Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Metoda ta pozwala na oddzielenie współistniejących gatunków białek, w tym różnych konformerów lub wariantów, oraz na scharakteryzowanie online różnic w ich strukturze wyższego rzędu w jednym pomiarze CEMS. Wykorzystuje efekt elektroforetyczny, aby zapewnić prawie 100% czas trwania środowiska dla reakcji HDX i ortogonalnej separacji współistniejących gatunków białek podczas HDX w celu analizy MS od góry do dołu. Rozpocznij od wstępnego kondycjonowania elektroforezy kapilarnej, wymiany wodorowo-deuterowej lub konfiguracji CE HDX.

Stosując ultradźwięki w mieszaninie 50% metanolu, 49% wody i 1% kwasu mrówkowego, należy oczyścić przepływ przez granicę faz CE-MS mikrofiolki przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Zamontuj zmodyfikowaną kapilarnę HPC na elektroferezie kapilarnej lub przyrządzie CE. Przepłucz kapilarnę roztworem elektrolitu tła lub BGE przez 10 minut za pomocą automatycznego próbnika i pozostaw ją wypełnioną BGE.

Użyć odpowiedniej długości rurki kapilarnej z niezmodyfikowanej stopionej krzemionki jako rurki infuzyjnej dla roztworu modyfikującego. Za pomocą złączki i odpowiedniej tulei podłączyć rurkę modyfikatora do gazoszczelnej szklanej strzykawki o temperaturze i płukać rurkę roztworem modyfikatora przez co najmniej 10 minut za pomocą pompy infuzyjnej. Włóż wyloty rurki kapilary i modyfikatora CE z kodowaniem HPC załadowane odpowiednimi roztworami do oczyszczonego interfejsu CE-MS.

Przesunąć strzykawkę z pompami infuzyjnymi w taki sposób, aby roztwór modyfikujący dotarł do końcówki interfejsu. Zamontuj zmontowany interfejs CE-MS na obudowie źródła jonizacji w natrysku nanoelektronów spektrometru masowego. Zastosuj napięcie natrysku 3-5 kilowoltów do interfejsu CE-MS.

Zaparzaj roztwór modyfikatora za pomocą pompy zaparzającej z natężeniem przepływu w zakresie od 0,1 do 10 mikrolitrów na minutę i zapewnij stabilne rozpylanie elektryczne na końcówce interfejsu CE-MS. Umieścić fiolkę z próbką zawierającą BGE i próbnik automatyczny, który zostanie później użyty do uzyskania ślepych elektroferogramów i ślepych widm masowych. Oszacować objętość wtrysku, korzystając z zależności między objętością wtrysku a parametrami wtrysku.

I wstrzyknąć roztwór próbki za pomocą automatycznego próbnika przy dwóch PSI przez odpowiedni czas. Rozpocznij separację CE, przykładając napięcie elektroforetyczne 20 kilowoltów przy ciśnieniu infuzji w zakresie 0-2 PSI i uzyskaj elektroferogram. W międzyczasie należy pozyskać dane MS w trybie chromatograficznym, w którym wykres prądu jonowego jest pozyskiwany w funkcji czasu, a odpowiadające mu skany MS nie są automatycznie łączone w jedno widmo.

Zapisz ślepy elektroferogram i widma masowe jako odniesienia. Umieścić fiolki z próbkami zawierające żądane stężenia roztworów próbek białkowych w próbniku automatycznym i pobrać elektroferogramy oraz widma MS1 oddzielonych elektroforetycznie i znakowanych deuterem form białek. Wykonać tandemowe pomiary Ms. dla interesujących gatunków, albo po uzyskaniu widm MS1 w tym samym przebiegu, albo w kolejnym oddzielnym przebiegu.

Po każdym pomiarze przepłukiwać kapilarę BGE pod ciśnieniem 20 PSI przez co najmniej 10 minut. Wyczyść interfejs CEMS i wszystkie rurki do przechowywania po zakończeniu eksperymentów. Uzyskaj zestaw danych próbki punktu końcowego HDX ze stwardnieniem rozsianym w trybie infuzji bezpośredniej.

Niskie ciśnienie infuzji skutkowało lepszą separacją pików CE, ale doprowadziło do wydłużenia zarówno czasu migracji, jak i czasu trwania eksperymentu. Dłuższy czas reakcji HDX skutkował wyższym poziomem wydłużenia czasu stwardnienia analitów białkowych. Wariancja A i B immunoglobuliny beta lub beta IG, które różnią się tylko dwiema resztami aminokwasowymi w swojej sekwencji, spowodowała powstanie dwóch odpowiednio oddzielonych pików w elektroferogramie pochodzącym z EIC.

Różnicowa wariancja oznaczona deuterem spowodowała wyraźny rozkład masy jonów. Zaobserwowano mniejszą liczbę we względnej obfitości jonów Z niż jonów C ze względu na unikalne dysofiedowane wiązanie w potwierdzeniu beta IG, które ogranicza efektywność fragmentacji między CS 82 i CS 176. Większość jonów fragmentacyjnych wytwarzanych z beta IGA i beta IGB wykazuje podobny stopień wychwytu deuteru.

Jednak większe segmenty obejmujące miejsca zmienności sekwencji z beta IGA były zdeduplikowane w znacznie większym stopniu niż beta IGB. pH BGE jest dostosowywane zgodnie z punktem izoelektrycznym próbki, aby zapobiec agregacji białek i ułatwić separację przy jednoczesnym zachowaniu kompleksu.