Name: Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj metodę produkcji wektorów AAV w komórkach HEK293 do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych. Protokół zapewnia wysoką czystość i tytrowanie wektorów wirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas i Jacob G. E. Yates byli laureatami stypendiów studenckich Ontario Veterinary College oraz stypendiów dla absolwentów Ontario. Amira D. Rghei otrzymała stypendium Mitacs Accelerate Scholarshipship. Praca ta została sfinansowana przez Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant (#66009) oraz grant Collaborative Health Research Projects (partner NSERC) (#433339) dla SKW.

<ol><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+A+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li>
<li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li>
<li>Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
<li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss</a> (2020).</li>
<li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020).</li>
<li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020).</li>
<li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAV+vector+toolkit%3A+poised+at+the+clinical+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li>
<li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus%3A+chemical+and+physical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li>
<li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+inverted+terminal+repetition+in+adeno-associated+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA.</a> Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).</li>
<li>Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immunity+to+AAV+vectors+in+gene+therapy%3A+challenges+and+potential+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions.</a> Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).</li>
<li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li>
<li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+vectors%3B+advances+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li>
<li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier%3B+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li>
<li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((single+amino+acid+changes+can+influence+titer%2C+heparin+binding%2C+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li>
<li>Liu, J., Moon, Y. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li>
<li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li>
<li>Kimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+adeno-associated+virus+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13601(2019).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>dsDNA copy number calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html">http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html</a> (2021).</li>
<li>qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html">http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html</a> (2021).</li>
<li>Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication">https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication</a> (1996).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li>
<li>Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+4+%28AAV4%29+and+AAV5+Both+require+sialic+acid+binding+for+hemagglutination+and+efficient+transduction+but+differ+in+sialic+acid+linkage+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity.</a> Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).</li>
<li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).</li>
<li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124(2012).</li>
</ol>

Sarah K. Wootton jest wynalazcą w amerykańskim US10806802B2 patentowym kapsydu AAV6.2FF.

Produkcja rekombinowanych wektorów AAV (rAAV) opisana w tym artykule wykorzystuje powszechne materiały, odczynniki i sprzęt, które można znaleźć w większości laboratoriów i obiektów badawczych biologii molekularnej. Papier ten pozwala na uzyskanie przez czytelnik wysokiej jakości rAAV in vitro i in vivo . Przede wszystkim ten protokół produkcji rAAV, w porównaniu z bardziej żmudnymi protokołami obejmującymi oczyszczanie chlorkiem cezu, jest skuteczny i pozwala uniknąć stosowania ultrawirowania. Po trans...

Terapia genowa wykorzystująca wektory wirusa związanego z adenowirusem (AAV) poczyniła ogromne postępy w ciągu ostatnich trzech dekad1,2. Wykazana poprawa w zakresie różnych chorób genetycznych, w tym wrodzonej ślepoty, hemofilii oraz chorób układu mięśniowo-szkieletowego i ośrodkowego układu nerwowego, sprawiła, że terapia genowa AAV znalazła się w czołówce badań klinicznych3,4. W 2012 roku Europejska Agencja Leków (EMA) zatwierdziła Glyberę, wektor AAV1 wyrażający lipazę lipoproteinową (LPL) do leczenia niedoboru LPL, co czyni ją pierwszym pozwoleniem na dopuszczenie do obrotu terapii genowej w Europie lub Stanach Zjednoczonych5. Od tego czasu dwie dodatkowe terapie genowe AAV, Luxturna6 i Zolgensma7, otrzymały aprobatę FDA, a rynek ma się szybko rozwijać w ciągu najbliższych 5 lat, a do 2025 r. spodziewanych jest aż 10-20 terapii genowych8. Dostępne dane kliniczne wskazują, że terapia genowa AAV jest bezpieczną, dobrze tolerowaną i skuteczną metodą, co czyni ją jednym z najbardziej obiecujących wektorów wirusowych, z ponad 244 badaniami klinicznymi z udziałem AAV zarejestrowanymi w ClinicalTrials.gov. Rosnące zainteresowanie zastosowaniami klinicznymi z udziałem wektorów AAV wymaga solidnych i skalowalnych metod produkcji, aby ułatwić ocenę terapii AAV w dużych modelach zwierzęcych, ponieważ jest to krytyczny krok w procesie translacji9.
Dla produkcji wektorów AAV, dwoma głównymi wymaganiami są genom AAV i kapsyd. Genom typu dzikiego (wt)-AAV to jednoniciowy DNA o długości około 4,7 kb10. Genom wt-AAV składa się z odwróconych powtórzeń końcowych (ITR) znajdujących się na obu końcach genomu, które są ważne dla pakowania, oraz genów rep i cap11. Geny rep i cap, niezbędne do replikacji genomu, składania kapsydu wirusa i enkapsulacji genomu do kapsydu wirusa, są usuwane z genomu wirusa i dostarczane w trans do produkcji wektora AAV12. Usunięcie tych genów z genomu wirusa zapewnia miejsce dla terapeutycznych transgenów i wszystkich niezbędnych elementów regulatorowych, w tym promotora i sygnału poliA. ITR pozostają w genomie wektora, aby zapewnić prawidłową replikację genomu i enkapsulację wirusa13,14. Aby poprawić kinetykę ekspresji transgenu, genomy wektorów AAV można zaprojektować tak, aby były samokomplementarne, co łagodzi potrzebę konwersji z jednoniciowego na dwuniciowy DNA podczas replikacji genomu AAV, ale zmniejsza zdolność kodowania do ~2,4 kb15.
Poza projektem genomu AAV, wybór serotypu kapsydu określa tropizm tkanek i komórek wektora AAV in vivo2. Oprócz tropizmu tkankowego, wykazano, że różne serotypy AAV wykazują różną kinetykę ekspresji genów16. Na przykład Zincarelli i wsp.17 sklasyfikowali różne serotypy AAV na serotypy o niskiej ekspresji (AAV2, 3, 4, 5), serotypy o umiarkowanej ekspresji (AAV1, 6, 8) i serotypy o wysokiej ekspresji (AAV7 i 9). Podzielili również serotypy AAV na ekspresję o powolnym początku (AAV2, 3, 4, 5) lub ekspresję o szybkim początku (AAV1, 6, 7, 8 i 9). Te rozbieżne tropizmy i kinetyka ekspresji genów wynikają z różnic aminokwasów w białkach kapsydu, formacji białek kapsydu i interakcji z receptorami/koreceptorami komórek gospodarza18. Niektóre kapsydy AAV mają dodatkowe korzystne cechy, takie jak zdolność do przekraczania bariery krew-mózg po podaniu donaczyniowym (AAV9) lub rezydują w długowiecznych komórkach mięśniowych w celu trwałej ekspresji transgenu (AAV6, 6.2FF, 8 i 9)19,20.
Ten artykuł ma na celu opisanie opłacalnej metody produkcji wektorów AAV o wysokiej czystości, wysokim mianie, do wykorzystania w przedklinicznych dużych modelach zwierzęcych. Produkcja AAV przy użyciu tego protokołu odbywa się za pomocą transfekcji podwójnego plazmidu do przylegających ludzkich komórek embrionalnych nerek (HEK) 293 hodowanych w stosach komórkowych. Ponadto w badaniu opisano protokół oczyszczania chromatografii powinowactwa siarczanu heparyny, który może być stosowany do serotypów AAV zawierających domeny wiążące heparynę, w tym AAV2, 3, 6, 6,2FF, 13 i DJ21,22.
Dostępnych jest wiele systemów pakowania do produkcji wektorów AAV. Wśród nich zastosowanie dwuplazmidowych systemów kotransfekcji, w których geny Rep i Cap oraz geny pomocnicze Ad (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 i VA RNA) są zawarte w jednym plazmidzie (pHelper), ma pewne praktyczne zalety w porównaniu z powszechną metodą transfekcji trójplazmidowej (potrójnej), w tym obniżone koszty produkcji plazmidu23,24. Plazmid genomu AAV zawierający kasetę ekspresji transgenu (pTransgene) musi być otoczony przez ITR i nie może przekraczać ~ 4,7 kb długości. Transgen może mieć wpływ na miano i czystość wektora ze względu na potencjalne efekty cytotoksyczne podczas transfekcji. Ocena czystości wektorów została opisana w niniejszym dokumencie. Wektory wyprodukowane tą metodą, które dają 1 x 1013 vg / ml dla każdego, oceniano na modelach myszy, chomików i owiec.
Tabela 1: Skład wymaganych rozwiązań. Niezbędne informacje, w tym wartości procentowe i objętościowe, komponentów potrzebnych do różnych rozwiązań w całym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table 1- 62727_R2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &m; m filtr</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>SM2001C</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td>UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice</td></tr><tr><td>10-komorowy stos komórek</td><td>Corning</td><td>3271</td><td></td></tr><tr><td>1L Butelka PETG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2019-1000</td><td></td></tr><tr><td>30% Akrylamid/Bis Roztwór</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka przypodłogowa</td><td>FroggaBio</td><td>FS-96</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki samoprzylepne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić</td></tr><tr><td>rękawiczki Zestaw do oczyszczania krwi i tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Służy do oczyszczania DNA w sekcji 4.6 protokołu</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td>UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawiczki</td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli komórkowych</td><td>Greiner bio-one</td><td>7000232</td><td>talerze 15 cm</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa do hodowli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>Rurka stożkowa 15 ml</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa do hodowli</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955240</td><td>50 ml probówka stożkowa</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z 1000 mg/L D-glukozy, L-glutaminą</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32209</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Greenfield</td><td>P016EA95</td><td>Rozcieńczyć alkohol etylowy (95% obj.) do 20% dla sekcji 3.7.4 i 70% dla sekcji 6.1.1.1</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>OSTROŻNOŚĆ. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS z Mg2+ i Ca2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH302268.02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS bez Mg2+ oraz Ca2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HEK293</td><td>Amerykańska kolekcja kultur tkankowych</td><td>CRL-1573</td><td>Po otrzymaniu rozmrozić komórki i hodowlę zgodnie z opisem w katalogu producenta s protokół. Gdy komórki zostaną zminimalizowane i dobrze rosną, zamroź podfrakcję na przyszłość w podwielokrotnościach i przechowuj w ciekłym azocie. Zawsze używaj komórek poniżej fragmentu numer 30. Po ponad 30-krotnym pasażowaniu wyhodowanych komórek zaleca się ponowne uruchomienie hodowli z przechowywanych podwielokrotności</td></tr><tr><td>HEK293 zestaw ELISA białka komórki gospodarza</td><td>Cygnus Technologies</td><td>F650S</td><td>Postępuj zgodnie z wymaganiami producenta s instrukcje</td></tr><tr><td>Kolumna siarczanu heparyny</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>17040703</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KC34120</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; L-glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka podtrzymująca probówkę wirówkową o dużej objętości</td><td>Corning</td><td>CLS431124</td><td>Poduszka nośna musi być używana z probówkami wirówkowymi o dużej objętości, chyba że wirnik wirówki ma odpowiednie poduszki z dnem w kształcie litery V</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe o dużej objętości</td><td>Corning</td><td>CLS431123-6EA</td><td>Probówki wirówkowe 500 ml</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp; </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Probówka do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, sterylizuj przed użyciem</td></tr><tr><td>Woda o jakości molekularnej</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa N-lauroilsarkozyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5125</td><td>UWAGA. Nosić rękawice</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP35810</td><td></td></tr><tr><td>Optimem, zredukowane podłoże surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>Sterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Rozcieńczyć do 1x do stosowania na komórki</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pHelper</td><td>De novo projekt lub uzyskany z repozytorium plazmidów</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Umywalka na pipety</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>Zakup sterylnych misek pipetowych</td></tr><tr><td>Eter tert-oktylofenylowy glikolu polietylenowego (Triton X-100)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>UWAGA. Nosić rękawice</td></tr><tr><td>Polietylenina (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcje do produkcji 1L roztworu. 0,22&mu; m filtrować i przechowywać w temperaturze 4&deg; C</td></tr><tr><td>Polipropylenowa półspódniczka PCR</td><td>FroggaBio</td><td>WS-96</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>UWAGA. Nosić rękawice</td></tr><tr><td>membrana z polifluorku winylidenu (PVDF)</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>10600023</td><td>Do manipulacji używaj kleszczy. Nosić rękawice.</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Progen</td><td>65158</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka białkowa</td><td>FroggaBio</td><td>PM008-0500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pTrangene</td><td>De novo projekt lub uzyskany z repozytorium plazmidu</td><td>NA</td><td>Musi zawierać poliA SV40 w genomie, aby był zgodny z miareczkowaniem AAV w sekcji 5.0</td></tr><tr><td>Rurka pompy</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96440-14</td><td>Zoptymalizuj długość rurek i powstrzymywanie wirusa we frakcjach E1-E5</td></tr><tr><td>RQ1 Dnaza 10 Bufor reakcyjny</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Stosować przy stężeniu 10x w protokole z sekcji 4.0</td></tr><tr><td>RQ1 Dnaza bez rnazy</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik próbki</td><td>Cygnus Technologies</td><td>I700</td><td>Należy zakupić osobno do użytku z zestawem</td></tr> <tr><td>ELISA białka komórki gospodarza HEK293Przeciwciało wtórne, HRP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G-21040</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Oxoid</td><td>LP0033B</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28312</td><td>UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-4</td><td></td></tr><tr><td>SV40 sonda startera polyA</td><td>IDT</td><td></td><td>Użyj sekwencji w tabeli X, aby uzyskać cytat z IDT do syntezy</td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15524010</td><td>UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Filter</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC810024</td><td>Ultra-4 Należy użyć urządzenia odśrodkowego 10K, ponieważ ma ono granicę masy cząsteczkowej 10000</td></tr><tr><td>Uniwersalny nukleaza do lizy komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88702</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna mieszanka mistrzowska qPCR</td><td>NEB</td><td>M3003L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001325</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice</td></tr><tr><td>UWAGA:&nbsp; Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać wskazówki dotyczące stosowania niebezpiecznych chemikaliów.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Wektory wirusa związanego z adenowirusem (AAV) są jednymi z najbardziej zaawansowanych klinicznie wektorów terapii genowej, z trzema terapiami genowymi AAV zatwierdzonymi dla ludzi. Postęp kliniczny nowych zastosowań AAV obejmuje przejście od małych modeli zwierzęcych, takich jak myszy, do większych modeli zwierzęcych, w tym psów, owiec i naczelnych. Jednym z ograniczeń podawania AAV większym zwierzętom jest zapotrzebowanie na duże ilości wirusa o wysokim mianie. Chociaż hodowla komórek zawiesinowych jest skalowalną metodą produkcji wektorów AAV, niewiele laboratoriów badawczych ma sprzęt (np. bioreaktory) lub wie, jak wytwarzać AAV w ten sposób. Co więcej, miana AAV są często znacznie niższe, gdy są wytwarzane w zawiesinie komórek HEK 293 w porównaniu z przylegającymi komórkami HEK293. Opisano tutaj metodę wytwarzania dużych ilości AAV o wysokim mianie przy użyciu stosów komórek. Opisano również szczegółowy protokół miareczkowania AAV, a także metody walidacji czystości wektorów. Na koniec przedstawiono reprezentatywne wyniki ekspresji transgenu za pośrednictwem AAV w modelu owiec. Ten zoptymalizowany protokół produkcji wektorów AAV na dużą skalę w przylegających komórkach umożliwi laboratoriom biologii molekularnej postęp w testowaniu nowych terapii AAV na większych modelach zwierzęcych.

Przeniesienie wyników z modeli małych gryzoni na modele większych zwierząt, a w konsekwencji do zastosowań klinicznych, stanowi znaczne wyzwanie ze względu na dużą ilość AAV wymaganą do transdukcji większych zwierząt i osiągnięcia efektów terapeutycznych. Aby porównać wydajność transdukcji racjonalnie zaprojektowanego kapsydu AAV6.2FF, u którego wcześniej wykazano 101-krotny wzrost wydajności transdukcji w komórkach mięśniowych myszy w porównaniu do AAV63, myszom, chomikom oraz jagniętom podano AA...

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje >1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

Ten protokół produkcji wektorów wirusowych AAV jest opłacalny i daje AAV o wysokiej czystości, wysokim mianie klasy badawczej do stosowania w przedklinicznych, dużych modelach zwierzęcych. Technika ta wykorzystuje przylegające komórki HEK293 w komorach hodowli komórkowych, co jest efektywne czasowo i mniej praktyczne, co pozwala na mniej zakłóceń w komórkach. Protokół ten może znacznie pomóc w produkcji wektorów wirusowych w dziedzinie terapii genowej, a także może być stosowany do produkcji innych serotypów AAV, które również wiążą siarczan heparanu.Na początek zbierz komórki HEK293 z hodowli, gdy osiągnie ona 80% konfluencji. Odessać pożywkę przed delikatnym umyciem płytki do hodowli komórkowej trzema mililitrami PBS. Następnie odessać PBS i dodać trzy mililitry trypsyny.Inkubuj płytki przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji zneutralizować trypsynę, dodając siedem mililitrów kompletnego DMEM do płytki i zebrać supernatant w 50-mililitrowych stożkowych probówkach. Delikatnie odwróć probówki, aby upewnić się, że komórki są jednorodne.Aby określić gęstość komórek, wymieszaj 10 mikrolitrów próbek komórek z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego. I dodaj mieszaninę do szkiełka do liczenia komórek, aby przeanalizować ją w liczniku komórek. Wymieszaj zawiesinę komórkową z jednym litrem wstępnie podgrzanego kompletnego DMEM, aby zobaczyć komorę hodowlaną.Delikatnie obróć komorę, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Inkubuj komorę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Oprócz komory do hodowli komórkowej, komórki hodowlane o wielkości od 10 do czwartej komórek na centymetr kwadratowe na 15-centymetrowej płytce jako odniesienie dla zbieżności.Po 65 godzinach inkubacji, gdy komórki zlewają się w 80 do 90%, powoli dodaj mieszaninę polietylenoiminy-DNA i DMEM do portu komory hodowli komórkowej. Rozprowadź płyn równomiernie we wszystkich rzędach przed inkubacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. Po inkubacji energicznie potrząśnij komorą hodowli komórkowej, aby usunąć komórki, aż pożywka stanie się mętna, i wlej ją do czterech lub 500 mililitrowych probówek wirówkowych.Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 18 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wlej sklarowany supernatant do jednolitrowej butelki PETG i ponownie zawieś granulki komórek w 50 mililitrach licencjonowanego buforu w 500-mililitrowych probówkach wirówkowych. Inkubować probówki przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji odwirować probówki pod ciśnieniem 18 000 razy G przez 30 minut i przenieść supernatant do tej samej litrowej butelki PETG. Przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozmrozić surowy lizat w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Po rozmrożeniu przefiltruj go za pomocą filtra 0,22 mikrona. Bezpośrednio przed etapami oczyszczania należy pasywować koncentrator odśrodkowy, dodając cztery mililitry buforu do wstępnej obróbki filtra na każdą używaną kolumnę heparyna-sefaloza. Umieść rurkę w pompie perystaltycznej.Sekwencyjne uruchamianie rozwiązań i nośników. Przygotuj się do chromatografii, podłączając pięciomililitrową kolumnę heparyny-sefarozy do rurki i przepuszczając przez kolumnę 25 mililitrów Bazell DMEM. Następnie załaduj 0,2 mikromola przefiltrowanego surowego lizatu na kolumnę z natężeniem przepływu od jednej do dwóch kropli na sekundę.Przemyć kolumnę sekwencyjnie, aby wymyć pięć mililitrów pięciokrotnie 300 milimolami chlorku sodu HBSS, magnezem i wapniem, a następnie oznaczyć pięć elucji jako E1 do E5. Gdy wszystko będzie gotowe, obracać koncentrator odśrodkowy zawierający bufor do obróbki wstępnej pod ciśnieniem 900 razy G przez dwie minuty. Odrzuć przepływ. Umyj filtr koncentratora odśrodkowego czterema mililitrami HBSS z magnezem i wapniem, wirując z prędkością 1000 razy G przez dwie minuty.Następnie dodać elucję E2 do koncentratora odśrodkowego i wirować z prędkością 1000 razy G przez pięć minut. Odrzuć przepływ. Podobnie odwirować elucję E3 do koncentratora odśrodkowego, aż stężenie wirusa osiągnie około jednego mililitra.Usuń skoncentrowany wirus z koncentratora odśrodkowego za pomocą końcówki z filtrem P200 i zbierz go do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Po pobraniu wirusa przepłukać koncentrator odśrodkowy 200 mikrolitrami HBSS z magnezem i wapniem. Energicznie pipetować w górę iw dół przez 30 sekund, aby usunąć wirusa przyklejonego do membrany, a następnie zebrać skoncentrowany wirus w tej samej 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej.Dobrze wymieszaj rurkę. Umyj kolumnę i nasącz 20% etanolem przed przechowywaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rurkę pompy należy przechowywać w jednym molowym wodorotlenku sodu.Skuteczność transdukcji kapsydu AAV6.2FF porównano u myszy, chomików i jagniąt przez 28 dni po podaniu domięśniowym. Myszy podawały pięć razy od 10 do 12. genomu wektora na kilogram ludzkiej IgG AAV6.2FF, wyrażonej od 171 do 237 mikrogramów na mililitr ludzkiej IgG w surowicy. Chomikowi podaje się dwa razy od 10 do 13 genomów wektora na kilogram ludzkiej IgG AAV6.2FF, wyrażającej znacznie wyższy poziom ludzkiej IgG niż myszy.Podczas gdy duży model zwierzęcy był w stanie wyrazić średnio 35 mikrogramów na mililitr poziomu ludzkiej IgG w osoczu. Duże modele zwierzęce mogą określić ekspresję transgenu AAV in vivo i określić, czy transgeny mają efekt terapeutyczny przeciwko zaburzeniu lub chorobie będącej przedmiotem zainteresowania. Badanie wykazało doskonałą zdolność transdukcji AAV6.2FF, nowego wektora serotypu AAV 6 w mięśniach szkieletowych, a także niską immunogenność wektorów wirusa AAV in vivo.

production-adeno-associated-virus-vectors-cell-stacks-for-preclinical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wektory rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (rAAVs) stają się coraz bardziej cenne w badaniach in vivo na zwierzętach. Opisujemy, w jaki sposób rAAVs mogą być produkowane w laboratorium oraz jak można oznaczać miano tych wektorów, aby uzyskać dokładny odczyt liczby wyprodukowanych cząstek zakaźnych.

Produkcja i miareczkowanie rekombinowanych wektorów wirusowych opartych na wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV)

Prezentujemy podstawową technikę inżynierii molekularnej i ewolucji syntetycznych wektorów do terapii genowej opartych na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA (DNA family shuffling). Ponadto przedstawiamy ogólne wytyczne oraz reprezentatywne przykłady selekcji i analizy poszczególnych chimerycznych kapsydów o ulepszonych właściwościach w odniesieniu do komórek docelowych w hodowli lub u myszy.

Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

W tym protokole, wektor AAV2 jest wytwarzany przez kokulturację komórek owadów Spodoptera frugiperda (Sf9) z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) wirusa bakulowirusa (BV)-AAV2-AAV2 lub genem terapeutycznym oraz komórkami Sf9 zakażonymi BV-AAV2-rep-cap w hodowli zawiesinowej. Cząsteczki AAV są uwalniane z komórek za pomocą detergentu, klarowane, oczyszczane za pomocą chromatografii kolumnowej powinowactwa i zagęszczane przez filtrację o przepływie stycznym.

Opracowanie procesu produkcji i oczyszczania wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV)2 przy użyciu systemu hodowli komórek bakulowirusa i owadów

W tym manuskrypcie, iniekcja podspojówkowa jest demonstrowana jako prawidłowa metoda dostarczania wektora do tkanek oka u myszy za pomocą systemu iniekcyjnego składającego się z pompy strzykawkowej do infuzji/pobrania i gazoszczelnej wyjmowanej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji. Ten system iniekcji można również dostosować do innych dróg podawania wewnątrzgałkowego.

Podspojówkowe podawanie wektorów wirusa związanych z adenowirusem w małych modelach zwierzęcych

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Szybkość wymiany wirusów w systemach morskich i słodkowodnych można oszacować za pomocą techniki redukcji i ponownego pojawienia się. Uzyskane dane pozwalają badaczom wywnioskować tempo śmiertelności mikroorganizmów indukowanej przez wirusy w systemach wodnych.

Szacowanie szybkości produkcji wirusów w systemach wodnych

Niniejszy artykuł opisuje różne procedury przesiewowe u szczurów i myszy w celu wykrycia endo- lub ektopasożytnictwa. Przedstawiono kilka testów diagnostycznych, zarówno tych odpowiednich do stosowania u żywych zwierząt, jak i tych wykonywanych po eutanazji zwierzęcia. Dołączono zdjęcia pomagające w identyfikacji pasożytów szczurów i myszy.

Diagnostyka ektopasożytów i endopasożytów u laboratoryjnych szczurów i myszy

Poznaj metodę produkcji wektorów AAV w komórkach HEK293 do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych. Protokół zapewnia wysoką czystość i tytrowanie wektorów wirusowych.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

Przeglądaj więcej filmów