Izolacja i hodowla in vitro makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego do badania biologii NO-redoks

Protokół ten pomaga w hodowli makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy z niedoborem iNOS lub BH4 przy użyciu starannie zdefiniowanych pożywek i surowicy o niskim poziomie BH4 i azotanów, aby uniknąć zakłóceń w mechanizmach redoks. Poprzez staranne kontrolowanie poziomów potencjalnych zanieczyszczeń w procesie hodowli, możemy ograniczyć interferencję tlenku azotu, zapewniając dokładność i odtwarzalność systemu modelowego. Metoda ta pozwala na dokładne pomiary biopteryny, tlenku azotu i wszelkich dalszych czynników związanych z tymi niezbędnymi związkami.

Procedurę zademonstruje dr Thomas Nichol, doktor habilitowany z naszego laboratorium. Na początek umieść nogi w 70% etanolu na dwie minuty, aby zmyć wszelkie futro lub pozostałości. Następnie przenieś nogi na czystą, sterylną bakteriologiczną szalkę Petriego.

Ostrożnie zeskrob ostrzem wzdłuż kości, przecinając ścięgna i usuwając mięsień z kości. Gdy kości zostaną oczyszczone z mięśni, przetnij nasadę w górnej części kości piszczelowej, tuż poniżej kolana. Kość piszczelową można przeciąć na dole, tuż nad skrzyżowaniem z kością strzałkową.

Na koniec przeciąć nasadę na obu końcach kości udowej, tuż przed stawami kolanowymi i biodrowymi. Aby przepłukać szpik kostny, napełnij 10-mililitrową strzykawkę 10 mililitrami PBS i przymocuj ją do igły. Następnie wbij igłę do jamy szpikowej kości.

Delikatnie przepłukać jednym do dwóch mililitrów PBS, przesuwając igłę w górę iw dół. Następnie wciągnąć zawiesinę pięć do dziesięciu razy do i z jednomililitrowej strzykawki, aby ją zdezagregować. Zebrać zawiesinę do jednomililitrowej strzykawki i przepuścić ją przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do czystej 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

Na koniec umieść próbki na lodzie. Aby zamrozić szpik kostny do późniejszego wykorzystania, odwirować komórki w temperaturze 1000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś czerwoną osadkę w dwóch mililitrach płynu niezamarzającego.

Następnie inkubuj go w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez noc. W przypadku zamrożenia zawiesinę należy szybko rozmrozić w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieść zawiesinę komórek do czystej sterylnej probówki zawierającej trzy mililitry pożywki DMEM/F-12.

Następnie osadzaj komórki przez odwirowanie. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach przygotowanej pożywki DMEM/F-12. Policz komórki i umieść je w plastikowym naczyniu niepokrytym TC w przygotowanym podłożu DMEM/F-12.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Piątego dnia nakarm komórki, dodając 50% pierwotnej objętości pożywki DMEM/F-12. Szóstego dnia stymulować komórki, dodając przygotowany GM-CSF do końcowego stężenia 50 nanogramów na mikrolitr bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowych.

Siódmego dnia usuń wszystkie pożywki z komórek. Następnie krótko umyj komórki wstępnie podgrzanym PBS i dodaj pożywkę DMEM/F-12 zawierającą 2% FBS o niskiej endotoksynie, 1X penicylinę lub streptomycynę, L-glutaminę, 25 nanogramów na mikrolitr M-CSF i 50 nanogramów na mikrolitr GM-CSF. Na koniec inkubuj komórki przez noc w pożywce, aby aktywować makrofagi do fenotypu M0.

W przypadku fenotypu M1 stymuluj komórki 100 nanogramami na mikrolitr LPS i 10 nanogramami na mikrolitr IFN-gamma. W przypadku fenotypu M2 stymuluj komórki 100 nanogramami na mikrolitr IL-4. Inkubuj komórki przez noc.

Ósmego dnia komórki są gotowe do zbioru lub dalszej obróbki zgodnie z potrzebami badacza. Pożywki uzupełnione 10% FBS zawierały podobne azotyny i tetrahydrobiopterynę, niezależnie od M-CSF i GM-CSF, czyli LCM. Jednak całkowite poziomy biopteryny były wyższe w pożywkach z suplementacją LCM.

Zaobserwowano jednak większą zmienność pomiędzy różnymi partiami LCM. PCR wykazał produkt 1030 par zasad u myszy typu dzikiego, podczas gdy myszy z nokautem GCH wytworzyły produkt 1392 par zasad, potwierdzając wycięcie krytycznych eksonów. Leczenie tamoksyfenem znosiło białko GCH w komórkach z nokautem.

Komórki nokautujące i kontrolne nadal wytwarzały iNOS, po stymulacji LPS i IFN. BMDM hodowane od myszy z warunkowym nokautem GCH wykazywały znacznie zmniejszoną tetrahydrobiopterynę i zmniejszoną zawartość azotynów. Te same komórki hodowane w pożywkach LCM nie miały ekspresji GCH1.

Jednak po nokautowaniu komórki wytwarzają znaczne ilości tetrahydrobiopteryny i azotynów. W ósmym dniu nie stwierdzono istotnych różnic w morfologii między nieaktywowaną kontrolą a BMDM z nokautem GCH przy różnych stężeniach tamoksyfenu. BMDM wykazują cechy, których oczekuje się od niestymulowanych makrofagów, z okrągłymi przylegającymi komórkami i wydłużonymi kończynami.

Podczas pracy z komórką pierwotną, taką jak ta, konieczne jest dokładne wysterylizowanie wszystkich tkanek i sprzętu. Ponadto wybór odpowiedniej pożywki i suplementu jest ważny dla utrzymania środowiska o niskiej zawartości tlenku azotu i BH4. Granulki i pożywki komórkowe mogą być używane do różnych zastosowań końcowych, z naciskiem na rolę tlenku azotu, biopteryny lub komórkowego stanu redoks.

Może obejmować między innymi HPLC, qPCR i Western blot.