Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół
8 czerwca 2021
Prezentowany tutaj jest protokół metody wymiany wodoru i deuteru (HDX) opartej na elektroforezie kapilarnej w połączeniu ze spektrometrią mas z góry na dół. Podejście to charakteryzuje różnicę w strukturach wyższego rzędu między różnymi gatunkami białek, w tym białkami w różnych stanach i różnymi proteoformami, poprzez prowadzenie jednoczesnej różnicowej separacji HDX i elektroforetycznej.
Metoda ta pozwala na oddzielenie współistniejących gatunków białek, w tym różnych konformerów lub wariantów, oraz na scharakteryzowanie online różnic w ich strukturze wyższego rzędu w jednym pomiarze CEMS. Wykorzystuje efekt elektroforetyczny, aby zapewnić prawie 100% czas trwania środowiska dla reakcji HDX i ortogonalnej separacji współistniejących gatunków białek podczas HDX w celu analizy MS od góry do dołu. Rozpocznij od wstępnego kondycjonowania elektroforezy kapilarnej, wymiany wodorowo-deuterowej lub konfiguracji CE HDX.
Stosując ultradźwięki w mieszaninie 50% metanolu, 49% wody i 1% kwasu mrówkowego, należy oczyścić przepływ przez granicę faz CE-MS mikrofiolki przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Zamontuj zmodyfikowaną kapilarnę HPC na elektroferezie kapilarnej lub przyrządzie CE. Przepłucz kapilarnę roztworem elektrolitu tła lub BGE przez 10 minut za pomocą automatycznego próbnika i pozostaw ją wypełnioną BGE.
Użyć odpowiedniej długości rurki kapilarnej z niezmodyfikowanej stopionej krzemionki jako rurki infuzyjnej dla roztworu modyfikującego. Za pomocą złączki i odpowiedniej tulei podłączyć rurkę modyfikatora do gazoszczelnej szklanej strzykawki o temperaturze i płukać rurkę roztworem modyfikatora przez co najmniej 10 minut za pomocą pompy infuzyjnej. Włóż wyloty rurki kapilary i modyfikatora CE z kodowaniem HPC załadowane odpowiednimi roztworami do oczyszczonego interfejsu CE-MS.
Przesunąć strzykawkę z pompami infuzyjnymi w taki sposób, aby roztwór modyfikujący dotarł do końcówki interfejsu. Zamontuj zmontowany interfejs CE-MS na obudowie źródła jonizacji w natrysku nanoelektronów spektrometru masowego. Zastosuj napięcie natrysku 3-5 kilowoltów do interfejsu CE-MS.
Zaparzaj roztwór modyfikatora za pomocą pompy zaparzającej z natężeniem przepływu w zakresie od 0,1 do 10 mikrolitrów na minutę i zapewnij stabilne rozpylanie elektryczne na końcówce interfejsu CE-MS. Umieścić fiolkę z próbką zawierającą BGE i próbnik automatyczny, który zostanie później użyty do uzyskania ślepych elektroferogramów i ślepych widm masowych. Oszacować objętość wtrysku, korzystając z zależności między objętością wtrysku a parametrami wtrysku.
I wstrzyknąć roztwór próbki za pomocą automatycznego próbnika przy dwóch PSI przez odpowiedni czas. Rozpocznij separację CE, przykładając napięcie elektroforetyczne 20 kilowoltów przy ciśnieniu infuzji w zakresie 0-2 PSI i uzyskaj elektroferogram. W międzyczasie należy pozyskać dane MS w trybie chromatograficznym, w którym wykres prądu jonowego jest pozyskiwany w funkcji czasu, a odpowiadające mu skany MS nie są automatycznie łączone w jedno widmo.
Zapisz ślepy elektroferogram i widma masowe jako odniesienia. Umieścić fiolki z próbkami zawierające żądane stężenia roztworów próbek białkowych w próbniku automatycznym i pobrać elektroferogramy oraz widma MS1 oddzielonych elektroforetycznie i znakowanych deuterem form białek. Wykonać tandemowe pomiary Ms. dla interesujących gatunków, albo po uzyskaniu widm MS1 w tym samym przebiegu, albo w kolejnym oddzielnym przebiegu.
Po każdym pomiarze przepłukiwać kapilarę BGE pod ciśnieniem 20 PSI przez co najmniej 10 minut. Wyczyść interfejs CEMS i wszystkie rurki do przechowywania po zakończeniu eksperymentów. Uzyskaj zestaw danych próbki punktu końcowego HDX ze stwardnieniem rozsianym w trybie infuzji bezpośredniej.
Niskie ciśnienie infuzji skutkowało lepszą separacją pików CE, ale doprowadziło do wydłużenia zarówno czasu migracji, jak i czasu trwania eksperymentu. Dłuższy czas reakcji HDX skutkował wyższym poziomem wydłużenia czasu stwardnienia analitów białkowych. Wariancja A i B immunoglobuliny beta lub beta IG, które różnią się tylko dwiema resztami aminokwasowymi w swojej sekwencji, spowodowała powstanie dwóch odpowiednio oddzielonych pików w elektroferogramie pochodzącym z EIC.
Różnicowa wariancja oznaczona deuterem spowodowała wyraźny rozkład masy jonów. Zaobserwowano mniejszą liczbę we względnej obfitości jonów Z niż jonów C ze względu na unikalne dysofiedowane wiązanie w potwierdzeniu beta IG, które ogranicza efektywność fragmentacji między CS 82 i CS 176. Większość jonów fragmentacyjnych wytwarzanych z beta IGA i beta IGB wykazuje podobny stopień wychwytu deuteru.
Jednak większe segmenty obejmujące miejsca zmienności sekwencji z beta IGA były zdeduplikowane w znacznie większym stopniu niż beta IGB. pH BGE jest dostosowywane zgodnie z punktem izoelektrycznym próbki, aby zapobiec agregacji białek i ułatwić separację przy jednoczesnym zachowaniu kompleksu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę wymiany wodoru na deuter (HDX) opartą na elektroforezie kapilarnej, połączoną z top-down mass spectrometry. Umożliwia ona charakterystykę różnic w strukturach wyższego rzędu pomiędzy różnymi gatunkami białek, w tym różnymi stanami i proteoformami, poprzez jednoczesne różnicowe HDX i rozdział elektroforetyczny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Spektrometria mas
- Chemia białek
Wprowadzenie
- Elektroforeza kapilarna (CE) jest potężną techniką rozdziału biomolekuł.
- Wymiana wodoru/deuteru (HDX) dostarcza informacji na temat dynamiki i struktury białek.
- Spektrometria mas typu top-down umożliwia analizę nienaruszonych białek oraz ich wariantów.
- Metoda ta pozwala na analizę wielu konformerów białka w jednym pomiarze.
Cel badania
- Opracowanie metody analizy struktur wyższego rzędu białek.
- Ułatwienie rozdzielania współistniejących form białek.
- Zwiększenie wydajności pomiarów HDX poprzez rozdzielenie elektroforetyczne.
Zastosowane metody
- Kondycjonowanie układu do elektroforezy kapilarnej.
- Ultrasonikacja interfejsu CE-MS w mieszaninie metanolu, wody i kwasu mrówkowego.
- Płukanie kapilary roztworem elektrolitu tła.
- Przeprowadzanie reakcji HDX w kontrolowanym środowisku podczas elektroforezy.
Główne wyniki
- Skuteczna separacja różnych konformerów białek.
- Charakterystyka różnic strukturalnych w ramach jednego pomiaru CEMS.
- Wykazana efektywność metody w analizie online.
- Pozyskanie wiedzy na temat dynamiki form białkowych.
Wnioski
- Metoda CE HDX jest skuteczna w badaniu struktury białek.
- Podejście to można zastosować do różnych gatunków i stanów białek.
- Oferuje ona usprawniony proces analizy dynamiki białek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Rozwiązanie problemu heterogeniczności konformacyjnej leków białkowych pozostaje krytycznym wyzwaniem w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym, szczególnie w zakresie charakteryzacji struktur wyższego rzędu oraz dynamiki współistniejących stanów białkowych. Ta metoda wymiany wodoru/deuteru oparta na elektroforezie kapilarnej (CE-HDX) umożliwia specyficzną dla konformeru analizę różnic strukturalnych białek w jednym pomiarze, co wspiera walidację celu oraz redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Dzięki integracji rozdziału elektroforetycznego z analizą MS top-down, podejście to zwiększa pewność predykcyjną w odniesieniu do zachowania białek i dostarcza informacji niezbędnych do podjęcia decyzji go/no-go podczas identyfikacji wiodących cząsteczek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez rozstrzyganie różnic konformacyjnych między wariantami białek a proteoformami.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez charakterystykę struktur wyższego rzędu specyficznych dla konkretnych konformerów.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w wyborze celu poprzez ujawnienie dynamiki strukturalnej istotnej dla funkcji biologicznej.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje biologicznie istotne systemy białkowe do dalszego screeningu poprzez rozdzielanie i charakteryzację współistniejących stanów.
- Wynik ilościowy: Zapewnia pomiary deuterowania na poziomie globalnym i fragmentowym, co umożliwia ilościowe porównanie konformerów białek.
- Powtarzalność: Minimalizuje pozostałość rozpuszczalnika protycznego podczas HDX, tworząc środowisko niemal całkowitego deuterowania w celu uzyskania spójnych wyników.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy spostrzeżenia dotyczące konformacji z etapu odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez charakteryzację dynamiki białek w roztworze.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia relacje struktura-funkcja w wariantach białek, zmniejszając niejednoznaczność w optymalizacji związku wiodącego.
- Zgodność z biomarkerami: Wspiera identyfikację biomarkerów konformacyjnych powiązanych z efektami funkcjonalnymi w układach istotnych dla danej choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, w którym rozdzielczość konformacyjna dostarcza informacji niezbędnych do inżynierii białek i kampanii przesiewowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez oddzielanie i analizowanie współistniejących konformerów białek w warunkach bliskich natywnym.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów poprzez dostarczanie powtarzalnych, ilościowych odczytów strukturalnych dla poszczególnych gatunków białek.
- Analityka: Dostarcza globalnych poziomów deuterowania oraz specyficznych dla fragmentów wzorców poboru, co ułatwia analizę porównawczą stanów białek.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę strukturalną z efektami funkcjonalnymi, wspierając decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka.
- Wykorzystanie korporacyjne: Funkcjonuje jako platforma wielokrotnego użytku do charakteryzacji heterogeniczności białek w wielu celach terapeutycznych i projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność przewidywań dotyczących zachowania białek poprzez rozstrzygnięcie heterogeniczności konformacyjnej.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki zautomatyzowanej integracji CE-MS oraz zminimalizowaniu artefaktów rozpuszczalnikowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji typu go/no-go poprzez zmniejszenie niepewności mechanistycznej w odniesieniu do celów białkowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów białkowych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o stabilność strukturalną i dynamikę.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu elektroforezy kapilarnej, spektrometrii mas oraz zasad HDX białek.
- Zależy od kompatybilności interfejsu CE-MS, optymalizacji elektrolitu tła oraz dostarczania roztworu modyfikatora.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji parametrów gaszenia HDX, denaturacji oraz akwizycji MS.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne dotyczące zmiennej wielkości, ładunku i rozpuszczalności białek w warunkach elektroforetycznych.
- Ograniczone przez czas analizy przy niskich ciśnieniach infuzji, które poprawiają rozdzielczość, ale wydłużają czas trwania eksperymentu.
