Name: Przygotowanie i wszczepienie elektrod dla elektrycznie zapalających myszy VGAT-Cre w celu wygenerowania modelu padaczki skroniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj metodę implantacji elektrod w myszy VGAT-Cre do generowania modelu padaczki skroniowej. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów epileptogenezy z minimalnym uszkodzeniem neuronów hipokampa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Johnowi Williamsonowi za pomocne dyskusje na temat tego protokołu. Prace te były wspierane przez NS112549 grantowy NIH/NINDS.

Wykorzystanie zwierząt przebiegało zgodnie z wytycznymi ARRIVE12 i zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Wirginijskiego.
1. Wykonywanie zestawów słuchawkowych z dwiema elektrodami bipolarnymi (Rysunek 1)
<img alt="Układ do elektroprzędzenia, różne konstrukcje igieł, proces wytwarzania włókien, schemat eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62929/62929fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Kluczowe etapy produkcji zestawu słuchawkowego EEG. (A) Wygląd elektrod na różnych etapach protokołu (numery po lewej odpowiadają poszczególnym krokom). (B) Zdjęcie gotowego produktu zamontowanego w wykonanym samodzielnie uchwycie pasującym do ramy stereotaktycznej. Należy zauważyć, że uchwyt kończy się zespołem kołnierza z pinem, który pasuje do podstawy zestawu słuchawkowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62929/62929fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol>
	<li>Odetnij 3,5 cm stalowego drutu powlekanego politetrafluoroetylenem.</li>
	<li>Zdejmij około 1 mm izolacji z obu końców drutu. Nie usuwaj zbyt dużego fragmentu izolacji.</li>
	<li>Umieść dwa piny w uchwycie imadłowym tak, aby dolna część pinu z dłuższym nacięciem była skierowana w dół.</li>
	<li>Nałóż topnik na odsłonięte końce drutu oraz na górne części pinów.</li>
	<li>ZCynuj odsłoniętą część drutu, używając minimalnej ilości lutu potrzebnej do pokrycia powierzchni.</li>
	<li>Nałóż minimalną ilość lutu na górną część pinu, uważając, aby nie wypłynął on po bokach.</li>
	<li>Gdy lut jest w stanie stopionym, wprowadź jeden z odsłoniętych końców drutu do pinu tak głęboko, jak to możliwe. 
	UWAGA: W pinie znajduje się boczny otwór, przez który drut może wypaść – nie dopuść do tego. Cała odsłonięta część drutu musi pozostać wewnątrz pinu.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.6–1.7 dla drugiego pinu, wykorzystując drugi odsłonięty koniec drutu.</li>
	<li>Pozostaw piny na 30 s w celu zastygnięcia, wyjmij je z uchwytu imadłowego, a następnie pociągnij za nie, aby upewnić się, że połączenie między drutem a pinami jest mocne i stabilne.</li>
	<li>Opłucz piny w zimnej wodzie, a następnie osusz.</li>
	<li>Zweryfikuj przewodność między pinem 1 a pinem 2 za pomocą omomierza.</li>
	<li>Zbliż piny na końcach drutu; trzymaj je równolegle i blisko siebie. Zaciśnij kleszczyki hemostatyczne na środku drutu. Następnie obracaj kleszczyki, tak aby drut skręcił się ciasno wokół własnej osi. Usuń kleszczyki.</li>
	<li>Zaciśnij pęsetę na skręconym drucie 2 mm poniżej pinów i zegnij drut pod kątem 90˚.</li>
	<li>Zegnij ten sam drut ponownie o 90˚ w stronę przeciwną nad pęsetą, tworząc drugie zgięcie w odległości 1 mm od pierwszego.</li>
	<li>Odetnij skręcony drut pod kątem 45° poniżej zgięcia na wysokości 3,5 mm, używając małych, ostrych nożyczek.</li>
	<li>Przygotuj dwie takie elektrody bipolarne (skręcone z dwoma pinami) dla każdego zestawu słuchawkowego (opcjonalnie, druga służy jako zapasowa w przypadku problemów elektrycznych z pierwszą).</li>
	<li>Przygotuj jedną pojedynczą elektrodę referencyjną, przecinając na pół drut z przylutowanymi pinami na obu końcach (kroki 1.1–1.17, Rysunek 1A).</li>
	<li>Odetnij drut na długości 7 mm.</li>
	<li>Zegnij koniec 1 mm poniżej końcówki.</li>
	<li>Następnie przytrzymaj pęsetą zegniętą końcówkę drutu o długości 1 mm i mocno owiń drut wokół pęsety, aby utworzyć małą pętlę (o średnicy 1 mm).</li>
	<li>Zegnij pętlę prostopadle do prostej części drutu, tak aby końcówka drutu ponownie była skierowana na zewnątrz.</li>
	<li>Zamontuj dwie elektrody bipolarne i pojedynczą elektrodę referencyjną w sześciopinowym postumencie w taki sposób, aby elektrody bipolarne znajdowały się obok siebie w odległości 6 mm, a elektroda referencyjna była umieszczona w środkowym zewnętrznym otworze (Rysunek 1B). 
	UWAGA: Metodą alternatywną jest implantacja elektrod, ich cementacja w miejscu docelowym, a następnie włożenie ich pinów do postumentu.</li>
</ol>
2. Stereotaktyczna implantacja elektrod
<ol>
	<li>Przed operacją należy wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne oraz zespół elektrod sześciopinowych w autoklawie. Podczas operacji należy zachować sterylne pole operacyjne i używać sterylnych rękawiczek chirurgicznych. Zaleca się stosowanie sterylnych obłożeń (np. Press n’ Seal) do przykrycia zwierzęcia z wyłączeniem obszaru operacyjnego.</li>
	<li>Do zabiegów chirurgicznych należy wykorzystać 8-tygodniowe myszy VGAT-Cre (dobrane pod względem wieku, obu płci), 4 tygodnie po odsadzeniu. Przed operacją należy zapisać masę ciała zwierzęcia, aby umożliwić pomiar utraty masy ciała po zabiegu.</li>
	<li>Należy użyć certyfikowanego parownika izofluranu lub niskoprzepływowego systemu anestezjologicznego wyposażonego w precyzyjną pompę strzykawkową, zintegrowany cyfrowy parownik oraz podkładkę grzewczą z systemem sprzężenia zwrotnego. 
	UWAGA: Systemy niskoprzepływowe umożliwiają podawanie znieczulenia z niskim natężeniem przepływu, proporcjonalnym do wielkości zwierzęcia, do komory indukcyjnej lub poprzez lejek nosowy zamocowany na ramie stereotaktycznej (70 ml/min, stężenie izofluranu w powietrzu wynosi 4% podczas indukcji i 2% podczas operacji). Zastosowanie mniejszej ilości środka znieczulającego jest korzystne nie tylko dla zwierzęcia podczas zabiegów operacyjnych, ale także zmniejsza ryzyko narażenia personelu laboratoryjnego na działanie izofluranu.</li>
	<li>Umieść znieczulone zwierzę na podgrzewanej podkładce rozgrzanej do 37 °C aby utrzymać ciepłotę ciała zwierzęcia podczas operacji. W przypadku zastosowania systemu regulacji temperatury z pętlą sprzężenia zwrotnego, lekko nasmarowaną sondę temperaturową należy wprowadzić do odbytnicy zwierzęcia w celu monitorowania temperatury w trakcie zabiegu.</li>
	<li>Zamocuj zwierzę w ramie stereotaktycznej, delikatnie wprowadzając pręty uszne do uszu, a przednie górne zęby do uchwytu siekaczy. Nałóż stożek na nos w celu zapewnienia prawidłowego podawania anestetyku. Upewnij się, że głowa jest wypoziomowana, wycentrowana i nie przesuwa się podczas lekkiego sprawdzania stabilności.</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 0,5 ml roztworu normosol w celu nawodnienia.</li>
	<li>Należy zastosować środek nawilżający do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki.</li>
	<li>Głębokość znieczulenia monitorowano, sprawdzając brak odruchu wycofania po uciśnięciu palca kończyny tylnej, a następnie w trakcie operacji obniżono stężenie izofluranu do 1,5%–2,0%.</li>
	<li>Usuń owłosienie w obrębie i wokół pola operacyjnego poprzez wyrywanie, użycie strzyżarki (golenie) lub kremu do depilacji, a następnie zdezynfekuj skórę, stosując trzy cykle naprzemiennego nakładania jodyny i etanolu, kończąc jodyną. Usuwanie owłosienia poza bezpośrednie miejsce operacji jest zalecane tylko wtedy, gdy istnieją możliwości utrzymania znieczulenia w tej lokalizacji. W razie potrzeby użyj nasączonych alkoholem patyczków bawełnianych, aby usunąć owłosienie z obszaru bezpośrednio otaczającego głowę. Podaj podskórnie 0,05 ml miejscowego środka przeciwbólowego – bupiwakainy (0,25%).</li>
	<li>Wykonaj nacięcie czaszki za pomocą skalpela, a następnie wytnij fragment skóry ostrymi nożyczkami chirurgicznymi, odsłaniając kości czaszki. Odsuwając skórę, za pomocą patyczka higienicznego oczyść czaszkę ze wszystkich mięśni i tkanek podskórnych zasłaniających widok. 
	UWAGA: Aby zatrzymać przypadkowe krwawienie, należy uciskać miejsce krwawienia sterylnym patyczkiem bawełnianym aż do momentu ustania krwawienia.</li>
	<li>Oczyścić czaszkę nadtlenkiem wodoru za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych, aby uczynić widocznymi szwy czaszkowe oraz punkty bregma i lambda.</li>
	<li>Dokładnie osusz czaszkę, a następnie za pomocą aplikatora nanieś jedną kroplę samotrawiącego adhesywu stomatologicznego. Wetrzeć go w czaszkę, odczekać 60 s i utwardzić za pomocą stomatologicznej lampy UV przez 40 s. Powierzchnia o połysku świadczy o tym, że adhesyw został skutecznie usieciowany z czaszką. 
	UWAGA: Ten etap jest kluczowy dla zapewnienia stabilnego przymocowania zestawu nagłownego.</li>
	<li>Używając wiertła o średnicy 0,031" (0,79 mm), należy wywiercić po obu stronach dwa otwory trepanacyjne do implantacji głębokich elektrod hipokampalnych (prędkość obrotowa ok. 5000 obr./min). Należy wywiercić jeden dodatkowy otwór trepanacyjny dla elektrody referencyjnej nad móżdżkiem, za punkt lambda. 
	UWAGA: Podczas wiercenia należy powoli opuszczać wiertło i unikać przedostania się do tkanki mózgowej.</li>
	<li>Współrzędne elektrod są następujące (od punktu bregma w mm): elektrody hipokampa: 3 mm tylnie, 3 mm bocznie i 3 mm głębokości; elektroda referencyjna w móżdżku: 6 mm tylnie, 0 mm bocznie i 0 mm głębokości (podtwardówkowo).</li>
	<li>Aby zwiększyć dokładność, należy użyć wiertarki zamontowanej w aparacie stereotaksycznym i wyzerować osie X/Y manipulatora stereotaksycznego w punkcie styku z bregmą – stanowi ona punkt odniesienia dla współrzędnych.</li>
	<li>Złóż zestaw słuchawkowy, wkładając wszystkie elektrody do sześciopinowego gniazda, upewniając się, że piny zostały całkowicie w nich osadzone. Zamontuj gniazdo w uchwycie elektrod na ramie stereotaktycznej (Rycina 1B).</li>
	<li>Ustaw elektrody nad odpowiadającymi im otworami trepanacyjnymi. Implantuj stereotaktycznie skręcone dwubiegunowe elektrody z drutu ze stali nierdzewnej w prawym i lewym hipokampie oraz elektrodę referencyjną w móżdżku, powoli opuszczając zestaw nagłówkowy i prowadząc elektrody do otworów trepanacyjnych.</li>
	<li>Gdy elektroda skręcana do hipokampa znajduje się bezpośrednio nad otworem, wyzeruj oś Z i powoli opuść ją do poziomu -3,0 mm.</li>
	<li>Przykryć powierzchnię czaszki i elektrody cementem stomatologicznym, wypełniając przestrzeń między powierzchnią czaszki a podstawą pedestalu. Brzegi skóry powinny przylegać do cementu stomatologicznego w taki sposób, aby żadna tkanka podskórna nie pozostała odsłonięta. Odczekać do wyschnięcia i utwardzenia cementu. Następnie odłączyć uchwyt elektrod od ramienia stereotaktycznego i zdjąć uchwyt z pedestalu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,1 ml ketoprofenu (1 mg/ml, s.c.) w celu zapewnienia analizji oraz drugą dawkę 0,5 ml normosolu (s.c.) w celu nawodnienia, a następnie wyjąć zwierzę z uchwytu stereotaktycznego.</li>
	<li>Umieść izotermiczną podkładkę wstępnie podgrzaną do 37 °C wewnątrz pustej klatki w wiwariacie, przykrytej ręcznikiem papierowym. Gdy zwierzę całkowicie się obudzi, należy umieścić je w czystej klatce z podścieliskiem i miękkim pokarmem, a następnie przenieść z powrotem do wiariatu. Od tego momentu zwierzęta są utrzymywane pojedynczo, aby zapobiec przegryzaniu zestawów słuchawkowych. Nie stosuje się klatek z drucianymi prętami, aby uniknąć zaklinowania zestawów słuchawkowych; zamiast tego butelki z wodą są przywiązane do dolnej części wieka klatki, a karma znajduje się w podścielisku.</li>
	<li>Przez 7Would hours po operacji podawać zwierzęciu miękki pokarm oraz monitorować utratę masy ciała i ocenę kondycji ciała (BCS). W przypadku odwodnienia zwierząt (utrata masy ciała, zwiększony turgor skóry, zapadnięte oczy) można podać podskórnie 0,5 ml roztworu Normosol. Ketoprofen można podawać podskórnie raz dziennie przez kolejne 2 dni po operacji (należy stosować schemat analgezji zgodnie z lokalnymi wytycznymi IACUC). Pozostawić zwierzęta w klatkach do pełnego powrotu do zdrowia na okres od 4 do 7 dni przed przeniesieniem do systemu rejestracji EEG.</li>
</ol>
3. Protokół elektrycznego wywoływania napadów (kindling)
<ol>
	<li>Podłącz myszy do systemu rejestracji EEG za pomocą elastycznego kabla pasującego do gniazd na głowie myszy i komutatora (patrz Tabela materiałów listy). Pozostaw zwierzęta na jedną dobę w celu aklimatyzacji przed przystąpieniem do poniższego protokołu stymulacji elektrycznej. Codziennie monitoruj ich ogólny stan zdrowia oraz proces aklimatyzacji; usuń zwierzęta z systemu w przypadku wystąpienia objawów choroby, stresu i/lub ciągłego spadku masy ciała przekraczającego 25%</li>
	<li>Podłącz oba przewody z elektrody stymulującej do wyjścia stymulatora prądu stałego. 
	UWAGA: Bardzo pomocne jest zastosowanie płytki drukowanej, która umożliwia przełączanie tych elektrod z rejestratora EEG na stymulator.</li>
	<li>Ustaw stymulator tak, aby emitował impulsy o czasie trwania 1 ms z częstotliwością 50 Hz przez 2 s.</li>
	<li>Ustaw wyjście stymulatora na 20 mikroamperów (µA) i dostarczyć 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. tętno</li>
	<li>Monitoruj EEG pod kątem charakterystycznego wyładowania następczego w postaci wysokonapięciowych iglic, które utrzymują się po ustąpieniu impulsu stymulacji elektrycznej.</li>
	<li>Jeśli nie zaobserwowano wyładowania, należy zwiększyć wartość wstrzykiwanego prądu w 20 µA przyrosty aż do wywołania wyładowania wtórnego. Ilość wymaganego prądu stanowi Próg Wyładowania Wtórnego (ADT).</li>
	<li>Typowe ADT mają wielkość 20-50 µAJeśli nie zaobserwowano wyładowań nawet po zwiększeniu do 200 µAnastępnie wymagana jest diagnostyka połączeń elektrycznych i okablowania zestawu słuchawkowego za pomocą omomierza o wysokiej czułości. Jeśli problem dotyczy elektrody stymulującej, należy spróbować przeprowadzić stymulację za pomocą pozostałych elektrod głębinowych.</li>
	<li>Zwierzęta poddawane są procesowi kindle’owania poprzez stymulację 2 lub 6 razy dziennie prądem o natężeniu stanowiącym 1,5-krotność wartości ADT dla danej myszy.</li>
	<li>Monitoruj odpowiedź behawioralną na stymulację, która narasta od zmiany stanu do obustronnych napadów toniczno-klonicznych z upadkiem. Ocenę przeprowadź z wykorzystaniem zmodyfikowanej skali Racine'a.11Aby uniknąć wywołania śmiertelnych napadów tonicznych, należy przerwać proces kindlingu, jeśli kolejne bodźce prowadzą do wzrostu nasilenia i czasu trwania napadów, aż do osiągnięcia 6 stopnia w zmodyfikowanej skali Racine'a (bieganie i skakanie).</li>
</ol>

<ol><li>Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nationwide+trends+in+medical+expenditures+among+adults+with+epilepsy%3A+2003-2014%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014.</a> Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).</li>
<li>Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy%3A+Frequency%2C+Causes%2C+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Foundation+of+America%22%5BJournal%5D)">Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences.</a> Epilepsy Foundation of America. , (1990).</li>
<li>Galanopoulou, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+epilepsy+treatments%3A+issues+in+preclinical+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology.</a> Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).</li>
<li>Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Institute+of+Neurological+Disorders+and+Stroke+%28NINDS%29+Epilepsy+Therapy+Screening+Program+%28ETSP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP).</a> Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).</li>
<li>Buckmaster, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+animal+models+of+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy.</a> Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).</li>
<li>Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+temporal+lobe+epilepsy+following+systemic+chemoconvulsant+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).</li>
<li>Loscher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+of+current+animal+models+of+seizures+and+epilepsy+used+in+the+discovery+and+development+of+new+antiepileptic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Seizure%22%5BJournal%5D)">Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs.</a> Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).</li>
<li>Buckmaster, P. S., Haney, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+outcomes+of+pilocarpine+treatment+in+a+mouse+model+of+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Research%22%5BJournal%5D)">Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).</li>
<li>Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+neuronal+death+in+the+mouse+pilocarpine+model+of+chronic+epilepsy+using+Fluoro-Jade+C+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining.</a> Brain Research. 1241, 157-167 (2008).</li>
<li>Dey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potassium+leak+channel+silences+hyperactive+neurons+and+ameliorates+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus.</a> Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).</li>
<li>Straub, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+kindled+VGAT-Cre+mice+as+a+new+animal+model+of+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 61 (10), 11(2020).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), 1000412(2010).</li>
<li>Vong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+action+on+GABAergic+neurons+prevents+obesity+and+reduces+inhibitory+tone+to+POMC+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons.</a> Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).</li>
<li>Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+ontogeny+of+the+cranial+base+and+craniofacial+skeleton+in+male+C57BL%2F6J+mice%3A+A+reference+standard+for+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis.</a> Frontiers in Physiology. 6, (2016).</li>
<li>Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-sustaining+limbic+status+epilepticus+induced+by+%27continuous%27+hippocampal+stimulation%3A+electrographic+and+behavioral+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Research%22%5BJournal%5D)">Self-sustaining limbic status epilepticus induced by 'continuous' hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics.</a> Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).</li>
<li>Lothman, E. W., Williamson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+electrical+stimulus+parameters+on+afterdischarge+thresholds+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Research%22%5BJournal%5D)">Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus.</a> Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).</li>
<li>Lewczuk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroencephalography+and+behavior+patterns+during+experimental+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus.</a> Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).</li>
<li>Wenker, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postictal+death+is+associated+with+tonic+phase+apnea+in+a+mouse+model+of+sudden+unexpected+death+in+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy.</a> Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).</li>
<li>Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindling+and+status+epilepticus+models+of+epilepsy%3A+rewiring+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain.</a> Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Raport ten opisuje protokół, w którym elektryczne rozpalanie myszy prowadzi do epilepsji. Ponieważ elektroda stymulująca jest umieszczona w hipokampie, jest to ogniskowa padaczka limbiczna, która modeluje padaczkę skroniową (TLE) u pacjentów. Krytycznym krokiem w tym protokole jest użycie myszy VGAT-Cre, które ze względu na wprowadzenie kasety rekombinazy IRES-Cre do genu Vgat , wykazują upośledzone hamujące prądy GABA11. C57BL/6 nie rozwija padaczki po rozpaleniu za pomocą tego protokołu...

Epilepsja to poważne zaburzenie neurologiczne o znacznych obciążeniach ekonomicznych i ludzkich. NINDS szacuje, że 3 miliony Amerykanów cierpi na epilepsję. Około 0,6 miliona z tych pacjentów cierpi na padaczkę skroniową (TLE)1. Niestety, leczenie TLE kończy się niepowodzeniem u jednej trzeciej pacjentów z powodu nieskuteczności, rozwoju oporności na leki lub nietolerancji działań niepożądanych2. Nie ulega wątpliwości, że istnieje znacząca potrzeba opracowania nowych terapii dla TLE, a wniosek ten podzielają Komitet Nauk Podstawowych Amerykańskiego Towarzystwa Padaczkowego, Grupa Robocza Międzynarodowej Ligi Przeciwko Padaczce ds. Przedklinicznego Odkrywania Leków na Padaczkę oraz Krajowa Rada Doradcza ds. Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu3,4.
Obecne modele zwierzęce padaczki płata skroniowego używają albo chemokonulsantów (np. kainian, pilokarpina), albo przedłużonej stymulacji elektrycznej w celu wywołania długotrwałego stanu padaczkowego5,6,7. Wiele zwierząt umiera podczas zabiegu (10%-30% u szczurów, do 90% u myszy8). Zwierzęta, które przeżyły i rozwinęła się padaczka, wykazują rozległą śmierć neuronów w całym mózgu9,10. Ta śmierć uruchamia kaskadę reakcji, zaczynając od aktywacji mikrogleju, astrocytów i naciekających monocytów. Reakcje neuronalne obejmują reorganizację obwodów (np. kiełkowanie włókien omszałych), narodziny nowych neuronów, które nie integrują się prawidłowo z obwodami (np. ektopowe komórki ziarniste) oraz wewnętrzne zmiany, które prowadzą do nadpobudliwości (np. regulacja w górę kanałów Na +). Model padaczki bez istotnej śmierci neuronów ułatwi poszukiwanie nowych leków przeciwpadaczkowych.
Podczas testowania hipotezy GABA dotyczącej epilepsji, odkryto, że leczenie myszy VGAT-Cre łagodnym protokołem elektrycznego rozpalania doprowadziło do spontanicznych napadów motorycznych i elektrograficznych11. Ogólnie rzecz biorąc, elektryczne rozpalanie gryzoni nie prowadzi do spontanicznych napadów, które definiują epilepsję, chociaż może w przypadku nadmiernego rozpalania11. Myszy VGAT-Cre wyrażają rekombinazę Cre pod kontrolą genu pęcherzykowego transportera GABA (VGAT), który ulega ekspresji w neuronach hamujących GABA-ergiczne. Stwierdzono, że insercja Cre zaburzała ekspresję VGAT na poziomie mRNA i białka, upośledzając w ten sposób przekaźnictwo synaptyczne GABA-ergiczne w hipokampie. Stwierdzono, że rozpalone myszy VGAT-Cre mogą być przydatne do badania mechanizmów związanych z epileptogenezą i do badań przesiewowych nowych metod terapeutycznych11. Niniejszy raport zawiera szczegółowe informacje na temat metod wykorzystywanych do generowania modelu.

<table><tbody><tr><td>16-kanałowy zewnątrzkomórkowy różnicowy wzmacniacz prądu przemiennego (115 V / 60 Hz)</td> <td>AD Instruments</td><td>AM3500-115-60</td><td>Alternatywny wzmacniacz EEG</td></tr><tr><td>363 / CP KOŁNIERZ WTYKOWY, TULEJA PINÓW</td><td>P1 Technologies</td><td>363SLEEVPIN0NL</td><td>Do uchwytu elektrody</td></tr><tr><td>, 363-363 5CM - 100CM Z SIATKĄ 6TCM</td><td>P1 Technologies</td><td>363363XXXXCM004</td><td>mysz do komutatora</td></tr><tr><td>Kamery CCTV Qcwox HD Sony IR LED</td><td>Sony</td><td>QC-SP316</td><td></td></tr><tr><td>Komutator SL6C/SB (pojedyncza szczotka)</td><td>P1 Technologies</td><td>8BSL6CSBC0MT</td><td>dawniej Plastics One, Inc.</td></tr><tr><td>Wzmacniacz prądu</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Wiertła, #75, OD&nbsp; 0.310" LOC 130 PT</td><td>Kyocera</td><td>105-0210.310</td><td></td></tr><tr><td>E363/0 STYK GNIAZDOWY SKOŚNY</td><td>P1 Technologies</td><td>8IE3630XXXXE</td><td>piny do złącza</td></tr><tr><td>iBond Klej samotrawiący</td><td>Kulzer</td><td>CE0197</td><td></td></tr><tr><td>MS363 COKÓŁ 2298 6 PIN BIAŁY</td><td>P1 Technologies</td><td>8K000229801F</td><td>Złącze zestawu słuchawkowego EEG</td></tr><tr><td>Ohomierz</td><td>Simpson</td><td>260</td><td>Wysoka czułość</td></tr><tr><td>PowerLab 16/35 i LabChart Pro</td><td>AD Instruments</td><td>PL3516/P</td><td>Alternatywne oprogramowanie EEG</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific Corp.</td>Jednostka anestezjologiczna <td>SS-01</td><td>i Monitorowanie RightTemp</td></tr><tr><td>Wiertarka stereotaktyczna i zestaw mikrosilnika</td><td>Foredom Electric Co.</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Drut pokryty teflonem do elektrody głębokościowej, OD 0,008'A-M</td> <td>Systems</td><td>791400</td><td></td></tr><tr><td>Myszy VGAT-Cre na tle kongenicznym C57BL/6J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>000664</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i wszczepienie elektrod dla elektrycznie zapalających myszy vgat-cre w celu wygenerowania modelu padaczki skroniowej

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

Odkryto, że elektryczne rozpałkowanie myszy VGAT-Cre doprowadziło do spontanicznych napadów motorycznych i elektrograficznych. Niedawny artykuł koncentrował się na tym, w jaki sposób unikalne myszy VGAT-Cre były wykorzystywane do rozwoju spontanicznych nawracających napadów padaczkowych (SRS) po rozpaleniu i prawdopodobnym mechanizmie - wstawieniu Cre do genu VGAT - zakłócił jego ekspresję i zmniejszył ton GABA-ergyczny. Niniejsze badanie rozszerza te obserwacje na większą kohortę myszy, koncentrując się na kluczowych kwestiach, takich jak czas trwania SRS po rozpaleniu oraz wpływ płci i wieku zwierzęcia. W niniejszym raporcie opisano protokoły następujących kluczowych kroków: wykonanie zestawów słuchawkowych z elektrodami głębokości hipokampa do stymulacji elektrycznej i do odczytu elektroencefalogramu; operacja polegająca na bezpiecznym przymocowaniu zestawu słuchawkowego do czaszki myszy, aby nie spadł; oraz kluczowe szczegóły protokołu elektrycznego rozpalania, takie jak czas trwania impulsu, częstotliwość pociągu, czas trwania pociągu i ilość wstrzykiwanego prądu. Protokół rozpalania jest solidny, ponieważ niezawodnie prowadzi do epilepsji u większości myszy VGAT-Cre, zapewniając nowy model do testowania nowych leków przeciwpadaczkowych.

Zwierzęta 
Model został pierwotnie opracowany z wykorzystaniem myszy VGAT-Cre (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)13 na zmieszanym tle genetycznym. Zastosowano go jednak również u szczepu VGAT-Cre, który jest kongeniczny z C57BL/6J. Nie zaobserwowano różnic w rozwoju epilepsji pomiędzy tymi szczepami. Oba szczepy wykazują ekspresję rekombinazy Cre pod kontrolą promotora pęcherzykowego transportera GABA. Myszy te zostały wygenerowane poprzez wprowadzenie kasety IRES-Cre (knock-in)...

Ten raport opisuje metody generowania modelu padaczki skroniowej na podstawie elektrycznego rozpalenia transgenicznych myszy VGAT-Cre. Rozpalone myszy VGAT-Cre mogą być przydatne w określaniu, co powoduje padaczkę i w badaniach przesiewowych nowych terapii.

Przygotowanie i wszczepienie elektrod dla elektrycznie zapalających myszy VGAT-Cre w celu wygenerowania modelu padaczki skroniowej

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...

Protokół ten generuje nowy model padaczki skroniowej, w której u myszy rozwinęły się spontaniczne napady, i okazał się bardzo przydatny do badania mechanizmów epileptogenezy, a także do badań przesiewowych nowych terapii. Ta procedura u myszy VGAT-Cre niezawodnie prowadzi do spontanicznych, nawracających napadów elektrograficznych i ruchowo-ruchowych, nie powodując rozległej śmierci komórek hipokampa, która często występuje po stanie padaczkowym wywołanym chemoconvulsantami lub ciągłą stymulacją elektryczną. Aby rozpocząć produkcję zestawów słuchawkowych, odetnij drut ze stali nierdzewnej pokrytej politetrafluoroetylenem o długości 3,5 centymetra i zdejmij około jednego milimetra warstwy izolacyjnej z obu końców drutu.Umieść dwa kołki na uchwycie imadła, tak aby dolna część kołka miała dłuższą szczelinę skierowaną w dół. Następnie nałóż topnik na odizolowane końce drutu i wierzchołki kołków. Ocynuj odizolowaną część drutu i górną część pinów wystarczającą ilością lutu, aby pokryć go bez przelewania się na boki.Umieść jeden z odizolowanych końców drutu w kołku tak głęboko, jak to możliwe, podczas gdy lut się topi. Powtórz proces dla drugiego pinu z drugim odizolowanym końcem drutu.

preparation-implantation-electrodes-for-electrically-kindling-vgat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Częściowo izolowana kora („podcięcie”) stanowi wydajny model zwierzęcy potraumatycznej epileptogenezy. W niniejszym materiale demonstrujemy sposób wykonania nowego urządzenia chirurgicznego oraz jego zastosowanie w celu tworzenia bardziej precyzyjnych i spójnych uszkodzeń niezbędnych do wygenerowania tego modelu.

Przygotowanie modelu podcięcia w badaniu epileptogenezy potraumatycznej u gryzoni

Opisano procedurę optogenetycznej manipulacji aktywnością neuronów piramidowych kory mózgowej przy jednoczesnym monitorowaniu elektroencefalogramu, elektromiogramu oraz stężenia mleczanu w mózgu. Rejestracje eksperymentalne są przeprowadzane u myszy z podłączonymi przewodami podczas spontanicznych cykli snu i czuwania. Sprzęt do optogenetyki został zbudowany w naszym laboratorium; sprzęt pomiarowy jest dostępny w sprzedaży.

Symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Ten film demonstruje technikę wszczepiania zespołu elektrod do mózgu myszy. Zespół zawiera elektrody bipolarne do rejestrowania aktywności z hipokampa i elektrodę odniesienia do uzyskiwania podstawowej aktywności z móżdżku. Znieczuloną mysz umieszcza się na stereotaktycznej ramie, a zespół elektrod wszczepia się w docelowy obszar mózgu. Następnie zwierzę może dojść do siebie przed wykonaniem zapisu elektrofizjologicznego.

Wszczepienie zespołu elektrod do mózgu myszy w celu zapisu elektrofizjologicznego

Badania wykazały, że katodowa przezczaszkowa stymulacja prądem stałym może powodować efekt tłumiący napady oporne na leki. W tym badaniu opracowano konfigurację eksperymentalną in vitro, w której oceniano stymulację prądem stałym i rejestrację wieloelektrodową aktywności podobnej do napadu w przygotowaniu wycinków mózgu myszy. Ocenie poddano parametry stymulacji prądem stałym.

Stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy

Ten artykuł demonstruje skuteczność akupunktury, modeli epilepsji i analizy snu u gryzoni. Opisano procedurę akupunktury i identyfikację punktów akupunkturowych. Pilokarpina lub pentylenotetrazol (PTZ) jest stosowany w celu wywołania padaczki. Do analizy snu wykorzystuje się elektrokortykogram (ECoG), elektromiogram (EMG), temperaturę mózgu i zapisy aktywności lokomotorycznej.

Manipulacja elektrokortykogramem padaczkowym (ECoG) i snem u szczurów i myszy za pomocą akupunktury

Ten szczegółowy protokół opisuje umieszczanie elektrod stymulacji przezczaszkowej na kości skroniowej w celu zbadania krótko- i długoterminowych efektów przezczaszkowej stymulacji elektrycznej u swobodnie poruszających się szczurów.

Przewlekła przezczaszkowa stymulacja elektryczna i zapis wewnątrzkorowy u szczurów

Ten manuskrypt opisuje metodę wywoływania stanu padaczkowego poprzez ogólnoustrojowe wstrzykiwanie pilokarpiny oraz monitorowania spontanicznych nawracających napadów u żywych zwierząt za pomocą bezprzewodowego systemu telemetrii wideo i elektroencefalogramu. Protokół ten może być wykorzystany do badania patofizjologicznych mechanizmów przewlekłej padaczki, epileptogenezy i ostrych napadów.

Pilokarpinowy model padaczki skroniowej i monitorowanie EEG z wykorzystaniem systemu radiotelemetrycznego u myszy

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Modele ostrych napadów są ważne dla badania mechanizmów leżących u podstaw zdarzeń padaczkowych. Co więcej, możliwość generowania zdarzeń padaczkowych na żądanie zapewnia wysoce efektywną metodę badania dokładnej sekwencji zdarzeń leżących u podstaw ich inicjacji. W tym miejscu opisujemy ostre modele napadów korowych 4-aminopirydyny ustalone w tkance mysiej i ludzkiej.

Wytwarzanie i inicjacja na żądanie ostrej aktywności ictal w tkankach gryzoni i ludzkich

Wyzwaniem badań nad padaczką jest opracowanie nowych metod leczenia dla pacjentów, u których klasyczna terapia jest niewystarczająca. Korzystając z nowego protokołu - za pomocą wszczepialnego systemu dostarczania leków - jesteśmy w stanie kontrolować napady padaczkowe u znieczulonych myszy poprzez elektroforetyczne dostarczanie GABA do ogniska padaczkowego.

Elektroforetyczne dostarczanie kwasu γ-aminomasłowego (GABA) do ogniska padaczkowego zapobiega napadom padaczkowym u myszy

Ciało migdałowate odgrywa kluczową rolę w padaczce skroniowej, która wywodzi się z tej struktury i z niej się rozprzestrzenia. Ten artykuł zawiera szczegółowy opis wytwarzania głębokich elektrod mózgowych z funkcjami zarówno rejestrującymi, jak i stymulującymi. Wprowadza model padaczki przyśrodkowego płata skroniowego wywodzącej się z ciała migdałowatego.

Użycie elektrody bipolarnej do stworzenia mysiego modelu padaczki skroniowej poprzez elektryczne rozppalenie ciała migdałowatego

Poznaj metodę implantacji elektrod w myszy VGAT-Cre do generowania modelu padaczki skroniowej. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów epileptogenezy z minimalnym uszkodzeniem neuronów hipokampa.

Przygotowanie i wszczepienie elektrod dla elektrycznie zapalających myszy VGAT-Cre w celu wygenerowania modelu padaczki skroniowej (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie i wszczepienie elektrod dla elektrycznie zapalających myszy VGAT-Cre w celu wygenerowania modelu padaczki skroniowej

Przeglądaj więcej filmów