Name: Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Poznaj metodę wiszących kropelek do tworzenia trójwymiarowych sferoidów guzowych w badaniu interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym. Ta technika umożliwia współkulturę komórek Huh7 i Hep3B z fibroblastami COS-7 oraz LX2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MYWZ jest finansowany przez Sekretarza Stanu ds. Biznesu, Energii i Strategii Przemysłowej oraz Nagrodę Newtona 2020 jako część brytyjskiej Oficjalnej Pomocy Rozwojowej "ODA" i funduszu Newton. SS jest wspierany przez stypendium Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist C53575/A29959. SS, FO i HR otrzymują fundusze w ramach projektu HUNTER, finansowanego dzięki partnerstwu między Cancer Research UK, Fondazione AIRC i Fundación Cientifica de la Asociación Española Contra el Cancer.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzić w warunkach sterylnych w laminarnym dygestorium mikrobiologicznym klasy II (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Włączyć dygestorium i odczekać do ustabilizowania przepływu powietrza.</li>
		<li>Dokładnie spryskać wewnętrzne powierzchnie dygestorium 70% etanolem, aby wyeliminować ewentualne zanieczyszczenia pozostawione przez poprzednich użytkowników.</li>
		<li>Przygotować 5% roztwór dezynfekujący w zlewce szklanej o pojemności 500 mL. Do roztworu należy wrzucać supernatant komórkowy lub szczątki komórkowe.</li>
		<li>Dokładnie oczyścić wszystkie mikropipety i pudełka z końcówkami 70% etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować świeże podłoża do hodowli komórkowej poprzez uzupełnienie podłoża DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) z wysoką zawartością glukozy o 10% dezaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny (100 unit/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny) oraz 2 mM L-glutaminy. W przypadku linii komórek gwiaździstych wątroby LX2 należy zmniejszyć stężenie dodatku FBS do 2%.</li>
	<li>Podgrzać podłoża hodowlane przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
	<li>Wyjąć linie komórek nowotworowych HCC Huh7 i Hep3B oraz linie fibroblastów COS7 i LX2 z regału do przechowywania w ciekłym azocie. Szybko rozmrozić kriokonserwowane komórki.</li>
	<li>Rozcieńczyć rozmrożone komórki 2 mL świeżego podłoża hodowlanego. Wirować komórki z prędkością 200 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej. Odlać supernatant i resuspender osad komórkowy w 1 mL świeżego, ciepłego podłoża hodowlanego.</li>
	<li>Zasiać komórki w kolbie do hodowli komórkowej T75. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowej w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przy 95% wilgotności do momentu osiągnięcia przez komórki 60%-70% konfluencji.</li>
</ol>
2. Zbieranie komórek
<ol>
	<li>Odssać pożywkę hodowlaną i trzykrotnie przemyć komórki roztworem PBS (phosphate buffer saline).</li>
	<li>Dodać 2 mL uprzednio ogrzanej trypsyny 1x, aby odłączyć komórki adherentne od dna kolb T75. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 min.</li>
	<li>Zneutralizować trypsynę, dodając 4 mL pełnej pożywki hodowlanej. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować komórki z prędkością 200 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej. Odlać nadsącz i resuspendować komórki w 4 mL świeżej pożywki hodowlanej.</li>
</ol>
3. Liczenie komórek
<ol>
	<li>Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową na wortexie, aby zapewnić jednorodny rozkład komórek w probówce do wirowania.</li>
	<li>Za pomocą pipety 10 µL wymieszaj 10 µL zawiesiny komórkowej z 10 µL błękitu trypanu. Delikatnie pipetuj mieszaninę w górę i w dół cztery razy, aby zapewnić całkowite zabarwienie zewnętrznej powierzchni komórek barwnikiem.</li>
	<li>Policz liczbę komórek przy użyciu hemocytometru.
	<ol>
		<li>Najpierw nałóż szkiełko nakrywkowe na obszar zliczania hemocytometru przed naniesieniem zabarwionej zawiesiny komórkowej.</li>
		<li>Umieść końcówkę pipety z zawiesiną komórkową w rowku V hemocytometru. Delikatnie wprowadź zawartość końcówki na szkiełko do zliczania.</li>
		<li>Pozostaw zawiesinę na kilka minut, aby osiadła, przed umieszczeniem preparatu na stoliku mikroskopu w celu zliczenia komórek. 
		UWAGA: Aby uniknąć podwójnego liczenia, zliczaj komórki znajdujące się tylko przy dwóch krawędziach dużego kwadratu.</li>
		<li>Wliczaj komórki nakładające się na górną lub prawą linię siatki, a pomijaj te nakładające się na dolną lub lewą linię.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz całkowitą liczbę komórek. 
	UWAGA: Liczba komórek na ml = <img alt="Obliczanie formuły zliczania komórek; równanie ilustrujące analizę rozcieńczenia i stężenia próbki." src="/files/ftp_upload/62868/62868eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>
4. Pobieranie pożywki warunkowanej (CM) z fibroblastów
<ol>
	<li>Odssać pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki LX2 roztworem PBS.</li>
	<li>Dodaj 2 ml uprzednio ogrzanej trypsyny 1x, aby odkleić komórki adherentne od dna kolb T75. Inkubuj kolbę w 37 °C w inkubatorze przez 4 min.</li>
	<li>Inaktywuj trypsynę, dodając 4 ml pełnej pożywki hodowlanej. Zbierz zawiesinę komórkową i odwiruj komórki z prędkością 200 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej. Policz komórki zgodnie z krokiem 3.</li>
	<li>Wysiać 1 x 106 komórki LX2 w naczyniu 10 cm3 szalki przez 48 h w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zebrać medium warunkujące (CM) fibroblastów po 48 h. Wirować przy 200 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej, aby odwirować pływające komórki. Pożywkę CM przefiltruj sterylnie za pomocą 0.22 µm filtr zamocowany na końcówce strzykawek o pojemności 20 ml.</li>
	<li>Zebrać nadsącz CM. Rozdzielić CM na aalikwoty do probówek o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszych zastosowań. 
	UWAGA: Roztwór można przechowywać przez 6 miesięcy w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Walidacja gęstości komórek w celu uzyskania idealnych sferoidów
<ol>
	<li>Odssać pożywkę hodowlaną i trzykrotnie przemyć linie komórkowe HCC buforem PBS.</li>
	<li>Dodać 2 mL uprzednio ogrzanej trypsyny 1x, aby odkleić komórki adherentne od dna kolb T75. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 min.</li>
	<li>Zneutralizować trypsynę poprzez dodanie 4 mL pełnej pożywki hodowlanej. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować komórki z prędkością 200 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Policzyć komórki zgodnie z krokiem 3.</li>
	<li>Nanieść pipetą różne gęstości komórek z linii nowotworowych (12000, 6000, 3000, 1500, 1000, 750, 500, 250 i 125 komórek) w 20 µL pożywki na wewnętrzną powierzchnię pokrywki szalki Petriego o rozmiarze 10 cm3.</li>
	<li>Dodać 10 mL sterylnego PBS na dno szalki, aby zapewnić wilgotne warunki dla procesu tworzenia sferoidów.</li>
	<li>Odwrócić pokrywkę szalki 10 cm3, tak aby pożywka wraz z zawiesiną komórkową zwisała nad wilgotnym środowiskiem. Pozostawić zwisające krople na 3 dni.</li>
	<li>Wykonać zdjęcia sferoidów przy powiększeniu 50x za pomocą mikroskopu odwróconego 3 dni po naniosieniu pierwotnych kropli.</li>
</ol>
6. Heterotypowe sferoidy guzowe/stromalne
<ol>
	<li>Zawiesić 1500 komórek HCC Huh7 wraz z 1500 komórkami fibroblastów ssaczych COS7 (stosunek 1:1) w kroplach wiszących w celu sformowania sferoidów. Do dna naczynia dodać 10 ml sterylnego PBS, aby zapewnić wilgotne warunki dla sferoidów.</li>
	<li>Odwróć pokrywkę naczynia o średnicy 10 cm3 szalkę, aby pożywka wraz z zawiesiną komórek mogła zwisać nad wilgotnym środowiskiem. Pozostaw zwisające krople na 3 dni.</li>
	<li>Wykonuj zdjęcia sferoidów za pomocą mikroskopu odwróconego od 3. do 10. dnia hodowli.
	<ol>
		<li>Umieść 10 cm3 szalkę na stoliku mikroskopu. Dla wszystkich sferoidów ustaw powiększenie mikroskopu na 50x.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie mikroskopu na podłączonym komputerze i dostrój ostrość, aby uzyskać wyraźny obraz każdego sferoidu. Użyj Narzędzie do rejestracji danych w oprogramowaniu mikroskopu, aby zapisać pozyskane obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Homotypowe sferoidy Hep3B w CM z komórek LX2
<ol>
	<li>Zawiesić 3000 komórek HCC Hep3B w wiszących kroplach w celu utworzenia sferoidów. Do dna szalki dodać 10 mL sterylnego PBS, aby zapewnić warunki wilgotnościowe dla sferoidów.</li>
	<li>Odwrócić pokrywkę szalki 10 cm3, aby medium, w tym zawiesina komórek, zwisało nad wilgotnym środowiskiem. Pozostawić wiszące krople na 3 dni.</li>
	<li>Przenieść sferoidy Hep3B do 20 µL świeżego CM z komórek LX2 w wiszących kroplach. 
	UWAGA: W procesie przenoszenia sferoidów należy używać sterylnych, autoklawowanych, niefiltrowanych końcówek do pipet o objętości 200 µL, aby uniknąć rozbicia lub uszkodzenia utworzonych sferoidów. Służy to również wyeliminowaniu wszelkich pozostałych komórek, które nie przyłączyły się do głównego, pojedynczego sferoidu.
	<ol>
		<li>Do procesu przenoszenia użyć autoklawowanej pipety 20 µL. Ustawić objętość pipety na 2 µL. Zamocować końcówkę do pipety.</li>
		<li>Odwrócić pokrywkę szalki 10 cm3, na której utworzono sferoidy. Umocować pokrywkę na stoliku mikroskopu świetlnego. Dostroić ostrość mikroskopu, aby każdy sferoid był widoczny.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć powietrze z mikropipety, naciskając tłok. Włożyć końcówkę pipety do kropli zawierającej sferoid przeznaczony do przeniesienia. Zbliżyć się bardzo blisko sferoidu, nie dotykając go końcówką.</li>
		<li>Delikatnie zwolnić nacisk na tłok, aby zassać sferoid do końcówki mikropipety w 2 µL medium.</li>
		<li>Przenieść sferoid do nowej kropli zwisającej z nowej szalki 10 cm3, zawierającej nowe medium/medium kondycjonowane/substancję leczniczą. 
		UWAGA: Używając mikroskopu świetlnego, upewnić się, że wszystkie sferoidy zostały pomyślnie przeniesione do nowej szalki 10 cm3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia sferoidów przy powiększeniu 50x przy użyciu mikroskopu odwróconego, począwszy od dnia przeniesienia (dzień 3) aż do 7. dnia hodowli w LX2 CM.</li>
</ol>
8. Obliczanie objętości sferoidu
<ol>
	<li>Przypisz unikalny identyfikator numeryczny do każdego sferoidu, aby umożliwić codzienne obrazowanie tych samych obiektów.</li>
	<li>Przeanalizuj obrazy rosnących sferoidów za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
	<ol>
		<li>Otwórz obraz każdego sferoidu w programie. Użyj narzędzia zaznaczania Freehand i obrysuj każdy sferoid. Z menu rozwijanego Analysis wybierz Set Measurement, a następnie Area. Zatwierdź przyciskiem OK.</li>
		<li>Ręcznie narysuj okrąg wokół każdego sferoidu. Po obrysowaniu sferoidu naciśnij Ctrl + M , aby program obliczył powierzchnię sferoidu w pikselach. Przelicz powierzchnię sferoidu na objętość. 
		UWAGA: Objętość sferoidumm3 = 0,09403 × <img alt="Schemat wzoru na powierzchnię sferoidu; (Spheroid area_pixel x 0.28)/1000^1.5 dla biologii obliczeniowej." src="/files/ftp_upload/62868/62868eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"></li>
		<li>Oblicz zmianę objętości sferoidu w stosunku do jego objętości z pierwszego dnia obrazowania. 
		UWAGA: Służy to normalizacji objętości sferoidu do objętości początkowej i zwiększeniu dokładności, uwzględniając naturalne różnice w rozmiarze początkowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics+for+the+year+2020%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics for the year 2020: an overview.</a> International Journal of Cancer. , (2021).</li>
<li>Llovet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 6(2021).</li>
<li>Reeves, H. L., Zaki, M. Y., Day, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+in+obesity%2C+Type+2+diabetes%2C+and+NAFLD%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+%26+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma in obesity, Type 2 diabetes, and NAFLD.</a> Digestive Diseases & Sciences. 61 (5), 1234-1245 (2016).</li>
<li>Forner, A., Reig, M., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).</li>
<li>Reig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+hepatocellular+carcinoma.+Update+of+the+consensus+document+of+the+AEEH%2C+AEC%2C+SEOM%2C+SERAM%2C+SERVEI%2C+and+SETH%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+Clinica+%28Barc%29%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma. Update of the consensus document of the AEEH, AEC, SEOM, SERAM, SERVEI, and SETH.</a> Medicina Clinica (Barc). 156 (9), 1-30 (2021).</li>
<li>Pfister, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NASH+limits+anti-tumour+surveillance+in+immunotherapy-treated+HCC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NASH limits anti-tumour surveillance in immunotherapy-treated HCC.</a> Nature. 592 (7854), 450-456 (2021).</li>
<li>Llovet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trial+design+and+endpoints+in+hepatocellular+carcinoma%3A+AASLD+consensus+conference%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Trial design and endpoints in hepatocellular carcinoma: AASLD consensus conference.</a> Hepatology. 73, Suppl 1 158-191 (2021).</li>
<li>Llovet, J. M., Hernandez-Gea, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%3A+reasons+for+phase+III+failure+and+novel+perspectives+on+trial+design%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma: reasons for phase III failure and novel perspectives on trial design.</a> Clinical Cancer Research. 20 (8), 2072-2079 (2014).</li>
<li>Brown, Z. J., Heinrich, B., Greten, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+hepatocellular+carcinoma%3A+an+overview+and+highlights+for+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of hepatocellular carcinoma: an overview and highlights for immunotherapy research.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 15 (9), 536-554 (2018).</li>
<li>Nikolic, M., Sustersic, T., Filipovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+and+on-chip+systems%3A+Biomaterial+interaction+studies+with+tissues+generated+using+lung+epithelial+and+liver+metabolic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro models and on-chip systems: Biomaterial interaction studies with tissues generated using lung epithelial and liver metabolic cell lines.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 120(2018).</li>
<li>Clark, A. M., Ma, B., Taylor, D. L., Griffith, L., Wells, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+metastases%3A+Microenvironments+and+ex-vivo+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Liver metastases: Microenvironments and ex-vivo models.</a> Experimental Biology and Medicine. 241 (15), 1639-1652 (2016).</li>
<li>Paish, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioreactor+technology+for+modeling+fibrosis+in+human+and+rodent+precision-cut+liver+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A bioreactor technology for modeling fibrosis in human and rodent precision-cut liver slices.</a> Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).</li>
<li>Brassard-Jollive, N., Monnot, C., Muller, L., Germain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+3D+systems+to+model+tumor+angiogenesis+and+interactions+with+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro 3D systems to model tumor angiogenesis and interactions with stromal cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 594903(2020).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Kleinman, H. K., Philp, D., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracellular+matrix+in+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Role of the extracellular matrix in morphogenesis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 14 (5), 526-532 (2003).</li>
<li>Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organizing+principle%3A+microenvironmental+influences+in+the+normal+and+malignant+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast.</a> Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).</li>
<li>Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W., Koteliansky, V. E., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+myofibroblasts+in+breast+cancer.+Recapitulation+of+tumor+environment+in+culture+unravels+diversity+and+implicates+converted+fibroblasts+and+recruited+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">The origin of the myofibroblasts in breast cancer. Recapitulation of tumor environment in culture unravels diversity and implicates converted fibroblasts and recruited smooth muscle cells.</a> Journal of Clinical Investigations. 95 (2), 859-873 (1995).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+stromal+fibroblast-modulated+3D+tumor+spheroid+model+for+studying+tumor-stroma+interaction+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A novel stromal fibroblast-modulated 3D tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60660(2020).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+hepatic+stellate+cells+play+pivotal+roles+in+hepatocellular+carcinoma+cell+chemoresistance+and+migration+in+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Activated hepatic stellate cells play pivotal roles in hepatocellular carcinoma cell chemoresistance and migration in multicellular tumor spheroids.</a> Scientific Reports. 6, 36750(2016).</li>
<li>Pingitore, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+multilineage+3D+spheroids+as+a+model+of+liver+steatosis+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human multilineage 3D spheroids as a model of liver steatosis and fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), (2019).</li>
<li>Kozyra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+3D+spheroids+as+a+model+for+steatosis+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14297(2018).</li>
<li>Khawar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+mixed-cell+spheroids+mimic+stroma-mediated+chemoresistance+and+invasive+migration+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Three dimensional mixed-cell spheroids mimic stroma-mediated chemoresistance and invasive migration in hepatocellular carcinoma.</a> Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).</li>
<li>Feaver, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+human+liver+system+for+interrogating+non-alcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigations+Insight%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro human liver system for interrogating non-alcoholic steatohepatitis.</a> Journal of Clinical Investigations Insight. 1 (20), 90954(2016).</li>
<li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+multidrug+resistance+transporter+P-glycoprotein+in+multicellular+tumor+spheroids+by+hypoxia-inducible+factor+%28HIF-1%29+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) and reactive oxygen species.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 17 (3), 503-505 (2003).</li>
<li>Chen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+candidate+metastasis-associated+genes+in+three-dimensional+HCC+spheroids+with+different+metastasis+potential%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Screening candidate metastasis-associated genes in three-dimensional HCC spheroids with different metastasis potential.</a> International Journal of Clinical Experimental Pathology. 7 (5), 2527-2535 (2014).</li>
<li>Venkataraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+self-association+of+basic+fibroblast+growth+factor+is+stabilized+by+heparin+during+receptor+dimerization+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preferential self-association of basic fibroblast growth factor is stabilized by heparin during receptor dimerization and activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (2), 845-850 (1996).</li>
<li>Bissell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+structure%2C+nuclear+organization%2C+and+gene+expression+in+normal+and+malignant+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast.</a> Cancer Research. 59, 1757-1763 (1999).</li>
<li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+of+melanoma+cells+profoundly+affects+gene+expression+profile%3A+a+high+density+oligonucleotide+array+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study.</a> Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).</li>
<li>Delcommenne, M., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+integrin+expression+by+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Control of integrin expression by extracellular matrix.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (45), 26794-26801 (1995).</li>
<li>Meshel, A. S., Wei, Q., Adelstein, R. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+mechanism+of+three-dimensional+collagen+fibre+transport+by+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic mechanism of three-dimensional collagen fibre transport by fibroblasts.</a> Nature Cell Biology. 7 (2), 157-164 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345 (6193), 216-220 (2014).</li>
<li>Weiswald, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+characterised+ex+vivo+colospheres+as+a+three-dimensional+colon+cancer+cell+model+of+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Newly characterised ex vivo colospheres as a three-dimensional colon cancer cell model of tumour aggressiveness.</a> British Journal of Cancer. 101 (3), 473-482 (2009).</li>
<li>Kondo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retaining+cell-cell+contact+enables+preparation+and+culture+of+spheroids+composed+of+pure+primary+cancer+cells+from+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6235-6240 (2011).</li>
<li>Rajcevic, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+derived+organotypic+spheroids+maintain+essential+tissue+characteristics+but+adapt+their+metabolism+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sciences%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer derived organotypic spheroids maintain essential tissue characteristics but adapt their metabolism in culture.</a> Proteome Sciences. 12, 39(2014).</li>
<li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+drug+screen%3A+considerations+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).</li>
<li>Friedrich, J., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+anti-tumor+therapy+in+3-D%3A+spheroids--old+hat+or+new+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental anti-tumor therapy in 3-D: spheroids--old hat or new challenge.</a> International Journal of Radiation Biology. 83 (11-12), 849-871 (2007).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnology & Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Esparza-Baquer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-2+defends+the+liver+against+hepatocellular+carcinoma+through+multifactorial+protective+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">TREM-2 defends the liver against hepatocellular carcinoma through multifactorial protective mechanisms.</a> Gut. 70 (7), 1345-1361 (2021).</li>
<li>Dangles-Marie, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tumor+cell+defect+in+activating+autologous+CTLs+is+associated+with+inefficient+antigen+presentation+correlated+with+heat+shock+protein-70+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tumor cell defect in activating autologous CTLs is associated with inefficient antigen presentation correlated with heat shock protein-70 down-regulation.</a> Cancer Research. 63 (13), 3682-3687 (2003).</li>
<li>Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hanging-drop+multicellular+spheroids+as+a+model+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumour angiogenesis.</a> Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).</li>
<li>Mayer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+gastric+cancer+spheroids+recapitulate+growth+pattern+and+differentiation+phenotype+of+human+gastric+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Multicellular gastric cancer spheroids recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric carcinomas.</a> Gastroenterology. 121 (4), 839-852 (2001).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stellate+cell+lines%2C+LX-1+and+LX-2%3A+new+tools+for+analysis+of+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis.</a> Gut. 54 (1), 142-151 (2005).</li>
</ol>

FO jest dyrektorem i udziałowcem Fibrofind Limited.

Kontekst, w którym rosną eksperymentalne linie komórkowe, wpływa na ich profil ekspresji genów, analizę szlaku i kryteria funkcjonalne. Na przykład w komórkach raka piersi koordynacja między różnymi szlakami onkogennymi jest zachowana tylko wtedy, gdy komórki rakowe są hodowane w konformacji3D 27. Rozregulowane geny w sferoidach czerniaka 3D i raka piersi, ale nie w komórkach jednowarstwowych, są bardziej istotne dla ludzkiego guza in vivo 28,29. Na przykład poziomy integryny β1 w komórkach nabłonka sutka i odpowiednikach nowotworowych były niższe niż poziomy wyhodowane w formacie2D 29. Co więcej, fibroblasty w strukturach 3D mają tendencję do wyraźnej migracji pod względem morfologii i szybkości w porównaniu z tymi hodowanymi na plastiku30. Ponadto sztywność mechaniczna substratu wzrostu aktywuje specyficzne szlaki, które sprzyjają złośliwej transformacji normalnych komórek nabłonka poprzez deregulację kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) / Rho w komórkach nabłonkowych31. Czynniki te sprzyjają przejściu od konwencjonalnej hodowli 2D do modeli sferoidalnych 3D, ponieważ kultury 3D są bardziej zgodne z chorobami ludzkimi.
W obecnym badaniu wykorzystano konwencjonalne narzędzia i materiały laboratoryjne do stworzenia trójwymiarowego modelu sferoidalnego guza. Powstałe sferoidy reagowały na sygnały proliferacji pochodzące z fibroblastów, o czym świadczy ich znacznie zwiększony wzrost. Model ten należy do kategorii sferoid guzów wielokomórkowych. Istnieją trzy inne kategorie sferoid guza 3D, w tym guzy32, sfery nowotworowe pochodzenia tkankowego 33,34 i organotypowe sferoidy wielokomórkowe35. W wielokomórkowych sferoidach nowotworowych komórki nowotworowe są zawieszone w warunkach niskiej adhezji, aby umożliwić im agregację w kule bez dotykania dna naczynia hodowlanego36. Zastosowano kilka podejść, aby zapewnić tę niezależność od zakotwienia, począwszy od systemów obrotowych, technik nakładania płynów i niepowlekanych płyt w kształcie litery U o bardzo niskim mocowaniu37. W HCC większość kultur sferoidalnych in vitro wykorzystuje 24- lub 96-dołkowe płytki o bardzo niskim przyłączeniu do tworzenia zaokrąglonych sferoid 18,19,20,21,22. Technika ta nie jest jednak opłacalna i nie wyklucza przypadkowego kontaktu komórki z plastikiem. Inne systemy wykorzystują trans-studzienki23 lub plastry wątroby12 do produkcji mikrotkanek wątroby. Wykorzystanie tkanek ludzkich w pracach translacyjnych jest złotym standardem, ale nie zawsze dostępnym lub dostępnym dla wielu grup badawczych. Obecne podejście opierało się na teorii wiszących kropel. Zawiesinę komórkową dodaje się tak, że sferoidy guza są formowane w dostępnym interfejsie ciecz-powietrze, tworząc pojedyncze zaokrąglone kule38. Zaletami stosowania tej techniki są brak jakiegokolwiek kontaktu komórka-plastik oraz łatwość badania przesłuchów autokrynnych i parakrynnych między komórkami nowotworowymi a komórkami fibroblastów. Model ten został następnie zweryfikowany w innym badaniu rozszyfrowującym znaczenie niemiąższowego TREM2 w ochronie wątroby przed rozwojemHCC 39. Praca ta wykazała, że objętość zarówno sferoid Hep3B, jak i PLC/PRF5 była wyższa w kontrolnej LX2 CM w porównaniu z nadekspresją TREM2 LX2 CM w sposób zależny od Wnt39.
W obecnym badaniu fibroblasty zmieszano z komórkami nowotworowymi przed utworzeniem sferoidów, aby zbadać proliferacyjny wpływ tej kokultury. Inni dodali fibroblasty, komórki śródbłonka i komórki odpornościowe z zawiesiną komórek nowotworowych po utworzeniu sferoidy guza w celu zbadania migracji komórek zrębu do guza 40,41. Obecny heterotypowy model sferoidalny wykazywał podobny wzorzec wzrostu do wcześniej opisanych modeli i oryginalnego guza in vivo; Sferoidy wykazują wykładniczy wzrost, po którym następuje opóźniona faza wzrostu, najprawdopodobniej z powodu wyczerpania składników odżywczych i powiększenia nekrotycznego rdzenia42. Zamiast dodawać czynniki wzrostu i mitogeny, aby pomóc w tworzeniu sferoidów, w badaniu zastosowano bardziej fizjologiczne podejście, polegające na tym, że te czynniki wzrostu pochodzą z bezpośredniego kontaktu z fibroblastami lub ich sekretomem w fibroblastach CM. Należy wspomnieć, że komórki LX2 mogą być dalej aktywowane przez leczenie TGFβ1 lub PDGF43. Komórki LX2 traktowano 10 ng / ml TGFβ1 przez 48 godzin przed usunięciem pożywki do różnych warunków eksperymentalnych. Komórki LX2 przemyto trzykrotnie PBS (aby wykluczyć bezpośredni efekt TGFβ1), a następnie dodano świeże podłoże na kolejne 24 godziny przed pobraniem CM. CM zebrany z LX2 stymulowanego TGFβ1 indukował wzrost sferoid Hep3B w szybszym tempie niż CM z kontrolnego LX2 (dane nie pokazane). Ten elastyczny system może nadawać się do kohodowli różnych komórek nowotworowych plus/minus fibroblastów, a także linii pochodzących od pacjentów. Może również zaoferować średnioprzepustowy test przesiewowy dla leków, który można szybko zaadoptować i wprowadzić do procesu odkrywania leków translacyjnych w celu informowania o dawkowaniu w badaniach in vivo.
Ograniczeniem obecnego badania jest wykorzystanie unieśmiertelnionych linii komórkowych w tworzeniu sferoidów, a nie świeżo wyizolowanych komórek nowotworowych HCC i fibroblastów związanych z rakiem. Innym ograniczeniem jest porównanie wzrostu homotypowej sferoidy Hep3B między CM z LX2 a świeżymi pożywkami, a nie CM z innych linii komórkowych niebędących fibroblastami. To ostatnie ograniczenie można rozwiązać poprzez genetyczną modyfikację interesującego genu w fibroblastach, a następnie zastosowanie CM z typu dzikiego w porównaniu z genetycznie modyfikowanymi fibroblastami do homotypowych sferoidów.

Globalna częstość występowania i śmiertelność z powodu raka wątroby nadal rośnie, pomimo postępów w leczeniu chorób wątroby i większości innych rodzajów raka. W 2018 roku rak wątroby wyprzedził raka jelita grubego i żołądka, stając się drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem na świecie1. W 2020 roku odnotowano ponad 9 000 000 nowych diagnoz, co stanowi 4,7% wszystkich przypadków raka na całym świecie1. Jest to szczególnie rozczarowujące, biorąc pod uwagę, że istotne czynniki ryzyka rozwoju HCC, najczęstszej postaci raka wątroby, są dobrze scharakteryzowane2. Marskość wątroby jest najczęstszym czynnikiem ryzyka rozwoju HCC, przy czym 80% przypadków rozwija się na tle ustalonej marskości wątroby2. Przewlekłe choroby wątroby, które prowadzą do marskości wątroby, a w konsekwencji HCC, obejmują wirus zapalenia wątroby typu B (HBV), wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), alkoholową chorobę wątroby (ARLD), niealkoholowe stłuszczeniowe choroby wątroby (NAFLD) - te ostatnie przypisywane otyłości i cukrzycy typu 2 (T2DM)2,3. Obecne protokoły postępowania w HCC są zależne od stadium zaawansowania i ograniczone dla osób z zaawansowanym rakiem, które najczęściej mają słabe wyniki4. Nastąpił znaczny postęp w stosowaniu inhibitorów kinaz, a ostatnio leczenia immunoonkologicznego, chociaż realistycznie rzecz biorąc, przynosi korzyści tylko mniejszości pacjentów z zaawansowanym rakiem wątroby5. Co więcej, istnieje obawa, że HCC powstające u pacjentów z NAFLD - najszybciej rozwijającą się przyczyną leżącą u podstaw, odpowiadającą za ponad 50% nowo zdiagnozowanych przypadków HCC w krajach zachodnich, mogą być bardziej odporne na terapię inhibitorem punktów kontrolnych Programmed death 1 (PD1) 6.
Dokonano ogromnych inwestycji w badania kliniczne dla pacjentów z HCC, w tym znaczące ulepszenia w badaniach klinicznych i ich punktach końcowych7. Po dekadzie niepowodzeń inwestycje te zaczęły zmieniać możliwości dla pacjentów. Jednak rzeczywistość jest taka, że ogólny odsetek pacjentów, u których uzyskano odpowiedź na leczenie, pozostaje stosunkowo niski, a pacjenci rekrutowani do badań często słabo reprezentują tych, którymi opiekują się kliniki. Niebezpieczeństwo polega na tym, że zaliczki są kosztowne i przynoszą korzyści nielicznym, a nie wielu. W miarę pojawiania się coraz większej liczby potencjalnych terapii do jednorazowego użytku lub skojarzonej, niezbędne jest posiadanie modeli przedklinicznych, które lepiej przewidują odpowiedzi in vivo. Prawdopodobnie będą to modele, które uwzględniają dodatkowe czynniki przyczyniające się do zmienności obserwowanej w odpowiedziach pacjentów, które lepiej odzwierciedlają ludzką heterogeniczność HCC i patologiczną złożoność8. Systemy, które odtwarzają stany patofizjologiczne HCC in vivo, są potrzebne, aby pomóc zrozumieć biologię ewolucji, wzrostu i progresji guza. Istniejące eksperymentalne modele przewlekłych chorób wątroby i HCC zwykle dzielą się na trzy główne kategorie: modele zwierzęce in vivo (przejrzane w9), hodowle in vitro10 i ex vivo11,12 modele. Podejścia oparte na zwierzętach są szeroko stosowane do badania przewlekłych chorób wątroby, w tym HCC; Jednak zmienność genetyczna, wysokie koszty eksploatacji i różne układy odpornościowe między gatunkami należą do głównych ograniczeń w stosowaniu takich modeli9. Podczas gdy niektóre modele ex vivo stanowią doskonałe narzędzie do skupienia się na tkankach ludzkich w porównaniu z innymi modelami linii komórkowych in vitro, dostępność tkanek i ograniczony czas trwania eksperymentu utrudniają ich wykorzystanie na dużą skalę.
Z drugiej strony, modele linii komórkowych in vitro pozostają dobrym wyborem dla naukowców pracujących z ograniczonymi zasobami, z mniejszą potrzebą stałego dopływu świeżych tkanek ludzkich10. Modele te stanowią również narzędzie, które można wykorzystać jako pierwsze badanie przesiewowe, aby pomóc w docelowej walidacji wyboru leku przed przejściem do bardziej złożonych modeli in vivo. Niedawna modyfikacja tradycyjnych kultur jednowarstwowych 2D w hodowle 3D poprawiła skuteczność tych modeli in vitro13,14.
Modele in vitro 3D mogą podsumować krytyczne cechy obserwowane w normalnych i patologicznych stanach człowieka. W warunkach fizjologicznych transdukcja sygnału jest inicjowana poprzez przesłuch komórkowy i interakcję z innymi cząsteczkami tkanki łącznej, a mianowicie białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), tworząc sieć interakcji 3D15,16. Guz ewoluuje w formie sferycznej 3D podczas złośliwej transformacji, dla której tlen i składniki odżywcze są łatwo obfite w interfazę bez guza / guza. W tym samym czasie w rdzeniu guza dominują warunki niedotlenienia. Ta niejednorodność w dostępności składników odżywczych powoduje aktywację przestrzennie odrębnych szlaków sygnałowych i metabolicznych, które regulują nowotworzenie Warunki te są słabo podsumowane w konwencjonalnych kulturach jednowarstwowych 2D14, w których komórki rosną na sztywnym plastiku hodowlanym w fizjologicznie nieistotny sposób. Komórki rakowe komunikują się również z innymi komórkami niemiąższowymi, które są głównym źródłem ECM, sygnalizacji wzrostu i inwazji w mikrośrodowisku guza. W przeciwieństwie do kultur 2D, modele 3D in vitro mogą stanowić bardziej odpowiednią platformę do badania tej interakcji guz-zręb17.
modele 3D są szeroko stosowane w dziedzinie HCC i różnią się sposobem tworzenia mikrotkanek18,19,20,21,22,23. Większość z tych modeli używała płyt o bardzo niskim wiązaniu18,19,20,21,22 lub trans-wells23 w procesie tworzenia sferoidów. Opisany protokół przedstawia technikę wiszących kropel jako alternatywny, wolny od plastiku i opłacalny model sferoidalny guza 3D in vitro. Może to ułatwić ocenę parakrynnej i autokrynnej roli fibroblastów w proliferacji komórek nowotworowych w formacie 3D.

<table><tbody><tr><td>1x probówki Trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59429C</td><td></td></tr><tr><td>2 ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender.com</td><td>Online</td><td></td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym klasy II BioMAT2</td><td>Medair Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Biosera</td><td>M-D1107</td><td></td></tr><tr><td>Excel sofware</td><td>Microsoft office 365</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad prism sofware</td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td>GraphPad</tr><tr><td>Dezaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>life tech</td><td>105000064</td><td></td></tr><tr><td>Image J oprogramowanie</td><td>Fidżi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (100 jednostek/ml penicyliny i 100 &mu; g/ml streptomycyny)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100ml</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 90 mm, potrójnie wentylowana</td><td>Greiner</td><td>633175</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Virkon&trade; Środek dezynfekujący o szerokim spektrum działania, wiadro 5 kg</td><td>Rely+On&trade;</td><td>SCI-129999</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Ziess</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Agresywność i brak dobrze tolerowanych i szeroko skutecznych metod leczenia zaawansowanego raka wątrobowokomórkowego (HCC), dominującej formy raka wątroby, racjonalizują jego rangę jako drugiej najczęstszej przyczyny zgonów związanych z rakiem. Modele przedkliniczne muszą zostać dostosowane w celu podsumowania warunków panujących u ludzi, aby wybrać najlepszych kandydatów terapeutycznych do rozwoju klinicznego i wspomóc dostarczanie medycyny spersonalizowanej. Trójwymiarowe (3D) komórkowe modele sferoidalne są obiecujące jako wyłaniająca się alternatywa in vitro dla dwuwymiarowych (2D) kultur jednowarstwowych. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowy model sferoidalny guza, który wykorzystuje zdolność pojedynczych komórek do agregacji, gdy jest utrzymywany w wiszących kropelkach i jest bardziej reprezentatywny dla środowiska in vivo niż standardowe monowarstwy. Co więcej, sferoidy 3D mogą być wytwarzane przez łączenie komórek homotypowych lub heterotypowych, co lepiej odzwierciedla heterogeniczność komórkową in vivo, potencjalnie umożliwiając badanie interakcji środowiskowych, które mogą wpływać na progresję i reakcje na leczenie. Obecne badania zoptymalizowały gęstość komórek w celu utworzenia homotypowych i heterotypowych sferoid guza 3D poprzez unieruchomienie zawiesin komórkowych na pokrywkach standardowych 10 cm3 szalek Petriego. Przeprowadzono analizę podłużną w celu wygenerowania krzywych wzrostu dla sferoidów homotypowego i heterotypowego guza/fibroblastów. Na koniec zbadano proliferacyjny wpływ fibroblastów (komórek COS7) i miofibroblastów wątroby (LX2) na sferoidy guza homotypowego (Hep3B). Gęstość wysiewu wynosząca 3,000 komórek (w pożywce 20 μl) z powodzeniem dała heterotypowe sferoidy Huh7 / COS7, które wykazywały stały wzrost wielkości do 8 dnia hodowli, po którym nastąpiło opóźnienie wzrostu. Odkrycie to zostało potwierdzone przy użyciu homotypowych sferoidów Hep3B hodowanych w pożywce kondycjonowanej LX2 (ludzka linia komórek gwiaździstych wątroby) (CM). LX2 CM wyzwalał proliferację sferoid Hep3B w porównaniu ze sferoidami kontrolnymi guza. Podsumowując, protokół ten wykazał, że sferoidy guza 3D mogą być używane jako proste, ekonomiczne i preprzesiewowe narzędzie in vitro do bardziej kompleksowego badania interakcji guz-zręb.

Komórki hodowane w wielowarstwowym formacie 3D dokładniej odzwierciedlają złożoność mikrośrodowiska guza niż konwencjonalne hodowle 2D24,25. Wcześniej w wielu badaniach media hodowlane sferoidów uzupełniano różnymi mitogenami i czynnikami wzrostu26, aby zainicjować tworzenie sferoidów. W niniejszym badaniu dodatek fibroblastów lub ich CM dostarcza niezbędnych mitogenów i czynników wzrostu w celu przyspieszenia wzrostu sferoidów.
Rysunek 1 przedstawia dane z badania pilotażowego, w którym ludzkie komórki HCC Huh7 wysiano z malejącą gęstością, zaczynając od 12 000 aż do 125 komórek w 20 µL świeżego medium przez 3 dni. Gęstość wysiewu 12 000 komórek doprowadziła do powstania sferoidów o asymetrycznym kształcie, który nie uległ poprawie nawet po zmniejszeniu gęstości wysiewu komórek o połowę. Jednakże sferoidy utworzone z 3000 komórek wydawały się bardziej okrągłe (Rysunek 1, górny rząd). Dalsza redukcja stężenia komórek nie pozwoliła ani na sformowanie pojedynczych sfer (sfery o gęstości 125, 250 i 500 komórek), ani nie zapewniła regularnego, sferycznego wyglądu (sferoidy o gęstości 1000 i 1500 komórek). Warto wspomnieć, że przy gęstości 500 komórek nowotworowych powstało wiele małych sfer; jednak przy powiększeniu 50x uchwycono tylko jeden mały sferoid (Rysunek 1, górny rząd). Ten sam zoptymalizowany protokół zastosowano do linii komórkowej fibroblastów nerkowych naczelnych COS7 (Rysunek 1, środkowy rząd). Zawieszenie 125, 250 i 500 fibroblastów COS7 w 20 µL wiszących kropli zaowocowało powstaniem jednego okrągłego sferoidu z wieloma mniejszymi sferoidami, podczas gdy wyższe gęstości komórek (1000, 1500 i 3000) tworzyły pojedyncze, półokrągłe sferoidy. Podobnie jak w przypadku sferoidów nowotworowych Huh7, większe zawiesiny komórkowe (6 000 i 12 000 komórek/sferę) prowadziły do tworzenia nieregularnych agregatów komórkowych, w związku z czym wyższe stężenia komórek odrzucono (Rysunek 1, środkowy rząd). Niskie gęstości heterotypowych zawiesin komórkowych Huh7/COS7 (125, 250 i 500 komórek/sferę) generowały pojedynczy sferoid z wieloma pływającymi lub częściowo przylegającymi sferoidami (Rysunek 1, dolny rząd). Sferoidy heterotypowe złożone z 1000 i 1500 komórek były półokrągłe, podczas gdy gęstość wysiewu 3000 komórek (1500 na typ komórki) dała okrągły sferoid 3D. Jak wspomniano wcześniej, wyższe gęstości komórek prowadziły do tworzenia agregatów, a nie wyraźnie zdefiniowanych sferoidów (Rysunek 1, dolny rząd). Podsumowując, sferoidy o gęstości 3000 komórek były okrągłe, podobnie jak ludzkie guzy HCC, i zostały przyjęte do dalszych eksperymentów. Hodowanie zawiesin komórkowych w formie wiszących kropli przez 3 dni było wystarczające do promowania formowania sferoidów.
Po zoptymalizowaniu najlepszego stężenia komórek i punktu czasowego dla formowania sferoidów w bieżącym kontekście, podłużnie oceniono wpływ proliferacyjny współhodowli linii komórkowych guza i fibroblastów. Rysunki 2 oraz Rysunek 3 przedstawiają heterotypowe sferoidy Huh7/COS7 (łącznie 3000 komórek na sferoid) monitorowane od dnia 3. do dnia 10. Sferoidy homotypowe Huh7 i COS7 (po 1500 komórek każda) posłużyły jako kontrole. Od 4. dnia sferoidy heterotypowe rosły, przyjmując idealny, okrągły kształt w porównaniu do sferoidów homotypowych (Rysunek 2). Początkowa objętość sferoidu heterotypowego była większa niż objętość każdego ze sferoidów homotypowych. Przyrost sferoidów obliczono jako zmianę ich objętości w stosunku do objętości początkowej w dniu formowania sferoidów, aby uniknąć normalnych różnic w objętości sferoidów (dzień 3, Rysunek 3). Sferoidy heterotypowe wykazały początkowo fazę szybkiego wzrostu od 4. do 7. dnia, po której nastąpiła wolniejsza faza wzrostu w 8. dniu (Rysunki 2, górny rząd, oraz Rysunek 3). Objętość sferoidów zmniejszyła się w 9. i 10. dniu, co prawdopodobnie odzwierciedla wyczerpanie składników odżywczych, powstanie niedotlenionego rdzenia lub śmierć komórek.
W przeciwieństwie do nich, homotypowe sferoidy Huh7 i COS7 rosły w znacznie wolniejszym tempie (Rysunek 2, środkowy i dolny rządek; Rysunek 3). Sferoidy homotypowe wykazywały relatywnie statyczną krzywą wzrostu aż do piątego dnia hodowli (dwóch dni po utworzeniu sferoidów). Od 6. dnia sferoidy homotypowe zaczęły wykazywać stopniowy wzrost krzywej wzrostu, choć w tempie znacznie niższym niż w przypadku sferoidów heterotypowych (Rysunek 3). Podsumowując, heterotypowe sferoidy nowotwór/fibroblast rosną w szybszym tempie niż sferoidy homotypowe, co sugeruje, że bezpośredni kontakt komórek nowotworowych i fibroblastów zwiększa rozmiar sferoidów nowotworowych.
Na koniec, aby zweryfikować powyższe ustalenia i zbadać wpływ parakrynny komórek mezenchymalnych na proliferację sferoidów HCC w kontekście wątrobowym, 3-dniowe homotypowe sferoidy HCC Hep3B hodowano w zwykłej świeżej pożywce lub w CM z hepatycznych komórek gwiaździstych LX2 (Rysunek 4 i Rysunek 5) przez kolejne 4 dni. Z pierwszej obserwacji wynikało, że 3000 komórek Hep3B utworzyło idealnie okrągłe sferoidy po 3 dniach (Rysunek 4). Sferoidy Hep3B wykazywały ciągłą proliferację w świeżej pożywce od 3. do 7. dnia (Rysunek 4, górny rząd). Tempo wzrostu wzrosło, gdy sferoidy Hep3B utrzymywano w CM LX2 (Rysunek 4, dolny rząd). Ta zależna od pożywki zmiana w tempie wzrostu sferoidów Hep3B wykazywała istotność statystyczną od 4. dnia aż do końca eksperymentu (Rysunek 5), co sugeruje indukowaną przez fibroblasty proliferację sferoidów nowotworowych.
Podsumowując, w niniejszym badaniu pomyślnie zmodyfikowano istniejące hodowle sferoidów 3D, aby wykorzystać wzajemne oddziaływania między komórkami nowotworu HCC a różnymi liniami komórkowymi fibroblastów oraz zbadać znaczenie proliferacyjne tej bezpośredniej i pośredniej interakcji komórkowej (Rycina 6). Dalsza charakterystyka utworzonych sferoidów jest niezbędna, aby usprawnić sposób, w jaki komórki nowotworowe oddziałują z otaczającym je mikrośrodowiskiem.
<img alt="Obrazy mikroskopowe zmienności gęstości komórek w sferoidach Huh7, Cos7 oraz Huh7/Cos7." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Optymalizacja optymalnej gęstości komórek dla formowania sferoidów. Kolumny reprezentują różne gęstości wysiewu komórek, a wiersze reprezentują sferoidy utworzone z komórek Huh7 (górny wiersz), komórek COS7 (środkowy wiersz) oraz heterotypowych komórek Huh7/COS7 (dolny wiersz). Obrazy przedstawiają sferoidy utworzone po zawieszeniu 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 i 12000 komórek (od lewej do prawej) w 20 µL medium przez 3 dni. Badanie pilotażowe obejmowało dwa sferoidy na warunek, a obrazy wykonano przy powiększeniu 50x, pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost sferoidów Huh7/COS7 w ciągu 10 dni, obraz mikroskopowy, porównanie rozwoju sferoidów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wzrost sferoidów heterotypowych w porównaniu do homotypowych. Kolumny reprezentują dzień, w którym wykonano zdjęcia sferoidów, a wiersze przedstawiają reprezentatywne obrazy sferoidów utworzonych z komórek Huh7 (górny wiersz), komórek COS7 (środkowy wiersz) oraz komórek Huh7/COS7 (dolny wiersz). Obrazy przedstawiają sferoidy utworzone po zawieszeniu 3000 komórek dla każdego wariantu (homotypowe Huh7, COS7 lub heterotypowe Huh7/COS7) w różnych punktach czasowych, od lewej do prawej. Eksperyment obejmował 10 sferoidów na wariant, a zdjęcia wykonano przy powiększeniu 50x, pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres zmiany objętości sferoidów; sferoidy Huh7, Cos7, heterotypowe; badanie 10-dniowe, istotność statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza podłużna wzrostu sferoidów heterotypowych w porównaniu do homotypowych. Wykres przedstawia krzywą wzrostu heterotypowych sferoidów Huh7/COS7 w porównaniu do homotypowych sferoidów Huh7 i COS7. Dane przedstawiono jako średnia ± s.e.m; n = 10 niezależnych sferoidów. ** p &lt; 0.01; ****p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie wzrostu sferoidów Hep3B, hodowla w pożywce standardowej vs. pożywce LX2, w ciągu 7 dni; analiza obrazów mikroskopowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wzrost homotypowych sferoidów Hep3B w pożywce LX2 CM. Kolumny reprezentują dzień, w którym wykonano zdjęcia sferoidów, a wiersze przedstawiają reprezentatywne obrazy sferoidów Hep3B hodowanych w świeżej pożywce DMEM (górny wiersz) lub w pożywce LX2 CM (dolny wiersz). W eksperymencie zastosowano siedem sferoidów na każdą warunek (świeża pożywka lub LX2 CM), a zdjęcia wykonano przy powiększeniu 50x, pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost sferoidów, porównawczy wykres liniowy; świeża pożywka hodowlana vs. LX2 CM w ciągu 3–7 dni, zmiana objętości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza podłużna wzrostu homotypowych sferoidów Hep3B. Wykres przedstawia krzywą wzrostu sferoidów Hep3B w świeżej pożywce DMEM lub w LX2 CM. Dane przedstawiono jako średnia ± s.e.m; n = 7 niezależnych sferoidów. ****p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tworzenie sferoidów nowotworowych, konfiguracja mikroskopowa, analiza komórek, wykres zmiany objętości sferoidów w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Schematyczne przedstawienie procesu tworzenia sferoidów. Zawiesinę komórek pipetuje się na wewnętrzną stronę pokrywy szalki Petriego o objętości 10 cm3. Pokrywę odwraca się i pozostawia na 3 dni, aby umożliwić tworzenie sferoidów homotypowych lub heterotypowych. Zdjęcia sferoidów wykonuje się przy 50-krotnym powiększeniu. Rysunek został stworzony przy użyciu internetowego narzędzia do ilustracji naukowej (patrz Tabela materiałów). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Brakuje kompleksowych modeli in vitro, które wiernie odwzorowują daną chorobę ludzką. Obecne badanie przedstawia trójwymiarowe (3D) tworzenie i hodowlę sferoidów guza, wiarygodne narzędzie in vitro do badania interakcji guz-zręb w ludzkim raku wątrobowokomórkowym.

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Sferoidy nowotworowe 3D zastąpiły konwencjonalną technikę jednowarstwową 2D jako złoty standard w badaniach nad rakiem in vitro. Modele te pozwalają na wspólną hodowlę wielu typów komórek, które odzwierciedlają niejednorodność mikrośrodowiska guza i pozwalają na wykorzystanie interakcji przestrzennych. Zaletą stosowania metody wiszących kropel do generowania sferoid 3D jest brak interakcji komórka-plastik oraz łatwość badania interakcji między komórkami nowotworowymi a komórkami nienowotworowymi.Technika ta zapewnia również powtarzalny i opłacalny sposób modelowania interaction. 3D zrębu nowotworu, ponieważ nowotwory są cennymi modelami przedklinicznymi i są często wykorzystywane jako narzędzie do badań przesiewowych leków. Metoda ta może być stosowana do badania farmakologicznego wpływu wielu związków na wzrost guza i otaczające go mikrośrodowisko.Proces tworzenia sferoidów jest przyjazny dla użytkownika i wymaga konwencjonalnego sprzętu laboratoryjnego do hodowli komórkowych. Sferoidy można obrazować za pomocą dowolnego stacjonarnego mikroskopu światła odwróconego, a analizę wielkości i kształtu sferoidy można przeprowadzić za pomocą powszechnie dostępnego oprogramowania do analizy obrazu online. Na początek usuń linie komórek nowotworowych Huh7 i Hep3B HCC oraz linie komórkowe fibroblastów COS-7 i LX2 z ich stojaka do przechowywania w ciekłym azocie i szybko je rozmroź.Po rozmrożeniu rozcieńczyć rozmrożone komórki dwoma mililitrami świeżej pożywki hodowlanej. Odwirować komórki. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze świeżej, ciepłej pożywki hodowlanej.Następnie zasiej komórki w kolbach do hodowli komórkowych T75 i inkubuj je w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż komórki osiągną 60 do 70 stopni konfluencji. W celu pobrania komórek należy odessać pożywkę hodowlaną i trzykrotnie przemyć komórki PBS. Następnie, aby oderwać przylegające komórki od dna kolb, dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanej trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po czterech minutach dezaktywuj trypsynę, dodając cztery mililitry kompletnej pożywki hodowlanej i zbierz zawiesinę komórek, a następnie odwiruj komórki i odrzuć supernatant przed ponownym zawieszeniem komórek w jednym mililitrze świeżej pożywki hodowlanej. Na koniec dodaj dodatkowe trzy mililitry świeżej pożywki hodowlanej. Aby policzyć komórki, delikatnie odwiruj zawiesinę komórek.Następnie za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego i delikatnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół cztery razy, aby zapewnić całkowite zabarwienie zewnętrznej powierzchni komórki barwnikiem. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na obszarze zliczania hemocytometrów. Następnie umieść końcówkę pipety zawierającą mieszaninę komórek obok krawędzi szkiełka nakrywkowego i delikatnie wyrzuć zawartość końcówki do szkiełka liczącego.Po odczekaniu kilku minut, aż gnojowica opadnie, zamocuj hemocytometr na stoliku mikroskopu i policz komórki nakładające się na górną lub prawą liniaturę, unikając tych, które zachodzą na dolną lub lewą liniaturę. Na koniec oblicz całkowitą liczbę komórek za pomocą tej formuły. Po zaaspirowaniu pożywki hodowlanej należy trzykrotnie przemyć komórki LX2 PBS.Odłącz komórki za pomocą trypsyny, jak pokazano wcześniej, i odwiruj je. Po policzeniu komórek, jak pokazano wcześniej, wysiewaj się od jednej razy 10 do szóstej komórki LX2 w naczyniach o pojemności 10 centymetrów sześciennych i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 48 godzinach zebrać pożywkę kondycjonowaną przez fibroblasty i odwirować, aby osadzać wszelkie pływające komórki.Filtr wysterylizuj kondycjonowane podłoże za pomocą filtra 0,22 mikrona dołączonego do 20-mililitrowej strzykawki. Następnie podzielić pożywkę na dwie mililitrowe probówki do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Dodaj 10 mililitrów sterylnego PBS na dno naczynia o pojemności 10 centymetrów sześciennych, aby zapewnić wilgotne warunki dla sferoid.Następnie zawieś 1 500 komórek HuH7 HCC z 1 500 komórkami fibroblastów COS-7 ssaków w wiszących kropelkach, aby utworzyć kule. Odwróć pokrywkę naczynia, aby pożywka, w tym zawiesina komórek, mogła zwisać nad wilgotnym środowiskiem. Po trzech dniach, aby zrobić zdjęcia sferoid, umieść czaszę na stoliku odwróconego mikroskopu i ustaw powiększenie na pięć razy.Następnie otwórz oprogramowanie mikroskopu na podłączonym komputerze i dostosuj jego ostrość, aby uzyskać wyraźny obraz każdej sferoidy. Następnie użyj narzędzia przyciągania w oprogramowaniu mikroskopu, aby uzyskać obrazy i zapisać uzyskane obrazy. Dodaj 10 mililitrów sterylnego PBS na dno naczynia o pojemności 10 centymetrów sześciennych.Następnie zawieś 3 000 komórek Hep3B HCC w wiszących kropelkach, aby uformować kule i odwróć pokrywkę naczynia, pozwalając kropelkom wisieć nad wilgotnym środowiskiem przez trzy dni. Następnie przenieś sferoidy Hep3B do 20 mikrolitrów świeżej pożywki z komórek LX2 w wiszących kropelkach. Następnie odwróć pokrywkę naczynia, na którym uformowane są sferoidy i przymocuj pokrywkę do stolika mikroskopu świetlnego.Dostosuj precyzyjną ostrość mikroskopu, aby każda sferoida była widoczna, jak pokazano wcześniej. Po naciśnięciu przycisku tłoka w celu ostrożnego opróżnienia mikropipety z powietrza, należy włożyć końcówkę pipety do kropli zawierającej sferoidę, która ma zostać przeniesiona. Zbliż się bardzo do sferoidy, nie dotykając jej końcówką.Następnie delikatnie zwolnij nacisk na przycisk tłoka, aby umożliwić zassanie sferoidy do końcówki mikropipety w dwóch mikrolitrach pożywki. Następnie przenieś sferoidę do nowej kropli wiszącej na nowej czaszy o pojemności 10 centymetrów sześciennych. Rób zdjęcia sferoid w pięciokrotnym powiększeniu za pomocą odwróconego mikroskopu od dnia transferu do siódmego dnia hodowli w pożywce kondycjonowanej LX2.Aby przeanalizować obrazy rosnących sferoid, otwórz każdy obraz sferoidy w oprogramowaniu do analizy obrazu i użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby obrysować każdą sferoidę. Następnie z rozwijanego przycisku analizy wybierz ustaw pomiar, a następnie obszar i naciśnij OK. Następnie ręcznie narysuj okrąg wokół każdej sferoidy, a gdy sfera zostanie zakreślona, naciśnij Control M, aby umożliwić programowi obliczenie obszaru sferoidy w pikselach. Następnie przekształć obszar sferoidy w objętość za pomocą tego wzoru.Na koniec oblicz zmianę objętości sferoidy w stosunku do jej objętości w pierwszym dniu przechwytywania obrazu. Podczas optymalizacji gęstości komórek pod kątem tworzenia sferoidów, wyższe gęstości wysiewu wynoszące 12 000 i 6 000 komórek dały sferoidy o asymetrycznym kształcie, podczas gdy gęstość zasiewu wynosząca 3 000 komórek dała idealnie zaokrągloną sferoidę 3D. W ten sposób 3 000 sferoid o gęstości komórek zostało zaadaptowanych do dalszych eksperymentów.Podłużna ocena wpływu proliferacyjnego z jednoczesnej hodowli linii komórkowych guza i fibroblastów wykazała, że od czwartego dnia heterotypowe sferoidy rosły w idealnym okrągłym kształcie w porównaniu ze sferoidami homotypowymi. Sferoidy heterotypowe początkowo wykazywały szybką fazę wzrostu rozpoczynającą się od czwartego dnia do siódmego dnia, po której następowała wolniejsza faza w ósmym dniu. Objętość sferoidy zmniejszyła się następnie w dziewiątym i dziesiątym dniu, co może odzwierciedlać wyczerpanie składników odżywczych lub niedotlenienie rdzenia i śmierć komórki.W przeciwieństwie do tego, homotypowe sferoidy wykazywały stosunkowo statyczną krzywą wzrostu do piątego dnia, po której następował stopniowy wzrost ich krzywych wzrostu od szóstego dnia. Wyższe tempo wzrostu sferoid heterotypowych sugeruje, że bezpośredni kontakt między guzem a fibroblastami zwiększa rozmiar sferoid guza. Kiedy trzydniowe homotypowe sferoidy Hep3B hodowano w świeżych pożywkach, komórki utworzyły idealnie zaokrąglone sferoidy po trzech dniach i wykazywały ciągłą proliferację aż do siódmego dnia.Tempo wzrostu wzrosło, gdy sferoidy były utrzymywane w pożywkach kondycjonowanych LX2, co sugeruje proliferację sferoidów guza napędzaną przez fibroblasty. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że sterylny BBS jest dodawany na dno naczyń, aby utrzymać odpowiedni wilgotny stan do tworzenia sferoid. Zachowaj również ostrożność podczas odwracania pokrywy, aby sferoidy i kropelki nie zostały zakłócone.Sferoidy guza 3D mogą być utrwalone lub zamrożone i przechowywane do przyszłych zastosowań, takich jak immunochemia lub immunofluorescencja, a także ekstrakcja RNA do analizy transkryptomicznej. Heterotypowe sferoidy ze wstępnie znakowanymi komórkami mogą być obrazowane i śledzone, aby zapewnić wgląd w interakcje komórka-komórka w mikrośrodowisku guza.

a-three-dimensional-spheroid-model-to-investigate-tumor-stromal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Źródło: Guyon, J., et al. Model sferoidalny 3D glejaka. J. Vis. Exp. (2020)Film demonstruje generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych. Sferoidy są tworzone z ludzkich komórek nowotworowych mózgu i osadzone w macierzy kolagenowej. Komórki nowotworowe na obrzeżach sferoidy przyjmują fenotyp inwazyjny, wydzielając proteazy w celu degradacji kolagenu i posuwając się do inwazji na otaczającą macierz.

Generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Powstaje nowy trójwymiarowy model sferoidalny oparty na heterotypowym oddziaływaniu komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu. Tutaj prezentujemy kokulturę komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną w celu wizualizacji powstawania sferoid. Ten trójwymiarowy model stanowi istotną platformę do badania interakcji między guzem a zrębem i testowania terapii przeciwnowotworowych.

Nowatorski, modulowany fibroblastami zrębu model sferoidalny 3D guza do badania interakcji guz-zręb i odkrywania leków

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Ten protokół przedstawia model biomimetyczny 3D z towarzyszącym zwłóknieniowym przedziałem zrębowym. Przygotowany z fizjologicznie odpowiednich hydrożeli w proporcjach naśladujących biofizyczne właściwości zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywnego mediatora interakcji komórkowych, wzrostu guza i przerzutów.

Model biomimetyczny raka wątroby do badania interakcji guz-zręb w środowisku 3D o przestrajalnych właściwościach biofizycznych

Wielokomórkowe sferoidy guza 3D zostały przygotowane z komórkami gruczolakoraka płuc, fibroblastami i monocytami, a następnie wyizolowano fibroblasty związane z rakiem (CAF) z tych sferoidów. Izolowane CAF porównano z normalnymi fibroblastami w celu oceny zdrowia mitochondriów poprzez badanie potencjału transbłonowego mitochondriów, reaktywnych form tlenu i aktywności enzymatycznej.

Ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj metodę wiszących kropelek do tworzenia trójwymiarowych sferoidów guzowych w badaniu interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym. Ta technika umożliwia współkulturę komórek Huh7 i Hep3B z fibroblastami COS-7 oraz LX2.

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

Przeglądaj więcej filmów