Name: Bezkomórkowa produkcja skalowana i adiuwantowe dodawanie do rekombinowanego głównego białka błony zewnętrznej z Chlamydia muridarum w celu opracowania szczepionki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Poznaj metodę bezkomórkowej produkcji białek błonowych w nanodyskach dla szczepionek podjednostkowych z użyciem Chlamydia muridarum. Ta skalowalna technika umożliwia szybkie uzyskiwanie antygenów o natywnym kształcie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Publicznej Służby Zdrowia R21 AI20925 i U19 AI144184 z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych. Prace te zostały wykonane pod auspicjami Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych przez Lawrence Livermore National Laboratory w ramach kontraktu DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine, w placówkach gwarantowanych przez Publiczną Służbę Zdrowia (PHS) zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
1. Przygotowanie szkła
UWAGA: Wszystkie materiały użyte do produkcji preparatów szczepionkowych dla zwierząt są wolne od endotoksyn.
<ol>
	<li>Aby zniszczyć zanieczyszczającą endotoksynę, piecz oczyszczone szklane naczynia, które będą przechowywać, w piekarniku w temperaturze 180 °C przez 4 godziny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie bufora
<ol>
	<li>Przygotować 250 ml oczyszczających o powinowactwie do niklu wymienionych w tabeli 1. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do reakcji
<ol>
	<li>Odważyć 20 mg 1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DMPC) do wolnej od endotoksyn probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Rozpuść go w 1 ml wody wolnej od endotoksyn, sonduj co najmniej cztery razy w temperaturze 6 A przez 1 minutę, z 1-minutowymi przerwami między nimi, aż do uzyskania czystości. Usunąć wszelkie zanieczyszczenia metaliczne z sondy przez odwirowanie w temperaturze 13 000 × g przez 2 minuty w temperaturze 22 °C, a następnie przenieść rozpuszczony lipid do nowej probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od endotoksyn</li>.
	<li>Odważyć 1 mg telodendrymeru PEG5k-CA8 do probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od endotoksyn. Rozpuścić w wodzie wolnej od endotoksyn do stężenia 20 mg/ml. Wirować aż do całkowitego rozpuszczenia i rozcieńczyć do 2 mg/ml.</li>
	<li>W nowej probówce wolnej od endotoksyn połącz 210 μl roztworu DMPC o stężeniu 20 mg/ml z 210 μl roztworu telodendrymeru o stężeniu 2 mg/ml.</li>
</ol>
4. Bezkomórkowa produkcja MOMP-tNLP dla preparatów szczepionek podjednostkowych
<ol>
	<li>Przygotuj MOMP-tNLP przy użyciu metod bezkomórkowych zmodyfikowanych na podstawie wcześniej opublikowanego protokołu5.
	<ol>
		<li>Dwie godziny przed rozpoczęciem reakcji bezkomórkowej otwórz zestaw do ekspresji białka bezkomórkowego prokariotycznego i rozmrozić jeden z do rekonstytucji. Po rozmrożeniu dodaj jedną tabletkę koktajlu inhibitorów proteazy bez EDTA i pozwól mu całkowicie się rozpuścić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postępuj zgodnie z tym protokołem, używając zestawu zaprojektowanego do przeprowadzania reakcji 5 x 1 ml. 
	UWAGA: Typowa produkcja na dużą skalę to 3 x 1 ml.
	<ol>
		<li>Na każdy 1 ml reakcji dodać 525 μl buforu do rozpuszczenia do butelki z lizatem E. coli i delikatnie przetoczyć do rozpuszczenia. Dodać 250 μl buforu do rozpuszczenia do butelki zawierającej dodatki reakcyjne (np. ATP, GTP) i delikatnie rozwałkować do rozpuszczenia.</li>
		<li>Dodać 8,1 ml buforu do rozpuszczenia do butelki z reakcyjnym płynem, ponownie zakryć gumowym korkiem (należy uważać, aby nie dotknąć wnętrza gumowego korka) i delikatnie odwrócić/zwinąć do rozpuszczenia.</li>
		<li>Dodać 3 ml buforu do rozpuszczenia do butelki z mieszaniną aminokwasów, zakryć gumowym korkiem i delikatnie odwrócić/zwinąć do rozpuszczenia. 
		UWAGA: Uważaj, aby nie dotknąć wnętrza gumowego korka, ponieważ może to prowadzić do zanieczyszczenia.</li>
		<li>Dodać 1,8 ml buforu do rozpuszczenia do butelki z metioniną, delikatnie rozwałkować do rozpuszczenia, a następnie przechowywać na lodzie do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór reakcyjny.
	<ol>
		<li>Do butelki z lizatem E. coli dodać 225 μl odtworzonej mieszaniny reakcyjnej, 270 μl odtworzonej mieszaniny aminokwasów bez metioniny i 30 μl odtworzonej metioniny. Dodatkowo dodać 400 μl mieszaniny DMPC/telodendrymer, 15 μg plazmidu MOMP i 0,6 μg plazmidu Δ49ApoA1. Rozwałkować/delikatnie wstrząsnąć do wymieszania. 
		UWAGA: Upewnij się, że oba plazmidy są zbudowane z tego samego szkieletu plazmidu. Nie wirować.</li>
		<li>Pobrać 20 μl całego roztworu i odłożyć go na bok w probówce o pojemności 1,5 ml do reakcji kontrolnej z ekspresją GFP (patrz poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór paszowy. Do butelki z mieszanką paszową dodać 2,65 ml odtworzonej mieszanki aminokwasów bez metioniny i 300 μl odtworzonej metioniny. Rozwałkować/delikatnie wstrząsnąć do rozpuszczenia. 
	UWAGA: W tym czasie niewykorzystany bufor do rozpuszczenia i metioninę można zwrócić do zamrażarki w celu przechowywania.</li>
	<li>Przenieść 1 ml roztworu reakcyjnego do wewnętrznej komory reakcyjnej znajdującej się w bezkomórkowym zestawie reakcyjnym i zamknąć po napełnieniu. Przenieść 10 ml roztworu zasilającego do zewnętrznej komory naczynia reakcyjnego i zamknąć. 
	UWAGA: Nie przepełniaj komór! Obecność pęcherzyków powietrza w górnej części zarówno wewnętrznej komory reakcyjnej, jak i wewnętrznej komory zasilającej niekorzystnie wpłynie na reakcję. Pozostały roztwór reakcyjny można umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml i pozostawić do wymieszania z naczyniem głównym.</li>
	<li>Dodać 0,5 μl plazmidu kontrolnego GFP (0,5 mg/ml) do uprzednio porcjowanej mieszaniny reakcyjnej o stężeniu 20 μl. 
	UWAGA: Wiele zestawów jest dostarczanych z plazmidem kontrolnym do celów kontroli jakości. Większość plazmidu wykazującego ekspresję GFP z promotorem T7 i miejscem wiązania rybosomów E. coli (RBS) może być również używana jako plazmid kontrolny.</li>
	<li>Umieścić reakcję w wytrząsarce o prędkości 300 obr./min, 30 °C na okres do 18 godzin. Aby sprawdzić, czy reakcja przebiegła pomyślnie, użyj źródła światła UV, aby sprawdzić fluorescencję w wyniku syntezy kontrolnego GFP (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) już po 15 minutach inkubacji. 
	UWAGA: Warunki te, w szczególności temperatura, mogą wymagać optymalizacji pod kątem ekspresji innych białek błonowych.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie MOMP-tNLP
<ol>
	<li>Użyć unieruchomionej chromatografii powinowactwa do niklu, aby oczyścić kompleks nanocząstek MOMP-tNLP z bezkomórkowej mieszaniny reakcyjnej za pomocą znacznika Hisa na białku Δ49ApoA1.
	<ol>
		<li>Przenieść 1 ml 50% zawiesiny żywicy oczyszczającej His-Tag do jednorazowej kolumny chromatograficznej o pojemności 10 ml i zrównoważyć ją z 3 ml buforu wiążącego.</li>
		<li>Pozwól buforowi spłynąć, zakryj wylot i dodaj 250 μl buforu wiążącego do żywicy.</li>
		<li>Przed dodaniem reakcji bezkomórkowej do kolumny należy zachować 20 μl do późniejszej analizy przez SDS-PAGE. Zmieszać reakcję bezkomórkową ze zrównoważoną żywicą i inkubować na laboratoryjnym kołysku w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odkręć kolumnę, przemyj nasadkę 500 μl dodatkowego buforu wiążącego i dodaj ten płyn do reszty kolumny.</li>
	<li>Zebrać przepływ cieczy z kolumny do późniejszej analizy za pomocą SDS-PAGE.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 1 ml buforu płuczącego zawierającego 20 mM imidazolu sześć razy i zebrać frakcje. Uważaj, aby żywica nie wyschła między praniami. Przy drugim płukaniu energicznie mieszaj żywicę, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Eluować MOMP-tNLP w sześciu 300 μl frakcji buforu elucyjnego 1 (zawierającego 250 mM imidazolu), a następnie jedną końcową elucję za pomocą 300 μl buforu elucyjnego 2 (zawierającego 500 mM imidazolu). Przy drugiej elucji energicznie wymieszać żywicę, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
</ol>
6. Analiza przez SDS-PAGE
UWAGA: Wszystkie frakcje elucji powinny być analizowane przez SDS-PAGE w celu sprawdzenia ilości i czystości interesującego nas białka.
<ol>
	<li>Załadować po 1 μl każdego z całkowitego lizatu i przepływu, a następnie 5 μl dla wszystkich zebranych popłuczyn i frakcji elucyjnych.
	<ol>
		<li>Wymieszaj podwielokrotności eluowanych MOMP-tNLP, płukanek, przepływu i całkowitego lizatu z 4x buforem ładującym próbkę SDS-PAGE. Wymieszać próbki i poddać je denaturacji termicznej z 10-krotnym środkiem redukującym próbki, chyba że wskazano inaczej.</li>
		<li>Analizuj frakcje za pomocą elektroforezy żelowej przy użyciu 1,0 mm, 4 do 12%, żeli Bis-Tris SDS-PAGE z 1x buforem roboczym MES-SDS, wraz z odpowiednim wzorcem masy cząsteczkowej. Uruchom żele na 35 minut przy napięciu 200 V.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Żele należy poplamić zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Wyjmij żel z kasety i umieść go w 60 ml plamy żelowej. Podgrzewaj żel w kuchence mikrofalowej w plamie żelowej przez 30 s i delikatnie kołysz pojemnikiem przez 30 sekund, aby równomiernie rozprowadzić ciepło. Podgrzewaj żel w plamie w kuchence mikrofalowej do 80–85 °C przez kolejne 30 sekund i umieść żel na wytrząsarce orbitalnej, aby kołysał się przez 5 minut.</li>
		<li>Podgrzewaj żel w kuchence mikrofalowej po raz trzeci przez 30 s, a następnie wróć do wytrząsarki orbitalnej, aby kołysać się przez kolejne 23 minuty.</li>
		<li>Przenieść żel do czystego pojemnika i przemyć w 100 ml roztworu myjącego (10% metanol, 7% kwas octowy) przez 30 min. 
		UWAGA: Jest to krytyczny krok, ponieważ należy unikać podgrzewania roztworu myjącego. Niezastosowanie się do tego może spowodować przebarwienia tła i nieprawidłowości na końcowym obrazie żelu.</li>
		<li>Po umyciu spłucz żel w ultraczystej wodzie dwa razy po 5 min każdy.</li>
		<li>Zobrazuj żele za pomocą imagera żelowego o długości fali 600 nm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Użyj SDS-PAGE, aby określić ilościowo ilość pojedynczego białka w roztworze nanocząstek, jeśli istnieje wzorzec białka do porównania. 
		UWAGA: W tym przykładzie seryjne rozcieńczenia rekombinowanego MOMP są rozwiązywane przez SDS-PAGE, a gęstości pasm są określane ilościowo za pomocą oprogramowania instrumentu.</li>
		<li>Wygeneruj krzywą standardową, używając gęstości pasm MOMP. Rozpuść próbki MOMP-tNLP na tym samym żelu SDS-PAGE i oblicz składnik MOMP cząstek, korzystając z krzywej standardowej MOMP <silna klasa="xfig">(Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Western i kropki oraz przechowywanie
<ol>
	<li>W przypadku western blotting należy rozpuścić próbki za pomocą SDS-PAGE i przenieść żele za pomocą komercyjnego systemu suchego blottingu ze standardowymi ustawieniami zgodnie z protokołem producenta.
	<ol>
		<li>Usunąć blot ze stosu po zakończeniu transferu i inkubować każdy blot przez noc w temperaturze 4 °C w odpowiednim buforze blokującym zawierającym 0,2% Tween 20 i 0,5 mg/ml MAb40 lub 0,2 mg/ml przeciwciało anty-His-tag MAbHIS skierowane przeciwko znacznikowi His-tag z białka Δ49ApoA1. 
		UWAGA: Rozcieńczenia przeciwciał stosowane do blottingu wynoszą 1:1,000 dla MAb40 i 1:500–1,000 dla przeciwciała MAbHIS.</li>
		<li>Umyj każdą plamę 3 razy przez 5 minut za pomocą PBS-T (1x PBS, 0,2% Tween 20, pH 7,4).</li>
		<li>Inkubować bloty przez 1 godzinę w buforze blokującym zawierającym drugorzędowe przeciwciało sprzężone z fluoroforem (np. IRDye) w rozcieńczeniu 1:10 000.</li>
		<li>Umyj bloty 3 razy przez 5 minut za pomocą PBS-T. Użyj imagera fluorescencyjnego, aby zobrazować plamy po ostatnim praniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku plam kropkowych należy osuszyć 3 μg oczyszczonego MOMP-tNLP i opróżnić tNLP za pomocą aparatu do plam punktowych. Zablokuj i rozwiń blot przy użyciu tych samych metod, które opisano powyżej dla western blot.</li>
</ol>
8. Ocena endotoksyn
<ol>
	<li>Określ ilościowo poziomy endotoksyn za pomocą systemu testowania endotoksyn opartego na teście lizatu lizatu amebocytów limulusa (LAL). Przygotować wolny od endotoksyn 25 mM Tris, pH 7,4, bufor do próbek, używając 1 M roztworu chlorowodorku Tris i wody wolnej od endotoksyn. 
	UWAGA: Zazwyczaj próbki należy rozcieńczyć przy użyciu tego bufora do próbek, a rozcieńczenia dostosować, aby znaleźć odpowiedni zakres dla poszczególnych próbek. W tym przypadku próbki MOMP-tNLP rozcieńcza się 500-krotnie w buforze próbki, a 25 μl umieszcza się w każdym dołku wkładu urządzenia o czułości 0,05 EU/ml. Poziomy endotoksyn MOMP-tNLP i pustego tNLP stosowane w opisanych poniżej badaniach na myszach wynoszą od 0,4 do 12 EU/μg białka w zależności od próbki.</li>
</ol>
9. Liofilizacja
<ol>
	<li>Liofilizuj i przechowuj nanocząstki MOMP-tNLP do długotrwałego (do lat) stosowania w temperaturze -20 °C. Aby przygotować zawiesiny tNLP i MOMP-tNLP do liofilizacji, dodaj trehalozę jako środek ochronny podczas procesu zamrażania i liofilizacji. 
	UWAGA: Ten proces został szeroko zweryfikowany dla różnych formuł tNLP7,8.</li>
	<li>Podzielić aktualną objętość roztworu MOMP-tNLP przez 9, aby uzyskać objętość 1 M trehalozy w sterylnej, wolnej od endotoksyn, dejonizowanej wodzie wymaganej do osiągnięcia końcowego stężenia 0,1 M trehalozy. Zanotuj końcową objętość i podziel ją na wolne od endotoksyn probówki polipropylenowe o pojemności 15 ml lub 50 ml zgodnie z potrzebami.</li>
	<li>Wymieszany roztwór zamrozić na suchym lodzie i liofilizować przez noc za pomocą liofilizatora. Suszone preparaty należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	<li>Rozpuść liofilizowane tNLP przy użyciu wody wolnej od endotoksyn. Delikatnie rozwałkuj, aż liofilizowane ciasto całkowicie się rozpuści i ponownie nawodni. Aby usunąć trehalozę, należy dializować roztwór w stosunku do PBS za pomocą membrany dializacyjnej o natężeniu 3,5 kDa.</li>
</ol>
10. Dodawanie adiuwantów
UWAGA: Te i inne podobne preparaty szczepionek podjednostkowych opartych na NLP mogą łatwo zawierać adiuwanty lipofilowe, takie jak CpG-ODN1826 i FSL-1. CpG-ODN1826 jest zmodyfikowanym oligonukleotydem CpG klasy B (5'-tccatgacgttcctgacgtt-3') z pełnym szkieletem fosforotionowym z ugrupowaniem 5' cholesterolu (5'-chol-C6). Koniugacja CpG-ODN1826 z tNLP odbywa się za pośrednictwem oddziaływań hydrofobowych między ugrupowaniem cholesterolu a dwuwarstwą fosfolipidową tNLP i została wykazana i dobrze scharakteryzowana, jak wcześniej zgłoszono9,10.
<ol>
	<li>Przed włączeniem do tych preparatów należy oczyścić zmodyfikowany cholesterolem CpG za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami w celu usunięcia zanieczyszczającej endotoksyny, a także wszelkich niezmodyfikowanych cząsteczek CpG.
	<ol>
		<li>Po otrzymaniu od sprzedawcy ponownie uwodnić liofilizowany materiał CpG w wodzie wolnej od endotoksyn i oczyścić go na preparatywnej kolumnie C4 RP-HPLC przy użyciu gradientu separacji składającego się z 10 mM octanu trietyloamoniu (TEAA) (faza ruchoma A) i acetonitrylu (faza ruchoma B). 
		UWAGA: Dodatkowe informacje są dostępne w tabeli 2.</li>
		<li>Połącz i liofilizuj frakcje zawierające CpG modyfikowane cholesterolem. Aby zapewnić całkowite usunięcie resztek TEAA, rozpuść CpG w 15 ml wody wolnej od endotoksyn i ponownie liofilizuj ją trzykrotnie.</li>
		<li>Po końcowej liofilizacji rozpuść CpG w wodzie wolnej od endotoksyn (>20 mg/ml końcowego stężenia CpG), podwielokrotności i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebna. W celu uzupełnienia preparatów należy rozcieńczyć CpG do stężenia 1–2,5 mg/ml. 
		UWAGA: FSL-1 jest dostępny w postaci liofilizowanego proszku klasy szczepionkowej. Roztwór ten rozpuszcza się przy użyciu sterylnej i wolnej od endotoksyn wody o stężeniu 1 mg/ml. Szczepionka jest podawana domięśniowo (domięśniowo), przy czym każda dawka zawiera 10 μg MOMP w całkowitej objętości 50 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby osiągnąć pożądaną dawkę preparatu, należy dializować nanocząstki do PBS i zagęścić je za pomocą odśrodkowego koncentratora próżniowego przed dodaniem adiuwanta. Należy przy tym zachować ostrożność, aby zapobiec całkowitemu wysuszeniu próbki — podczas wirowania sprawdzaj objętość próbki co 20–30 minut.</li>
	<li>Dodać adiuwant w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Aby ocenić pomyślne włączenie, należy przeanalizować końcowe preparaty i ich składniki za pomocą analitycznej chromatografii wykluczającej (SEC). 
	UWAGA: Do tych preparatów użyto kolumny SEC w buforze PBS (0,5 ml/m natężenia przepływu), a elucję wykryto za pomocą detektora diodowego UV-vis. Inkorporację oceniano, porównując absorpcję cząstek z adiuwantami z absorpcją cząstek nieadiuwantowych przy 214 i 280 nm.</li>
	<li>Przechowywać adiuwantowy MOMP-tNLP i opróżnić tNLP w temperaturze 4 °C przed użyciem u zwierząt przez okres do 14 dni. Aby w pełni ocenić stabilność nowego preparatu tNLP, należy okresowo analizować przechowywane tNLP według SEC. 
	UWAGA: Stabilność będzie się różnić w zależności od preparatu.</li>
</ol>
11. Badanie surowicy
<ol>
	<li>Uzyskaj samice 3-tygodniowych myszy (BALB/c, n = 6).</li>
	<li>Zaszczepić myszy domięśniowo (i.m.) w każdą tylną kończynę 10 μg MOMP w postaci MOMP-tNLP z adiuwantem 5 μg CpG i 1 μg FSL-1 (całkowita objętość na wstrzyknięcie = 50 ml).</li>
	<li>Po szczepieniu obserwuj myszy, aż będą w stanie utrzymać leżącą mostek.</li>
	<li>Cztery tygodnie po pierwszym szczepieniu (prime) należy zaszczepić zwierzęta po raz drugi (dawką przypominającą) 10 μg MOMP w postaci MOMP-tNLP z adiuwantem 5 μg CpG i 1 μg FSL-1 (całkowita objętość w wstrzyknięciu = 50 ml).</li>
	<li>W 56. dniu po pierwszym szczepieniu należy pobrać krew w celu oceny miana przeciwciał. Rozpocznij od znieczulenia myszy poprzez wstrzyknięcie dożylnego roztworu ksylazyny (0,3 mg/20 g masy ciała) i ketaminy (3,0 mg/20 g masy ciała). Ściśnij przednie i tylne nogi, aby upewnić się, że nie dochodzi do szarpnięcia. Nałóż wazelinę na okolice oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Za pomocą rurki kapilarnej z mikrohematokrytem przebić splot zaoczodołowy. Zebrać 100 ml krwi do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Po pobraniu krwi obserwuj myszy, aż wyzdrowieją ze znieczulenia i będą w stanie utrzymać leżącą mostek.</li>
	<li>Pozwól krwi krzepnąć w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie wiruj w temperaturze 2 000 × g przez 10 minut. Zebrać surowicę i zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>W tym czasie wyzwij zwierzęta z Chlamydia muridarum lub poddaj je eutanazji. Poddaj myszy eutanazji, najpierw wstrzykując roztwór ksylazyny (0,3 mg/20 g masy ciała) i ketaminy (3,0 mg/20 g masy ciała), a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Przetestuj przeciwciała w surowicy specyficzne dla MOMP przy użyciu technik western blot, jak opisano powyżej. Zbierz surowice myszy od wszystkich immunizowanych myszy i użyj zbiorczej surowicy zamiast pierwszorzędowego przeciwciała w rozcieńczeniu 1:5 000.</li>
</ol>

<ol><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li>
<li>Coleman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+association+of+the+Yersinia+pestis+translocon+proteins%2C+YopB+and+YopD%2C+are+facilitated+by+nanolipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles.</a> PLoS One. 11 (3), 0150166(2016).</li>
<li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein%2C+forming+soluble+nanolipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+diameter%2C+monodispersity%2C+and+solubility+of+ApoA1+nanolipoprotein+particles+using+telodendrimer+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry.</a> Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+production+of+a+functional+oligomeric+form+of+a+Chlamydia+major+outer-membrane+protein+%28MOMP%29+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).</li>
<li>Tifrea, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protection+in+mice+against+a+Chlamydia+muridarum+respiratory+challenge+by+a+vaccine+formulated+with+the+major+outer+membrane+protein+in+nanolipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles.</a> Vaccines. 9 (7), 755(2021).</li>
<li>Cleveland, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-angle+X-ray+and+neutron+scattering+demonstrates+that+cell-free+expression+produces+properly+formed+disc-shaped+nanolipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles.</a> Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).</li>
<li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+to+nickel-chelating+nanolipoprotein+particles+increases+the+potency+and+efficacy+of+subunit+vaccines+to+prevent+West+Nile+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).</li>
<li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalized+delivery+of+adjuvant+and+antigen+using+nanolipoprotein+particles+enhances+the+immune+response+to+recombinant+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).</li>
<li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+nanolipoprotein+particles+%28NLPs%29+as+an+in+vivo+delivery+platform%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform.</a> PLoS One. 9 (3), 93342(2014).</li>
<li>Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+can+elicit+an+immune+response+as+protective+as+that+resulting+from+inoculation+with+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analyses+of+the+major+outer+membrane+protein+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).</li>
<li>Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+status+and+future+prospects+for+a+vaccine+against+Chlamydia+trachomatis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection.</a> Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).</li>
<li>Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+expression%2C+single-channel+analysis+and+membrane+topology+of+recombinant+Chlamydia+trachomatis+Major+Outer+Membrane+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein.</a> BMC Microbiology. 5, 5(2005).</li>
<li>Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+an+intranasal+challenge+by+vaccines+formulated+with+native+and+recombinant+preparations+of+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein.</a> Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+of+functional+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases.</a> Scientific Reports. 5 (1), 12896(2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Chlamydia jest najczęstszą infekcją przenoszoną drogą płciową, która dotyka zarówno mężczyzn, jak i kobiety. Chociaż badania nad szczepionkami przeciwko Chlamydii trwają od dziesięcioleci, bezpieczna i skuteczna szczepionka, którą można by wprowadzić do masowej produkcji,pozostaje nieuchwytna. Chlamydiowy MOMP jest uważany za głównego kandydata jako ochronny antygen szczepionkowy; jednak MOMP jest wysoce hydrofobowy i podatny na nieprawidłowe składanie 14,15. Dalsze badania wykazały, że MOMP występuje w stanach oligomerycznych, które są niezbędne dla jego immunogenności11. Szczegółowo opisano tutaj zwalidowaną, bezkomórkową metodę koekspresji, która wytwarza oligomeryczny MOMP utworzony w nanocząstce tNLP jako szczepionka, z wydajnością około 1,5 mg oczyszczonego MOMP na 3 ml lizatu. Ta w pełni zestawiona procedura może być dalej skalowana do produkcji przemysłowej, zwiększając jej szanse jako użytecznego podejścia do wytwarzania szczepionek.
Wcześniej publikowaliśmy na temat wykorzystania ekspresji bezkomórkowej do produkcji białek błonowych osadzonych w NLPs 3,16, a także ekspresji do dysków stabilizowanych telodendrymerami. Jednak ta ostatnia technika pozwoliła na wytworzenie cząsteczek białka błonowego o większej niejednorodności i niższej rozpuszczalności. 4 Ponadto immunogenność cząstek MOMP-telodendrimer jest niejasna w porównaniu z cząstkami MOMP-tNLP6.
Procedurę tę można dostosować do zwiększenia ekspresji białek błony bakteryjnej, które są obiecującymi kandydatami na antygeny do stosowania w szczepionkach podjednostkowych. Procedura ta nie tylko wytwarza rozpuszczone białko błony bakteryjnej, ale ogólna struktura nanocząstek jest podatna na dalszą modyfikację przy użyciu różnych lipofilowych adiuwantów szczepionkowych, w tym między innymi CpG sprzężonego z ugrupowaniem cholesterolu lub FSL-1. Ekspresja innych kandydujących antygenów z bakterii jest wykonalna, chociaż parametry takie jak temperatura ekspresji, wybór lipidów i rodzaj systemu ekspresji mogą wymagać zbadania w celu osiągnięcia optymalnych plonów.
Ponadto wybór i stosunek plazmidu mają kluczowe znaczenie w tym procesie. Oba użyte plazmidy powinny być zbudowane z tego samego szkieletu. Jeśli wstawki są w przybliżeniu tej samej długości, proporcje można oprzeć na masie dodanego plazmidu, jak opisano tutaj. Jednak współczynniki oparte na molach dadzą bardziej powtarzalne wyniki, szczególnie przy skalowaniu reakcji. Proporcje, które sprawdzają się w reakcjach w skali ekranu (< 0,5 ml), mogą nie mieć zastosowania do większych reakcji i mogą wymagać dodatkowej optymalizacji. Białka niebłonowe mogą być nadal wyrażane przy użyciu zestawów bezkomórkowych, ale mogą nie wymagać nanocząstki lipidowej (koekspresji) do wytworzenia rozpuszczalnego produktu. Dodatkowo, podczas gdy protokół ten opisuje adiuwantowanie za pomocą CpG i FSL-1, system ten można formułować z innymi adiuwantami lipofilowymi lub mieszać z rozpuszczalnymi adiuwantami w zależności od potrzeb.
Istotne jest, aby unikać zanieczyszczenia podczas ustawiania reakcji ekspresji bezkomórkowej, ponieważ może to wpłynąć na plony. Wszelkie dodatki do reakcji, w tym same plazmidy, powinny być wysoce czyste. Ponadto ekspresja białek powinna mieć kontakt wyłącznie z materiałami i roztworami, które są wolne od zanieczyszczenia endotoksynami. Zanieczyszczenie endotoksynami w preparatach kandydujących może prowadzić do niespójnych i fałszywych wyników testów immunologicznych i może być szkodliwe w wystarczających ilościach. Chociaż nie zostało to tutaj opisane, dodatkowe oczyszczanie po chromatografii powinowactwa do niklu może być konieczne, jeśli na kolejnych etapach analizy, takich jak SDS-PAGE, zaobserwowano wiele zanieczyszczeń. Można to osiągnąć za pomocą SEC, chociaż warunki mogą wymagać optymalizacji na podstawie receptury po recepturze.

Prokariotyczne lub eukariotyczne lizaty do bezkomórkowej ekspresji białek są łatwo dostępne jako komercyjne produkty do syntezy interesujących białek (pełny przegląd znajdziesz w 1). Te systemy ekspresji są dostępne w różnych skalach i wykorzystują lizaty z różnych organizmów, w tym E. coli, roślin tytoniu i kultur ssaków. Lizaty bezkomórkowe oferują wiele korzyści w porównaniu z tradycyjnymi metodami produkcji białek rekombinowanych, w tym łatwość użycia oraz solidną, szybką produkcję białka. Chociaż metody te są stosowane głównie do produkcji rozpuszczalnych białek, grupa ta jest pionierem podejścia do ich wykorzystania do ekspresji białek błonowych.
To nowatorskie podejście wprowadza drobne modyfikacje do istniejących bezkomórkowych systemów ekspresji, włączając DNA kodujące dwa produkty białkowe do ekspresji, apolipoproteinę i białko błonowe, które są przedmiotem zainteresowania. Wyrażona apolipoproteina (pochodne ApoA1 lub ApoE4) oddziałuje z lipidami dodanymi do lizatu bezkomórkowego w celu spontanicznego składania (~20 nm) NLP. W przypadku jednoczesnej translacji z białkiem błonowym będącym przedmiotem zainteresowania, NLP i białko błonowe tworzą rozpuszczalny kompleks nanocząstek, w którym białko błonowe jest osadzone w dwuwarstwie lipidowej NLP. W ten sposób białko błonowe jest bardziej dostępne do dalszych zastosowań, ponieważ jest zawarte w rozpuszczalnych, dyskretnych cząstkach. Takie podejście może wytwarzać funkcjonalne oligomeryczne kompleksy białkowe w obrębie dwuwarstwy NLP2 i może wytwarzać składnik antygenowy szczepionki podjednostkowej, który jest następnie mieszany z adiuwantami lipofilowymi w celu utworzenia szczepionki nanocząsteczkowej zawierającej kolokalizowany antygen i adiuwant odpowiedni do oceny in vivo.
Ta obecna metoda jest zmodyfikowana na podstawie wcześniej opublikowanego protokołu3. Kluczowe modyfikacje koncentrują się na zwiększeniu skali reakcji bezkomórkowej i późniejszym oczyszczeniu kompleksu białko-NLP. Dalsza modyfikacja obejmuje dodanie amfifilowego polimeru znanego jako telodendrymer, który jest najpierw mieszany z lipidami przed dodaniem do reakcji bezkomórkowej. Kotranslacja plazmidów w obecności telodendrymeru i lipidów wytwarza NLP telodendrymeru (tNLP). Dodanie telodendrymeru pomaga również modulować rozmiar i monodyspersyjność powstałych nanocząstek tNLP4. Protokół ten jest specjalnie zoptymalizowany pod kątem badań nad szczepionkami na dużą skalę w celu wytworzenia białka antygenu podjednostkowego związanego z błoną, chlamydiowego MOMP5,6. Metoda wytwarza rekombinowany MOMP związany z tNLP, tworząc wysoce rozpuszczalny kompleks MOMP-tNLP, który zachowuje oligomeryzację MOMP. Typowa produkcja na dużą skalę w ilości 3 ml daje >1,5 mg oczyszczonego MOMP. Wytwarzany bezkomórkowo MOMP-tNLP jest podatny na szybkie dodawanie adiuwantów w celu badania immunogenności in vivo.

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC) w postaci proszku</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówek wirówkowych bez endotoksyn</td><td>Eppendorf</td><td>2600028</td><td></td></tr><tr><td>1 M roztwór chlorowodorku Trizma</td><td>Millipore Sigma</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty, odczynnik ACS, &ge; 99,7%</td> <td>miliporowy aparat Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot</td> Zapora buforowa <td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>dla XCell SureLock</td><td>Life Technologies</td><td>EI0012</td><td></td></tr><tr><td>C24 Wytrząsarka inkubatora</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bezkomórkowy system ekspresji: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit</td><td>BiotechRabbit</td><td>BR1400201</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete His-Tag Oczyszczanie Żywica</td><td>Roche Diagnostyka molekularna</td><td>5893682001</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche Diagnostyka molekularna</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>CpG-ODN1826</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-trehaloza dwuwodna</td><td>Millipore Sigma</td><td>71509</td><td></td></tr><tr><td>Rurki dializacyjne D-Tube Dialyzer Maxi</td><td>Millipore Sigma</td><td>71508-3</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe, spiekane kolumny z polipropylenu o pojemności 10 ml</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550EDU</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr>Zasilacz <td></td><td></td><td></td><td>do elektroforezy</td></tr><tr><td>Endobezpieczny wkład PTS</td> System testowy <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9594798</td><td></td></tr><tr><td>Endosafe-PTS Charles</td><td>River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel roztwór do mycia: 10% metanol, 7% roztwór</td> HCl kwasu octowego <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>i NaOH do Regulacja</td><td></td><td></td><td></td>pH</tr><tr><td>HPLC z detektorem diodowym UV-vis</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone HyPure woda klasy kulturowej</td><td>VWR</td><td>82007-328</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 System suchego blottingu</td><td>Technologie</td><td></td><td></td>życia</tr><tr><td>iBlot 2 Stosy transferowe, PVDF</td><td>Life Technologies</td><td>IB24001</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie Image Studio V2.0</td><td>Li-COR Biiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF Membrana</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Fc imager</td><td>Li-COR Biiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol (&ge; 99,9%)</td><td>Millipore Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka</td><td></td><td></td><td></td>mikrofalowa</tr><tr><td>NanoDrop One/OneC Mikroobjętość Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 do 12%, Bis-tris, 1,0 mm</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek NuPAGE LDS (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do biegania NuPAGE MES SDS (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP000202</td><td></td></tr><tr><td>Środek redukujący próbki NuPAGE (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący Odyssey w TBS zawierające 0,2% Tween 20</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td></td><td></td><td></td>orbitalna</tr><tr><td>PBS-T (1x PBS, 0,2% Tween 20, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEG5K-CA8 Telodendrimer (niestandardowy produkt syntezy)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wektor pIVEX2.4d</td> Roche <td>Molecular Diagnostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe: MAb40 (przeciwciało monoklonalne przeciwko zmiennej domenie 1 (VD1) C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe: MAbHIS, przeciwciało Penta-His</td><td>Qiagen</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator</td><td></td><td></td><td></td>sondy</tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometr</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Test białka kubitowego Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33212</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet Rainin: LTS 1000 i mikro; L</td><td>Końcówki</td><td></td> do pipet Rainin 17002428 <td></td></tr><tr><td>Rainin: LTS 20 i mikro; L</td><td></td><td>Końcówki do pipet Rainin</td> 17002429 <td></td></tr><tr><td>Rainin: LTS 200 i mikro; L</td><td>Pipety Rainin</td><td>17002426</td><td></td></tr><tr><td>Rainin</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne: IRDye 800CW koza (poliklonalna) anty-mysie IgG (ciężka i lekka)</td> <td>Li-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Wstępnie barwione białko Standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy NaH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; S0751</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200, kolumna 5/150 GL</td><td>Cytiva</td><td>GE28-9909-45</td><td></td></tr><tr><td>Syntetyczna diacylowana lipoproteina-TLR2/6 FSL-1</td><td>Invivogen</td><td>&nbsp; tlrl-fsl</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Żel rubinowy Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S12001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Źródło</td><td></td><td></td><td></td>światła UV</tr><tr><td>Wirówka próżniowa</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR 15 mL stożkowe (89039-666)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR 50 ml stożkowe (89039-656)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies )</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

bezkomórkowa produkcja skalowana i adiuwantowe dodawanie do rekombinowanego głównego białka błony zewnętrznej z chlamydia muridarum w celu opracowania szczepionki

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Szczepionki podjednostkowe oferują przewagę nad bardziej tradycyjnymi inaktywowanymi lub atenuowanymi szczepionkami pochodzącymi z całych komórek pod względem bezpieczeństwa, stabilności i standardowej produkcji. Aby uzyskać skuteczną szczepionkę podjednostkową opartą na białku, antygen białkowy często musi przyjąć konformację podobną do natywnej. Jest to szczególnie ważne w przypadku antygenów powierzchniowych patogenów, które są białkami związanymi z błoną. Metody bezkomórkowe są z powodzeniem stosowane do produkcji prawidłowo sfałdowanego funkcjonalnego białka błonowego poprzez kotranslację cząstek nanolipoprotein (NLP), powszechnie znanych jako nanodyski. 
Ta strategia może być wykorzystana do produkcji szczepionek podjednostkowych składających się z białek błonowych w środowisku związanym z lipidami. Jednak produkcja białek bezkomórkowych jest często ograniczona do małej skali (<1 ml). Ilość białka produkowanego w małych seriach produkcyjnych jest zwykle wystarczająca do badań biochemicznych i biofizycznych. Jednak proces bezkomórkowy musi zostać zwiększony, zoptymalizowany i dokładnie przetestowany, aby uzyskać wystarczającą ilość białka do badań szczepionek na modelach zwierzęcych. Inne procesy związane z produkcją szczepionek, takie jak oczyszczanie, dodawanie adiuwantów i liofilizacja, muszą być optymalizowane równolegle. W artykule przedstawiono opracowanie rozszerzonego protokołu ekspresji, oczyszczania i formułowania szczepionki podjednostkowej białka związanego z błoną. 
Skalowane reakcje bezkomórkowe wymagają optymalizacji stężeń i proporcji plazmidu przy użyciu wielu wektorów ekspresyjnych plazmidu, selekcji lipidów i dodawania adiuwantów do produkcji na wysokim poziomie formułowanych cząsteczek nanolipoprotein. Metoda ta została zademonstrowana w tym miejscu z ekspresją głównego białka błony zewnętrznej chlamydii (MOMP), ale może być szeroko stosowana do innych antygenów białek błonowych. Skuteczność antygenu można ocenić in vivo za pomocą badań immunizacji w celu zmierzenia produkcji przeciwciał, jak wykazano tutaj.

Profil SDS-PAGE oczyszczania powinowactwem do Ni białka MOMP-tNLP z 1 mL reakcji bezkomórkowej przedstawiono na Ryc. 1B. Reakcja doprowadziła do wysokiego poziomu ekspresji zarówno białka MOMP, jak i Δ49ApoA1. Wcześniejsze wyniki wykazały, że bezkomórkowa ekspresja Δ49ApoA1 w obecności DMPC i telodendrymeru prowadzi do powstania nanolipoproteinowych cząsteczek telodendrymerowych (tNLPs)4. Współelucja MOMP z Δ49ApoA1 wskazała, że MOMP wiąże się z tNLPs, ponieważ znacznik His znajduje się wyłącznie na rusztowaniu tNLP Δ49ApoA1, a nie na MOMP. MOMP jest białkiem silnie nierozpuszczalnym, które można eluować jedynie poprzez tworzenie kompleksów z tNLPs, o których wykazano, że ułatwiają solubilizację białek błonowych.
Frakcje elucyjne zawierające MOMP-tNLP połączono, a całkowite stężenie białka określono za pomocą urządzenia do ilościowego oznaczania opartego na fluorescencji lub urządzenia mierzącego stężenie poprzez absorbancję przy 280 nm, zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi oznaczania białek. Aby umożliwić precyzyjne dawkowanie szczepionki MOMP, istotne jest również określenie stężenia MOMP w oczyszczonych kompleksach. Opracowaliśmy metodę ilościowego oznaczania MOMP opartą na densytometrii żelowej (Rysunek 2), w której jako wzorca wykorzystano oczyszczone rekombinowane białko MOMP o znanym stężeniu. Poprzez sporządzenie krzywej wzorcowej i porównanie jej z próbką MOMP-tNLP można dokładnie określić stężenie MOMP. Wyznaczenie stężenia MOMP w oczyszczonej próbce pozwoliło na oszacowanie wydajności MOMP w reakcjach bezkomórkowych w różnych skalach, co jest istotne dla zaplanowania układu reakcji odpowiedniego do dalszych badań (Tabela 3).
MOMP musi tworzyć oligomery, aby wywołać silną odpowiedź immunologiczną11. W celu zbadania stanu oligomerycznego MOMP, MOMP-tNLP analizowano w obecności i przy braku zarówno ciepła, jak i reduktora ditiotreolu (DTT, 50 mM, Ryc. 3A). Oligomery MOMP wyższego rzędu zidentyfikowano za pomocą SDS-PAGE w próbkach, których nie poddano działaniu ciepła i DTT. W porównaniu z nimi, próbki poddane działaniu ciepła w obecności DTT wykazały na żelu głównie dwa wyraźne prążki, odpowiadające odpowiednio MOMP i Δ49ApoA1 (około 40 kDa i 22 kDa). Wyniki te ściśle przypominają wzór prążkowania na żelu przypisywany tworzeniu oligomerów MOMP, co jest kluczowe dla jego skuteczności.
Dalsza analiza western blot z użyciem MAb40, przeciwciała przeciwko liniowemu epitopowi w domenie zmiennej białka MOMP, wykazała podobny wzór prążków, co potwierdziło tworzenie oligomerów przez białko MOMP w jego stanie nienaturalnym (Rycina 3B). Ważnym czynnikiem wpływającym na tworzenie oligomerów MOMP jest stosunek plazmidu MOMP do plazmidu Δ49ApoA1 podczas przygotowania reakcji bezkomórkowej. W Tabeli 4 przedstawiono stosunek plazmidów oraz wynikający z niego stopień wbudowania MOMP do tNLP. Wcześniejsze badania wskazały, że chlamydialne białko MOMP oraz inne białka błony zewnętrznej mogą występować głównie w formie trimerów12. Aby zmaksymalizować tworzenie trimerów w reakcji bezkomórkowej, pożądany jest stopień wbudowania bliski trzem białkom MOMP na jedną cząsteczkę NLP, co odpowiada stosunkowi plazmidu MOMP do Δ49ApoA1 wynoszącemu ok. 25:1.
W celu bardziej usprawnionego wykrycia obecności MOMP i tNLP zastosowano analizę dot blot. Przeciwciało MAb40 wykorzystano do wykrycia całkowitej ilości MOMP. Przeciwciało MAbHIS, nakierowane na znacznik His w rusztowaniu Δ49ApoA1 białka tNLP, posłużyło do oceny obecności tNLP. Współwystępowanie sygnałów z przeciwciał MAb40 i MAbHIS wskazywało na formowanie kompleksu MOMP-tNLP. Reakcja kontrolna doprowadziła do powstania pustego tNLP, które wykazywało jedynie dodatni sygnał z MAbHIS (Rycyna 3C). Aby przetestować immunogenność MOMP-tNLP wytworzonych w reakcji bezkomórkowej, MOMP-tNLP podano z adiuwantem CpG + FSL-1 w formie wstrzyknięć domięśniowych (i.m.) u myszy w schemacie prime-boost opisanym powyżej. Od uodpornionych myszy pobrano surowice, a poziom specyficznych dla MOMP przeciwciał IgG zmierzono za pomocą analizy western blot (Rycina 4). Surowice z myszy wstrzykniętych z MOMP-tNLP z adiuwantem wykazały silne wiązanie z MOMP, co wskazuje, że MOMP-tNLP może wywołać odpowiedź immunologiczną in vivo.
<img alt="Oczyszczanie białek fluorescencyjnych w probówkach z żelem GFP i wyniki elektroforezy SDS-PAGE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ekspresja i oczyszczanie MOMP-tNLP. (A) Zdjęcie probówek zawierających niewielkie alikwoty reakcji bezkomórkowej, w której pomyślnie wyekspresowano kontrole GFP, świecące pod źródłem światła UV (po prawej), w porównaniu do lizatów bez plazmidu GFP (po lewej). (B) Żel białkowy barwiony SYPRO Ruby po SDS-PAGE przedstawia profil oczyszczania MOMP-tNLP. MOMP migruje przy 40 kDa, a 49ApoA1 migruje przy 22 kDa. Skróty: MOMP = chlamydial major outer membrane protein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein particle; MOMP-tNLP = kompleks MOMP-tNLP; GFP = plazmid kodujący zielone białko fluorescencyjne; MW = marker masy cząsteczkowej; T = całkowity lizat bezkomórkowy; FT = frakcja przepływowa; R1-R3 = alikwoty reakcji bezkomórkowej; W1, W6 = przemycia 1 i 6; E1-E7 = elucje od 1 do 7; Δ49ApoA1 = pochodna mysiej ApoA1 z tagiem His. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz żelu elektroforetycznego z krzywą wzorcową białka; wykres przedstawia wyniki analizy liniowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ilościowe oznaczenie MOMP w próbkach MOMP-tNLP. (A) Żel SDS-PAGE barwiony SYPRO Ruby do ilościowego oznaczenia MOMP. Na żel naniesiono rekombinowane MOMP o znanych stężeniach w celu uzyskania krzywej wzorcowej. Każda ścieżka zawierała 0,1 µg, 0,5 µg, 1,0 µg, 2,0 µg i 4,0 µg MOMP. Na ten sam żel naniesiono próbki MOMP-tNLP przeznaczone do analizy ilościowej. (B) Krzywa wzorcowa stężenia MOMP została wygenerowana za pomocą densytometrii. Ustalono równanie wiążące znormalizowaną gęstość prążka z ilością MOMP. Równanie to wykorzystano do obliczenia zawartości MOMP w nieznanych próbkach. Skróty: MOMP = główne białko zewnętrznej błony chlamydii; tNLP = nanolipoproteinowa cząstka telodendrymera; MOMP-tNLP = kompleks MOMP-tNLP; SDS-PAGE = elektroforeza żelowa w polu elektrycznym w obecności dodecylosiarczanu sodu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza oczyszczania białka za pomocą SDS-PAGE i dot blot; detekcja MOMP, tNLP, przeciwciał; porównanie wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3: MOMP-tNLP produkowane w systemie bezkomórkowym umożliwiają tworzenie struktur wyższego rzędu przez MOMP. (A) Żel SDS-PAGE dla MOMP-tNLP z i bez poddania działaniu ciepła oraz reduktora DTT, barwiony SYPRO Ruby. Po podgrzaniu i zastosowaniu DTT, MOMP pojawił się głównie jako prążek monomeru przy ~40 kDa, ponieważ ciepło i reduktor rozbiły większość struktur MOMP wyższego rzędu. W absence ciepła i DTT obecne były prążki wyższego rzędu, co wskazuje na konformację oligomeryczną MOMP. (B) Western blot dla MOMP-tNLP oraz samego MOMP, niepoddanych oraz poddanych działaniu ciepła i DTT. Po transferze membranę przetestowano przeciwciałem MAb40 (rozcieńczenie 1:1 000). Zaobserwowano wzór prążków podobny do żelu barwionego SYPRO Ruby, co potwierdza, że prążki o wyższej masie cząsteczkowej były rzeczywiście oligomerami MOMP. (C) Dot blot próbek MOMP-tNLP i pustych tNLP (w duplikacie) przetestowanych przeciwciałami MAb40 i MAbHIS. Skróty: MOMP = główne białko zewnętrznej błony chlamydii; tNLP = nanocząsteczka nanolipoproteiny telodendrymerowej; MOMP-tNLP = kompleks MOMP-tNLP; SDS-PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu; DTT = ditiotreitol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki Western blot pokazujące prążki białkowe, analiza antygenu MOMP-tNLP, użyte przeciwciała pierwotne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
Rycina 4: MOMP-tNLP wytwarzane w systemie bezkomórkowym jest silnie immunogenne. Surowica z immunizowanych myszy wykazała silny sygnał IgG przeciwko MOMP. Do immunizacji myszy wykorzystano MOMP-tNLP z dodatkiem adiuwantów CpG + FSL-1. Surowice od sześciu immunizowanych myszy zostały pobrane, połączone i wykorzystane do detekcji MOMP-tNLP. Surowica była w stanie związać się z MOMP w analizie Western blot i wykazała silny sygnał IgG (lewo). Western blot z użyciem MAb40 jako przeciwciała pierwotnego (prawo) wykazał podobne prążki, co wskazuje, że surowica zawierała swoiste dla MOMP przeciwciała IgG. Skróty: MOMP = główne białko zewnętrznej błony chlamydii; tNLP = nanocząsteczka lipoproteinowa typu telodendrimer; MOMP-tNLP = kompleks MOMP-tNLP; CpG = adiuwant CpG modyfikowany cholesterolem; FSL-1 = adiuwant lipofilny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Nazwa buforu</td>
			<td >NaH2PO4</td>
			<td >NaCl</td>
			<td >Imidazol</td>
			<td >pH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bufor wiążący</td>
			<td >50 mM</td >
			<td >300 mM</td >
			<td >10 mM</td >
			<td >8.0</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Bufor płuczący</td>
			<td >50 mM</td >
			<td >300 mM</td >
			<td >20 mM</td >
			<td >8.0</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Bufor elucyjny 1</td>
			<td >50 mM</td >
			<td >300 mM</td >
			<td >250 mM</td >
			<td >8.0</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Bufor elucyjny 2</td>
			<td >50 mM</td >
			<td >300 mM</td >
			<td >500 mM</td >
			<td >8.0</td >
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista buforów niezbędnych do oczyszczania za pomocą powinowactwa do niklu, z wyszczególnieniem stężeń poszczególnych składników oraz pH.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas trwania</td>
			<td>50 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szybkość przepływu</td>
			<td>6,0 ml/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typ gradientu</td>
			<td>Binarny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor A</td>
			<td>10 mM TEAA w H2O20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor B</td>
			<td>MeCN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient</td>
			<td>% Bufor B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 min</td>
			<td>60%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30,5 min</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 min</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40,5 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Warunki oczyszczania modyfikowanego cholesterolem CpG metodą odwróconej fazy HPLC. Skróty: TEAA = octan trietyloamoniu; MeCN = acetonitryl.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lizat bezkomórkowy (ml)</td>
			<td>lipid DMPC (mg)</td>
			<td>Telodendrymer (mg)</td>
			<td>plazmid MOMP (µg)</td>
			<td>Wydajność oczyszczonego MOMP (mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>0.4</td>
			<td>15</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>8</td>
			<td>0.8</td>
			<td>30</td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>12</td>
			<td>1.2</td>
			<td>45</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>75</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Ilość lipidów, telodendrymeru i plazmidów wykorzystanych w reakcjach bezkomórkowych o różnej skali oraz odpowiadające im wydajności. Skróty: MOMP = główne białko błony zewnętrznej chlamydii; DMPC = 1,2-dimyrystoylo-sn-glycero-3-fosfocholina.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="2">Stosunki ilości wprowadzonych plazmidów, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td >1:1</td>
			<td >5:1</td>
			<td >10:1</td>
			<td >25:1</td>
			<td >50:1</td>
			<td >100:1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2">Stosunki ilości wyprodukowanego białka, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td >0.02</td >
			<td >0.32</td >
			<td >0.64</td >
			<td >3.46</td >
			<td >6.55</td >
			<td >20.04</td >
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2">Szacowana liczba insercji MOMP na tNLP</td>
			<td >0.03</td >
			<td >0.37</td >
			<td >0.75</td >
			<td >4.04</td >
			<td >7.65</td >
			<td >23.39</td >
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Stosunki plazmidów w reakcji bezkomórkowej i wynikające z nich szybkości insercji MOMP. Skróty: MOMP = główne białko błony zewnętrznej chlamydii; tNLP = telodendrymerowa nanolipoproteina; Δ49ApoA1 = pochodna mysiej ApoA1 z etykietą His.

Ten protokół opisuje użycie komercyjnych, bezkomórkowych zestawów do ekspresji białek do produkcji białek błonowych opartych na nanodyskach, które mogą być używane jako antygeny w szczepionkach podjednostkowych.

Bezkomórkowa produkcja skalowana i adiuwantowe dodawanie do rekombinowanego głównego białka błony zewnętrznej z Chlamydia muridarum w celu opracowania szczepionki

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard ...

Wiele potencjalnych antygenów podjednostkowych szczepionki to białka błonowe. Historycznie rzecz biorąc, były one trudne do wyprodukowania i oczyszczenia w wystarczających ilościach. Dzięki tej technice jesteśmy w stanie stworzyć interesujące antygeny osadzone w błonie lipidowej, aby zapewnić potwierdzenie podobne do natywnego.Proces ten ułatwia również formułowanie z interesującymi adiuwantami. Ekspresja bezkomórkowa umożliwia szybką produkcję interesujących białek w ich natywnej strukturze bezznacznikowej. Technika ta jest również skalowalna i już współpracujemy z firmami komercyjnymi nad opracowaniem preparatów szczepionek wykorzystujących ten proces.Demonstrujemy tutaj proces dla antygenu chlamydii, ale proces ten można łatwo dostosować do produkcji interesujących antygenów, niezależnie od tego, czy są to białka błonowe, czy nie. Proces ten może mieć zastosowanie zarówno do opracowywania szczepionek przeciwko patogenom, jak i nowotworom. Na początek przygotuj MOMP-tNLP, stosując metodę bezkomórkową.Rozmrozić bufor do rozpuszczenia z zestawu do ekspresji białek bezkomórkowych na dwie godziny przed rozpoczęciem reakcji i dodać do niego inhibitor proteazy wolny od EDTA. Użyj zestawu zaprojektowanego do przeprowadzenia pięciu jednomililitrowych reakcji. Na każdą jednomililitrową reakcję dodać 525 mikrolitrów buforu do rozpuszczenia do butelki z lizatem E. coli i zwinąć ją do rozpuszczenia.Dodać 250 mikrolitrów buforu do rozpuszczenia do butelki reakcyjnej zawierającej dodatek i rozpuścić przez walcowanie. Następnie dodaj 8,1 mililitra buforu do rozpuszczenia do butelki z reakcją i zwiń ją do rozpuszczenia. Do butelki z mieszaniną aminokwasów dodać trzy mililitry buforu do rozpuszczenia, aby go rozpuścić.Do innej butelki metioniny dodaj 1,8 mililitra buforu do rozpuszczania, rozpuść go i przechowuj na lodzie. Dodać 225 mikrolitrów odtworzonej mieszaniny, 270 mikrolitrów odtworzonej mieszaniny aminokwasów bez metioniny i 30 mikrolitrów odtworzonej metioniny do butelki z lizatem. Następnie dodaj 400 mikrolitrów mieszaniny DMPC / telodendrymer, 15 mikrogramów plazmidu MOMP i 0,6 mikrograma delta-49ApoA1 do mieszaniny i wymieszaj.Podwielokrotność 20 mikrolitrów całkowitego roztworu w probówce o pojemności 1,5 mililitra Do reakcji kontrolnej z ekspresją GFP. Przygotować roztwór paszowy, dodając 2,65 mililitra odtworzonej mieszaniny aminokwasów bez metioniny i 300 mikrolitrów odtworzonej metioniny. Przenieś jeden mililitr roztworu reakcyjnego do wewnętrznej komory reakcyjnej w bezkomórkowym zestawie reakcyjnym i zamknij go.Napełnij zewnętrzną komorę naczynia reakcyjnego 10 mililitrami roztworu pokarmowego i zamknij ją. Dodać 0,5 mikrolitra plazmidu kontrolnego GFP do 20-mikrolitrowych podwielokrotności mieszaniny reakcyjnej. Umieść reakcję w wytrząsarce z prędkością 300 obrotów na minutę przez 18 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Monitorować reakcję pod światłem UV po 15 minutach pod kątem fluorescencji spowodowanej syntezą GFP. Oczyść kompleks nanocząstek MOMP-tNLP z bezkomórkowej mieszaniny reakcyjnej za pomocą immobilizowanej chromatografii powinowactwa do niklu przy użyciu znacznika HIS na białku delta-49ApoA1. Przenieś jeden mililitr 50% zawiesiny żywicy oczyszczającej HIS-tag do 10-mililitrowej jednorazowej kolumny chromatograficznej i dodaj trzy mililitry buforu wiążącego w celu zrównoważenia.Następnie opróżnij bufor i dodaj 250 mikrolitrów buforu wiążącego do żywicy. Ekstrahować 20 mikrolitrów bezkomórkowej mieszaniny reakcyjnej do analizy SDS-PAGE. Dodać pozostałą bezkomórkową mieszaninę reakcyjną ze zrównoważoną żywicą i inkubować na laboratoryjnym kołysku przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zdjąć nasadkę kolumny i umyć ją 500 mikrolitrami buforu wiążącego. Dodaj płyn myjący do kolumny i zbierz przepływ do analizy SDS-PAGE. Przemyć kolumnę jednym mililitrem buforu do przemywania z 20-milimolowym imidazolem sześć razy i zebrać frakcje.Podczas mycia po raz drugi użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby wymieszać żywicę. Eluować MOMP-tNLP w sześciu 300-mikrolitrowych frakcjach buforu elucyjnego I zawierającego 250-milimolowy imidazol i końcowej elucji za pomocą 300 mikrolitrów buforu elucyjnego II zawierającego 500-milimolowy imidazol. Przy drugiej elucji energicznie wymieszać żywicę, pipetując w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.Użyj imagera żelowego, aby uchwycić obrazy w 600 nanometrach. Następnie określ ilościowo ilość różnych białek w nanocząstkach za pomocą analizy SDS-PAGE przy użyciu wzorca białkowego. Narysuj krzywą standardową, korzystając z gęstości pasm MOMP.Następnie określ składnik MOMP nanocząstek za pomocą wzorca. Rozpuścić próbki za pomocą SDS-PAGE i przenieść stosy żeli za pomocą komercyjnego systemu suchego blottingu do analizy Western blot. Usuń bloty ze stosu i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w buforze blokującym zawierającym 0,2% TWEEN 20 i 0,5 mikrograma na mililitr MAb40 lub 0,2 mikrograma na mililitr przeciwciała antyHIS-tag MAbHIS skierowanego przeciwko znacznikowi HIS z białka delta-49ApoA1.Umyj każdą plamę PBST trzy razy przez pięć minut na pranie. Inkubować bloty przez jedną godzinę w buforze blokującym zawierającym przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem w rozcieńczeniu 1:10 000. Powtórz pranie za pomocą PBST i uchwyć obraz za pomocą imagera fluorescencyjnego po ostatnim praniu.Za pomocą aparatu do igraszek punktowych osuszyć trzy mikrogramy MOMP-tNLP i opróżnić tNLP. Rozwiń i zablokuj bloty, stosując tę samą metodę dla Western blot. Wymieszany roztwór zamrozić na suchym lodzie i liofilizować przez noc za pomocą liofilizatora.Wysuszone preparaty należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W razie potrzeby rozpuść liofilizowane tNLP w wodzie wolnej od endotoksyn i zwiń je do rozpuszczenia i ponownego uwodnienia. Dializować roztwór za pomocą PBS i usunąć trehalozę za pomocą membrany dializacyjnej o mocy 3,5 kilodaltonu.Odwirować roztwór nanocząstek w koncentratorze próżniowym przed dodaniem adiuwanta. Monitorować objętość próbki po 20 do 30 minutach, aby zapobiec całkowitemu wysuszeniu. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj adiuwant w sterylnych warunkach.Korzystając z analitycznej chromatografii wykluczania wielkości, przeanalizuj preparat pod kątem pomyślnego włączenia. Przechowuj adiuwantowane MOMP-tNLP i opróżnij tNLP w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do 14 dni. Analiza stabilności preparatu tNLP za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.Analizę SDS-PAGE MOMP-tNLP przeprowadzono za pomocą chromatografii powinowactwa do niklu, która wykazała, że bezkomórkowa mieszanina reakcyjna ma wysoki poziom ekspresji zarówno białek MOMP, jak i delta-49ApoA1. Stosując densytometrię żelową, stężenie MOMP określono ilościowo przy użyciu oczyszczonego rekombinowanego MOMP o znanym stężeniu jako wzorcu. Aby określić tworzenie oligomerów, SDS-PAGE MOMP i MOMP-tNLP poddano działaniu ciepła i DTT, które wykazały wyraźne pasma dla MOMP i delta-49ApoA1.Analizę Western blot przy użyciu przeciwciała MAb40 zastosowano przeciwko białku MOMP, co ujawniło wzór prążków potwierdzający tworzenie oligomerów przez białko MOMP w stanie niedenaturowanym. Test dot blot przeprowadzono w obecności przeciwciał MAb40 i MAbHIS, co wskazywało na powstawanie MOMP-tNLP. Jednak puste tNLP pokazało pozytywny sygnał dla MAbHIS.Surowice od immunizowanych myszy, którym wstrzyknięto adiuwantowy MOMP-tNLP, wykazały silne wiązanie MOMP i wskazały, że MOMP-tNLP może wywołać odpowiedź immunologiczną. Ponieważ protokół ten generuje białko z DNA, ważne jest, aby unikać zanieczyszczenia reakcji DNazą, RNazą, a także obcym DNA i RNA. Wszelkie materiały lub odczynniki używane w reakcjach powinny być wolne od tego typu cząsteczek.Po ekspresji, oczyszczeniu i dodaniu adiuwantów, te potencjalne szczepionki mogą być oceniane w odpowiednich modelach zwierzęcych dla patogenów będących przedmiotem zainteresowania w celu oceny markerów aktywacji immunologicznej lub oceny ochrony podczas prowokacji. W przypadku chlamydii, główne białko błony zewnętrznej (MOMP) od wielu lat jest uważane za wiodący antygen kandydujący do szczepionek podjednostkowych, ale trudno jest je wyprodukować na skalę niezbędną do zastosowania szczepionki. Bezkomórkowa koekspresja tego białka błonowego jest realnym sposobem na rozpoczęcie procesu oceny tego białka w modelach zwierzęcych, takich jak myszy, a ostatecznie przejście do testów na ludziach.

cell-free-scaled-production-adjuvant-addition-to-recombinant-major

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Gilmore, S. F., et al. Bezkomórkowa skalowana produkcja i adiuwantowe dodawanie do rekombinowanego głównego białka błony zewnętrznej z Chlamydia muridarum w celu opracowania szczepionki. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje bezkomórkową syntezę stabilizowanych nanodyskami błonowych antygenów białkowych przy użyciu systemu dwukompartmentowego. Urządzenie utrzymuje optymalne warunki do wydajnej syntezy białek, prawidłowego fałdowania i stabilnej integracji w nanodyski.

Synteza stabilizowanych nanodyskami antygenów białek błonowych przy użyciu systemu bezkomórkowego

Źródło: Gilmore, S. F. i wsp. Bezkomórkowa skalowana produkcja i adiuwantowe dodawanie do rekombinowanego głównego białka błony zewnętrznej z Chlamydia muridarum w celu opracowania szczepionki. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje zastosowanie Western blotting do oceny integralności strukturalnej głównego białka błony zewnętrznej (MOMP) w kompleksach szczepionek opartych na nanocząsteczkach. Przedstawiono w nim kluczowe etapy związane z transferem białek, znakowaniem przeciwciał i...

Western blot do oceny integralności strukturalnej bakteryjnego antygenu szczepionkowego

Ten film demonstruje skuteczną technikę homogenizacji w celu wygenerowania emulsji antygenowo-adiuwantowej do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) w modelu mysim. Emulsja zawiera autoantygen — glikoproteinę mielinową oligodendrocytów (MOG) — w fazie wodnej, otoczoną ciągłą fazą olejową zawierającą inaktywowane bakterie chorobotwórcze. Emulsja zapewnia przedłużone uwalnianie antygenów w celu przedłużenia odpowiedzi immunologicznej.

Przygotowanie emulsji z adiuwantem antygenowym w celu wywołania autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Ten film demonstruje metodę generowania szczepionek przeciwko pęcherzykom błony zewnętrznej (OMV) wyświetlającym wiele wartości. Komórki ssaków są transfekowane w celu ekspresji i wydzielania antygenów wirusowych połączonych ze znacznikiem SpyTag i znacznikiem polihistydyny. Antygeny te są następnie oczyszczane przy użyciu kolumny powinowactwa do kwasu niklowo-nitrylotryoctowego (Ni-NTA). Oczyszczony antygen miesza się z pęcherzykami błony zewnętrznej wykazującymi ekspresję powierzchniowego...

Wytwarzanie wielowalentnej szczepionki pęcherzykowej z błoną zewnętrzną

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wektora Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 o nazwie Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 poprzez wykorzystanie strategii inkorporacji antygenu kapsydu. Wykazano, że wektor ten wykazuje przydatność jakościową, zdolność do ucieczki z surowic Ad5-dodatnich in vitro oraz antygenowość i immunogenność w stosunku do włączonych antygenów.

Wykorzystanie strategii inkorporacji kapsydu antygenu do opracowania metod szczepień z wektorem 5 serowirusa

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

Szczegółowa metoda jest tutaj opisana jako oczyszczanie, ponowne fałdowanie i charakterystyka samoorganizujących się nanocząstek białkowych (SAPN) do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek.

Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych

Aby wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zwierzęcy model stwardnienia rozsianego, myszy są immunizowane emulsją typu woda w oleju zawierającą autoantygen i kompletny adiuwant Freunda. Chociaż istnieje kilka protokołów przygotowania tych emulsji, tutaj przedstawiono szybki, prosty i ustandaryzowany protokół homogenizacji do przygotowania emulsji.

Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Ten protokół szczegółowo opisuje wzbogacanie natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (mEV) z aksonicznych kultur Mycobacterium smegmatis (Msm) oraz jak można projektować i wzbogacać rekombinowane MsmEV zawierające mCherry (czerwony fluorescencyjny reporter). Na koniec zweryfikowano nowatorskie podejście polegające na wzbogaceniu MsmEV zawierających białko EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Obecny protokół przygotowuje i ocenia właściwości fizyczne, odpowiedź immunologiczną i efekt ochronny in vivo nowej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym.

Ocena odpowiedzi immunologicznej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym przeciwko zakażeniu gronkowcem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Poznaj metodę bezkomórkowej produkcji białek błonowych w nanodyskach dla szczepionek podjednostkowych z użyciem Chlamydia muridarum. Ta skalowalna technika umożliwia szybkie uzyskiwanie antygenów o natywnym kształcie.

Bezkomórkowa produkcja skalowana i adiuwantowe dodawanie do rekombinowanego głównego białka błony zewnętrznej z Chlamydia muridarum w celu opracowania szczepionki (Wideo) | JoVE Journal

Bezkomórkowa produkcja skalowana i adiuwantowe dodawanie do rekombinowanego głównego białka błony zewnętrznej z Chlamydia muridarum w celu opracowania szczepionki

Przeglądaj więcej filmów