i beta IGB wykazuje podobny stopień wychwytu deuteru.Jednak większe segmenty obejmujące miejsca zmienności sekwencji z beta IGA były zdeduplikowane w znacznie większym stopniu niż beta IGB. pH BGE jest dostosowywane zgodnie z punktem izoelektrycznym próbki, aby zapobiec agregacji białek i ułatwić separację przy jednoczesnym zachowaniu kompleksu.

capillary-electrophoresis-based-hydrogendeuterium-exchange-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Spektrometria mas MALDI-TOF została z powodzeniem wykorzystana do monitorowania wymiany wodoru/deuteru w wiązaniach amidowych podczas aktywacji kinazy białkowej Pak2.

Analiza aktywacji Pak2 za pomocą wymiany wodoru na deuter w wiązaniach amidowych oraz spektrometrii mas MALDI-TOF

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły dla spektrometrii mas z wymianą amidu i deuteru w stanie stałym (ssHDX-MS) oraz spektrometrii mas znakowania fotolitycznego w stanie stałym (ssPL-MS) dla białek w stałych proszkach. Metody te dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości na temat konformacji i oddziaływań białek w amorficznym stanie stałym, które mogą być przydatne w projektowaniu preparatów.

Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Szczegółowy protokół jest opisany do separacji, identyfikacji i charakterystyki proteoform w próbkach białek za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej-elektrorozpylania jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (CZE-ESI-MS/MS). Protokół może być wykorzystany do charakterystyki proteoform w prostych próbkach białkowych w wysokiej rozdzielczości oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomów.

Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Syntetazy lantipeptydu katalizują wieloetapowe reakcje podczas biosyntezy naturalnych produktów peptydowych. W tym miejscu opisujemy ciągły, oddolny przepływ pracy spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS), który można wykorzystać do badania dynamiki konformacyjnej syntetaz lantipeptydów, a także innych podobnych enzymów zaangażowanych w biosyntezę naturalnych produktów peptydowych.

Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych

Strukturalny zespół monomerycznej alfa-synukleiny wpływa na jej fizjologiczne funkcje i właściwości fizykochemiczne. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzić spektrometrię mas z wymianą milisekundową wodór/deuter i późniejsze analizy danych w celu określenia informacji konformacyjnych na monomerze tego wewnętrznie nieuporządkowanego białka w warunkach fizjologicznych.

Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych

Tutaj opisujemy zastosowanie techniki odchylania wiązki fototermicznej w połączeniu z umieszczonym w klatce związkiem wapnia, DM-nitrofenem, do monitorowania dynamiki mikrosekund i milisekund oraz energetyki zmian strukturalnych związanych ze związkiem wapnia z neuronalnym czujnikiem wapnia, Modulatorem Antagonisty Elementu Regulatorowego.

Submilisekundowe zmiany konformacyjne w białkach rozwiązane przez odchylenie wiązki fototermicznej

Ten artykuł przedstawia protokół wizualizacji strumieni gazowych źródła jonizacji otoczenia za pomocą fotografii Schlierena i spektrometrii mas.

Wizualizacja spektrometrii mas otoczenia z wykorzystaniem fotografii Schlierena

Poznaj metodę wymiany wodorowo-deuterowej opartą na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół. Technika ta umożliwia analizę różnic struktur wyższego rzędu w pojedynczym pomiarze.

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół (Wideo) | JoVE Journal

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Przeglądaj więcej filmów