Name: Wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji Streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj wysokowydajny system transkrypcji-translacji Streptomyces venezuelae do syntezy rekombinowanych białek. Metoda umożliwia ekspresję genów o wysokiej zawartości GC i badanie szlaków metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za następujące wsparcie badawcze: EPSRC [EP/K038648/1] dla SJM jako PDRA z PSF; Wellcome Trust sponsorował stypendium ISSF dla SJM z PSF w Imperial College London; Grant badawczy Towarzystwa Królewskiego [RGS\R1\191186]; Nagroda Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] dla SJM na Uniwersytecie w Kent; oraz stypendium doktoranckie Global Challenges Research Fund (GCRF) dla KC na Uniwersytecie w Kent.

UWAGA: Zobacz Tabelę 1 i Tabelę 2, aby zapoznać się z przepisami na podłoże GYM i płytę agarową oraz do płukania S30A i S30B.
1. Przygotowanie rozwiązań i ogólne wytyczne
<ol>
	<li>Po przygotowaniu wszystkie roztwory, komórki (po wzroście) i ekstrakty komórkowe należy przechowywać na lodzie, chyba że określono wyjątek.</li>
	<li>Zapasy na 1 M Mg-glutaminianu, 4 M K-glutaminianu, 40% (w/v) PEG 6000, 1 g/ml kwasu poliwinylosulfonowego należy przechowywać w temperaturze pokojowej, a wszystkie inne zapasy w temperaturze -80 °C. Zminimalizuj liczbę cykli zamrażania i rozmrażania, aby uniknąć degradacji chemicznej.</li>
	<li>W celu przygotowania roztworu energetycznego (patrz Tabela 3), takiego jak 3-PGA (wymaga dostosowania pH), postępuj zgodnie ze wskazówkami zawartymi w protokole E. coli TX-TL41. 
	UWAGA: Wszystkie składniki są w pełni rozpuszczalne w ddH2O i przechowywane w postaci podwielokrotności w zamrażarce w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Rozmrażaj poszczególne zapasy lub roztwory energetyczne (opisane później) na lodzie. Podgrzej zapas aminokwasów w temperaturze 42 °C z wirowaniem przez ~15-30 minut, aby rozpuścić wszystkie aminokwasy.</li>
	<li>Ponieważ niektóre aminokwasy (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) wytrącają się na lodzie, minimalizując czas odpoczynku, pozostaw ten roztwór w temperaturze pokojowej i użyj wiru do rozpuszczenia.</li>
	<li>Dodać obliczone objętości (tabela 3) roztworów podstawowych i wody i dobrze wymieszać za pomocą wiru.</li>
	<li>Roztwór energetyczny należy podzielić na 20-100 μl porcji na probówkę lub według uznania na lód i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek S. venezuelae ATCC 10712
<ol>
	<li>Dzień 1 - Przygotowanie pożywki/buforu i nocna hodowla wstępna
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l sterylnego płynnego podłoża GYM w kolbie z przegrodami o pojemności 2 l, zgodnie z opisem w Tabeli 1. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się ze źródłami sprzętu/chemikaliów/odczynników.</li>
		<li>Przygotować 1 x 50 ml sterylnego płynnego podłoża GYM w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml, zgodnie z opisem w Tabeli 1.</li>
		<li>Przygotować 100 ml 1 M HEPES-KOH pH 7,5, 100 ml 1 M MgCl2 i 500 ml 4 M roztworów NH4Cl, aby uzyskać 1 l płuczących S30A i 1 l płuczących S30B. Przepisy znajdują się w tabeli 2.</li>
		<li>Przygotuj nocną hodowlę wstępną. Podgrzej wstępnie sterylne 50 ml płynnej pożywki GYM w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml do temperatury 28 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię S. venezuelae ATCC 10712 (lub szczepu pokrewnego) z płytki agarowej GYM do wstępnie ogrzanych 50 ml płynnej pożywki GYM i inkubować w temperaturze 28 °C, 200 obr./min przez 16 godzin (nocna hodowla wstępna).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2 - Przygotuj prekulturę na dzień i główną kulturę wzrostu.
	<ol>
		<li>Podgrzać 50 ml sterylnego płynnego podłoża GYM w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml w temperaturze 28 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Przenieść 1 ml nocnej kultury wstępnej do wstępnie ogrzanych 50 ml płynnej pożywki GYM i inkubować w temperaturze 28 °C, 200 obr./min przez 8 godzin (hodowla wstępna w ciągu dnia).</li>
		<li>Po tym okresie wzrostu sprawdzić OD600 w spektrofotometrze, używając rozcieńczenia 1:10 sterylnym podłożem GYM w plastikowej kuwecie o pojemności 1 ml (1 cm długości ścieżki). 
		UWAGA: OD600 powinien osiągnąć co najmniej 3-4. Jeśli wzrost jest słaby, zaleca się powtórzenie kroków 2.2.1-2.2.2.</li>
		<li>Subkultura: 0,25 ml dziennej kultury wstępnej w 1 l płynnej pożywki GYM w 2-litrowych kolbach z przegrodami.</li>
		<li>Wstrząsać przez noc w temperaturze 28 °C, 200 obr./min przez 14 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3 – Zbierz komórki
	<ol>
		<li>Po poprzednim okresie inkubacji (14 godzin) zapisz OD600 głównej kultury. Rozcieńczyć nocną kulturę w stosunku 1:10 świeżą pożywką GYM do pomiaru OD600. 
		UWAGA: Na tym etapie OD600 powinien osiągnąć 3,0-4,0.</li>
		<li>Jeśli OD600<3.0, zwiększ prędkość wytrząsania do 250-300 obr./min i zwiększaj, aż zostanie osiągnięta OD600 3.0. Rosną nie dłużej niż dodatkowe 2 godziny (łącznie 16 godzin).</li>
		<li>Jeśli OD600>3,0, przenieść kultury do pojemników wirujących i szybko schłodzić na mokrym lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Czekając, aż hodowla komórkowa ostygnie na lodzie, należy przygotować 4 ml świeżych 1 M ditiotreitolu (DTT), S30A i S30B, jak opisano w tabeli 1, i przechowywać je na lodzie. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać informacje o źródle substancji chemicznej/odczynników.</li>
		<li>Wstępnie zważyć pustą probówkę wirówkową o pojemności 50 ml i schłodzić w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Dodaj 2 ml 1 M DTT do 1 l buforu S30A na lodzie i dobrze wymieszaj. 
		UWAGA: Dodaj DTT do myjących S30A i S30B tylko przed ich użyciem.</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 6 000 × g, w temperaturze 4 °C, 10 min i ostrożnie wyrzucić supernatant szybkim i pojedynczym ruchem. 
		UWAGA: Jeśli osad zostanie zakłócony, zmaksymalizuj retencję komórek za pomocą resztkowego podłoża GYM i kontynuuj protokół.</li>
		<li>Dodać 500 ml buforu S30A i ponownie zawiesić komórki, energicznie potrząsając butelkami wirującymi, aż grudki komórek zostaną jednorodnie rozproszone.</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 6 000 × g, w temperaturze 4 °C, 6 minut i ostrożnie wyrzucić supernatant. 
		UWAGA: Chociaż w tym momencie osad komórkowy będzie twardszy, niektóre ogniwa pozostaną w zawiesinie (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Traktować zgodnie z opisem w ppkt 2.3.7 i zachować jak najwięcej komórek.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.3.8-2.3.9.</li>
		<li>Dodaj 2 ml 1 M DTT do 1 l buforu S30B na lodzie i dobrze wymieszaj. Dodaj 500 ml buforu S30B do komórek. Powtórz krok 2.3.9.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml buforu S30B i przenieść do wstępnie zważonej, schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. W razie potrzeby przenieś pozostałe komórki z dodatkowymi 5-10 ml buforu S30B. Napełnij do 50 ml S30B.</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 6 000 × g, w temperaturze 4 °C, 10 minut i ostrożnie odrzucić supernatant.</li>
		<li>Powtórz krok 2.3.13.</li>
		<li>Ostrożnie odessać pozostały supernatant S30B za pomocą pipety o pojemności 100-200 μl.</li>
		<li>Zważyć mokre ogniwa w peletek. 
		UWAGA: Typowa masa granulatu z mokrymi komórkami na 1 l nocnej hodowli GYM (OD600 = 3,0) wynosi ~4,5 g.</li>
		<li>Na każdy 1 g mokrych komórek dodać 0,9 ml buforu S30B. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety Pasteura lub wiru.</li>
		<li>Odwirować krótko (~10 s) do 500 × g w celu osadzenia komórek. 
		UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany, a komórki można zamrozić na ciekłym azocie lub suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80°C. Ze względów bezpieczeństwa należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas pracy z ciekłym azotem, w tym osłony twarzy i rękawice.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Liza komórek za pomocą sonikacji w celu uzyskania surowego ekstraktu komórkowego
UWAGA: Na tym etapie użytkownik może zdecydować się na zakłócenie komórek przez sonikację albo we frakcjach 1 ml (opcja 1), albo jako większą zawiesinę komórek (5 ml) w probówce o pojemności 50 ml (opcja 2). Obie opcje zostały szczegółowo opisane poniżej, aby zapewnić odtwarzalność, ponieważ końcowa objętość zawiesiny komórek może ulec zmianie z powodu utraty komórek podczas poprzednich etapów zbioru i mycia. Nowy użytkownik powinien najpierw spróbować użyć opcji 2.1, aby ustanowić protokół.
<ol>
	<li>Liza komórek przez sonikację we frakcjach 1 ml
	<ol>
		<li>Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml (odciąć koniec końcówki, aby zwiększyć rozmiar otworu), przenieś 1 ml zawiesiny komórek do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml. 
		UWAGA: Jeśli komórki są zamrożone, szybko rozmrozić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą osad w letniej wodzie przed lizą komórek. Przenieś probówkę do mokrego lodu, gdy tylko granulki zaczną się rozmrażać i schładzaj przez 10 minut.</li>
		<li>Umieść każdą probówkę do mikrowirówki w zlewce z lodowatą wodą, używając plastikowego stojaka na probówki do przytrzymania probówki do sonikacji. 
		UWAGA: Ze względu na wrażliwość ekstraktu komórkowego na przegrzanie, ważne jest, aby rurki nie nagrzewały się, aby zapobiec wytrącaniu się białek i zmniejszonej aktywności enzymatycznej.</li>
		<li>Użyj sondy sonikatora z końcówką o średnicy 3 mm i wyczyść ją 70% (v/v) etanolem i wodą podwójnie destylowaną (ddH2O). Opuść końcówkę sonikatora do zawiesiny ogniwa, aż znajdzie się ~1 cm poniżej powierzchni cieczy.</li>
		<li>Wprowadź następujące ustawienia do sonikatora: częstotliwość 20 kHz, amplituda 65%, czas włączenia impulsu 10 s, czas wyłączenia impulsów 10 s, całkowity czas sonikacji 1 min.</li>
		<li>Uruchom protokół sonikacji. Przesuwaj rurkę w górę/w dół i na boki podczas pierwszych dwóch cykli spoczynku, aby zapewnić równomierne sonikowanie komórek. Zapisz pobór energii. 
		UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa należy nosić odpowiednią ochronę słuchu podczas sonikacji. Lepkość zmniejszy się, gdy komórki zostaną zakłócone, a jasnokremowe granulki mokrych komórek powinny zamienić się w jednorodny brązowy płyn. Zalecany dopływ energii wynosi 240 J na ml mokrych komórek. Jeśli komórki są tylko częściowo zbagatelizowane, zawiesina nadal będzie miała kremowy kolor z lepkimi grudkami komórek, szczególnie po bokach probówki.</li>
		<li>Odwróć probówkę 2-3 razy i powtórz sonikację przez dodatkowy jeden lub dwa cykle po 10 sekund, często mieszając, aż komórki zostaną całkowicie rozerwane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liza komórek poprzez sonikację zawiesiny komórek o pojemności 5 ml
	<ol>
		<li>Jeśli komórki są zamrożone, szybko rozmrozić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą osad w letniej wodzie, wstrząsając przed lizą komórek. Przenieś probówkę do mokrego lodu, gdy tylko granulki zaczną się rozmrażać i schładzaj przez 10 minut.</li>
		<li>Krótko obrócić probówkę o wymiarach 500 x g, aby osadzić komórki.</li>
		<li>Umieść probówkę o pojemności 50 ml w zlewce z lodowatą wodą w celu sonikacji. 
		UWAGA: Ze względu na wrażliwość ekstraktu komórkowego na przegrzanie, ważne jest, aby rurki nie nagrzewały się, aby zapobiec wytrącaniu się białek i zmniejszonej aktywności enzymatycznej.</li>
		<li>Użyj sondy sonikatora z końcówką o średnicy 6 mm i wyczyść ją 70% (v/v) etanolem i ddH2O (patrz schemat wizualny sondy 6 mm w <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Opuść końcówkę sonikatora do zawiesiny ogniw (~5 ml), aż znajdzie się ~1 cm poniżej powierzchni cieczy.</li>
		<li>Wprowadź następujące ustawienia do sonikatora: częstotliwość 20 kHz, amplituda 65%, czas włączenia impulsu 10 s, czas wyłączenia impulsów 10 s, całkowity czas sonikacji 1 min na ml mokrych komórek (łącznie 5 minut).</li>
		<li>Uruchom protokół sonikacji. Przesuwaj rurkę w górę/w dół i na boki podczas pierwszych dwóch cykli spoczynku, aby upewnić się, że komórki są równomiernie sonikowane. 
		UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa należy nosić odpowiednią ochronę słuchu podczas sonikacji. Lepkość zmniejszy się, gdy komórki zostaną rozerwane, a jasnokremowe mokre komórki powinny zamienić się w jednorodny brązowy płyn. Zapisz pobór energii. Zalecany jest optymalny dopływ energii wynoszący 240 J na ml mokrych komórek (łącznie ~1200 J po 5 minutach sonikacji).</li>
		<li>Jeśli niektóre komórki pozostaną nienaruszone, postępuj zgodnie ze wskazówkami z kroku 3.1.5.</li>
		<li>Przenieść ekstrakty komórkowe do probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Klarowanie ekstraktu komórkowego i reakcja spływu
<ol>
	<li>Odwirować zlizane komórki w temperaturze 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek. Przenieść supernatant do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w postaci podwielokrotności o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Przeprowadź reakcję spływu ekstraktów komórkowych. Inkubować probówki o pojemności 1,5 ml zawierające ekstrakty komórkowe w temperaturze 30 °C przez 60 minut w bloku grzewczym lub inkubatorze bez wstrząsania.</li>
	<li>Odwirować ekstrakty komórkowe o stężeniu 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatanty w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wymieszać sklarowany osad, obracając probówkę pięć razy do uzyskania jednorodnej konsystencji, a następnie trzymać ją na lodzie. Delikatnie odwróć, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Rozcieńczyć 10 μl ekstraktu komórkowego 100-krotnie buforem S30B i zmierzyć całkowite stężenie białka za pomocą testu Bradforda z trzema powtórzeniami technicznymi (patrz Materiał uzupełniający S2 dla wytycznych dotyczących testu Bradforda).</li>
	<li>Jeśli stężenie białka wynosi 20-25 mg/ml, przenieś ekstrakty komórkowe w postaci 100 μl podwielokrotności do nowych probówek o pojemności 1,5 ml, błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa podczas pracy z ciekłym azotem należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej, w tym osłony twarzy i rękawice.</li>
	<li>Jeśli stężenie białka wynosi <20 mg/ml, powtórz kroki przygotowania surowego ekstraktu, aby upewnić się, że wysokiej jakości ekstrakt komórkowy i wydajność TX-TL są porównywalne z poprzednio opublikowaną pracą5.</li>
</ol>
5. Przygotowanie szablonu DNA plazmidu
<ol>
	<li>Oczyść plazmid pTU1-A-SP44-mScarlet-I (pochodzenia pUC19) ze świeżo przekształconego szczepu plazmidu E. coli (DH10β, JM109) wyhodowanego w 50 ml kultury LB (ze 100 mg/ml karbenicyliny) za pomocą odpowiedniego zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Eluować plazmid w 2 x 300 μl wody wolnej od nukleaz i połączyć frakcje.</li>
	<li>Dodać 0,1 objętości (66 μl) 3 M octanu sodu (pH 5,2).</li>
	<li>Dodać 0,7 objętości (462 μl) izopropanolu.</li>
	<li>Inkubować DNA w temperaturze -20 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 16 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj 2 ml 70% (v/v) etanolu do osadu DNA.</li>
	<li>Odwróć probówkę 3-4 razy, aby ponownie zawiesić osad plazmidowego DNA.</li>
	<li>Odwirować przy 16 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.7-5.9 i usuń cały widoczny płyn.</li>
	<li>Suszyć osad DNA na powietrzu przez 10-30 minut lub suszyć przez 5 minut za pomocą wirówki próżniowej.</li>
	<li>Zawiesić wysuszony osad w 600 μl ddH2O bez nukleaz.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Przygotować 50-100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Zalecane jest wysokie stężenie DNA w zakresie 500-1000 ng/μL ze względu na ścisłe ograniczenia objętościowe reakcji bezkomórkowych. Rozcieńczyć plazmidowy rdzeń DNA do 80 nM; 168 ng/μL plazmid pTU1-A-SP44-mScarlet-I odpowiada 80 nM. </li>
</ol>
6. Przygotowanie roztworu Streptomyces Master Mix (SMM)
<ol>
	<li>Roztwór aminokwasów
	<ol>
		<li>Użyj zestawu do próbowania aminokwasów, aby uniknąć błędów ręcznych i skrócić czas przygotowania, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dostępnymi online.</li>
		<li>Rozcieńczyć 20x roztwór podstawowy aminokwasu za pomocą ddH2O do końcowego stężenia 6 mM (5 mM L-Leu).</li>
		<li>Dalej rozcieńczyć do 2,4 mM (2 mM L-Leu) w roztworze 2,4x SMM (patrz Tabela 3). 
		UWAGA: Końcowe stężenie w reakcji TX-TL wynosi 1 mM 19x aminokwasy i 0,83 mM L-Leu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór energetyczny i dodatki
	<ol>
		<li>Przygotować pozostałe składniki roztworu 2,4x SMM, postępując zgodnie z przepisem opisanym w Tabeli 3.</li>
		<li>Alternatywnie, przygotuj 2,4x Rozwiązanie Minimalnego Zużycia Energii (MES), postępując zgodnie z przepisem opisanym w Tabeli 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Ustawianie standardowej reakcji S. venezuelae TX-TL
<ol>
	<li>Rozmrozić ekstrakt komórkowy, roztwór SMM (lub MES) i plazmidowe DNA na lodzie. Wstępnie schłodzić 384-dołkową płytkę w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Ustaw reakcje TX-TL, w których 25% objętości to plazmidowe DNA, 33,33% to ekstrakt komórkowy, a 41,67% to roztwór SMM; utrzymuj je na lodzie, aby uniknąć odchylenia czasu rozpoczęcia. 
	UWAGA: Dostarczono standardowy szablon TX-TL (Tabela 4) do obliczania objętości potrzebnych odczynników na podstawie liczby reakcji. Standardowa objętość dla reakcji 33 μl jest następująca: 11 μl ekstraktu komórkowego, 13,75 μl SMM i 8,25 μl plazmidowego DNA.</li>
	<li>Delikatnie wiruj mieszaninę przez ~5 s przy niskiej prędkości, aby upewnić się, że roztwór jest jednorodny. Unikaj pienienia/tworzenia się pęcherzyków.</li>
	<li>Przenieść 10 μl podwielokrotności do trzech dołków na płytce 384-dołkowej jako trzykrotek techniczny bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Uszczelnij płytkę przezroczystą pokrywą i wiruj z prędkością 400 × g przez 5 s.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 28 °C w inkubatorze (do odczytów punktu końcowego) lub na czytniku płytek bez wstrząsania. 
	UWAGA: Reakcje zwykle wymagają 3-4 godzin, aby osiągnąć zakończenie. Patrz Materiał uzupełniający S2, aby uzyskać wskazówki dotyczące czytnika płytek i standardowych pomiarów mScarlet-I.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym manuskrypcie opisano wysokowydajny protokół TX-TL S. venezuelae ze szczegółowymi krokami, które są proste do wykonania zarówno dla doświadczonych, jak i nowych użytkowników systemów TX-TL. Kilka cech z istniejących protokołów TX-TL41 Streptomyces45 i E. coli zostało usuniętych w celu ustanowienia minimalnego, ale wysokowydajnego protokołu dla S. venezuelae TX-TL 5,26. Zaleca...

Systemy transkrypcyjno-translacyjne (TX-TL) bez komórek stanowią idealną platformę prototypowania dla biologii syntetycznej do realizacji szybkich cykli projektowania, budowy i testowania, koncepcji inżynieryjnej dla biologii syntetycznej1. Ponadto rośnie zainteresowanie systemami TX-TL do produkcji wysokowartościowych białek rekombinowanych w środowisku otwartej reakcji2, na przykład w celu włączenia niestandardowych aminokwasów do koniugatów przeciwciało-lek3. W szczególności TX-TL wymaga ekstraktu komórkowego, plazmidu lub liniowego DNA oraz roztworu energetycznego do katalizowania syntezy białek w reakcjach wsadowych lub półciągłych. Podczas gdy Escherichia coli TX-TL jest dominującym systemem bezkomórkowym, wiele pojawiających się niemodelowych systemów TX-TL przyciągnęło uwagę do różnych zastosowań4,5,6,7,8. Kluczowe zalety TX-TL to elastyczna skalowalność (skala od nanolitra do litra)9,10, wysoka powtarzalność i zautomatyzowane przepływy pracy8,11,12. W szczególności automatyzacja TX-TL pozwala na przyspieszoną charakterystykę części genetycznych i elementów regulatorowych8,12,13.
Jeśli chodzi o konfigurację reakcji, TX-TL wymaga zarówno pierwotnych, jak i wtórnych źródeł energii, a także aminokwasów, kofaktorów, dodatków i matrycowej sekwencji DNA. Trifosforany nukleotydów (NTP) stanowią podstawowe źródło energii do napędzania początkowej syntezy mRNA (ATP, GTP, CTP i UTP) i białek (tylko ATP i GTP). Aby zwiększyć wydajność TX-TL, NTP są regenerowane poprzez katabolizm wtórnego źródła energii, takiego jak maltose14, maltodextrin15, glucose14, 3-fosfoglicerynian (3-PGA)16, phosphoenolpyruvate17 i L-glutaminian18. Ta wrodzona aktywność metaboliczna jest zaskakująco wszechstronna, ale słabo zbadana, zwłaszcza w powstających systemach TX-TL. Każde źródło energii ma inne właściwości i zalety pod względem wydajności ATP, stabilności chemicznej i kosztów, co jest ważnym czynnikiem przy skalowaniu reakcji TX-TL. Do tej pory obecne protokoły dla E. coli TX-TL osiągnęły do 4,0 mg/ml (~157 μM) dla modelowego białka zielonej fluorescencji (GFP), wykorzystując mieszankę 3-PGA (30 mM), maltodekstryny (60 mM) i D-rybozy (30 mM) jako wtórne źródło energii19.
Ostatnio obserwuje się rosnące zainteresowanie badaniem szlaków biosyntezy metabolitów wtórnych w systemach TX-TL20,21,22. W szczególności Actinobacteria są głównym źródłem metabolitów wtórnych, w tym antybiotyków i chemikaliów rolniczych23,24. Ich genomy są wzbogacone o tzw. biosyntetyczne klastry genów (BGC), które kodują szlaki enzymatyczne biosyntezy metabolitów wtórnych. Do badania części genetycznych Actinobacteria i szlaków biosyntezy opracowano ostatnio szereg systemów TX-TL opartych na Streptomyces5,6,25,26. Te wyspecjalizowane systemy Streptomyces TX-TL są potencjalnie korzystne z następujących powodów: [1] zapewnienie natywnego środowiska fałdowania białek dla enzymów ze Streptomyces spp.26; [2] dostęp do optymalnej puli tRNA dla wysokiej ekspresji genów G+C (%); [3] aktywny metabolizm pierwotny, który potencjalnie może zostać przejęty w celu dostarczenia prekursorów biosyntetycznych; oraz [4] dostarczanie enzymów, prekursorów lub kofaktorów z metabolizmu wtórnego obecnych w natywnym ekstrakcie komórkowym. W związku z tym niedawno stworzono wysokowydajny zestaw narzędzi S.venezuelae TX-TL, aby wykorzystać te unikalne możliwości5.
Streptomyces venezuelae to nowy gospodarz dla biologii syntetycznej z bogatą historią w biotechnologii przemysłowej5,27,28,29 i jako modelowy system do badania podziału komórek i regulacji genetycznej u Actinobacteria30,31,32. Główny szczep typu, S. venezuelae ATCC 10712, ma stosunkowo duży genom 8,22 Mb z 72,5% zawartością G+C (%) (numer dostępu: CP029197), który koduje 7377 sekwencji kodujących, 21 rRNA, 67 tRNA i 30 klastrów genów biosyntetycznych27. W biologii syntetycznej S. venezuelae ATCC 10712 jest atrakcyjnym podłożem dla heterologicznej ekspresji szlaków biosyntezy. W przeciwieństwie do większości innych barwników Streptomyces, zapewnia kilka kluczowych zalet, w tym szybki czas podwajania (~40 min), szeroki zakres narzędzi genetycznych i eksperymentalnych5,28, brak zlepiania się grzybni i zarodnikowanie w płynnych podłożach28,33. Kilka badań wykazało również wykorzystanie S. venezuelae do heterologicznej produkcji różnorodnego zestawu metabolitów wtórnych, w tym poliketydów, peptydów rybosomalnych i nierybosomalnych34,35,36,37,38. Te połączone cechy sprawiają, że szczep ten jest atrakcyjnym gospodarzem mikrobiologicznym do zastosowań w biologii syntetycznej i inżynierii metabolicznej. Chociaż S. venezuelae nie jest dominującym modelem Streptomyces dla heterologicznej ekspresji genów, wraz z dalszymi osiągnięciami jest on przygotowany do szerszego zastosowania w odkrywaniu produktów naturalnych.
Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) dla wysokowydajnego systemu TX-TL S. venezuelae, który został zaktualizowany z oryginalnego, poprzednio opublikowanego protokołu26. W tej pracy zoptymalizowano roztwór energetyczny i warunki reakcji w celu zwiększenia wydajności białka do 260 μg/ml dla białka reporterowego mScarlet-I w 4-godzinnej reakcji wsadowej 10 μl, przy użyciu standardowego plazmidu pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Plazmid ten został specjalnie zaprojektowany, aby umożliwić różne metody wykrywania ekspresji białek. Protokół został również uproszczony, a system energetyczny został zoptymalizowany w celu zmniejszenia złożoności i kosztów tworzenia reakcji bezkomórkowych bez uszczerbku dla wydajności. Wraz ze zoptymalizowanym systemem TX-TL opracowano bibliotekę części genetycznych do precyzyjnego dostrajania ekspresji genów oraz jako narzędzia fluorescencyjne do monitorowania TX-TL w czasie rzeczywistym, tworząc w ten sposób wszechstronną platformę do prototypowania ekspresji genów i naturalnych szlaków biosyntezy produktów ze Streptomyces spp. i pokrewnych Actinobacteria.
W tej pracy, zalecany standardowy plazmid (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) może być użyty do ustalenia przepływu pracy S. venezuelae TX-TL w nowym laboratorium i jest dostępny na AddGene (patrz Tabela uzupełniająca S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I zapewnia użytkownikowi elastyczność w badaniu innych ramek otwartego czytania (ORF). mScarlet-I ORF jest zoptymalizowany pod kątem ekspresji genu S. venezuelae. Promotor SP44 jest silnym konstytutywnym promotorem, który jest wysoce aktywny zarówno u E. coli, jak i Streptomyces spp.39. Plazmid ma dwa unikalne miejsca enzymu restrykcyjnego (NdeI, BamHI), aby umożliwić subklonowanie nowych ORF w ramce ze wspólnym C-końcowym znacznikiem FLAG i systemem znaczników wiążących fluoresceinę arsenową (FlAsH). Alternatywnie, oba znaczniki mogą zostać usunięte z włączeniem kodonu stop po subklonowaniu nowego genu. Za pomocą tego wektora bazowego wykazano wysokowydajną ekspresję szeregu białek, a mianowicie białek ze szlaku biosyntezy oksytetracykliny i niescharakteryzowanej nierybosomalnej syntetazy peptydowej (NRPS) ze Streptomyces rimosus (<klasa silna = "xfig">Figura 2). Jeśli chodzi o wykrywanie mRNA, standardowy plazmid pTU1-A-SP44-mScarlet-I zawiera aptamer dBrokułów (w regionie 3'-nieulegającym translacji) do wykrywania za pomocą sondy 3,5-difluoro-4-hydroksybenzylidenimidazolinon (DFHBI). W celu zwiększenia elastyczności na AddGene udostępniono również zestaw narzędzi EcoFlex40 kompatybilnych z MoClo, w tym wektor wahadłowy Streptomyces kompatybilny z EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) oraz szereg plazmidów wariantu pTU1-A-SP44 eksprymujących białko zielonej fluorescencji superfolder (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I i β-glukuronidazę (GUS). W szczególności plazmid pSF1C-A pochodzi z pAV-gapdh28 i jest utwardzany z miejsc BsaI/BsmBI do montażu MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP jest odpowiednikiem pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP z EcoFlex40, ale zawiera dodatkowe funkcje koniugacji i integracji chromosomów w Streptomyces spp. przy użyciu systemu integrazy phiC3128.
Pierwszy etap protokołu obejmuje wzrost szczepu S. venezuelae ATCC 10712 lub blisko spokrewnionego, pobieranie komórek w połowie fazy wykładniczej, etapy płukania komórek i równowagę w S30A i S30B. Ten etap trwa trzy dni, a czas na wzrost komórek można wykorzystać na przygotowanie pozostałych składników, jak opisano poniżej. Pobrane komórki są następnie poddawane lizie za pomocą sonikacji, klarowane i poddawane reakcji spływu. Na tym końcowym etapie przygotowania ekstrakty komórkowe można przygotować do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C, aby zminimalizować utratę aktywności. Do montażu reakcji TX-TL przy użyciu tego protokołu przedstawiono Streptomyces Master Mix (SMM), z opcją formatu Minimal Energy Solution (MES), który daje porównywalną wydajność. Ponadto zaleca się rozłożenie świeżej kultury S. venezuelae ATCC 10712 z glicerolu o temperaturze -80 °C na płytkę agarową GYM i inkubację w temperaturze 28 °C przez co najmniej 48-72 godzin, aż pojawią się pojedyncze kolonie. Do kolejnych kroków należy używać tylko świeżych kultur.

<table><tbody><tr><td>Kolba 2,5 l UltraYield</td><td>Thomson</td><td>931136-B</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA (>93%)</td><td>Sigma</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>384 Well/przezroczysta płyta dolna</td><td>ThermoFisher</td><td>10692202</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (98%)</td><td>Fluorochem</td><td>44722</td><td></td></tr><tr><td>ATP, CTP, UTP, GTP (roztwór 100 mM, >99%)</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości)</td><td>Melford</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości)</td><td>Melford</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI (&ge; 98% - HPLC)</td><td>Sigma</td><td>SML1627</td><td></td></tr><tr><td>DTT (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>FlAsH-EDT2 (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-363644</td><td></td></tr><tr><td>Glukozo-6-fosforan (>98%)</td><td>Sigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Free Acid (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>Czterowodna sól hemimagnezowa kwasu L-glutaminowego (>98%)</td><td>Sigma</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (98%)</td><td>Ekstrakt z słodu fluorochem</td><td>494356</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>70167-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-6000</td><td>Sigma</td><td>807491</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 96-dołkowa płytka do mikrodializy, 10K MWCO</td><td>ThermoFisher</td><td>88260</td><td></td></tr><tr><td>Poly (winyl siarczan) sól potasowa</td><td>Sigma</td><td>271969</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian potasu (>99%)</td><td>Sigma</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>Próbnik aminokwasów RTS</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (99%)</td><td>Fluorochem</td><td>94554</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE (1 g)</td>Ekstrakt z drożdży <td>Sigma</td><td>505471</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Melford</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płyt</td><td>BMG</td><td>Omega</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. są głównym źródłem klinicznych antybiotyków i chemikaliów przemysłowych. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 to szybko rosnąca odmiana i naturalny producent chloramfenikolu, jadomycyny i pikromycyny, co czyni ją atrakcyjnym kandydatem na podwozie do biologii syntetycznej nowej generacji. Dlatego narzędzia genetyczne, które przyspieszają rozwój S. venezuelae ATCC 10712, a także innych modeli Streptomyces spp., są wysoce pożądane w inżynierii produktów naturalnych i odkryciach. W tym celu w protokole tym przewidziano dedykowany bezkomórkowy system S. venezuelae ATCC 10712, który umożliwia wysokowydajną heterologiczną ekspresję genów o wysokiej zawartości G + C (%). Protokół ten jest odpowiedni dla reakcji wsadowych na małą skalę (10-100 μl) w formacie płytki 96-dołkowej lub 384-dołkowej, podczas gdy reakcje są potencjalnie skalowalne. System bezkomórkowy jest solidny i może osiągnąć wysokie plony (~5-10 μM) dla szeregu rekombinowanych białek w minimalnym ustawieniu. Prace te obejmują również szeroki zestaw narzędzi plazmidowych do pomiaru w czasie rzeczywistym syntezy mRNA i białek, a także barwienia fluorescencyjnego w żelu znakowanych białek. Protokół ten można również zintegrować z wysokoprzepustowymi procesami charakterystyki ekspresji genów lub badaniem szlaków enzymatycznych z genów o wysokiej zawartości G + C (%) obecnych w genomach Actinomycetes.

Niniejszy szczegółowy protokół został przedstawiony jako przykład, aby pomóc użytkownikowi w stworzeniu systemu TX-TL dla Streptomyces w oparciu o szczep modelowy S. venezuelae ATCC 10712 (Rycina 1). Użytkownik może chcieć badać inne szczepy Streptomyces; jednakże etapy wzrostu/zbioru innych szczepów o dłuższym czasie podwajania lub odmiennych preferencjach wzrostu będą wymagały indywidualnej optymalizacji w celu uzyskania najlepszych wyników. Dla uzyskania repreze...

Ten protokół szczegółowo opisuje ulepszoną metodę syntezy wysokiej wydajności białek rekombinowanych z systemu transkrypcyjno-translacyjnego bezkomórkowego Streptomyces (TX-TL).

Wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji Streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Nasz protokół zapewnia uproszczony przepływ pracy dla Streptomyces venezuelae bezkomórkowej translacji transkrypcyjnej. Nasz system wykorzystuje enzymy i szlaki metaboliczne z tego niemodelowego organizmu. Głównymi zaletami są heterologiczna ekspresja genów o wysokiej zawartości GC, zapewnienie korzystnego środowiska przekazywania białek oraz otwarty system do precyzyjnego dostrajania szlaków biosyntezy.Nasza metoda otworzy nowe możliwości w badaniu Streptomyces i pokrewnych bakterii o wysokim GC. Pozwala to na badanie enzymów i ekspresji genów u tych bakterii. Ta technika została opracowana z myślą o łatwości wdrożenia przez nowych użytkowników.Jedynym krokiem, który wymaga wcześniejszego doświadczenia lub zapoznania się z nią, jest sonikacja w celu wytworzenia wysoce aktywnych ekstraktów surowych. Aby rozpocząć zbieranie wstępnie wyhodowanych komórek trzeciego dnia, należy rozcieńczyć kulturę przez noc w stosunku 1 do 10 świeżą pożywką GYN do pomiaru gęstości optycznej lub OD przy 600 nanometrach. Jeśli średnica zewnętrzna kultury przy 600 nanometrach jest mniejsza niż 0,3, zwiększ prędkość wytrząsania do 250 do 300 obrotów na minutę i zwiększaj, aż OD osiągnie 0,3.Rosnąć nie dłużej niż dodatkowe dwie godziny. Jeśli OD jest większe niż 0,3, przenieść kultury do pojemników wirówkowych i szybko schłodzić na mokrym lodzie przez 30 minut. Czekając, aż hodowla komórkowa ostygnie, przygotuj cztery mililitry świeżego jednomolowego ditiotreitolu, S30A i S30B i trzymaj je na lodzie.Po zważeniu pustej 50-mililitrowej probówki wirówkowej należy ją wstępnie schłodzić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Dodaj dwa mililitry jednego molowego ditiotreitolu do jednego litra buforu S30A na lodzie i dobrze wymieszaj. Odwirować komórki w temperaturze 6 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odrzuceniu supernatantu szybkim ruchem, dodać 250 mililitrów buforu S30A i ponownie zawiesić komórki, energicznie potrząsając butelkami wirującymi, aż grudki komórek zostaną jednorodnie rozproszone. Następnie ponownie odwiruj komórki przez sześć minut. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i powtórzyć dodawanie buforu S30A, a następnie odwirować, jak pokazano.Następnie dodaj dwa mililitry jednego molowego DTT do jednego litra buforu S30B na lodzie i dobrze wymieszaj. Dodaj 250 mililitrów buforu S30B do komórek i powtórz wirowanie. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach buforu S30B i przenieść zawiesinę komórek do wstępnie zważonej, wstępnie schłodzonej 50-mililitrowej probówki wirówkowej.W razie potrzeby przenieś pozostałe komórki z dodatkowymi pięcioma do 10 mililitrami buforu S30B i napełnij probówkę do objętości 50 mililitrów S30B. Odwiruj komórki przez 10 minut. Odrzucić supernatant i powtórzyć wirowanie przy poprzednich ustawieniach, jak pokazano.Po odrzuceniu supernatantu należy odessać pozostały supernatant S30B za pomocą pipety o pojemności od 100 do 200 mikrolitrów i zważyć osad z mokrymi komórkami. Na każdy gram mokrych komórek dodaj 0,9 mililitra buforu S30B. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety Pasteura lub wiru.Wirować krótko przez około 10 sekund do 500 G w celu osadzenia komórek. Opuść końcówkę sonikatora do zawiesiny ogniwa, aż końcówka znajdzie się około jednego centymetra poniżej powierzchni cieczy. Wprowadź różne parametry w ustawieniach sonikatora.Ustaw częstotliwość na 20 kiloherców, amplitudę na 65%, czas włączania i wyłączania impulsu na 10 sekund, a całkowity czas sonikacji na jedną minutę. Rozpocznij sonikację i przesuwaj rurkę w górę lub w dół i na boki podczas pierwszych dwóch cykli spoczynku, aby zapewnić równomierne sonikowanie komórek. Jeśli komórki nie są w pełni zmiksowane, odwróć probówkę dwa do trzech razy i powtórz sonikację przez dodatkowy jeden lub dwa 10-sekundowe cykle z częstym mieszaniem, aż komórki zostaną całkowicie rozerwane.Odwiruj zlizane komórki, aby usunąć resztki komórek, a następnie przenieś supernatant do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej jako podwielokrotność jednego mililitra. W celu uzyskania reakcji spływu ekstraktów komórkowych należy inkubować komórkę zawierającą ekstrakt komórkowy w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 60 minut na bloku grzewczym lub w inkubatorze bez wytrząsarki. W przypadku reakcji transkrypcji-translacji rozmrozić ekstrakt komórkowy SMM lub roztwór MES i plazmidowe DNA na lodzie.Wstępnie schłodzić 384-dołkową płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Ustaw reakcję transkrypcji-translacji na lodzie, gdzie 25% objętości to plazmidowe DNA, 33,33% to ekstrakt komórkowy, a 41,67% to roztwór SMM. Delikatnie wiruj mieszaninę przez około pięć sekund przy niskiej prędkości, aby upewnić się, że roztwór jest jednorodny, unikając pienienia lub tworzenia się pęcherzyków.Przenieść trzy porcje po 10 mikrolitrów do trzech dołków płytki 384-dołkowej jako trzykrotek techniczny bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Po zamknięciu płytki przezroczystą pokrywą, obracać płytkę z prędkością 400 razy G przez pięć sekund i inkubować reakcję w temperaturze 28 stopni Celsjusza w inkubatorze lub czytniku płytek bez wstrząsania. Bezkomórkowa transkrypcja i translacja Streptomyces venezuelae została zoptymalizowana pod kątem wysokiej ekspresji białek fluorescencyjnych ze standardowego plazmidu pTU1-A-SP44, a także enzymów biosyntetycznych wykrywanych za pomocą elektroforezy żelowej.Ekspresję standardowego plazmidu pTU1-A-SP44-mScarlet-I mierzono kilkoma metodami. Przeprowadzono pomiary fluorescencji mRNA w czasie rzeczywistym przy użyciu aptameru RNA dRoccoli, niedojrzałego białka mScarlet-I za pomocą systemu znaczników FlAsH oraz dojrzałego białka mScarlet-I. Barwienie fluorescencyjne mScarlet-I w żelu przy użyciu znacznika FlAsH przeprowadzono jako dodatek do barwienia Coomassie Blue całkowitego białka bezkomórkowego.Po tej procedurze można przeprowadzić testy aktywności w celu zbadania enzymów i szlaków, które stanowią wyzwanie przy użyciu standardowych metod. Rozciąga się również w kierunku zwiększenia biosyntezy i wysokoprzepustowej ekspresji genów. Rozwijamy tę technikę do badania enzymów metabolicznych z bakterii o wysokim GC.Wykazaliśmy potencjał naszego systemu do badania zwiększonej biosyntezy w reakcjach bezkomórkowych.

a-high-yield-streptomyces-transcription-translation-toolkit-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Heterologiczna biosynteza erytromycyny A w E. coli obejmuje następujące etapy eksperymentalne: 1) transfer genetyczny; 2) rekonstrukcję heterologiczną; oraz 3) analizę produktu. Każdy z tych etapów zostanie omówiony w kontekście motywacji, potencjału oraz wyzwań związanych z produkcją terapeutycznych produktów naturalnych z wykorzystaniem E. coli jako gospodarza zastępczego.

Logika, kroki eksperymentalne i potencjał heterologicznej biosyntezy produktów naturalnych na przykładzie złożonego antybiotyku erytromycyny A produkowanego przez E. coli

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół (A) identyfikacji naturalnego produktu o aktywności antybiotykowej, (B) oczyszczania związku, (C) pierwszego modelu jego biosyntezy, (D) sekwencjonowania/-eksploracji genomu oraz (E) weryfikacji klastra genów biosyntetycznych.

Od produktu naturalnego do klastra genów biosyntezy: demonstracja z użyciem poliketomycyny ze Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

To badanie opisuje metody koekspresji wielu genów z pojedynczego plazmidu w Escherichia coli za pośrednictwem T7 przy użyciu systemu plazmidowego pMGX.

Indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy RNA T7, pMGX

Ten manuskrypt opisuje ogólne podejście do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do uprawy mikrobiologicznej. Jest to możliwe dzięki iteracyjnemu procesowi pracy, łączącemu eksperymentalny projekt oparty na Krigingu i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, która jest wspierana przez robotykę laboratoryjną w celu zwiększenia niezawodności i szybkości przygotowywania pożywek do pracy z cieczami.

Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Tutaj prezentujemy protokoły dla początkujących badaczy, które rozpoczynają fenotypowanie dla farmakologicznie ważnego rodzaju bakterii Streptomyces.

Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Tutaj prezentujemy łatwe w użyciu protokoły produkcji i oczyszczania metabolitów diterpenoidowych poprzez kombinatoryczną ekspresję enzymów biosyntetycznych w Escherichia coli lub Nicotiana benthamiana, a następnie chromatograficzne oczyszczanie produktu. Otrzymane metabolity nadają się do różnych badań, w tym charakterystyki struktury molekularnej, badań funkcjonalnych enzymów i testów bioaktywności.

Indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych

Protokół eksploracji genomu sterowany spektrometrią mas jest ustanowiony i opisany tutaj. Opiera się na informacjach o sekwencjach genomu i analizie LC-MS/MS i ma na celu ułatwienie identyfikacji cząsteczek ze złożonych ekstraktów mikrobiologicznych i roślinnych.

Eksploracja genomu pod kontrolą spektrometrii mas jako narzędzie do odkrywania nowych produktów naturalnych

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania i kalibracji buforu ekstraktów komórkowych z egzonukleazy V nokautujących szczepów Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD i ΔrecB). Jest to szybkie, łatwe i bezpośrednie podejście do ekspresji w bezkomórkowych systemach syntezy białek przy użyciu liniowych matryc DNA.

Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA

Poznaj wysokowydajny system transkrypcji-translacji Streptomyces venezuelae do syntezy rekombinowanych białek. Metoda umożliwia ekspresję genów o wysokiej zawartości GC i badanie szlaków metabolicznych.

Wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji Streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych (Wideo) | JoVE Journal

Wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji Streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych

Przeglądaj więcej filmów