Ocena aktywności przeciwnowotworowej in vivo nanocząstek bezwodnika IL-1α

Protokoły te zapewniają skuteczny sposób badania aktywności przeciwnowotworowej ataków modulatorów immunologicznych. Co więcej, przy użyciu proponowanych metod można przeprowadzić analizę powiązanych szans w krążących cytokinach i populacjach komórek odpornościowych. Główną zaletą tego protokołu jest to, że jest to łatwy i prosty sposób na wszczepienie guza i monitorowanie jego wzrostu. Bezpośrednią implikacją tej techniki jest ocena skuteczności niektórych terapii lub wyzwań w badaniach przeciwnowotworowych. Dodatkowo, niektóre aspekty tych technik są odpowiednie do badań toksyczności. Na początek rozmrozić zamrożoną fiolkę z mysimi komórkami EERL w podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przenieść je do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej ciepłą pożywkę hodowlaną. Odwirować stożkową probówkę o temperaturze 277 razy G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby usunąć pożywkę. Następnie ponownie zawiesić podniebienie komórkowe w ciągu trzech do pięciu mililitrów świeżej pożywki i przenieść ją do kolby do hodowli komórkowych T25. Pozwól komórkom rosnąć w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, rozpręż do większych kolb i przechodź co trzy dni. Gdy jest wystarczająco dużo komórek do pożądanej implantacji u wszystkich myszy, wyjmij kolby, wyrzuć pożywkę i delikatnie spłucz komórki PBS. Następnie dodaj cztery mililitry 0,25% trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Dodaj świeżą pożywkę, aby zatrzymać reakcję trypsyny i zbierz zawiesinę komórek w 50-mililitrowych stożkowych probówkach. Ponownie zawieś komórki na świeżym podłożu i policz komórki. Odwiruj jeszcze raz, a następnie dodaj zimny PBS do komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 10 milionów komórek na mililitr. Przed wstrzyknięciem zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie. Zdezynfekuj obszar boczny za pomocą pada z etanolu. Aby wstrzyknąć zawiesinę komórkową myszom, należy zassać 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do strzykawki i usunąć wszystkie pęcherzyki i martwą przestrzeń z góry. Następnie wstrzyknąć zawiesinę komórkową podskórnie w powolny i stały sposób znieczulonym myszom. Umieść zwierzęta w odpowiednich klatkach i monitoruj je, aż wyzdrowieją ze znieczulenia. Aby pobrać krew, chwyć luźną skórę nad ramieniem za pomocą ręki niedominującej i nakłuj żyłę podżuchwową igłą lub lancetem o rozmiarze 18. Zbierz od 200 do 300 mikrolitrów krwi do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej z polipropylenu lub probówki do separatora surowicy. Po pobraniu krwi należy delikatnie uciskać miejsce wkłucia, aż do ustania krwawienia. Wróć myszy do odpowiednich klatek i obserwuj, aż dojdą do siebie po znieczuleniu. Pozwól zebranej krwi skrzepnąć w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut. Następnie umieść probówki na lodzie, aż będą gotowe do odwirowania. Odwirować zakrzepłą krew w temperaturze 1540 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie zebrać warstwę surowicy od góry. Rozmrozić próbki surowicy lub osocza, trzymając je na lodzie. Następnie odwirować próbki w temperaturze 1 540 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać wszelkie resztki komórek i ostrożnie zebrać warstwę surowicy od góry. Umieść zestaw multipleksowy w temperaturze pokojowej i wykonaj test zgodnie z protokołem producenta. Połóż każdą mysz na plecach i spryskaj skórę brzucha 70% etanolem. Użyj kleszczy i nożyczek, aby przeciąć węzeł chłonny po prawej stronie myszy i guz po lewej stronie. Jeśli guz jest duży, pokrój go na małe kawałki i usuń około 500 do 600 miligramów z tkanki. Umieść tkanki na odpowiednich probówkach dysocjacyjnych zawierających od trzech do pięciu mililitrów pożywki RPMI. Homogenizuj tkankę za pomocą automatycznego dysocjatora. Po homogenizacji przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Wirować w temperaturze 277 razy G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby usunąć pożywkę. Umyj i ponownie zawieś komórki w jednym do dwóch mililitrów zimnego PBS. Użyj barwienia na niebiesko 0,4% trypsyny, aby policzyć żywotne komórki w hemocytometrze. Oblicz objętość potrzebną do uzyskania od dwóch do trzech milionów komórek i przenieś je do odpowiedniej lampy faksowej. Wirówka zliczała komórki w temperaturze 277 razy G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 300 mikrolitrach PBS. Dodaj 0,5 do jednego mikrolitra barwnika zombie na probówkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności. Odwirować komórki: Umyj je jednym do dwóch mililitrów buforu faksowego i ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach bufora faksu. Dodaj bloker receptora FC zgodnie z protokołem producenta i inkubuj komórki przez 10 minut. Ponownie odwirować przy poprzednio opisanych ustawieniach i umyć komórki jednym do dwóch mililitrów buforu faksu. Dodaj koktajl przeciwciał i inkubuj przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Po inkubacji odwirować i umyć komórki buforem faksowym o pojemności od jednego do dwóch mililitrów. Dodaj 300 do 400 mikrolitrów 2% roztworu paraformaldehydu i ponownie zawiesić w celu utrwalenia. Przechowuj komórki przez kilka dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub natychmiast przeanalizuj za pomocą wielokolorowego cytometru przepływowego. W tym badaniu wykazano działanie przeciwnowotworowe polibezwodnika IL-1